CN117126925B - 一种能够长期稳定保存的Crispr-Cas核酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于病原核酸检测技术领域，更具体地，涉及一种能够长期稳定保存的Crispr‑Cas核酸检测试剂盒。本发明提供的gRNA体外转录体系，能够进行高效体外转录合成相应的gRNA，实现在30分钟内完成gRNA的体外转录，大幅缩短了体外转录获得gRNA的时间，可以用于即时检验时快速生成gRNA。将上述gRNA体外转录体系应用于Crispr‑Cas核酸检测试剂盒，无需额外提供RNA，有利于试剂盒的保存与运输，适用于对各种病原微生物的现场快速高灵敏筛查，具有检测灵敏度高、特异性强、耗时短和稳定性好等优势。
Description
技术领域
本发明属于病原核酸检测技术领域，更具体地，涉及一种能够长期稳定保存的Crispr-Cas核酸检测试剂盒。
背景技术
目前各种病原体的检测主要依靠PCR技术及其他以PCR为基础的技术，PCR相关检测技术因其快速准确、灵敏度高等优点，目前被公认为病毒检测的“金标准”。但是，目前主流的PCR检测平台，都需要专业的仪器设备和相关技术人员，限制了其大规模推广应用，特别是在边远落后地区的应用。
现有的等温扩增技术如重组酶聚合酶扩增(RPA&RAA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉引物恒温扩增(CPA)等，可在单一温度下进行，大大降低了对仪器的要求，可用于现场检测，但其检测灵敏度不高，特异性较差，也不适用于低载量的病毒检测。
CRISPR/Cas检测技术是通过靶标基因被向导RNA(guide RNA，gRNA，也为singleguide RNA)识别激活Cas蛋白酶，利用Cas蛋白酶的反式切割活性切割探针实现对检测信号放大。DETECTR和Sherlock检测平台是将上述等温扩增技术与CRISPR/Cas技术结合的核酸检测方法，但其检测技术中含有向导RNA，而RNA极易降解，它的保存和运输要求极高，若RNA降解则会极大的影响检测结果。
专利文献(CN115948614A)可以实现现场快速生成sgRNA，但一方面因其引物设计特征，只适用于PCR扩增方式，等温扩增极易产生非特异性导致假阳性的产生，而PCR对于仪器的温度控制系统要求较高，对于现场检测的扩增仪器设计较为困难；另一方面该发明使用的两步扩增方法，费时比较长。
专利文献(WO2021068086A1)公开的体外现转方案，其转录活性较差，需要较长的时间转录获得所需gRNA，且转录体系内的dsDNA会产生极强的非特异性，导致较强的假阳性结果。
因此，本领域急需开发一种能够快速转录生成gRNA的转录体系，且该转录体系应用于Crispr-Cas核酸检测时适用于任何核酸扩增方式，不易出现假阳性结果。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种能够长期稳定保存的Crispr-Cas核酸检测试剂盒，以解决现有技术体外转录获得所需gRNA的时间长、对核酸扩增方式要求严格、容易导致假阳性结果等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种gRNA体外转录体系，其包括核酸构建体和RNA聚合酶；所述核酸构建体包括GAATT序列、启动子序列、用于转录生成gRNA的模板序列和PloyA序列；
其中，所述GAATT序列位于所述核酸构建体的5’端；所述PloyA序列位于所述核酸构建体的3’端。
优选地，所述PloyA序列为An，n≥16。
进一步优选地，所述PloyA序列为An，n≥24。
优选地，所述启动子序列选自T7启动子序列、T3启动子序列、U6启动子序列和SP6启动子序列中的一种或多种。
优选地，所述T7启动子序列的结构为：5’-TAATACGACTCACTATA-GY-3’或5’-TAATACGACTCACTATA-GY-AGA-3’，其中，Y为0-5的整数。优选地，Y为0-3的整数。进一步优选地，Y为3。
优选地，所述RNA聚合酶选自T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、U6 RNA聚合酶和Sp6RNA聚合酶中的一种或多种。
优选地，所述gRNA的体外转录体系中还包括固相载体、用于合成gRNA的底物和缓冲剂；所述固相载体能够吸附gRNA。
本发明还提供了一种能够长期稳定保存的Crispr-Cas核酸检测试剂盒，包括所述gRNA体外转录体系，还包括Cas蛋白检测体系。
优选地，所述Cas蛋白检测体系包括Cas蛋白和核酸探针，所述Cas蛋白包括Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b和Cas14中的一种或多种；所述核酸探针含有可检测的标记物，当所述核酸探针被Cas蛋白切割后，能够产生可检测信号；所述可检测的标记物包括荧光团或生物素；所述可检测信号包括荧光信号或生物素。
优选地，所述Crispr-Cas核酸检测试剂盒还包括靶核酸扩增体系，所述靶核酸扩增体系包括扩增靶核酸的扩增引物对、用于合成靶核酸的底物、聚合酶和扩增所需的缓冲试剂。
优选地，所述Crispr-Cas核酸扩增体系还包括核酸提取剂、核酸释放剂、解旋酶和逆转录酶中的一种或多种。
本发明还提供了所述Crispr-Cas核酸检测试剂盒用于生物样品和/或环境样品的靶核酸检测。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的gRNA体外转录体系，通过对核酸构建体进行设计能够获得高效的gDNA核酸模板，通过在核酸构建体的5’端引入GAATT的碱基序列，该结构可以有效的促进RNA聚合酶与启动子序列结合，促进体外转录；在核酸构建体的3’端引入一段PloyA的序列，延长的序列可以有效的减弱小片段转录的抑制作用，大大提高了体外转录活性，缩短了体外转录所需时间。
(2)本发明提供的gRNA体外转录体系，与现有技术相比，去除了传统RNA体外转录法的PCR扩增及胶回收步骤，能够进行高效体外转录合成相应的gRNA，实现在30分钟内完成gRNA的体外转录，大幅缩短了体外转录获得gRNA的时间，可以用于即时检验(point-of-care testing，POCT)时快速生成gRNA。
(3)优选实施例中，本发明提供的gRNA体外转录体系中包含的固相载体能够与RNA相结合，可以有效去除其它转录反应体系组分，避免其它转录体系组分影响后续Cas蛋白检测反应，降低了Crispr-Cas核酸检测试剂盒检测结果的非特异性，不易出现假阳性结果。
(4)本发明提供的gRNA体外转录体系应用于Crispr-Cas核酸检测试剂盒，无需额外提供RNA，有利于试剂盒的保存与运输，适用于各种靶核酸扩增方式，能够对各种病原微生物的现场快速高灵敏筛查，具有检测灵敏度高、特异性强、耗时短和稳定性好等优点，能够长期稳定保存。
附图说明
图1为本发明提供的能够长期稳定保存的Crispr-Cas核酸检测试剂盒的工作流程。
图2为本发明实施例1中DNaseI酶处理对体外转录gRNA的检测活性及特异性的影响。
图3为本发明对比例2中gDNA的不同长度的PloyA尾对体外转录的影响。
图4为本发明对比例3中磁珠吸附gRNA对Cas12a检测体系的影响；其中内容(A)、内容(B)分别为待测样本扩增方式是PCR扩增、RAA等温扩增时，磁珠吸附gRNA对Cas12a检测体系的影响。
图5为本发明实施例2中Crispr-Cas核酸检测试剂盒检测新冠假病毒的灵敏度和特异性；其中内容(A)、内容(B)、内容(C)分别为核酸扩增方式是逆转录+PCR、RT-PCR、RT-RAA时，检测灵敏度和特异性。
图6为本发明实施例3中Crispr-Cas核酸检测试剂盒检测猪腹泻病毒的灵敏度和特异性；其中内容(A)、内容(B)、内容(C)分别为核酸扩增方式是逆转录+PCR、RT-PCR、RT-RAA时，检测灵敏度和特异性。
图7为本发明实施例4中Crispr-Cas核酸检测试剂盒检测新冠阳性样品的灵敏度和特异性。
图8为本发明实施例5中Crispr-Cas核酸检测试剂盒的稳定性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
为缩短体外转录获得gRNA的时间，可以用于即时检验时快速生成gRNA，本发明提供了一种gRNA体外转录体系，包括核酸构建体和RNA聚合酶；所述核酸构建体包括GAATT序列、启动子序列、用于转录生成gRNA的模板序列和PloyA序列；一方面，所述GAATT序列位于所述核酸构建体的5’端，所述GAATT序列能够促进RNA聚合酶与启动子序列结合，促进体外转录；另一方面，所述PloyA序列位于所述核酸构建体的3’端，所述PloyA序列能够减弱小片段转录的抑制作用，提高体外转录活性。
为了有效减弱小片段转录的抑制作用，提高体外转录活性，缩短体外转录所需时间，一些实施例中，所述PloyA序列为An，n≥16。
较佳实施例中，所述PloyA序列为An，n≥24。
不受理论的限制，本发明中采用的启动子序列可以是任意在体外被所述RNA聚合酶识别、结合并开始转录而产生RNA的启动子序列，优选为T7启动子序列、T3启动子序列、U6启动子序列和SP6启动子序列中的一种或多种。
一些实施例中，所述T7启动子序列的结构为5’-TAATACGACTCACTATA-GY-3’或5’-TAATACGACTCACTATA-GY-AGA-3’，其中，Y为0-5的整数。较佳实施例中，Y为0-3的整数。最佳实施例中，Y为3。
一些实施例中，所述RNA聚合酶选自T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、U6 RNA聚合酶和Sp6 RNA聚合酶中的一种或多种。
一些实施例中，所述gRNA体外转录体系还包括用于合成gRNA的底物、缓冲剂和其他组分。
一些实施例中，所述用于合成gRNA的底物包括核苷单磷酸、核苷三磷酸、或其组合；所述缓冲剂可以是本领域中已知并且可用于本发明的任何特定或一般缓冲剂，包括但不限于Tris-HCl和磷酸盐缓冲液；所述其他组分包括但不限于无核酸酶水。
本发明所述gRNA体外转录体系以所述核酸构建体的一条链为模板，所述RNA聚合酶识别所述启动子序列并特异性结合，使所述启动子序列附近的双链解旋并解链，形成转录泡以促使所述用于合成gRNA的底物与所述核酸构建体的碱基配对，合成gRNA。
为降低检测结果的非特异性，一些实施例中，所述gRNA体外转录体系还包括固相载体，所述固相载体能够吸附gRNA。
较佳实施例中，所述固相载体可以为但不限于磁珠，所述磁珠通过与所述PloyA序列结合，吸附gRNA，从而有效去除转录反应体系其它组分。
较佳实施例中，所述磁珠为表面包被有Oligo dT的磁性聚合物微球，其能够偶联gRNA的PloyA结构，高效的从转录体系中分离出gRNA，从而有效去除转录反应体系其它组分。
本发明还提供了一种能够长期稳定保存的Crispr-Cas核酸检测试剂盒，其包括所述gRNA的体外转录体系，还包括Cas蛋白检测体系。
一些实施例中，所述Cas蛋白检测体系包括Cas蛋白和核酸探针。
不受理论的约束，本发明涉及的Cas蛋白可以是任意类型的Cas蛋白，例如但不限于Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b和Cas14。
不受理论的约束，本发明涉及的Cas12a蛋白可以是任意类型的Cas12a蛋白，例如但不限于FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a和Lb4Cas12a。
一些实施例中，本发明所述核酸探针含有可检测的标记物，当所述核酸探针被Cas蛋白切割后，能够产生可检测信号。
一些实施例中，所述可检测的标记物包括荧光团或生物素。一些实施例中，所述荧光团包括荧光基团和荧光淬灭基团，所述荧光基团例如但不限于FAM等，所述荧光淬灭基团例如但不限于BHQ1等。
一些实施例中，所述可检测信号包括荧光信号或生物素。
一些实施例中，所述核酸探针可以是但不限于单链DNA报告分子、双链DNA报告分子、单链RNA报告分子。较佳实施例中，所述核酸探针为单链DNA报告分子。
在本发明具体实施例中，所述单链DNA报告分子的序列为5’-TTTTTTTTATTT-3’。根据检测方式不同，所述单链DNA报告分子可采用不同的修饰方式：当用于检测荧光值时，其修饰方式为5’端标记荧光基团和3’端标记荧光淬灭基团；当用于免疫层析试纸检测，其修饰方式为5’端标记荧光基团和3’端标记生物素(Biotin)。其中，荧光基团例如但不限于FAM等，荧光淬灭基团例如但不限于BHQ1等。以Cas12a蛋白为例，当靶核酸、gRNA及Cas12a蛋白同时存在时，首先三者结合形成三元复合物，激活其顺式切割活性，当有Cas12a蛋白发生顺式切割，其反式切割活性被激活，切割单链DNA报告分子使探针的淬灭基团与荧光基团分离(或荧光基团与生物素分离)，使得Cas12a蛋白的切割作用被检测出来。
一些实施例中，所述Crispr-Cas核酸检测试剂盒还包括靶核酸扩增体系，所述靶核酸扩增体系包含扩增靶核酸的扩增引物对、用于合成靶核酸的底物、聚合酶和扩增所需的缓冲试剂。
一些实施例中，所述靶核酸扩增的方法可以使用任何适合的扩增技术，包括但不限于PCR扩增、RT-PCR扩增、LAMP扩增、RT-LAMP扩增、RPA扩增、RAA扩增、RT-RAA扩增、RT-RPA扩增、连接酶链式反应、分支DNA扩增、NASBA、SDA、转录介导扩增、滚环扩增、HDA、SPIA、NEAR、TMA和SMAP2。
一些实施例中，本发明并不对所述扩增所需的缓冲试剂进行限定，本领技术人员可以根据具体情况对扩增所需的缓冲试剂进行选择。
一些实施例中，所述聚合酶可以是本领域中已知并且可用于本发明的任何特定或一般聚合酶，所述聚合酶可以为DNA聚合酶，所述DNA聚合酶包括但不限于Pfu、KOD、Primerstar、Phusion、Bst DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Taq酶和Q5聚合酶。
一些实施例中，所述靶核酸可以是DNA，包括但不限于基因组DNA、线粒体DNA、病毒DNA、质粒DNA或合成的双链DNA。
一些实施例中，所述靶核酸可以是RNA，包括但不限于病毒RNA、信使RNA、核糖体RNA、转移RNA、微小RNA、短干扰RNA、小核RNA、合成RNA、长非编码RNA、微小RNA前体、病毒dsRNA和非病毒dsRNA。
一些实施例中，所述靶核酸的载体包括但不限于病毒、细菌、真菌、支原体、细胞、组织和器官等。
本发明还提供了所述Crispr-Cas核酸检测试剂盒用于生物样品和/或环境样品的靶核酸检测。
一些实施例中，所述生物样品、所述环境样品可以是食物样品(新鲜水果或蔬菜、肉)、饮料样品、纸表面、织物表面、金属表面、木材表面、塑料表面、土壤样品、淡水样品、废水样品、盐水样品、暴露于大气或其他气体样品，或它们的组合。如具体应用时，可以拭抹金属、木材、塑料、橡胶等的任何材料制成的家用/商业/工业表面并测试靶核酸。一些实施例中，还可以针对病原性细菌或寄生虫或者其他微生物的存在测试土壤样品，用于环境目的和/或用于人类、动物或植物疾病测试。一些实施例中，可以评估诸如淡水样品、废水样品或盐水样品的水样品的清洁度和安全性和/或可饮用性，以检测例如新型冠状病毒、猪腹泻病毒或其他病毒的存在。在其他实施方案中，所述生物样品可以获自以下来源：包括但不限于组织样品、唾液、血液、血浆、血清、粪便、尿液、痰液、粘液、淋巴、滑液、脑脊髓液、腹水、胸腔积液、血清肿、脓液，或皮肤或粘膜表面的拭子。
一些实施例中，所述核酸扩增体系还包括核酸提取剂、核酸释放剂、解旋酶和逆转录酶中的一种或多种。
一些实施例中，所述解旋酶可以是但不限于UvrD解旋酶、Rep解旋酶、PcrA解旋酶、大肠杆菌解旋酶I、大肠杆菌解旋酶II、大肠杆菌解旋酶III、大肠杆菌解旋酶IV、Rep解旋酶、DnaB解旋酶、PriA解旋酶、PcrA解旋酶、T4 Gp41解旋酶、T4 Dda解旋酶、SV40大T抗原、酵母RAD解旋酶、RecD解旋酶、RecQ解旋酶、热稳定性腾冲嗜热厌氧菌UvrD解旋酶、热稳定性嗜热栖热菌UvrD解旋酶、热稳定性水生栖热菌DnaB解旋酶、Dda解旋酶、乳头瘤病毒E1解旋酶、古细菌MCM解旋酶、真核MCM解旋酶和T7 Gp4解旋酶。
为了改善靶核酸的扩增，一些实施例中，所述核酸扩增体系还包括盐，诸如氯化镁(MgCl2)、氯化钾(KCl)或氯化钠(NaCl)。
一些实施例中，所述核酸扩增体系还包括生物或化学反应的其他组分，所述生物或化学反应的其他组分可以包括细胞裂解组分以使细胞破开或溶解以供分析其中的物质。所述细胞裂解组分可以包括但不限于洗涤剂或如上所述的盐。
一些实施例中，所述Crispr-Cas核酸检测试剂盒还可以包括用于纯化样品中的靶核酸的试剂、容器、对照物(阴性或阳性对照)、缓冲剂、助剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。一些实施例中，所述核酸检测试剂盒还可以包括使用说明书。
本发明还提供了所述Crispr-Cas核酸检测试剂盒在检测或辅助检测病毒核酸中的应用。该应用不限于检测DNA病毒、RNA病毒。一些实施例中，DNA病毒可以为痘病毒、杆状病毒等，RNA病毒可以为水疱疹性口炎病毒、猪腹泻病毒、新型冠状病毒等。
另外，本发明还提供了一种利用所述核酸检测试剂盒检测或辅助检测病毒核酸的方法，如图1所示，包括如下步骤：
S1、利用gRNA体外转录体系将gDNA核酸模板体外转录生成gRNA；
S2、利用靶核酸扩增体系对靶核酸进行扩增，得到扩增产物；
S3、将所述gRNA、所述扩增产物加入到Cas蛋白检测体系中并混合，进行Cas蛋白酶切反应，然后进行检测结果判读。
一些实施例中，步骤S1中，所述体外转录生成gRNA的时间小于30min，能够用于现场检测时快速生成所述gRNA。
本发明待检测样品可以直接是核酸样品，也可以是病毒样品。若检测病毒样品，一些实施例中，步骤S2中，还包括采用病毒核酸提取试剂盒先抽提病毒样品中的核酸，或者用免提取方式先直接将病毒样品浸入核酸释放剂中，通常常温反应5min～10min即可释放出病毒核酸，然后再进行后续的扩增。
一些实施例中，步骤S3中，所述Cas蛋白酶切反应的条件为37℃反应5min～40min，本领域技术人员可根据具体情况选自合适的方法进行检测结果判读，可以利用荧光定量PCR仪、蓝光或紫外光照或者胶体金免疫层析试纸进行检测结果判读，但不限于此。如进行蓝光或紫外光照显色检测时：若光照后反应管中为绿色，则结果为阳性；若光照后反应管中无色透明，则结果为阴性。如进行胶体金免疫层析试纸检测：若C线弱带(或无带)且T线有带，则结果为阳性；若C线有带且T线无带，则结果为阴性。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
本发明实验中所使用的病毒：
①本实验室根据新冠病毒Severe acute respiratory syndrome coronavirus2isolate Wuhan-Hu-1,complete genome NCBI Reference Sequence NC_045512.2基因组orf1ab基因序列，自主生产的对应orf1ab基因的慢病毒毒株；
②新冠样本取自新冠大流行时期本实验室新冠阴性人员和阳性患者；
③本实验室自主生产的Porcine epidemic diarrhea virus strain NW8,complete genome的猪腹泻病毒珠。
实施例1高效体外转录方法的建立及活性检测
1.根据新冠病毒Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2isolateWuhan-Hu-1,complete genome NCBI Reference Sequence NC_045512.2基因组的ORF1AB基因设计sgRNA，序列见表1，该sgRNA序列同本单位的专利文献(CN115948614A)，并设计其检测引物和gDNA(Cas12a)扩增引物。
表1ORF1AB基因的检测引物和gDNA(Cas12a)扩增引物的序列表
2.gDNA模板制备
2.1gDNA由生物公司合成；
2.2PCR扩增并胶回收纯化制备
1)使用引物对T7 promoter-F和ORF1AB-sgRNA-R进行PCR扩增，模板为CC265质粒，该质粒包含T7启动子和Cas12a蛋白结合的锚定序列，COV31质粒为本实验自行构建并保存。扩增反应条件为退火温度60℃。
2)gDNA模板胶回收：PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶进行电泳检测，切割目标片段，使用Axgen胶回收试剂盒胶回收，胶回收实验流程详见其说明书，并测定其回收浓度，4℃存储，用于后续体外转录。
3.检测模板DNA制备
3.1使用引物对ORF1AB-F和ORF1AB-R，模板为质粒COV31，该质粒上包含新冠病毒ORF1AB基因序列，扩增条件同本实施例步骤2。
3.2检测模板胶回收PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶进行电泳检测，切割目标片段，使用Axgen胶回收试剂盒胶回收，胶回收实验流程参照其说明书，并测定其回收浓度。
4.gRNA体外转录生成
4.1配制体外转录混合体系：1μL 10×reaction buffer，1μL ATP，1μL UTP，1μLGTP，1μLCTP，1μL T7 RNA Polymerase Mix；加入gDNA 50ng，补Nuclease-free water至10μL混匀，配制两组体系，37℃，10min。
4.2转录体系灭活将上述转录的体外转录RNA溶液一组加入DNaseI酶，37℃，10min，75℃，10min；另一组不加入DNaseI酶，75℃，10min。
4.3Oligo DT磁珠吸附：取5μL Oligo DT磁珠去除保存液后加入10μL的结合液并加入到上述不加入DNaseI酶的转录的RNA溶液中，室温反应5min，边反应边摇匀。使磁珠与RNA充分结合，加入磁力吸附磁珠，并弃溶液，加入10μL Nuclease-free water溶解gRNA。
5.Cas蛋白检测体系检测gRNA转录活性
5.1Cas蛋白检测反应体系：Cas蛋白检测体系为250nM Cas12a蛋白，2μL 10×NEBuffer2.1，500nM 2μL单链DNA报告分子(5’FAM-TTTTTTTTATTT-3’BHQ1)；加入1μL磁珠处理后的gRNA，10ng ORF1AB检测靶标DNA，并补Nuclease-free water至20μL混匀。未加入DNA的组别作为阴性对照。
5.2Cas蛋白检测结果判读：使用荧光定量仪进行Cas蛋白检测及荧光信号读取。反应液在37℃环境下反应30min，每分钟采集一次荧光信号，根据荧光信号强度来判定转录的gRNA是否具备活性。
6.实验结果
如图2所示，体外转录体系未加入DNaseI酶处理的活性与加入DNaseI酶处理的阳性样本相对荧光强度(ΔRFU)比较接近，说明其切割活性相近，而未加入DNaseI酶处理的活性与加入DNaseI酶处理的阴性样本相对荧光强度(ΔRFU)小于1000，说明两种方案的非特异性极好，说明使用oligoDT磁珠吸附RNA的方案无需加入DNaseI酶其检测活性和特异性极好，后续体外转录可。
对比例1不同T7 Promoter修饰对转录活性的影响
1.设计不同修饰的T7 Promoter序列，如表2所示。
表2不同修饰的T7 Promoter序列
| 名称 | 序列 | 备注 |
| T7-P1 | 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’ | 启动子I型 |
| T7-P2 | 5’-GAATTTAATACGACTCACTATAGGG-3’ | 启动子I型，上游加GAATT |
| T7-P3 | 5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3’ | 启动子I型，上游加GAAAT |
| T7-P4 | 5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’ | 启动子II型 |
| T7-P5 | 5’-GAATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’ | 启动子II型，上游加GAATT |
| T7-P6 | 5’-TAATACGACTCACTCCGGCAATC-3’ | 启动子III型 |
| T7-P7 | 5’-GAATTTAATACGACTCACTCCGGCAATC-3’ | 启动子III型，上游加GAATT |
| T7-P8 | 5’-TAATACGACTCACAATCGCGGAG-3’ | 启动子IV型 |
| T7-P9 | 5’-GAATTTAATACGACTCACAATCGCGGAG-3’ | 启动子IV型，上游加GAATT |
2.根据新冠病毒Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2isolateWuhan-Hu-1，complete genome NCBI Reference Sequence NC_045512.2基因组orf1ab基因序列设计的高效低脱靶的Orf1ab-sgRNA序列，不同修饰的T7 Promoter序列所对应的gDNA如表3所示。
表3不同修饰的T7 Promoter序列所对应的gDNA序列
3.体外转录使用上述gDNA模板进行体外转录
3.1配制体外转录混合体系：1μL 10×reaction buffer，1μL ATP，1μL UTP，1μLGTP，1μLCTP，1μL T7 RNA Polymerase Mix；加入gDNA 20ng，补Nuclease-free water至10μL，混匀在以下体系中37℃反应10min。
3.2DNaseI酶降解gDNA：在步骤3.1中添加1μL DNaseI酶，37℃反应10min。
3.3DNaseI酶失活：采用高温变性酶的方法，将步骤3.2中反应体系75℃处理10min，使DNaseI酶变性失活。
4.体外转录RNA定量检测
1)使用Quant-iTTMRiboGreenTMRNA Reagent and Kit(Invitrogen，R11491)试剂盒进行定量检测，取1μL转录产物稀释到99μL 1×TE Buffer，加入100μL的Quant-iTTMRiboGreenTMRNA工作液；
2)RNA标曲制备：取一支纯化的RNA，并将该RNA稀释至2μg/ml，按说明书对RNA进行标曲加样，并加入100μL的Quant-iTTMRiboGreenTMRNA工作液，使其终浓度分别为1μg/mL、500ng/mL、100ng/mL、20ng/mL；
3)将待测液和标曲样本加入荧光微孔板中，使用ID3多功能酶标仪和标准荧光素波长(激发波长为480nm，发射波长为520nm)测定样品荧光强度，根据标曲的荧光强度与浓度得出其曲线及对应线性关系方程式，然后换算待测样品的浓度。
5.实验结果
表4不同修饰的T7 Promoter序列转录活性
| gDNA | RNA | 与Orf1ab-T7-P3-gDNA1的效率比 |
| Orf1ab-T7-P1-gDNA1 | 0.962 | 92.06％ |
| Orf1ab-T7-P2-gDNA1 | 1.336 | 127.85％ |
| Orf1ab-T7-P3-gDNA1 | 1.045 | 100.00％ |
| Orf1ab-T7-P4-gDNA1 | 1.019 | 97.52％ |
| Orf1ab-T7-P5-gDNA1 | 1.247 | 119.41％ |
| Orf1ab-T7-P6-gDNA1 | 0.056 | 5.38％ |
| Orf1ab-T7-P7-gDNA1 | 0.095 | 9.06％ |
| Orf1ab-T7-P8-gDNA1 | 0.028 | 2.67％ |
| Orf1ab-T7-P9-gDNA1 | 0.080 | 7.69％ |
由表4可以看出，设计的9组T7启动子中转录产量比较发现，ORF1AB-T7-P2转录活性最优、Orf1ab-T7-P5转录活性次之，即T7启动子序列为GAATTTAATACGACTCACT ATAGGG时转录活性最佳，后续选择该启动子。
对比例2gDNA的PloyA尾对体外转录的影响
1.设计不同长度的PloyA尾，如表5所示。
表5不同长度的PloyA尾的gDNA序列
2.体外转录：上述所有gDNA模板与对比例1中的所有gDNA模板进行体外转录，转录方案同对比例1中步骤3。
3.体外转录RNA浓度定量：定量方案同对比例1步骤4。
4.实验结果
如图3所示，启动子的转录产物浓度gDNA1>gDNA2>gDNA3，说明gDNA模板的ployA尾转录效率A24>A16>A0，加入PloyA尾可以有效的提高体外转录活性，其中gDNA模板Orf1ab-T7-P2-gDNA1与Orf1ab-T7-P2-gDNA3之比约3.5，说明启动子加PloyA24的转录效率是不加PloyA尾的350％。由此可知：gDNA模板为GAATTTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATN23A24时转录活性最优，可高效的体外转录出gRNA。
对比例3Oligo DT磁珠吸附gRNA减小非特异性
1.RNA体外转录
1.1配制体外转录混合体系：1μL 10×reaction buffer，1μL ATP，1μL UTP，1μLGTP，1μLCTP，1μL T7 RNA Polymerase Mix；加入gDNA 50ng，补Nuclease-free water至10μL，混匀在以下体系中37℃反应10min；
1.2Oligo DT磁珠吸附：取5μL Oligo DT磁珠去除保存液后加入10μL的结合液并加入到转录的RNA溶液中，反应5min，边反应边摇匀。使磁珠与RNA充分结合，加入磁力吸附磁珠，并弃溶液，加入10μL Nuclease-free water溶解gRNA。
2.检测样本制备待测样品为质粒COV-31及H2O
2.1PCR扩增：体系配制2×Max Master Mix(Dye Plus)25μL，表1中ORF1AB-F和ORF1AB-R各0.4μM，分别加入质粒COV-31及H2O，补水至50μL进行扩增。扩增程序：95℃3min；95℃10s、60℃10s、72℃10s，共进行35个循环。
2.2RAA等温扩增：采用杭州众测基础型RAA核酸扩增试剂盒。反应体系：Buffer A25μL，Buffer B 2.5μL，表1中的引物ORF1AB-F和ORF1AB-R各0.4μM，分别加入质粒COV-31及H2O，并加Nuclease-free water至50μL，扩增反应条件为39℃30min。
3.Cas蛋白检测
Cas蛋白检测反应体系：Cas蛋白检测体系为250nM Cas12a蛋白，2μL 10×NEBuffer 2.1，500nM 2μL单链DNA报告分子，2μL本实施例步骤2.1或步骤2.2的扩增产物，1μL转录的gRNA，gRNA为本实施例步骤1.2处理的gRNA溶液，并补Nuclease-free water至20μL混匀。荧光检测方法同实施例1步骤5。
4.实验结果
如图4内容(A)、图4内容(B)所示，COV31为阳性样本，H2O为阴性样本。阳性样本，PCR产物磁珠吸附后的gRNA与体外转录gRNA原液的荧光增量差值小于2000；而阴性样本，PCR产物磁珠吸附后的gRNA与体外转录gRNA原液的荧光增量差值大于3000，RAA等温扩增产物磁珠吸附后的gRNA与体外转录gRNA原液的荧光增量差值大于8000。结果表明，加入oligoDT磁珠后显著提高了Cas12a检测体系的特异性。
实施例2新冠假病毒快速检测灵敏度和特异性
1.病毒核酸处理
1.1病毒预处理：取1管本实验室自行生产的慢病毒编号为Lv 1774，其中包装了新冠病毒Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2isolate Wuhan-Hu-1,complete genome NCBI Reference Sequence NC_045512.2基因组的orf1ab基因序列，其病毒滴度为2.00e+08TU/ml。先使用全能核酸酶消化病毒中的核酸，后高温灭活全能核酸酶。
1.2病毒稀释：使用百泰克的核酸样本释放剂(用于病毒核酸释放)进行稀释病毒液，依次稀释至1.00e+07、1.00e+06、1.00e+05、1.00e+04、1.00e+03、1.00e+02、1.00e+01、1.00e+00TU/ml，常温放置10min。
2.核酸扩增
2.1逆转录+PCR扩增：
1)逆转录：试剂盒为PrimeScriptTMRT reagent Kit(TAKARA，RR037A)配置10ul逆转录反应体系，2μL 5X PrimeScript Buffer(for Real Time)，0.5μL PrimeScript RTEnzyme Mix I，0.5μL Oligo dT Primer(50μM)*1，5μL RNase Free dH2O，2μL逆转录模板，模板为本实施例步骤1.2中所述的所有样品、Nuclease-free water(NTC)、杆状病毒基因组(AcMNPV)及新冠假病毒(阳性样本)提取的RNA；反应条件：37℃15min，85℃5s。
2)PCR扩增：2×Max Master Mix(Dye Plus)25μL，表1中的引物ORF1AB-F和ORF1AB-R各0.4μM，以上述所有的逆转录产物为模板，补Nuclease-free water至50μL进行扩增。扩增程序：95℃3min；95℃10s、60℃10s、72℃10s，共进行35个循环。
2.2RT-PCR扩增：PCR扩增酶为PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(TAKARA，RR055A)；配置50μL PCR反应液，25μL 2X 1Step Buffer，2μL PrimeScript 1StepEnzyme Mix，表1中的引物ORF1AB-F和ORF1AB-R各0.4μM，模板为本实施例步骤1.2中所述的所有样品、Nuclease-free water(NTC)、杆状病毒基因组(AcMNPV)及新冠假病毒(阳性样本)提取的RNA，并加Nuclease-free water至50μL，进行扩增。扩增程序：50℃15min；95℃3min；95℃10s、60℃10s、72℃10s，共进行35个循环。
2.3RT-RAA扩增：RAA等温扩增采用杭州众测基础型RAA核酸扩增试剂盒。反应体系：Buffer A 25μL，Buffer B 2.5μL，表1中的引物ORF1AB-F和ORF1AB-R各0.4μM，本实施例步骤1.2中所述的所有样品、Nuclease-free water(NTC)、杆状病毒基因组(AcMNPV)及新冠假病毒(阳性样本)提取的RNA，并加Nuclease-free water至50μL，进行扩增，扩增反应条件为39℃30min。
3.gRNA体外转录生成Orf1ab-gRNA转录及后处理方式同实施例1步骤4。
4.Cas蛋白检测灵敏度
Cas蛋白检测反应体系：Cas蛋白检测体系为250nM Cas12a蛋白，2μL 10×NEBuffer 2.1，500nM 2μL单链DNA报告分子；加入1μL gRNA，2μL本实施例步骤2中的核酸扩增产物，阴性样本为H2O，并补Nuclease-free water至20μL混匀。荧光检测方法同实施例1步骤5。
5.实验结果
结果判定标准：其中PCR和RT-PCR扩增的样品的荧光检测结果ΔRFU大于5000为阳性，ΔRFU小于3000为阴性；RT-RAA等温扩增的荧光检测结果ΔRFU大于10000为阳性，ΔRFU小于8000为阴性。如图5内容(A)、图5内容(B)、图5内容(C)所示，其中扩增方式为PCR和RT-PCR时检测灵敏度为1E+00TU/ml，扩增方式为RT-RAA时检测灵敏度为1E+01TU/ml，上述结果表明，运用本发明提供的Crispr-Cas核酸检测试剂盒，能够实现低至1E+00TU/ml的新冠假病毒的检出，且适用于各种核酸扩增方法。
实施例3猪腹泻病毒快速检测灵敏度和特异性
1.针对Porcine epidemic diarrhea virus strain NW8,complete genome基因组设计特异性的sgRNA，该序列同本单位的发明专利CN115948614A，并设计其检测引物和gDNA(Cas12a)扩增引物，序列如表6所示，并根据实施例1的方法制备gDNA模板。
表6PEDV的检测引物和gDNA(Cas12a)扩增引物序列
2.病毒核酸处理
2.1病毒预处理：取1管本实验室自行生产的猪腹泻病毒液，其病毒滴度为5.00e+06TU/ml，先使用全能核酸酶消化病毒中的核酸，后高温灭活全能核酸酶。
2.2病毒稀释：使用百泰克的核酸样本释放剂(用于病毒核酸释放)进行稀释病毒液，依次稀释至1.00e+06、1.00e+05、1.00e+04、1.00e+03、1.00e+02、1.00e+01、1.00e+00TU/ml，常温放置10min。
3.核酸扩增
3.1逆转录+PCR扩增：
1)逆转录：试剂盒为PrimeScriptTMRT reagent Kit(TAKARA，RR037A)，配置10μL逆转录反应体系，2μL 5X PrimeScript Buffer(for Real Time)，0.5μL PrimeScript RTEnzyme Mix I，0.5μL Oligo dT Primer(50μM)*1，5μL RNase Free dH2O，2μL逆转录模板，模板为本实施例步骤2.2中所述的所有样品、Nuclease-free water(NTC)、杆状病毒基因组(AcMNPV)及PEDV病毒(阳性样本)提取的RNA；反应条件：37℃15min，85℃5s。
2)PCR扩增：2×Max Master Mix(Dye Plus)25μL，表6中PEDV F和PEDV R各0.4μM，以上述所有的逆转录产物为模板，补Nuclease-free water至50μL进行扩增。扩增程序：95℃3min；95℃10s、60℃10s、72℃10s，共进行35个循环。
3.2RT-PCR扩增：PCR扩增酶为PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(TAKARA，RR055A)；配置50μL PCR反应液，25μL 2X 1Step Buffer，2μL PrimeScript 1StepEnzyme Mix，表6中的引物PEDV F和PEDV R各0.4μM，模板为本实施例步骤2.2中所述的所有样品、Nuclease-free water(NTC)、杆状病毒基因组(AcMNPV)及PEDV病毒(阳性样本)提取的RNA，并加Nuclease-free water至50μL，进行扩增。扩增程序：50℃15min；95℃3min；95℃10s、60℃10s、72℃10s，共进行35个循环。
3.3RT-RAA扩增：RAA等温扩增采用杭州众测基础型RAA核酸扩增试剂盒。反应体系：Buffer A 25μL，Buffer B 2.5μL，表6中的引物PEDV F和PEDV R各0.4μM，模板为本实施例步骤2.2中所述的所有样品、Nuclease-free water(NTC)、杆状病毒基因组(AcMNPV)及PEDV病毒(阳性样本)提取的RNA，并加Nuclease-free water至50μL，进行扩增，扩增反应条件为39℃30min。
4.gRNA体外转录生成PEDV-gRNA转录及后处理方式同实施例1步骤4。
5.Cas蛋白检测灵敏度
Cas蛋白检测反应体系：Cas蛋白检测体系为250nM Cas12a蛋白，2μL 10×NEBuffer 2.1，500nM单链DNA报告分子；加入1μL gRNA，2μL本实施例中步骤3的所有扩增产物，并补Nuclease-free water至20μL混匀。荧光检测方法同实施例1步骤5。
6.实验结果
结果判定标准：其中PCR和RT-PCR扩增的样品的荧光检测结果ΔRFU大于5000为阳性，ΔRFU小于3000为阴性；RT-RAA等温扩增的荧光检测结果ΔRFU大于10000为阳性，ΔRFU小于8000为阴性。如图6内容(A)、图6内容(B)、图6内容(C)所示，其中扩增方式为PCR和RT-PCR时，检测灵敏度为1E+00TU/ml，RT-RAA扩增方式为1E+01TU/ml。可以看出，运用本发明提供的Crispr-Cas核酸检测试剂盒能够实现低至1E+00TU/ml猪腹泻病毒的检出，且适用于各种核酸扩增方法。
实施例4新冠阳性样品的检测
1.病毒核酸处理
病毒来源：取至本实验室新冠阳性患者的鼻拭子，本次采集的鼻拭子共计10个，采样情况为1号、4号、6号、8号、10号采样时为阳性患者，7号采样后第二天核酸阳性，2号、3号、5号、9号采样后一周内核酸为阴性。
病毒样品处理：将采集的鼻拭子放入百泰克的核酸样本释放剂中，室温放置10min，95℃处理10min，灭活病毒。
2.核酸扩增
RT-PCR扩增：其中PCR扩增酶为PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(TAKARA，RR055A)；配置50μL PCR反应液，25μL 2X 1Step Buffer，2μL PrimeScript 1StepEnzyme Mix，表1中的引物ORF1AB-F和ORF1AB-R各0.4μM，模板为本实施例步骤1中所述的所有样品、新冠假病毒(阳性样本)1.00e+06TU/ml，并加Nuclease-free water至50μL，进行扩增。扩增程序：50℃15min；95℃3min；95℃10s、60℃10s、72℃10s，共进行35个循环。
3.gRNA体外转录生成Orf1ab-gRNA转录及后处理方式同实施例1步骤4。
4.Cas蛋白检测灵敏度
Cas蛋白检测反应体系：Cas蛋白检测体系为250nM Cas12a蛋白，2μL 10×NEBuffer 2.1，500nM单链DNA报告分子；加入1μL gRNA，2μL步骤2中的RT-PCR扩增，阴性样本为H2O，并补Nuclease-free water至20μL混匀。荧光检测方法同实施例1步骤5。
5.实验结果
如图7所示，RT-PCR扩增产物的荧光检测结果ΔRFU大于5000为阳性，ΔRFU小于3000为阴性；其中1号、4号、6号、7号、8号、10号为阳性，2号、3号、5号、9号为阴性。阳性判定结果与临床样本检测结果一致。结果表明，本发明提供的Crispr-Cas核酸检测试剂盒能够实现对临床鼻拭子中新冠病毒核酸的灵敏、快速、准确检测。
实施例5稳定性实验
1.病毒核酸处理病毒处理及稀释方案同实施例2步骤1。
2.RT-PCR扩增：PCR扩增酶为PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(TAKARA，RR055A)；配置50μL PCR反应液，25μL 2X 1Step Buffer，2μL PrimeScript 1Step EnzymeMix，表1中的引物ORF1AB-F和ORF1AB-R各0.4μM，模板为实施例2中步骤1.2中所述的所有样品、Nuclease-free water(NTC)及新冠假病毒(阳性样本)提取的RNA，补Nuclease-freewater至50μL，进行扩增。扩增程序：50℃15min；95℃3min；95℃10s、60℃10s、72℃10s，共进行35个循环。
3.gRNA体外转录
gDNA模板为取至6个月前扩增并胶回收纯化储存在4℃冰箱的gDNA，生成orf1ab-gRNA转录及后处理方式同实施例1步骤4。
4.Cas蛋白检测灵敏度
Cas蛋白检测反应体系：Cas蛋白检测体系按比例250nM Cas12a蛋白，2μL 10×NEBuffer2.1，500nM单链DNA报告分子制成冻干粉保存于4℃冰箱，本实施例的Cas蛋白检测反应体系为取至2个月前的冻干粉。
检测反应体系按如下方法配制1μL gRNA，250nM Cas12a蛋白，2μL 10×NEBuffer2.1，500nM单链DNA报告分子，2μL RT-PCR扩增产物，Nuclease-free water加至10μL反应混合液。荧光检测方法同实施例1步骤5。
5.实验结果
如图8所示，将gDNA模板放置于4冰箱保存6个月后用于体外转录，Cas蛋白反应体系冻干粉并用于体外转录其检测灵敏度可达1.00E+00TU/ml；与实施例2的检测结果一致，说明本发明提供的Crispr-Cas核酸检测试剂盒稳定性好，能够有效的用于现场检测。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种gRNA体外转录体系，其特征在于，包括核酸构建体和RNA聚合酶；所述核酸构建体包括GAATT序列、启动子序列、用于转录生成gRNA的模板序列和PloyA序列；
其中，所述GAATT序列位于所述核酸构建体的5’端；所述PloyA序列位于所述核酸构建体的3’端，所述PloyA序列为An，n≥16；所述启动子序列选自T7启动子序列、T3启动子序列和SP6启动子序列中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的gRNA体外转录体系，其特征在于，所述T7启动子序列的结构为：5’-TAATACGACTCACTATA-GY-3’或5’-TAATACGACTCACTATA-GY-AGA-3’，其中，Y为0-5的整数。
3.根据权利要求1所述的gRNA体外转录体系，其特征在于，所述RNA聚合酶选自T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的gRNA体外转录体系，其特征在于，所述gRNA的体外转录体系中还包括固相载体、用于合成gRNA的底物和缓冲剂；所述固相载体能够吸附gRNA。
5.一种能够长期稳定保存的Crispr-Cas核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至4任一项所述的gRNA体外转录体系，还包括Cas蛋白检测体系。
6.根据权利要求5所述的Crispr-Cas核酸检测试剂盒，其特征在于，所述Cas蛋白检测体系包括Cas蛋白和核酸探针，所述Cas蛋白包括Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b和Cas14中的一种或多种；所述核酸探针含有可检测的标记物，当所述核酸探针被Cas蛋白切割后，能够产生可检测信号；所述可检测的标记物包括荧光团或生物素；所述可检测信号包括荧光信号或生物素。
7.根据权利要求5所述的Crispr-Cas核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试剂盒还包括靶核酸扩增体系，所述靶核酸扩增体系包括扩增靶核酸的扩增引物对、用于合成靶核酸的底物、聚合酶和扩增所需的缓冲试剂。
8.根据权利要求7所述的Crispr-Cas核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增体系还包括核酸提取剂、核酸释放剂、解旋酶和逆转录酶中的一种或多种。
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Non-Patent Citations (2)
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