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CN117122695A - 一种靶向活化cd44分子的透明质酸功能化偶联物及制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向活化cd44分子的透明质酸功能化偶联物及制备方法和应用 Download PDF

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CN117122695A
CN117122695A CN202310611990.1A CN202310611990A CN117122695A CN 117122695 A CN117122695 A CN 117122695A CN 202310611990 A CN202310611990 A CN 202310611990A CN 117122695 A CN117122695 A CN 117122695A
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马茜
孙洁芳
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Beijing Inno Medicine Co ltd
Original Assignee
Beijing Inno Medicine Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种靶向活化CD44分子的透明质酸功能化偶联物，该偶联物具有式(1)所示的结构。所述透明质酸功能化偶联物具有传统药物无法实现的精准诊断和逆转斑块的效果，实现了透明质酸和活性物质的强强联合，与口服降酯药物相比具有其难以实现的逆转斑块效果和更低的系统毒性。

Description

一种靶向活化CD44分子的透明质酸功能化偶联物及制备方法 和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种靶向活化CD44分子的透明质酸功能化偶联物。本发明还涉及该透明质酸功能化偶联物的制备方法和用途。
背景技术
急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)是以冠状动脉粥样硬化斑块破裂或侵袭，继发完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合征。急性冠状动脉综合征是一种常见的严重的心血管疾病，是冠心病的一种严重类型。它包括急性ST段抬高性心肌梗死、急性非ST段抬高性心肌梗死和不稳定型心绞痛(UA)。其中，以急性ST段抬高性心肌梗死为主的心血管疾病已成为危害人类健康的头号杀手。据统计，全世界每年约有2千万人死于急性心肌梗死。在中国，情况同样不容乐观，每年有近100万人死于急性心肌梗死，急性心肌梗死已成为严重威胁我国居民健康的重要疾病之一。此外，急性冠状动脉综合征的突发性和难以预期也是临床诊断和治疗的一大难题。有研究表明，大部分的急性心肌梗死是由易损斑块引起的。现代医学认为，炎性反应贯穿于易损斑块形成、破裂以及血栓出现急性冠状动脉综合征的全过程。
易损斑块(vulnerable plaque，VP)，又称为“不稳定斑块(unstable plaque)”，最早在1989年由哈佛医学院Muller正式提出，是指易于形成血栓并极有可能触发一系列不良心脏事件的斑块。之后2003年Naghavi提出“易损斑块”具有血栓倾向并发展迅速，可能成为“罪犯斑块”的粥样硬化斑块，主要包括破裂斑块、侵蚀性斑块和部分钙化结节性病变。易损斑块的特点是不稳定，易于破裂，形成血栓导致不良心血管事件的发生。Naghavi等给出了易损斑块的组织学定义和标准(M Naghavi,MMadjid,MR Khan,RM Mohammadi,JTWillerson,SW Casscells,New developments in the detection of vulnerableplaque,Curr Atheroscler Rep2001,3(2):125-35.)。主要的标准包括活动性炎症、薄的纤维帽和大的脂质核心、内皮剥脱伴表面血小板聚集、斑块有裂隙或损伤以及严重的狭窄。次要的标准包括表面钙化斑、黄色有光泽的斑块、斑块内出血和正性重构。因此，对于易损斑块而言，早期干预至关重要。但是由于一般情况下易损斑块所导致的血管狭窄程度并不高，很多患者没有前期征兆，使得其危险性极高。因此，如何尽早准确的识别和诊断易损斑块，从而有效的预防和治疗急性心肌梗死成为本领域中亟待解决的问题。
目前，治疗易损斑块的方法主要是全身给药，例如口服他汀类药物(例如羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂)、阿司匹林、基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂和/或贝特类药物等。这些药物通过调节全身血脂、对抗炎症、抑制蛋白酶和血小板生成等来减少斑块内的脂质，改善血管重构，从而起到稳定斑块的作用。然而，临床应用中发现目前用于治疗易损斑块的药物的治疗效果并不理想。例如，临床常用的他汀类药物的口服给药生物利用度比较低，如辛伐他汀生物利用度＜5％，阿托伐他汀约12％，瑞舒伐他汀约为20％。动物实验也证实，当他汀类药物的剂量增加到1mg/kg以上时才可以起到增加纤维帽厚度和减少斑块体积的作用，且目前临床试验也已经证实，口服他汀类药物治疗易损斑块需要采用强化大剂量才能具有稳定易损斑块的作用，而全身大剂量使用他汀类药物治疗会存在严重副作用，例如导致肝功能异常、横纹肌溶解、II型糖尿病发生率升高，这使得他汀类药物的口服给药的稳定性和逆转斑块的效果遭遇了瓶颈。
另一方面，诊断易损斑块的技术主要包括冠状动脉造影、血管内超声(IVUS)、光学相干断层扫描(OCT)等，但这些技术均属于有创性的检查，并且诊断分辨率和准确性不高，同时这些诊断技术费用昂贵，也在一定程度上限制了临床上的普及。
靶向给药系统可以使药物在目标病变部位形成相对较高的浓度，并减少血液循环中的药量，从而在提高药效的同时抑制毒副作用，减少对正常组织和细胞的伤害。在易损斑块的诊断和治疗领域中，现有技术为利用靶向配体修饰的纳米载体来诊断易损斑块。然而，此类易损斑块的靶向探针在临床实际应用中的主要问题在于所述靶向给药系统的靶向位点的特异性不足。例如，此类靶向给药系统的靶向位点大多选择巨噬细胞，但由于巨噬细胞存在于身体各处，导致靶向探针的靶向特异性不够理想。因此，寻找到能够特异性靶向易损斑块内的细胞的靶向给药系统在本领域仍存在迫切需求。
CD44分子是一类跨膜蛋白多糖黏附分子，被证明广泛分布于淋巴细胞、单核细胞、内皮细胞等细胞的表面。基于表达细胞的活化状态，可以将CD44分子分为相对静止状态、诱导活化状态和结构活跃状态。本发明发明人发现，与正常细胞相比，易损斑块中的细胞诸如内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞等的表面的CD44会被易损斑块的微环境(诸如在炎症因子的影响下)所诱导活化。这一发现提示，易损斑块处的细胞表面存在的大量活化的CD44分子为以识别CD44的靶向给药系统提供了理想的靶位。
现有技术中靶向活化CD44分子的纳米载体递送系统，表面部分地被靶向配体修饰，所述靶向配体是能与活化的CD44分子特异性结合的配体，所述纳米载体递送系统可用于易损斑块或与易损斑块相关的疾病的诊断、预防和治疗。但现有技术中的纳米载体递送系统在药物的靶向效率、药物的利用率和对细胞的毒副作用等方面还不是非常理想。因此，寻找到一种具有较高靶向效率、较高的药物利用率和较低细胞毒性的靶向给药系统在本领域中显得尤为急迫。
发明内容
针对上述需求，本申请发明人提供了一种具有较高靶向效率、较高的药物利用率和/或较低细胞毒性的靶向活化CD44分子的透明质酸功能化偶联物、相应的药物组合物、其制备方法及应用。
第一方面，本发明提供了一种靶向活化CD44分子的透明质酸功能化偶联物，所述透明质酸功能化偶联物具有式(1)所示的结构：
其中：
HA为透明质酸；
D为活性物质，所述活性物质选自他汀类药物、细胞毒性药物、抗炎药物、激素类药物、核酸药物、NLRP 3抑制剂、PPARγ激动剂、放射性核素、光敏分子或示踪剂；
L为任意能够将所述透明质酸和所述活性物质连接的连接子；
n为1-100的整数。
第二方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明的靶向活化CD44分子的透明质酸功能化偶联物和药学上可接受的辅料。
第三方面，本发明提供了本发明的靶向活化CD44分子的透明质酸功能化偶联物或药物组合物在制备用于治疗和/或预防CD44活化相关病理状况或疾病的药物中的应用。
第四方面，本发明提供了本发明的靶向活化CD44分子的透明质酸功能化偶联物的制备方法。
第五方面，本发明提供了一种治疗CD44活化相关病理状况或疾病的方法，该方法包括向患有该疾病的患者给予本发明的透明质酸功能化偶联物或药物组合物。
第六方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含本发明的透明质酸功能化偶联物或药物组合物。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每一单独的出版物、专利或专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。
有益效果
本发明提供的用于靶向活化CD44分子的透明质酸功能化偶联物具有传统靶向药物无法实现的精准诊断和逆转斑块的效果，特别是活性物质与透明质酸通过一段可被细胞内组织蛋白酶选择性裂解的连接子连接，实现了透明质酸和活性物质的强强联合，与口服降脂药物相比，具有其难以实现的逆转斑块效果，并具有更低的毒性。
本发明的透明质酸功能化偶联物在进入体内后，经透明质酸的靶向作用将活性物质富集于CD44高表达的易损斑块组织，连接子的多肽部分被蛋白酶降解后，释放药物，从而实现诊断和/或治疗作用。
本发明的透明质酸功能化偶联物可以选择性在易损斑块的特殊时间完成活性物质定点释放，在提升活性物质治疗效果的同时，还能很好的降低药物的毒副作用。
由此说明，本发明提供的用于靶向活性CD44分子的透明质酸功能化偶联物和药物组合物能够有效的实现逆转斑块的作用，从而有效治疗和/或预防与CD44活化相关病理状况或疾病，有良好的应用前景。
附图说明
图1示出了实施例1中化合物4的核磁谱图；
图2示出了实施例1中化合物5的质谱谱图；
图3示出了实施例1中化合物6的质谱谱图；
图4示出了实施例1中HA和HA-CP-R的红外谱图；
图5示出了实施例2中HA和HA-TIBA的红外谱图；
图6示出了实施例3中HA和其衍生物HA-CP-R、HA-TIBA/CP-R的红外谱图；
图7示出了实施例4中HA-CP-R/AuNPs的TEM谱图；
图8示出了实施例5中HA-PEG-AuNPs的TEM谱图；
图9示出了实施例6中HA-CS/Fe3O4 NPs的TEM谱图；
图10示出了实施例7中HA-DOTA的红外谱图；
图11示出了实施例8中HA-miRNA 33a的红外谱图；
图12示出了实施例9中AuNP/HA-CP-miRNA 33a的TEM谱图；
图13示出了实施例10中HA-雷公藤甲素化合物的质谱图。
图14示出了经不同化合物治疗前后斑块进展百分比图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
定义
在上文或下文中，如无其他说明，“取代的”基团是指该基团中的氢原子被一个或多个取代基所替代而形成的基团。例如，“取代的C1-C5烃基”是指C1-C5烃基中的一个或多个氢原子被取代基所替代而形成的基团。本领域技术人员能够理解，可用于本发明应用的化合物中可以包含各种取代基，只要是该取代基的引入不会影响本发明的功能，能够实现本发明的目的，就可用于本发明。在一些实施方式中，所述取代基选自于由以下基团所组成的组：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)。
在一些实施方式中，所述取代基是C1-C3烷基、C6-C8芳基、-OC1-C3烷基、-OC1-C3烷基苯基、卤素取代基、氰基或硝基中的一种。本领域技术人员将理解的是，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行和/或本身不稳定的任何取代或取代模式。
如本文所使用的，“烷基”是指具有指定数量的碳原子的直链和支链饱和烃基，通常为1至20个碳原子，例如1至10个碳原子，如1至8个或1至3个碳原子。例如，C1-C5烷基包含1至5个碳原子的直链和支链烷基。当提及具有特定数量的烷基的残基时，旨在涵盖具有该数量的碳的所有支链和直链形式；因此，例如，“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集，指与烷基相同，但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一个碳－碳三键的不饱和支链或直链烷基，所述碳－碳三键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去两个氢分子而获得的。典型的炔基基团包括但不限于：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些实施方式中，炔基具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10、2至8或2至6个碳原子。亚炔基是炔基的一个子集，指的是与炔基相同、但有两个附着点的残基。
如本文所使用的，“环烷基”是指具有3至14个碳原子的饱和或不饱和和非芳香族烃环基团，除非另有具体说明。环烷基的例子包括但不限于：环丙基、甲基环丙基、2,2-二甲基环丁基、2-乙基环戊基或环己基。环烷基可以包含多个螺环或稠环。环烷基在常规价态允许的条件下在任意位置被任选地单、双、三、四或五取代。
在上文及下文中，“易损斑块”(vulnerable plaque，VP)，又称不稳定斑块，是指具有血栓形成倾向或极有可能快速进展成为"罪犯斑块"的动脉粥样硬化斑块，主要包括破裂斑块、侵蚀性斑块和部分钙化结节性病变。大量的研究表明，大部分的急性心肌梗死及脑卒中是由于轻、中度狭窄的易损斑块破裂，继发血栓形成所致。易损斑块的组织学表现包括活动性炎症、薄的纤维帽和大的脂质核心、内皮剥脱伴表面血小板聚集、斑块有裂隙或损伤以及严重的狭窄，以及表面钙化斑、黄色有光泽的斑块、斑块内出血和正性重构。
在上文及下文中，CD44活化相关病理状况或疾病是指与易损斑块相关的疾病。
在上文及下文中，“与易损斑块相关的疾病”是指疾病的发生和发展过程中与“易损斑块”相关、以“易损斑块”为特征、由“易损斑块”引起或继发于“易损斑块”的疾病。与“易损斑块”相关的疾病主要包括：动脉粥样硬化症、冠状动脉粥样硬化性心脏病(包括急性冠状动脉综合征、无症状心肌缺血隐匿性冠心病、心绞痛、心肌梗死、缺血性心脏病、猝死、支架内再狭窄)、脑动脉粥样硬化症(包括脑卒中)、外周血管动脉粥样硬化症(包括颈动脉粥样硬化症、肾动脉粥样硬化症、下肢动脉粥样硬化症、上肢动脉粥样硬化症)、主动脉夹层、血管瘤、血栓栓塞、心力衰竭和心源性休克等疾病。
在上文及下文中，“靶向给药系统”是指具有靶向给药能力的给药系统。在经某种途径给药以后，例如静脉注射Adcetris(武田公司研发的靶向CD30抗体偶联药物，2011年8月上市)后，靶向给药系统所包含的药物会通过特殊载体或靶向弹头(例如，抗体或靶向配体)的作用特异性地富集于靶部位。目前已知的用于实现靶向给药的手段包括利用各种纳米粒子给药系统的被动靶向性能、在微粒给药系统的表面进行化学修饰、利用一些特殊的理化性能、利用抗体介导靶向给药、利用配体介导靶向给药、利用前体药物靶向给药等。其中，利用配体介导靶向给药是利用某些器官和组织上的特定的受体可与其特异性的配体发生专一性结合的特点，将药物载体与配体结合，从而将药物导向特定的靶组织。
在上文和下文中，“透明质酸(hyaluronic acid，HA)”，又称玻尿酸，是一种高分子聚合物，分子式为(C14H21NO11)n。它是由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位糖胺聚糖(分子量为379)。D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间由β-1,3-配糖键相连，双糖单位之间由β-1,4-配糖键相连。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。一般的，透明质酸的分子量大小为1kD-500kD。
在上文及下文中，“CD44分子”是一类广泛地表达于淋巴细胞、单核细胞、内皮细胞等细胞的细胞膜上的跨膜蛋白多糖黏附分子，由胞外区段、跨膜区段和胞内区段等三个区段构成。CD44分子可介导多种细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的相互作用，参与体内的多种信号的传导，从而改变细胞的生物学功能。
在上文及下文中，“PEG”是指聚乙二醇。一般的，聚乙二醇的分子量大小为0.1-10kD。
在上文及下文中，本发明所述的药学上可接受的辅料包括酸加成盐和/或碱加成盐。所述的酸加成盐包括但是不限于来自无机酸诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸和膦酸的盐，以及来自有机酸如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、链烷二酸、芳香酸和脂肪族和芳香族磺酸的盐。因此，这些盐包括但是不限于硫酸盐，焦硫酸盐，硫酸氢盐，亚硫酸盐，亚硫酸氢盐，硝酸盐，磷酸，磷酸一氢盐，磷酸二氢盐，偏磷酸盐，焦磷酸盐，盐酸盐，氢溴酸盐，碘酸盐，乙酸盐，丙酸盐，辛酸盐，异丁酸盐，乙二酸盐，丙二酸盐，琥珀酸盐，辛二酸，癸二酸盐，富马酸盐，马来酸盐，苦杏仁酸盐，苯甲酸盐，氯代苯甲酸盐，甲基苯甲酸盐，二硝基苯甲酸盐，苯磺酸盐，甲苯磺酸盐，苯基乙酸盐，柠檬酸盐，乳酸盐，马来酸盐，酒石酸和甲磺酸盐，还包含氨基酸的盐如精氨酸盐，葡糖酸盐，半乳糖醛酸盐等。酸加成盐可以通过常规方式使游离碱与足够量的所需酸(酸指可以接受电子对的物质，包括离子、原子团或分子)接触形成盐的方式制备。
在上文及下文中，“碱加成盐”为碱金属或碱土金属与路易斯碱形成的盐或胺。在一些实施方式中，所述的碱加成盐为碱金属或碱土金属的氢氧化物。在一些实施方式中，所述碱金属包括钠或钾。在一些实施方式中，所述碱土金属为镁或钙。在一些实施方式中，适当的胺的例子包括但不限于N，N′-二苄基乙二胺，氯普鲁卡因，胆碱，二乙醇胺，乙二胺(乙烷-1，2-二胺)，N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。碱加成盐可通过以常规方式使游离酸与足够量的碱(碱是电子对的给予体，是可以给出电子对的分子或者离子)接触形成盐的方式制备。
在上文和下文中，本发明所述的溶剂化物是指本发明的偶联物与一种或多种溶剂分子的物理结合。该物理结合包括各种程度的离子作用或氢键作用。在某些情况下，溶剂化物可被分离出来，例如当一个或多个溶剂分子掺入到结晶固体的晶格中。“溶剂化物”包括溶液相和可分离的溶剂化物。代表性的溶剂化物包括乙醇化物、甲醇化物等。
在上文和下文中，“水合物”是其中一个或多个溶剂分子为H2O的溶剂化物。
在上文和下文中，本发明所述的前药指药物经过化学结构修饰后得到的在体外无活性或活性较小、在体内经酶或非酶的转化释放出活性药物而发挥药效的化合物。
在上文和下文中，“受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本发明的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
如本文所使用的，“治疗”是指获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
如本文所使用的，“预防”指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将本发明的透明质酸功能化偶联物或药物组合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未做出。
在一个方面，本发明提供了一种靶向活化CD44分子的透明质酸功能化偶联物，所述透明质酸功能化偶联物具有式(1)所示的结构：
其中：
HA为透明质酸；
D为活性物质，所述活性物质选自他汀类药物、细胞毒性药物、抗炎药物、激素类药物、核酸药物、NLRP 3抑制剂、PPARγ激动剂、放射性核素、光敏分子或示踪剂；
L为任意能够将所述透明质酸和所述活性物质连接的连接子；
n为1-100的整数。
式(1)中的透明质酸为能够特异性靶向CD44分子的配体。在一些实施方式中，所述透明质酸的分子量为1kD-500kD。在一些实施方式中，所述透明质酸的分子量为5kD-200kD。
式(1)中的活性物质为能够对易损斑块或与易损斑块相关的疾病起到诊断和/或治疗作用的物质。在一些实施方式中，所述活性物质为他汀类药物。在一些实施方式中，所述他汀类物质选自以下中的一种或多种：洛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀，或其药学上可接受的盐、酯、前药、溶剂化物或氘代化合物。在一些实施方式中，所述他汀类药物为瑞舒伐他汀或者阿托伐他汀。
在一些实施方式中，所述活性物质为细胞毒性药物。在一些实施方式中，所述细胞毒性药物选自以下中的一种或多种：蒽环类新霉素、喜树碱、17-AEP-GA、紫杉醇、美登素、鹅膏毒肽、Muscotoxin A、17-AEP-GA、Telomestatin、微管蛋白抑制剂H、Pepstatin、Lactacystin或Tubulysin M。
在一些实施方式中，所述活性物质为抗炎药物。在一些实施方式中，所述抗炎药物选自以下中的一种或多种：甲氨蝶呤、来氟米特(LEF)、艾拉莫德(ITD)、甲氨蝶呤(MTX)、环孢素A(CSA)、秋水仙碱、非甾体抗炎药(NSAISs)、慢作用抗风湿药(DMARDs)、糖皮质激素(GC)、Aeruginosin 865或雷公藤甲素、花椒毒酚。
在一些实施方式中，所述活性物质为核酸药物。所述核酸药物是指可用于治疗疾病的核酸本身或与之密切相关的化合物，包括天然核苷酸和经化学修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述核酸选自以下集合中的一种或多种：microRNA-33a、microRNA-27a/b、microRNA-106b、microRNA-302、microRNA-758、microRNA-10b、microRNA-19b、microRNA-26、microRNA-93、microRNA-128-2、microRNA-144、microRNA-145反义链以及其核酸类似物如锁核酸，或adnectin如BMS-962476，反义RNAi寡核苷酸如ALN-PCSsc、STATI基因的小干扰RNA(siRNA)。
在一些实施方式中，所述活性物质为激素类药物。在一些实施方式中，所述激素类药物选自以下中的一种或多种：地塞米松、甲泼尼龙、醋酸泼尼松或强的松龙。
在一些实施方式中，所述活性物质为NLRP3抑制剂。在一些实施方式中，所述抑制剂选自以下中的一种或多种：MCC950、MCC950、Dapansutrile、Stavudine、Selnoflast、CY-09、NLRP3-IN-4或Nodinitib-1。
在一些实施方式中，所述活性物质为PPARγ激动剂，所述PPARγ激动剂选自以下中的一种或多种：罗格列酮、吡格列酮、Tesaglitazar、曲格列酮、Leriglitazone、Edaglitazone、Inolitazone、10-Nitrolinoleic acid、GW1929、Balaglitazone、Indeglitazar、Lanifibranor、沙罗格列扎或Oroxin A。
在一些实施方式中，所述活性物质为放射性核素。在一些实施方式中，所述放射性核素选自以下中的一种或多种：p-SCN-Bn-DOTA螯合的In(III)、Y(III)、Lu(III)、Gd(III)或Cu(II)的放射性同位素。
在一些实施方式中，所述活性物质为光敏分子。在一些实施方式中，所述光敏分子选自以下中的一种或多种：核黄素、卟啉、血卟啉衍生物、二血卟啉醚、npe6和酞青类、5-氨基酮戊酸、间-四羟基苯基二氢卟酚(meso-tetrahydroxyphenyl chlorin，m-th pc)、初卟啉锡(tin etiopurpurin，snetz)、亚甲基兰(methylene blue)、亚甲苯兰(toluidineblue)、苯卟啉(benzoporphyrin)衍生物、lutelium texaphyrins(lu-tex)、苯并卟啉衍生物单酸(bpd-ma，vertoporfin)、酞青类(phthalocyanines)、得克萨卟啉(texaphyrins)、n-天门冬酰基二氢卟酚(n-aspartyl chlorin e6，npe6)、金丝桃素(hypercin)、血啉甲醚、碳纳米材料。
在一些实施方式中，所述活性物质为示踪剂。在一些实施方式中，所述示踪剂为CT示踪剂或MRI示踪剂。
CT是电子计算机X射线断层扫描技术，是一种临床常用的检查手段，CT造影剂是能够帮助增强病灶部位CT对比度，提升检测灵敏度的物质。在一些实施方式中，所述CT示踪剂选自碘纳米造影剂、金纳米造影剂、氧化钽纳米造影剂、铋纳米造影剂、镧系纳米造影剂中的一种。在一些实施方式中，所述CT示踪剂选自以下一种或多种：碘海醇、碘卡酸、碘佛醇、碘克沙醇、碘普罗胺、碘比醇、碘美普尔、碘帕醇、碘昔兰、醋碘苯酸、胆影酸、碘苯扎酸、碘甘卡酸、泛影酸、碘他拉酸钠、碘苯酯、碘番酸、碘阿芬酸、醋碘苯酸钠、碘多啥、丙碘酮、碘奥酮、碘曲仑、碘吡多、胆影酸葡甲胺、碘他拉酸、泛影葡胺、甲泛影酸、甲泛葡铵、碘化油、乙碘油。在一些实施方式中，所述CT示踪剂为碘海醇。
MRI是磁共振成像，利用磁共振现象重建人体结构，MRI示踪剂是能够帮助增强病灶部位MRI成像灵敏度，提升检测灵敏度的物质。在一些实施方式中，所述MRI示踪剂选自纵向弛豫造影剂或横向弛豫造影剂。在一些实施方式中，所述MRI示踪剂选自顺磁性造影剂、铁磁性造影剂或超磁性造影剂。在一些实施方式中，所述MRI示踪剂选自以下一种或多种：Gd-DTPA及其线型、环型多胺多羧类螯合物和锰的卟啉螯合物、大分子钆螯合物、生物大分子修饰的钆螯合物、叶酸修饰的钆螯合物、树状大分子显影剂、脂质体修饰的显影剂或含钆富勒烯。
L为任意能够将所述透明质酸和所述活性物质连接的连接子。连接活性物质与透明质酸的连接子可以使透明质酸功能化偶联物在血液中保持稳定，且在目标细胞内或附近释放活性物质，对于有效递送活性物质至关重要，也是决定透明质酸功能化偶联物毒性的关键因素。活性物质在循环中过早释放会导致全身毒性和较低的治疗指标。式(1)中的连接子可以为惰性连接子或可被细胞内组织蛋白酶、活性氧自由基、酸性微环境、基质金属酶等选择性裂解的连接子或不断裂的连接子。在一些实施方式中，所述连接子选自多肽连接子、酰胺键、二硫键、腙键、酯键、硫酯键、马来酰亚胺键、巯基-马来酰亚胺键、碳硫键、醚键中的一种或两种以上的组合。在一些实施方式中，所述连接子为多肽连接子。在一些实施方式中，所述多肽连接子具有如式(2)所示的结构：
—R1—Peptide—R2—
式(2)
其中：
所述Peptide选自以下氨基酸中的一种或多种：缬氨酸、瓜氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺；
R1为Peptide与HA之间的连接键，R2为Peptide与D之间的连接键。
在一些实施方式中，R1和R2分别独立选自含有以下化学键中的一种或多种：酰胺键、二硫键、腙键、酯键、硫酯键、马来酰亚胺键、巯基-马来酰亚胺键、-三氮唑-、碳硫键、醚键。在一些实施方式中，为了合成方式的方便，R1和R2分别独立地选自以下组中的一种：-(CH2)j-CO-NH(CH2)j-、-(CH2)j-S-S-(CH2)j-、-(CH2)j-NH-N＝C(CH2)j-、-(CH2)j-CO-O(CH2)j-、-(CH2)j-CO-S-(CH2)j-、-(CH2)j-CH2-S-(CH2)j-、-(CH2)j-O-O-(CH2)j-、
其中每个j各自独立的为0～10的整数。
在一些实施方式中，所述多肽连接子的结构选自以下结构中的一种或多种：缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基-羟基、Fmoc-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基-对硝基苯基碳酸脂、马来酰亚氨基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄醇-对硝基苯基碳酸脂、Fmoc-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基、马来酰亚氨基己酰基-亮氨酸-甘氨酸-精氨酸、Fmoc-苯丙氨酸-赖氨酸(Boc)-对氨基苄氧羰基-对硝基苯基碳酸脂、Fmoc-甘氨酸-甘氨酸-D-苯丙氨酸-氧叔丁基、Fmoc-丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-对氨基苄醇-对硝基苯基碳酸脂、丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-对氨基苄氧羰、马来酰亚氨基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基、马来酰亚氨基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基-氯、甲基丙烯醛-苯丙氨酸-C4-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基、甲基丙烯醛-苯丙氨酸-C4-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基-DMEA、甲基丙烯醛-PEG4-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基、Aloc-D-丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(Aloc)-对氨基苄氧羰基-对硝基苯基碳酸脂、Boc-苯丙氨酸-赖氨酸(Alloc)-对氨基苄氧羰基-对硝基苯基碳酸脂、Fmoc-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-氧叔丁基、Fmoc-苯丙氨酸-赖氨酸(Trt)-对氨基苄氧羰基-对硝基苯基碳酸脂、(Ac)苯丙氨酸-赖氨酸(Alloc)-对氨基苄醇-对硝基苯基碳酸脂、苯丙氨酸-赖氨酸(Trt)-对氨基苄氧羰基、Boc-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-OH、马来酰亚氨基己酰基-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸。
在一些实施方式中，式(1)中的连接子选自以下惰性线性或树枝状高分子材料中的一种或多种：含有2-5个碳原子的短链烷烃、PEG、PEI、PAMAM、聚赖氨酸或PMMI。在一些实施方式中，所述连接子为PEG或PEI。
所述线性或树枝状高分子材料的分子量为0.1kD～100KD。在一些实施方式中，所述线性或树枝状高分子材料的分子量为1kD～10kD。
n为偶联于所述透明质酸和所述活性物质的的数量。在一些实施方式中，n为3-80的整数。在一些实施方式中，n为6-32的整数。从合成容易程度、结构/工艺成本和给药效率等多方面考虑，在一些实施方式中，n为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
药物组合物
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如上所述的透明质酸功能化偶联物和药学上可接受的辅料。
所述药物上可接受的辅料可以是本领域常规采用的各种制剂或化合物中的一种或多种。例如，所述药学上可接受的辅料可以包括但不限于：稀释剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂。
在一些实施方式中，所述药物组合物单位剂量制剂中活性物质的量为0.001-1000毫克。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，对透明质酸功能化偶联物和药学上可接受的辅料的含量没有特别要求。在一些实施方式中，透明质酸功能化偶联物与药学上可接受的辅料的重量比可以为：1：9-95:5。在一些实施方式中，上述重量比为：3:7-90：1。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液，也可以为冻干粉制剂，实施给药时与液体辅料混合，配置成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它器官(例如眼部)。在一些实施方式中，所述药物组合物用于皮下给药。
在一些实施方式中，所述的药物组合物可用于治疗易损斑块或与易损斑块相关的疾病。
在本发明一个实施方案中，所述的药物组合物还可结合其他药物用于治疗易损斑块或与易损斑块相关的疾病。在一些实施方式中，所述其他药物可以选自他汀类药物。
在本发明的环境下，给药剂量通过所施用的具体化合物的效力和对象的病况、以及待治疗对象的体重或者体表面积而定。剂量的大小将根据在具体对象中伴随具体化合物给药产生的任何副作用的存在、性质和程度而定。在正被治疗的病症治疗或者预防中确定待给药的化合物的有效量中，医师可以评价诸如化合物的循环血浆水平、化合物毒性和/或疾病进程等因素而定。
本发明的透明质酸功能化偶联物和药物组合物的应用
在一些实施方式中，本发明提供了本发明的透明质酸功能化偶联物和/或药物组合物在制备用于治疗和/或预防CD44活化相关病理状况或疾病的药物中的应用。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗和/或预防CD44活化相关病理状况或疾病的方法，该方法包括将有效量的本发明的透明质酸功能化偶联物和/或药物组合物给予有需要的受试者。
通过将本发明的透明质酸功能化偶联物中的活性物质给予有需要的受试者，可以通过活性物质达到治疗和/或预防CD44活化相关病理状况或疾病的目的。因此，本发明的透明质酸功能化偶联物和/或药物组合物可用于治疗或预防CD44活化相关病理状况或疾病，或用于制备用于治疗和/或预防或减轻与CD44活化相关病理状况或疾病的药物。
在一些实施方式中，所述CD44活化相关疾病为与易损斑块相关的疾病。
所述“与易损斑块相关的疾病”是指疾病的发生和发展过程中与“易损斑块”为特征、由“易损斑块”引起或继发于“易损斑块”的疾病。在一些实施方式中，所述与易损斑块相关的疾病选自以下一种或多种：动脉粥样硬化症、冠状动脉粥样硬化性心脏病(包括急性冠状动脉综合征、无症状心肌缺血隐匿性冠心病、心绞痛、心肌梗死、缺血性心脏病、猝死、支架内再狭窄)、脑动脉粥样硬化症(包括脑卒中)、外周血管动脉粥样硬化症(包括颈动脉粥样硬化症、肾动脉粥样硬化症、下肢动脉粥样硬化症、上肢动脉粥样硬化症)、主动脉夹层、血管瘤、血栓栓塞、心力衰竭和心源性休克等疾病。
本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将本发明的透明质酸功能化偶联物和/或药物组合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将本发明的透明质酸功能化偶联物和/或药物组合物放置入受试者体内。适于本发明方法的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者体循环相比将更多活性物质递送到特定位点；而全身给药导致将本发明的透明质酸功能化偶联物和/或药物组合物递送至患者的基本整个身体。
可通过本领域已知的任何合适途径向患者给药，所述途径包括但不限于：口服或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每个月或每年1次或多次。
本发明的透明质酸功能化偶联物的制备方法
在一个方面，本发明提供了本发明的靶向活化CD44分子的透明质酸功能化偶联物的制备方法。
可以采用任何合理的合成路线制备本发明的式(1)所示的透明质酸功能化偶联物。
在一些实施方式中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将活性物质D衍生(酯化或偶联其他功能分子)后与连接子偶联形成L-D部分；
(2)将HA通过偶联化学基团形成HA衍生物；
(3)将步骤(2)所得HA衍生物与步骤(1)中得到的L-D通过化学途径偶联，形成式(1)所述的透明质酸功能化偶联物。
在一些实施方式中，步骤(2)中，所述偶联化学基团选自以下一种或多种：氨基、羧基、叠氮基、炔基、巯基。
试剂盒
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含有效量的本发明的透明质酸功能化偶联物或药物组合物中的至少一种。
在一些实施方式中，本发明所述的试剂盒可在一个容器中提供透明质酸功能化偶联物。在一些实施方式中，本发明所述的试剂盒可包含一个提供药学上可接受的赋形剂的容器。在一些实施方式中，所述试剂盒中还可包含其它成分，如稳定剂或防腐剂等。在一些实施方式中，本发明所述的试剂盒可在不同于提供本发明所述透明质酸功能化偶联物或药物组合物的容器以外的其它容器中包含至少一种其它治疗剂。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含用于将本发明的透明质酸功能化偶联物或药物组合物与药学上可接受的载体和/或辅料或其它成分(若有的话)进行混合的说明书。
在本发明的试剂盒中，所述透明质酸功能化偶联物或药物组合物和药学上可接受的载体和/或辅料，可以任何形式提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。
下面将通过实施例来进一步说明本发明，但是本发明并不因此而受到任何限制。
实施例
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
在本发明中，如无其他说明，则所有操作均在室温、常压下实施。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：二氯甲烷(DCM)，丙酮，二甲基亚砜(DMSO)，瑞舒伐他汀钙盐,甲基吗啉，2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪，2,4,6-三甲基苯甲酰，Pd(OH)2/C，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)吡啶和对甲苯磺酸吡啶酯(PPTS)购自Sigma-Aldrich。透明质酸购于山东润昕生物科技有限公司。
仪器：水合尺寸和Zeta电位，使用动态光散射(DLS)Zetasizer Nano ZS装置(英国马尔文)进行测量。
若无其它说明，以下提供的试剂比例均按体积比(v/v)计算。
实施例1
本实施例用于说明溶酶体刺激响应药物释放复合物透明质酸(HA)共价偶联瑞舒伐他汀(R)(HA-CP-R)的制备。
本实施例中，按照以下方法，合成了HA-CP-R。
(1.1)瑞舒伐他汀前药(化合物6)的制备
(1-1a)化合物2的合成
将化合物1(5g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，然后加入1-羟基苯并三唑(HOBt，2.1g)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC，2.7g)进行反应，经过硅胶柱层析得到产品化合物2(2.8g)。
(1-1b)化合物4的合成
将化合物3(5g)溶解于50mL二氯乙烷中，然后加入1-羟基苯并三唑(1.4g，TBSOTf)和二甲基吡啶(1g)，在室温下反应6小时，得到化合物4(3.1克)。
(1-1c)化合物5的合成
将化合物4(1.6g)溶解于20mL二氯甲烷中，加入二羟甲基丙酸(0.3g)和二异丙基乙胺(0.2g)，再加入化合物2(1.8g)，在室温下反应4h，得到化合物5(0.5克)。
(1-1d)化合物6的合成
将化合物5(0.5克)在50％三氟乙酸、二氯甲烷(TFA/DCM)溶剂中脱去BOC保护基，得到化合物6(54毫克)。
图1示出了化合物4的核磁结果。图2示出了化合物5的质谱结果。图3示出了化合物6的质谱结果。
(1-2)HA-CP-R的制备
将0.5g透明质酸HA(分子量约为100KDa)溶解于超纯水中，加入10mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和10mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)偶联剂，再加入50微升巯基丙胺，室温下反应5小时，随后将混合物转移到透析袋(MWCO：3kDa)洗去残留的二甲基亚砜(DMSO)。每12小时在蒸馏水中进行6次透析(2L，4℃)得到巯基化的HA衍生物HA-SH(0.54克)。
将0.1g HA-SH充分溶解于PBS缓冲溶液(5mL)中，再加入0.1g化合物6，在室温下搅拌反应24小时，超滤纯化(3KD Millipore超滤管)除去未反应的CP-R,得到偶联物HA-CP-R。图4为HA和HA-CP-R的红外谱图。
实施例2
本实施例用于说明靶向CT成像功能的HA-碘复合物(HA-TIBA)的制备。
在室温下，用Amberlite H树脂(10g)加入100mL HA(分子量为50KD)水溶液(1mg/mL)进行质子化处理，然后将其溶于10mL的水/乙腈(3：2)的混合物溶剂中，得到HA溶液。将三碘苯甲酸(0.5g，TIBA)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中加入DCC(1.1g)和DMPI(0.5g)进行反应，再加入4-甲基吗啉(0.2mL)和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(0.2g)并搅拌反应30分钟，加入上述HA溶液得到HA-TIBA偶联物，在室温下搅拌反应36小时。随后将混合物转移到透析袋(MWCO：3kDa)洗去残留的未反应物，在蒸馏水中进行6次透析(2L，4℃)得到具有CT成像功能的HA-碘复合物(HA-TIBA)。图5为HA和HA-TIBA的红外谱图。
实施例3
本实施例用于说明兼具CT成像和溶酶体刺激响应药物释放功能的HA偶联药物复合物(HA-TIBA/CP-R)的制备。
在室温下，用Amberlite H树脂(10g)加入100mL HA(50KD)水溶液(1mg/mL)进行质子化处理，然后将其溶于10mL水/乙腈(3：2)的混合物溶剂中，得到HA溶液。将三碘苯甲酸(0.5g，TIBA)溶解于DMF溶剂中，再加入二环己基碳二亚胺(DCC，1.5g)和N,N-二甲基哌嗪(DMPI0.5g)，反应1小时，再加入4-甲基吗啉(0.2mL)和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(0.2g)搅拌反应30分钟，加入上述HA溶液(10mL水/乙腈)，在室温下搅拌反应36小时，制备得到HA-TIBA偶联物。随后将混合物转移到透析袋(MWCO：3kDa)洗去残留的未反应物，在蒸馏水中进行6次透析(2L，4℃)得到具有CT成像功能的HA-TIBA复合物。
将HA-TIBA复合物(1.5g)充分溶解于超纯水(50mL)中，加入10mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和10mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)偶联剂活化羧基，加入50微升巯基丙胺，室温继续搅拌5小时，随后将混合物转移到透析袋(MWCO：3kDa)洗去残留的二甲基亚砜(DMSO)，每12小时后替换蒸馏水(2L，4℃)，进行6次透析得到巯基化的HA复合物(HA-TIBA-SH)。
将0.1g HA-TIBA-SH充分溶解于PBS缓冲溶液中，加入0.1g实施例1中的化合物6，在室温搅拌反应24小时后，超滤纯化除去未反应的化合物6,得到偶联物HA-TIBA/CP-R。图6为HA和HA-CP-R、HA-TIBA/CP-R的红外表征图。
实施例4
本实施例用于说明兼具CT成像和溶酶体刺激响应药物释放功能的HA偶联药物和金纳米粒复合纳米材料复合物(HA-CP-R/AuNPs)的制备。
在室温下，将1g透明质酸HA(分子量为约100KDa)充分溶解于100mL超纯水中，加入10mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和10mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)偶联剂，加入50微升巯基丙胺，室温下反应5小时，随后将混合物转移到透析袋(MWCO：3kDa)洗去残留的DMSO。每12小时后替换蒸馏水(2L，4℃)，进行6次透析，得到巯基化的HA衍生物HA-SH。将1g HA-SH充分溶解于10mLPBS缓冲溶液中，加入0.1g实施例1中的化合物6,在室温搅拌反应24小时，超滤纯化除去未反应的化合物6,得到偶联物HA-CP-R-SH。
配置100mL浓度为1mM的HAuCl4水溶液，加热至沸腾，在搅拌条件下加入0.1M柠檬酸钠溶液1mL，制得AuNPs，通过超滤方法纯化溶液(30KD分子量截流)，浓缩溶液制得10mMAuNPs。将10mL的AuNPs溶液与10mg制备的HA-CP-R-SH搅拌，通过金-巯基亲和作用将HA-CP-R-SH连接在AuNPs的表面，反应24小时后离心纯化获得HA-CP-R/AuNPs复合物,图7为HA-CP-R/AuNPs的透射电镜(TEM)谱图。图7的金纳米粒表面低衬度有机物层即为HA-CP-R-SH。
实施例5
本实施例用于说明用于CT成像HA偶联金纳米粒复合纳米材料(HA-PEG-AuNPs)的制备。
配置100mL 1mM HAuCl4水溶液，加热至沸腾，在剧烈搅拌条件下加入0.1M柠檬酸钠1mL，制得AuNPs，通过超滤方法纯化溶液，浓缩溶液制得10mM AuNPs。
将100mL AuNPs溶液与10mg NH2-PEG-SH(Mw：1000)搅拌，通过金-巯基亲和作用将NH2-PEG-SH连接在AuNPs的表面，反应24小时后离心纯化获得产物PEG-AuNPs，通过离心的方法收集AuNPs-PEG(10000rpm，10分钟)，离心后去上清液，下层为PEG-AuNPs。将0.1g透明质酸HA(分子量约为100KDa)充分溶解于超纯水中，加入10mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和10mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)偶联剂活化羧基，反应2小时后加入PEG-AuNPs继续反应6小时后离心纯化获得产物HA-PEG-AuNPs。图8为HA-PEG-AuNPs的透射电镜(TEM)谱图，图8的金纳米粒表面低衬度有机物层即为HA-PEG。
实施例6
本实施例用于说明用于MRI成像HA偶联Fe3O4复合纳米材料(HA-CS/Fe3O4 NPs)的制备。
(6-1)壳聚糖(CS)包被Fe3O4纳米粒(CS/Fe3O4 NPs)的制备
水热法制备CS/Fe3O4 NPs：将2g FeCl3溶解于10mL水中，再加入0.5g CS和0.5g醋酸钠混合搅拌溶解，加入水热反应釜180℃反应10小时，再经乙醇和纯水洗涤得到CS/Fe3O4NPs。
(6-2)HA-CS/Fe3O4 NPs的制备
将0.1g透明质酸HA(分子量为约10KDa)充分溶解于10mL超纯水中，加入10mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和10mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)偶联剂活化羧基，加入制备的CS/Fe3O4 NPs，室温继续搅拌5小时，在外加磁场下得到HA-CS/Fe3O4 NPs。图9为HA-CS/Fe3O4 NPs的透射电镜(TEM)谱图。
实施例7
本实施例用于说明用于MRI成像HA偶联钆特酸复合物(HA-DOTA)的制备。
用Amberlite H树脂对0.1g HA(10KD)质子化处理，然后将其溶于10mL水/乙腈(3：2)的混合物溶剂中，得到HA溶液。将钆特酸(5g)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中加入的DCC(1.2mL)和DMPI(0.5g)中，随后，加入4-甲基吗啉(2g)和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(0.6g)并搅拌反应30分钟，再加入上述HA溶液，在室温下搅拌反应36小时。随后将混合物转移到透析袋(MWCO：100kDa)洗去残留的未反应物，在蒸馏水中进行6次透析(2L，4℃)得到具有MRI成像功能的HA-DOTA复合物，HA和HA-DOTA的红外光谱如图10所示。
实施例8
本实施例用于说明用于HA偶联miRNA化合物(HA-miRNA33a)的制备。
将HA(0.1g)充分溶解于超纯水(10mL)中，加入10mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和10mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)偶联剂活化羧基，加入50微升戊二胺，室温下反应5小时，随后将混合物转移到透析袋洗去残留的二甲基亚砜(DMSO)。每12小时在蒸馏水中进行6次透析(2L，4℃)得到氨基化的HA复合物(HA-NH2)。
将0.1g HA-NH2充分溶解于10mLPBS缓冲溶液中，加入巯基化核酸SH-miRNA33a(10OD)，加入4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯偶联剂(5mg，SMCC)在室温搅拌反应24小时后，超滤纯化除去未反应的SH-miRNA33a,得到化合物HA-miRNA33a，HA和HA-miRNA33a的红外谱图如图11所示。
实施例9
用于核酸/CT治疗成像的HA偶联纳米金复合物(AuNP/HA-miRNA 33a)的制备。
将0.1g透明质酸HA(分子量为约100KDa)充分溶解于超纯水中，加入10mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和10mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)偶联剂活化羧基，加入50微升巯基丙胺，室温继续搅拌5小时，随后将混合物转移到透析袋(MWCO：3kDa)洗去残留的二甲基亚砜(DMSO)。每12小时在蒸馏水中进行6次透析(2L，4℃)得到巯基化的HA-SH(0.11g)。
将0.1g HA-SH充分溶解于PBS缓冲溶液中，加入5OD的SH-miRNA33a，加入4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯偶联剂(2mg，SMCC)在室温搅拌反应24小时后，获得复合物HA-CP-miRNA33a，每条HA分子上大约连接8个CP-miRNA33a分子(n＝8)，由于其中未反应的巯基可以和AuNPs形成配位键，可形成HA-CP-miRNA33a在AuNPs表面的连接，离心纯化获得纳米复合物(AuNP/HA-CP-miRNA33a)。AuNP/HA-CP-miRNA33a的透射电镜谱图如图12所示。
实施例10
本实施例说明靶向斑块治疗药物的HA-雷公藤甲素化合物(HA-Trip)的制备。按照下式合成得到HA-雷公藤甲素化合物。
(1)将雷公藤甲素即下式中化合物1(200.0mg)，丁二酸酐(280.0mg)，DMAP(340.0mg,)和三乙胺(280.0mg)溶于二氯甲烷(6.0mL)中，室温搅拌反应4小时，然后加水稀释，用0.1N的盐酸将上述溶液的pH值调至6，用二氯甲烷萃取3次，每次100mL，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，旋蒸，得到下式中化合物2(300.0mg,粗品，淡黄色油状固体)，直接用于下一步反应。MS(ESI,m/z):461(M+H)+.
(2)将化合物2(20mg)，N-羟基丁二酰亚胺(10mg)，EDCI(17mg)溶于二氯甲烷(1.0mL)，室温搅拌反应7小时，将反应液加水稀释，用二氯甲烷萃取3次，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，旋蒸，得到化合物RP-019(15.0mg,粗品，淡黄色固体)。MS(ESI,m/z):580(M+Na)+.
(3)在室温下，在Amberlite H树脂(10g)中加入100mL HA(分子量为50KD)水溶液(1mg/mL)进行质子化处理，然后将其溶于100mL丙酮溶剂中，得到沉淀的HA，将溶液离心在5000rpm速度下离心30min，回收HA冻干得到去除钠的透明质酸71mg。
(4)取20mg步骤(3)得到的透明质酸，溶解于10mL甲酰胺中，加入1mg上述合成的RP-019，室温搅拌反应24小时，反应结束后加入10mL丙酮沉淀反应，得到化合物3，即HA-雷公藤甲素化合物8.1mg。图13为化合物3的质谱图。
实施例11
本实施例说明靶向斑块治疗药物的HA-花椒毒酚化合物(HA-SPB)的制备。
在室温下，用Amberlite H树脂(10g)加入100mL HA(50KD)水溶液(1mg/mL)进行质子化处理，然后将其溶于100mL丙酮溶剂中，得到沉淀的HA，将溶液以5000rpm速度离心30min，冻干得到去除钠的透明质酸71mg。
取20mg上述得到的透明质酸，溶解于10mL甲酰胺中，加入1mg SPB(cas：858128-57-1)，室温搅拌反应24小时，反应结束后加入10mL丙酮沉淀反应，得到HA-花椒毒酚化合物(HA-SPB)10.6mg。
实施例12
本实施例说明靶向斑块治疗药物的HA-秋水仙碱化合物(HA-Col)的制备。按照下式反应步骤得到HA-秋水仙碱化合物。
(1)将秋水仙碱即化合物1(5.0g)和DMAP(1.53g)溶于乙腈(110.0mL)中，逐滴加入Boc2O(17.8g)，加入三乙胺(2.3g)。在75℃下搅拌反应2小时，然后将反应体系降至室温，继续向反应体系中逐滴加入Boc2O(1.6g),继续室温搅拌反应16小时。将反应液旋蒸后用二氯甲烷溶解，用柠檬酸水溶液将pH值调至2.5左右，用分液漏斗将有机相和水相分离，用二氯甲烷萃取2次，每次100mL，将有机相合并在一起，用无水硫酸钠干燥，浓缩，得到下图中化合物2(10.23g)，直接用于下一步反应。MS(ESI,m/z):500(M+H)+.
(2)将化合物2(4.0g)溶于甲醇(120.0mL)中，将反应体系用冰水浴降温至0℃，加入甲醇钠(2.5g)，室温搅拌3小时，向反应体系中加入饱和氯化铵水溶液(50.0mL),旋蒸掉体系中的甲醇，用乙酸乙酯萃取3次，每次100mL，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，得到化合物3(5.40g)，直接用于下一步反应。MS(ESI,m/z):458(M+H)+.
(3)将化合物3溶于二氯甲烷(25.0mL)中，加入三氟乙酸(6.5mL)，室温搅拌反应3小时，然后旋蒸，加入二氯甲烷(100mL)溶解，用饱和碳酸钠水溶液将反应体系的pH值调至10，用分液漏斗将有机相和水相分离，用二氯甲烷萃取3次，每次100mL。将有机相合并在一起，用无水硫酸钠干燥，浓缩，得到化合物4(1.39g)，直接用于下一步反应。MS(ESI,m/z):358(M+H)+.
(4)在室温下，用Amberlite H树脂(10g)加入100mL HA(50KD)水溶液(1mg/mL)进行质子化处理，然后将其溶于100mL丙酮溶剂中，得到沉淀的HA，将溶液以5000rpm速度离心30min，冻干得到去除钠的透明质酸71mg。
取20mg上述得到的HA，溶解于10mL中，加入1mg化合物4，10mgEDC，5mg sulfo-NHS室温搅拌反应24小时，反应结束后加入10mL丙酮沉淀反应，得到化合物4，即HA-秋水仙碱化合物(HA-Col)18.4mg。实验例1本发明的递送系统对动脉易损斑块的影响的体内实验
透明质酸(HA)是CD44的配体，能够起到靶向易损斑块的作用，瑞舒伐他汀(R)具有逆转斑块的作用。本实验例的目的是验证本发明实施例1、3制备的化合物(HA-CP-R，HA-TIBA/CP-R)对动脉易损斑块的体内治疗作用。
实验方法：
(1)配制游离瑞舒伐他汀的生理盐水溶液。
(2)构建小鼠动脉粥样硬化易损斑块模型：取SPF级ApoE-/-小鼠(10周龄，体重20±1g)作为实验动物，给予小鼠适应性高脂饮食(脂肪10％(w/w)，胆固醇2％(w/w)，胆酸钠0.5％(w/w)喂养40周后开始实验。
(3)实验动物分组及治疗：
将实验动物随机分为以下5组，每组6只：
易损斑块模型对照组：该组动物不进行任何治疗性处理；
瑞舒伐他汀灌胃组：以10mg瑞舒伐他汀/kg体重的剂量进行灌胃给药处理；
瑞舒伐他汀静脉注射组：以0.5mg瑞舒伐他汀/kg体重的剂量进行静脉注射给药处理；
HA-CP-R组：以0.5mg瑞舒伐他汀/kg体重的剂量进行静脉注射给药处理；
HA-TIBA/CP-R组：以0.5mg瑞舒伐他汀/kg体重的剂量进行静脉注射给药处理。
除易损斑块模型对照组外，其它治疗组的治疗每隔一天进行1次，共治疗5次。对于各组动物，于治疗前后进行颈动脉MRI扫描以检测斑块和管腔面积，并计算斑块进展百分比。
斑块进展百分比＝(治疗后斑块面积-治疗前斑块面积)/管腔面积。
实验结果发现，对于小鼠体内动脉易损斑块而言，无论是瑞舒伐他汀灌胃组还是瑞舒伐他汀静脉注射组，游离的瑞舒伐他汀都呈现出了一定的治疗效果，但是其无法阻止易损斑块的继续生长。但HA-CP-R组对于易损斑块的治疗效果发生了显著的提升，并起到了逆转斑块生长(缩小斑块)的治疗效果，带有功能修饰的HA-TIBA/CP-R组表现出更佳的治疗效果。
实验例2本发明的HA-CS/Fe3O4 NPs和HA-DOTA化合物对动脉易损斑块的体内示踪实验(MRI示踪)效果
透明质酸(HA)是CD44的配体，能够起到靶向易损斑块的作用，Fe3O4和DOTA分别是小分子无机、有机纳米MRI示踪剂。本实验例的目的是验证本发明实施例6和7制备的负载MRI示踪剂对动脉易损斑块的体内示踪效果。
(1)采用上述实施例所述的方法制备负载MRI示踪剂靶向递送系统。
(2)构建小鼠动脉粥样硬化易损斑块模型：取SPF级ApoE-/-小鼠(10周龄，体重20±1g)作为实验动物，给予小鼠适应性高脂饮食(脂肪10％(w/w)，胆固醇2％(w/w)，胆酸钠0.5％(w/w)喂养40周后开始实验。
(3)实验动物易损斑块示踪：
将实验动物随机分为以下各组，每组6只：
游离Fe3O4组：Fe3O4的给药剂量为0.1mg/kg体重；
HA-DOTA组：Fe3O4的给药剂量为0.1mg/kg体重；
HA-CS/Fe3O4 NPs组：Fe3O4的给药剂量为0.1mg/kg体重；
各实验组分别经尾静脉注入相应的示踪剂，并于给药前以及给药后2h进行MRI成像，观察各组动物的动脉粥样硬化易损斑块的识别情况。
在我们之前的研究中发现，游离的Fe3O4颗粒对于小鼠体内动脉易损斑块而言呈现出了一定的示踪效果。与游离的Fe3O4颗粒相比，当将Fe3O4纳米粒与HA偶联递送系统中时，其对于易损斑块的示踪效果有了非常显著的提高。实验结果发现，与游离MRI示踪剂相比，使用本发明所述的表面修饰有靶向配体的靶向递送系统给药有望显著提高MRI示踪剂对动脉易损斑块的识别作用，产生更好的示踪效果。
实验例3本发明的递送系统对动脉易损斑块的影响的体内实验
透明质酸(HA)是CD44的配体，能够起到靶向易损斑块的作用，瑞舒伐他汀(R)具有逆转斑块的作用。本实验例的目的是验证本发明实施例的化合物(HA-SPB，HA-Col,HA-Trip)对动脉易损斑块的体内治疗作用。
实验方法：
3.1配制游离瑞舒伐他汀的生理盐水溶液。
3.2构建小鼠动脉粥样硬化易损斑块模型：取SPF级ApoE-/-小鼠(10周龄，体重20±1g)作为实验动物，给予小鼠适应性高脂饮食(脂肪10％(w/w)，胆固醇2％(w/w)，胆酸钠0.5％(w/w)喂养40周后开始实验。
3.3实验动物分组及治疗：
将实验动物随机分为以下5组，每组6只：
易损斑块模型对照组：该组动物不进行任何治疗性处理；
瑞舒伐他汀灌胃组：以10mg瑞舒伐他汀/kg体重的剂量进行灌胃给药处理；
HA-SPB组：以0.5mg/kg体重的HA-SPB剂量进行静脉注射给药处理；
HA-Col组：以0.5mg/kg体重的HA-Col剂量进行静脉注射给药处理。
HA-Trip组：以0.5mg/kg体重的HA-Trip剂量进行静脉注射给药处理。
除易损斑块模型对照组外，治疗组的治疗每隔一天进行1次，共治疗10次。对于各组动物，于治疗前后进行主动脉采集称量重量，并计算斑块进展百分比。结果如图14所示。
斑块进展百分比＝(治疗后斑块面积-治疗前斑块面积)/管腔面积。
实验结果发现，对于小鼠体内动脉易损斑块而言，无论是灌胃给药还是静脉注射给药，游离的瑞舒伐他汀都呈现出了一定的治疗效果，但是其无法阻止易损斑块的继续生长。然而，当将抗炎药物(HA-SPB，HA-Col,HA-Trip)靶向递送到斑块，其对于易损斑块的治疗效果发生了显著的提升，并起到了逆转斑块生长(缩小斑块)的治疗效果，带有功能修饰的纳米系统表现出更佳的效果。
以上详细描述了本发明的一些实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述一些实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (21)

1.一种靶向活化CD44分子的透明质酸功能化偶联物，其中，所述透明质酸功能化偶联物具有式(1)所示的结构：
其中：
HA为透明质酸；
D为活性物质，所述活性物质选自他汀类药物、细胞毒性药物、抗炎药物、激素类药物、核酸药物、NLRP3抑制剂、PPARγ激动剂、放射性核素、光敏分子或示踪剂；
L为任意能够将所述透明质酸和所述活性物质连接的连接子；
n为1～100的整数。
2.根据权利要求1所述的透明质酸功能化偶联物，其中，n为3-80的整数，优选地，n为6～32的整数。
3.根据权利要求2所述的透明质酸功能化偶联物，其中，所述透明质酸的分子量大小为1kD-500kD，优选地，所述透明质酸的分子量为5kD-200kD。
4.根据权利要求1所述的透明质酸功能化偶联物，其中，所述他汀类药物选自以下中的一种或多种：洛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀，或其药学上可接受的盐、酯、前药、溶剂化物或氘代化合物。
5.根据权利要求1所述的透明质酸功能化偶联物，其中，所述激素类药物选自以下中的一种或多种：地塞米松、甲泼尼龙、醋酸泼尼松或强的松龙。
6.根据权利要求1所述的透明质酸功能化偶联物，其中，所述抗炎药物选自以下中的一种或多种：甲氨蝶呤、来氟米特(LEF)、艾拉莫德(ITD)、甲氨蝶呤(MTX)、环孢素A(CSA)、秋水仙碱、非甾体抗炎药(NSAISs)、慢作用抗风湿药(DMARDs)、糖皮质激素(GC)、Aeruginosin865或雷公藤甲素。
7.根据权利要求1所述的透明质酸功能化偶联物，其中，所述细胞毒性药物选自以下中的一种或多种：蒽环类新霉素、喜树碱、17-AEP-GA、紫杉醇、美登素、鹅膏毒肽、MuscotoxinA、17-AEP-GA、Telomestatin、微管蛋白抑制剂H、Pepstatin、Lactacystin或Tubulysin M。
8.根据权利要求1所述的透明质酸功能化偶联物，其中，所述核酸药物选自以下中的一种或多种：microRNA-33a、microRNA-27a/b、microRNA-106b、microRNA-302、microRNA-758、microRNA-10b、microRNA-19b、microRNA-26、microRNA-93、microRNA-128-2、microRNA-144、microRNA-145反义链以及其核酸类似物如锁核酸、或adnectin如BMS-962476、或反义RNAi寡核苷酸如ALN-PCSsc、STATI基因的小干扰RNA(siRNA)。
9.根据权利要求1所述的透明质酸功能化偶联物，其中，所述放射性核素选自以下中的一种或多种：p-SCN-Bn-DOTA螯合的In(III)、Y(III)、Lu(III)、Gd(III)或Cu(II)的放射性同位素。
10.根据权利要求1的所述的透明质酸功能化偶联物，其中，所述光敏分子选自以下中的一种或多种：核黄素、卟啉、血卟啉衍生物、二血卟啉醚、npe6和酞青类、5-氨基酮戊酸、间-四羟基苯基二氢卟酚、初卟啉锡(tin etiopurpurin，snetz)、亚甲基兰(methyleneblue)、亚甲苯兰(toluidine blue)、苯卟啉(benzoporphyrin)衍生物、luteliumtexaphyrins(lu-tex)、苯并卟啉衍生物单酸(bpd-ma，vertoporfin)、酞青类(phthalocyanines)、得克萨卟啉(texaphyrins)、n-天门冬酰基二氢卟酚(n-aspartylchlorin e6，npe6)、金丝桃素(hypercin)、血啉甲醚、碳纳米材料。
11.根据权利要求1所述的透明质酸功能化偶联物，其中，所述NLRP3抑制剂选自以下中的一种或多种：MCC950、MCC950、Dapansutrile、Stavudine、Selnoflast、CY-09、NLRP3-IN-4或Nodinitib-1。
12.根据权利要求1所述的透明质酸功能化偶联物，其中，所述PPARγ激动剂选自以下中的一种或多种：罗格列酮、吡格列酮、Tesaglitazar、曲格列酮、Leriglitazone、Edaglitazone、Inolitazone、10-Nitrolinoleic acid、GW1929、Balaglitazone、Indeglitazar、Lanifibranor、沙罗格列扎或Oroxin A。
13.根据权利要求1所述的透明质酸功能化偶联物，其中，所述示踪剂为CT示踪剂或MRI示踪剂；
优选地，所述CT示踪剂选自碘纳米造影剂、金纳米造影剂、氧化钽纳米造影剂、铋纳米造影剂、镧系纳米造影剂；更优选地，所述CT示踪剂选自以下一种或多种：碘海醇、碘佛醇、碘克沙醇、碘普罗胺、碘比醇、碘美普尔、碘帕醇、醋碘苯酸、碘甘卡酸、泛影酸、碘他拉酸钠、碘他拉酸、泛影葡胺、甲泛影酸、甲泛葡铵；和/或
优选地，所述MRI示踪剂选自纵向弛豫造影剂和横向弛豫造影剂；更优选地，所述MRI示踪剂选自顺磁性造影剂、铁磁性造影剂或超磁性造影剂；进一步优选地，所述MRI示踪剂选自以下一种或多种：Gd-DTPA及其线型、环型多胺多羧类螯合物和锰的卟啉螯合物、大分子钆螯合物、生物大分子修饰的钆螯合物、叶酸修饰的钆螯合物。
14.根据权利要求1所述的透明质酸功能化偶联物，所述连接子是惰性连接臂或可被细胞内组织蛋白酶、活性氧自由基、酸性微环境或基质金属酶选择性裂解的连接子；
优选地，所述连接子为多肽连接子，所述多肽连接子具有式(2)所示的结构：
—R1—Peptide—R2—式(2)
其中：
式(2)中的Peptide由以下一种或多种氨基酸构成：缬氨酸、瓜氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺；R1为Peptide与HA之间的连接键，R2为Peptide与D之间的连接键；
优选地，R1和R2分别独立选自以下一种或多种：酰胺键、二硫键、腙键、酯键、硫酯键、马来酰亚胺键、巯基-马来酰亚胺键、-三氮唑-、碳硫键、醚键；
更优选地，所述R1和R2分别独立地选自-(CH2)jCO-NH(CH2)j-、-(CH2)j-S-S-(CH2)j-、-(CH2)jNH-N＝C(CH2)j-、-(CH2)jCO-O(CH2)j-、-(CH2)j-CO-S-(CH2)j-、-(CH2)j-CH2-S-(CH2)j-、-(CH2)j-O-O-(CH2)j-、 其中每个j各自独立的为0～10的整数。
15.根据权利要求1所述的透明质酸功能化偶联物，其中，当所述活性物质为核酸药物或示踪剂时，所述连接子选自以下惰性线性或树枝状高分子材料中的一种或多种：含有2-5个碳原子的短链烷烃、PEG、PEI、PAMAM、聚赖氨酸或PMMI；优选地，所述连接子为PEG或PEI；
所述惰性线性或树枝状高分子材料的分子量为0.1kD～100kD，优选为1kD～10kD。
16.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1至15中任一项所述的透明质酸功能化偶联物和药学上可接受的辅料。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的辅料选自以下一种或多种：稀释剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂，所述药物组合物单位剂量制剂中活性物质的含量为0.001～1000毫克。
18.权利要求1-15任一项所述的透明质酸功能化偶联物或权利要求16-17任一项所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防CD44活化相关病理状况或疾病的药物中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其中，所述CD44活化相关病理状况或疾病为与易损斑块相关的疾病；更优选地，所述与易损斑块相关的疾病选自以下一种或多种：动脉粥样硬化症、冠状动脉粥样硬化性心脏病(包括急性冠状动脉综合征、无症状心肌缺血隐匿性冠心病、心绞痛、心肌梗死、缺血性心脏病、猝死、支架内再狭窄)、脑动脉粥样硬化症(包括脑卒中)、外周血管动脉粥样硬化症(颈动脉粥样硬化症、肾动脉粥样硬化症、下肢动脉粥样硬化症、上肢动脉粥样硬化症)、主动脉夹层、血管瘤、血栓栓塞、心力衰竭、心源性休克。
20.一种治疗CD44活化相关病理状况或疾病的方法，该方法包括向患有该疾病的患者给予权利要求1-15中任意一项所述的透明质酸功能化偶联物或权利要求16-17中任意一项所述的药物组合物。
21.一种试剂盒，该试剂盒包含权利要求1-15中任意一项所述的透明质酸功能化偶联物或权利要求16-17中任意一项所述的药物组合物。
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