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CN117105938A - 一种基于egfr变构位点的autac类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于egfr变构位点的autac类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN117105938A
CN117105938A CN202311005105.1A CN202311005105A CN117105938A CN 117105938 A CN117105938 A CN 117105938A CN 202311005105 A CN202311005105 A CN 202311005105A CN 117105938 A CN117105938 A CN 117105938A
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CN
China
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acid
egfr
cancer
compound
autac
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Withdrawn
Application number
CN202311005105.1A
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石巧娟
龚晓猛
黄文海
闵敬丽
蒋莉莉
王尊元
曾申昕
潘有禄
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Hangzhou Medical College
Original Assignee
Hangzhou Medical College
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Publication of CN117105938A publication Critical patent/CN117105938A/zh
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    • C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
    • C07D473/18—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 one oxygen and one nitrogen atom, e.g. guanine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia

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Abstract

本发明公开了一种具有下式Ⅰ所示的基于EGFR变构位点的AUTAC类化合物及其药学上可接受的盐和水合物。本发明还公开了所述化合物的制备方法，以及所述化合物和药物组合物在制备预防或/和治疗癌症的药物中的应用。所述化合物仅需较少用量即可诱导EGFR降解，能减轻对人体的毒副作用；还能表现出优异的EGFR蛋白降解作用和抗癌活性，其抗癌效果优于EGFR抑制剂，可用于预防或/和治疗多种癌症，在医药领域具有巨大的应用前景。

Description

一种基于EGFR变构位点的AUTAC类化合物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及药物化合物合成领域，具体涉及一种基于EGFR变构位点的AUTAC类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
自噬靶向嵌合体(autophagy-targeting chimera，AUTAC)是一种基于自噬-溶酶体途径降解细胞内蛋白或细胞器的技术，AUTAC分子包含作为降解标签的鸟嘌呤衍生物(FBnG)和与靶蛋白或细胞器结合的配体以提供靶标特异性，中间由一段linker连接。AUTAC分子可以诱导靶蛋白进行K63多泛素化，K63多泛素化可激活自噬受体蛋白p62/SQSTM1，并介导自噬体的产生，将靶标蛋白吞入并且转移到溶酶体中进行降解。
EGFR(epidermal growth factor receptor，简称为EGFR、ErbB-1或HER1)是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一，该家族包括HER1(erbB1，EGFR)、HER2(erbB2，NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)，HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。
研究表明：在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。其可能机制有：EGFR的高表达引起下游信号传导的增强；突变型EGFR受体或配体表达的增加导致EGFR的持续活化；自分泌环的作用增强；受体下调机制的破坏；异常信号传导通路的激活等。EGFR的过表达在恶性肿瘤的演进中起重要作用，胶质细胞、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有EGFR的过表达。因此其已成为有效的抗肿瘤靶点，多个EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinase inhibitors，TKIs)已经上市用于多种癌症的治疗。但是，在接受8-13个月的EGFR-TKIs治疗后，几乎所有的患者都不可避免地出现获得性耐药，降低了EGFR-TKIs的抗肿瘤效果。
第四代EGFR抑制剂EAI045结合于EGFR的变构位点而非ATP结合位点，因此ATP结合位点内的氨基酸突变对EAI045与EGFR的结合影响较小，并且文献也已证EAI045对EGFR野生型以及常见突变型均有较好的结合能力。考虑到EGFR的突变耐药问题，我们放弃“占据驱动(occupancy-driven)”ATP结合位点抑制EGFR，而通过暴露于EGFR二聚体外侧的变构位点，由AUTAC触发“事件驱动(event-driven)”降解EGFR，解决因EGFR的ATP结合位点氨基酸残基突变引起的耐药问题。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种基于EGFR变构位点的AUTAC类化合物及其制备方法和应用，该化合物不仅具有优异的EGFR蛋白降解作用和抗癌活性，还能减轻对人体的毒副作用，可用于制备抗肿瘤药物。
本发明的另一目的在于提供了上述化合物或其药学上可接受的盐和水合物在制备预防或/和治疗癌症的药物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了具有下式I所示的化合物或其药学上可接受的盐和水合物:
其中，
X独立地为O，NH或CH2；
n为1～7的整数。
本发明通过使用连接链将EGFR小分子抑制剂和自噬标签FBnG进行连接制得一种自噬靶向嵌合体(AUTACs)小分子，通过对EGFR进行泛素化标记，能够选择性诱导EGFR蛋白降解，具有较好的抗肿瘤活性。
进一步地，本发明根据权利要求1所述的基于EGFR变构位点的AUTAC类化合物，具体提供以下结构的化合物：
具体提供的化合物具有较好的诱导EGFR降解作用和抗肿瘤活性。
本发明还包括式(I)所示的化合物的立体异构体。本发明化合物的所有立体异构体，包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体以及他们的混合物(如外消旋物)，均包括在本发明的范围内。
本发明还包括式(I)所示的化合物的互变异构体。属于“互变异构体”或“互变异构形式”是指经由低能垒相互转化的不同能量的结构异构体。
化合物的制备方法，式Ⅰ化合物通过如下反应制得:化合物2与化合物3缩合，并脱Boc保护后得到中间体化合物4，再经过与化合物5缩合反应之后得到目标化合物I。其反应方程式如下：
其中，X独立地为O，NH或CH2；
n为1-7的整数。
本发明还包括式(I)的衍生物的前药，式(I)的衍生物自身可能具有较弱的活性甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。
药学上可接受的盐包括：与下列酸形成的加成盐:盐酸、氢嗅酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、茶二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸或苯甲酸；以及盐酸、氢嗅酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、苯磺酸或琉拍酸的酸成盐。
一种药物组合物，包括式(I)所述的化合物或其药学上可接受的盐和水合物，和药学上可接受的赋形剂。乙酸、三氟乙酸、马来酸、苯磺酸或琉拍酸的酸成盐。
其中，式(I)所述的化合物或其药学上可接受的盐和水合物作为活性成份，与药学上可接受的赋形剂混合制成药物组合物，所述的赋形剂为用于药学领域的稀释剂、辅助剂或载体。
一种在药物组合物中加入药学上可接受的辅料制成的临床上可接受的剂型，所述的剂型为注射剂、片剂或胶囊剂。
一种药物组合物，包括式(I)所述的化合物或其药学上可接受的盐和水合物，和不同的抗肿瘤药剂。本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐、水合物和前药可作为抗肿瘤药剂单独使用，还可以与不同的抗肿瘤药剂联合使用，用于治疗预防肿瘤。
本发明还公开了式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐和水合物在制备预防或/和治疗癌症的药物中的应用。
所述的癌症为多发性骨髓瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、结肠癌、髓母细胞瘤、急性粒细胞白血病、慢性白血病、前列腺癌、肝细胞瘤、肾细胞瘤、宫颈癌、皮肤癌、卵巢癌、结肠癌、神经胶质瘤、甲状腺癌或胰腺癌。
本发明与现有技术相比，具有以下效果：
(1)本发明式(I)所述的双功能小分子可以对EGFR进行泛素化标记，仅需较少用量即可诱导蛋白降解，这个过程类似于催化反应，并不需要等摩尔量的药物，能减轻对人体的毒副作用；
(2)本发明体外抗肿瘤活性测试及体外EGFR蛋白降解活性测试表明，式(I)所述的双功能小分子表现出了优异的EGFR蛋白降解作用和抗癌活性，其抗癌效果优于EGFR抑制剂，可用于预防或/和治疗多种癌症，在医药领域具有巨大的应用前景。
具体实施方式
下文中提供的实施例和制备例进一步阐明和举例说明本发明化合物及其制备方法。应当理解，下述实例和制备例的范围并不以任何方式限制本发明的范围。本发明的原料可以从商业途径获得或通过本领域已知的方法制备。
化合物的结构通过核磁共振(1H-NMR)和高分辨质谱(HRMS)来确定，NMR测定是用ACF-400BRUK型核磁共振仪，测定溶剂为氘代氯仿(CDC13)或氘代二甲亚砜(DMSO-D6)，TMS为内标。柱层析采用200-300目硅胶。
实施例1：
制备2-(6-溴-1-氧代异吲哚啉-2-基)-2-苯基乙酸甲酯(1a)：
称取2-氨基-2-苯基乙酸甲酯2.80g(13.92mmol)和5-溴-2-溴甲基苯甲酸甲酯3.90g(12.66mmol)溶于60mL DMF中，在0℃下滴加DIPEA(6.60mL，37.98mmol)。滴加完毕后，在80℃下搅拌12h，经TLC检测反应完全。将反应液冷却至室温后加入50mL水淬灭，再用饱和食盐水(300mL)和乙酸乙酯(100mL×3)萃取，合并有机相并用饱和食盐水(250mL×3)洗涤。有机相中加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，称重得3.28g棕色油状液体1a，收率约为72％。
(2)制备2-(6-溴-1-氧代异吲哚-2-基)-2-苯基乙酸(1b)：
将中间体1a(3.20g，8.89mmol)溶于THF/MeOH/H2O(1：1：1)的混合溶液(30mL)，并加入氢氧化锂(2.65g，63.30mmol)。搅拌2h后，经TLC检测反应完全。向反应液中加入30mL水，并用乙酸乙酯(50mL×2)萃取以除去未水解的反应物。水相用浓HCl调节pH至1～2，有白色固体析出，并用乙酸乙酯(150mL×3)提取，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得2.74g白色固体1b，收率约为87％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.87(d,J＝1.9Hz,1H),7.79(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.1Hz,1H),7.49-7.39(m,5H),5.98(s,1H),4.61(d,J＝17.8Hz,1H),3.90(d,J＝17.8Hz,1H).
(3)制备2-(6-溴-1-氧代异吲哚-2-基)-2-苯基-N-(噻唑-2-基)乙酰胺(1c)：
将中间体1b(2.00g，5.78mmol)，2-氨基噻唑(1.10g，11.55mmol)和HATU(4.40g，11.55mmol)溶于30mL DMF中，加入DIPEA(4.00mL，23.12mmol)，在45℃下搅拌8h后，经TLC检测反应完全，向反应液中加入30mL水淬灭，再用饱和食盐水(200mL)和乙酸乙酯(100mL×3)萃取，合并有机相并用饱和食盐水(250mL×3)洗涤。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析得粗品，最后用乙酸乙酯/石油醚体系重结晶得1.55g白色固体1c，收率约为63％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.88(d,J＝1.8Hz,1H),7.80(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),7.55(d,J＝8.2Hz,1H),7.50(t,J＝3.1Hz,1H),7.48-7.43(m,2H),7.38(dd,J＝6.4,1.8Hz,2H),7.29(d,J＝3.6Hz,1H),6.29(s,1H),4.73(d,J＝17.9Hz,1H),3.96(d,J＝17.9Hz,1H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ173.39,171.55,162.59,146.75,143.15,139.75,139.40,138.85,134.36,134.05,131.29,130.79,126.32,119.37,63.47,53.73.
(4)制备2-(1-氧代-6-(6-(哌嗪-1-基)吡啶-3-基)异吲哚-2-基)-2-苯基-N-(噻唑-2-基)乙酰胺(JBJ-07-149)：
首先将反应溶剂通氮气除氧，将中间体1c(520mg，1.21mmol)和(6-(哌嗪-1-基)吡啶-3-基)硼酸(440mg，1.81mmol)置于封管中，加入2N Na2CO3(3mL，6.00mmol)和1,4-二氧六环(12mL)，在100℃下预热20min，然后加入Pd(dppf)Cl2(53mg，0.07mmol)和X-phos(52mg，0.11mmol)。在100℃下搅拌8h后，待反应液冷却到室温，经TLC检测反应完全。反应液用二氯甲烷稀释并经硅藻土过滤，滤液用二氯甲烷(80mL×3)和水(200mL)萃取。合并有机相并用饱和食盐水(200mL×1)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析得292mg棕色固体JBJ-07-149，收率约为47％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.50(d,J＝2.6Hz,1H),7.96-7.84(m,3H),7.61(d,J＝8.0Hz,1H),7.46(ddd,J＝17.1,7.6,4.4Hz,4H),7.41-7.36(m,2H),7.27(d,J＝3.6Hz,1H),6.90(d,J＝8.9Hz,1H),6.32(s,1H),4.78(d,J＝17.6Hz,1H),3.99(d,J＝17.6Hz,1H),3.49(d,J＝5.1Hz,4H),2.82(t,J＝5.1Hz,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ168.99,168.18,159.05,158.22,146.18,141.11,138.26,138.24,136.41,135.01,132.71,129.86,129.57,129.27,129.19,124.74,124.38,120.00,114.46,107.38,58.74,48.90,45.79,45.52.
(5)制备2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-羧酸叔丁酯(2b):
称取2-氨基-6-氯嘌呤1g(5.89mmol)置于圆底烧瓶中，加入20mL DMSO溶解，在冰浴下加入二碳酸二叔丁酯1.3g(5.89mmol)，然后将反应瓶移至室温加入4-二甲氨基吡啶36mg(0.29mmol)，室温搅拌4h后经TLC检测反应完全，向反应液中加入10mL水淬灭，再用水(150mL)和乙酸乙酯(70mL×3)萃取，合并有机相并用饱和食盐水(150mL×3)洗涤。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得1.50g白色固体2b粗品，无需分离纯化，直接转投下一步。
(6)制备(6-氯-9H-嘌呤-2-基)氨基甲酸叔丁酯(2c):
将中间体2b全部投入圆底烧瓶，加入20mL无水四氢呋喃溶解，在冰浴下加入氢化钠0.5g(15.72mmol)，搅拌15min后将反应瓶移至室温反应过夜，次日TLC检测反应完全。在冰浴下向反应液中缓慢滴加冰水淬灭，直至无气泡产生，由于产物水溶性强，省去萃取步骤，直接干法拌样柱层析得白色固体4c粗品，最后经无水乙醇重结晶得1.14g白色针状晶体2c，两步总收率约为72％。
(7)制备(6-氯-9-(4-氟苄基)-9H-嘌呤-2-基)氨基甲酸叔丁酯(2d):
依次称取中间体2c 500mg(1.85mmol)，碳酸钠590mg(5.56mmol)置于圆底烧瓶中，加入12mL DMF溶解，最后加入4-氟溴苄254μL(2.04mmol)室温反应4h，经经TLC检测基本反应完全，向反应液中加入10mL水淬灭，再用水(150mL)和乙酸乙酯(70mL×3)萃取，合并有机相并用饱和食盐水(150mL×3)洗涤。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，干法拌样柱层析得356mg白色固体2d，收率约为51％。
(8)制备2-氨基-9-(4-氟苄基)-1,9-二氢-6H-嘌呤-6-酮(2e):
称取中间体2d 300mg(0.79mmol)置于圆底烧瓶中，加入8mL 80％甲酸水溶液，75℃反应2h，经TLC检测反应完全，直接干法拌样柱层析得140mg淡黄色固体2e，收率约为68％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.47(s,1H),8.67(s,1H),7.45-7.39(m,2H),7.22(t,J＝8.8Hz,2H),7.15(s,2H),5.30(s,2H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ161.26,155.41,155.35,150.75,137.65,132.61,130.32,130.25,116.10,115.93,112.15,46.49.
(9)制备2-氨基-8-溴-9-(4-氟苄基)-1,9-二氢-6H-嘌呤-6-酮(2f)
称取中间体4e 500mg(1.9mmol)置于三颈烧瓶中，N2保护，然后加入25mL反应溶剂(DCM：MeOH＝1：1)溶解，在N2流下加入三溴化吡啶860mg(2.7mmol)，溶液呈酒红色，室温反应过夜。次日反应液呈黄色悬浊液，TLC检测原料少量剩余，向反应液中滴加10％的硫代硫酸钠水溶液至溶液黄色消失，然后减压抽滤，滤渣用石油醚冲洗3～5次除去吡啶，滤渣再用混合溶剂(DCM：MeOH＝1：1)洗涤2次，得到浅黄色粉末状固体2f，其中含有少量未反应完全的中间体4e，但不影响下一步反应。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.76(s,1H),7.28-7.15(m,4H),6.72-6.52(m,2H),5.15(s,2H).
(10)制备N-乙酰基-S-(2-氨基-9-(4-氟苄基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-8-基)-L-半胱氨酸：
依次称取中间体4f 300mg(0.89mmol)，N-乙酰-L-半胱氨酸435mg(2.66mmol)和碳酸钾982mg(7.14mmol)置于封管中，加入20mL乙腈，N2氛围下110℃混悬液反应过夜，次日取瓶中固体经LC-MS检测反应完全，减压过滤得白色固体，经混合溶剂(DCM：MeOH＝1：1)洗涤2次，用2N盐酸溶液调节pH至中性，离心弃上清液，所得固体用纯净水洗涤两次，再离心弃上清液，所得固体80℃烘干，得到242mg白色粉末状固体FBnG，收率约为65％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.71(s,1H),8.56(d,J＝7.9Hz,1H),7.27-7.15(m,4H),6.58(s,2H),5.09(d,J＝3.5Hz,2H),4.48(ddd,J＝9.0,7.7,4.7Hz,1H),3.58(dd,J＝13.5,4.6Hz,1H),3.30-3.24(m,1H),1.84(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.16,169.84,163.18,160.76,156.15,154.17,153.26,142.34,133.01,132.99,129.50,129.42,117.05,116.10,115.88,52.14,45.05,40.18,34.22,22.82.MS(ESI):Calcd for C17H17FN6O4S[M+H]+421.11,found421.16.
(11)制备2-(6-(6-(4-(3-(2-氨基乙氧基)丙酰基)哌嗪-1-基)吡啶-3-基)-1-氧代异吲哚-2-基)-2-苯基-N-(噻唑-2-基)乙酰胺：
称取N-Boc-3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酸200mg(0.71mmol)和HATU 290mg(0.76mmol)置于圆底烧瓶中，加入20mL无水二氯甲烷溶解，然后加入DIPEA 250μL(1.47mmol)，45℃回流反应15min，然后加入JBJ-07-149 300mg(0.59mmol)继续回流反应4h。经TLC检测反应完全，向反应液中加水淬灭，用水(100mL)和二氯甲烷(50mL×3)萃取，有机相合并，用饱和碳酸钠溶液(100mL×2)洗涤，再用饱和食盐水(100mL×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得黄色油状物。将产物用5mL二氯甲烷溶解，然后缓慢滴加2N HCl-EA溶液5mL，室温搅拌3h后，经TLC检测反应完全。向反应液中滴加饱和碳酸氢钠溶液调节pH至8～9，用水(80mL)和二氯甲烷(30mL×3)萃取，有机相合并，用饱和食盐水(100mL×1)洗涤，再经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得268mg黄色粉末状固体2g，两步总收率约为73％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.52(d,J＝2.5Hz,1H),8.01-7.84(m,3H),7.61(d,J＝8.1Hz,1H),7.49-7.35(m,6H),7.23(d,J＝3.5Hz,1H),6.95(d,J＝8.9Hz,1H),6.30(s,1H),4.81(d,J＝17.6Hz,1H),3.99(d,J＝17.6Hz,1H),3.67-3.49(m,14H),3.43(t,J＝5.6Hz,2H),2.74(t,J＝5.6Hz,2H),2.63(t,J＝6.6Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ169.52,169.22,168.14,158.91,158.58,146.19,141.23,138.19,138.10,136.59,135.26,132.78,129.89,129.53,129.27,129.12,124.82,124.74,120.09,114.19,107.67,71.02,70.08,70.04,67.23,58.88,48.88,45.22,45.04,44.90,41.09,40.66,33.30.
(12)依次称取FBnG 78mg(0.19mmol)，EDCI 43mg(0.25mmol)和HOBt 33mg(0.24mmol)置于圆底烧瓶中，加入5mL DMF溶解，然后加入DIPEA 87μL(0.52mmol)，室温搅拌15min后加入中间体4g 100mg(0.15mmol)，室温反应过夜，次日TLC检测反应完全。反应液加水淬灭，用水(50mL)和乙酸乙酯(30mL×3)萃取，有机相合并，用饱和碳酸钠溶液(60mL×1)洗涤，再用饱和食盐水(60mL×3)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，干法拌样柱层析得38mg白色固体Ⅰ-1，收率约为25％。
得到的(2R)-2-乙酰氨基-3-((2-氨基-9-(4-氟苄基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-8-基)硫代)-N-(2-(3-氧代-3-(4-(5-(3-氧基-2-(2-氧代-1-苯基-2-(噻唑-2-基氨基)乙基)异吲哚啉-5-基)吡啶-2-基)哌嗪-1-基)丙氧基)乙氧基)乙基)丙酰胺(Ⅰ-1)，其结构如下：
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.72(s,1H),10.73(s,1H),8.51(d,J＝2.6Hz,1H),8.44(d,J＝8.1Hz,1H),8.11(t,J＝5.7Hz,1H),7.96-7.90(m,2H),7.86(dd,J＝8.0,1.8Hz,1H),7.60(d,J＝8.1Hz,1H),7.49(t,J＝3.0Hz,1H),7.48-7.44(m,2H),7.44-7.42(m,1H),7.42-7.35(m,2H),7.27(d,J＝3.5Hz,1H),7.20(dd,J＝8.7,5.6Hz,2H),7.17-7.10(m,2H),6.92(d,J＝9.0Hz,1H),6.60(s,2H),6.33(s,1H),5.08(s,2H),4.78(d,J＝17.6Hz,1H),4.51(td,J＝8.2,5.1Hz,1H),3.99(d,J＝17.6Hz,1H),3.63(t,J＝6.6Hz,2H),3.54(dt,J＝18.8,3.6Hz,9H),3.47(s,6H),3.38(t,J＝6.1Hz,3H),3.28(dd,J＝13.3,8.3Hz,1H),3.19(p,J＝5.8Hz,2H),2.61(t,J＝6.6Hz,2H),1.85(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ170.26,169.99,169.54,168.87,168.22,162.93,160.99,158.56,157.91,156.19,154.18,153.23,146.18,142.72,141.19,138.15,136.55,134.88,133.00,132.69,129.93,129.59,129.51,129.44,129.26,124.74,120.12,117.06,116.04,115.87,114.55,107.63,70.06,69.18,67.20,58.71,52.75,48.92,45.20,45.09,44.87,41.10,35.22,33.31,23.01.MS(ESI):Calcd for C52H54FN13O8S2[M+H]+1072.37,found 1072.76.
实施例2
具体制备方法同实施例1，得到的(2R)-2-乙酰氨基-3-((2-氨基-9-(4-氟苄基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-8-基)硫代)-N-(2-(2-(3-氧代-3-(4-(5-(3-氧基-2-(2-氧代-1-苯基-2-(噻唑-2-基氨基)乙基)异吲哚啉-5-基)吡啶-2-基)哌嗪-1-基)丙氧基)乙氧基)甲氧基)乙基)丙酰胺(Ⅰ-2)，其结构如下：
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.72(s,1H),10.73(s,1H),8.52(d,J＝2.6Hz,1H),8.45(d,J＝8.1Hz,1H),8.11(t,J＝5.7Hz,1H),7.98-7.90(m,2H),7.86(dd,J＝8.0,1.8Hz,1H),7.61(d,J＝8.1Hz,1H),7.50(d,J＝3.6Hz,1H),7.48-7.44(m,2H),7.45-7.42(m,1H),7.42-7.37(m,2H),7.28(d,J＝3.7Hz,1H),7.21(dd,J＝8.7,5.6Hz,2H),7.18-7.12(m,2H),6.93(d,J＝8.9Hz,1H),6.61(s,2H),6.34(s,1H),5.08(s,2H),4.78(d,J＝17.6Hz,1H),4.51(td,J＝8.1,5.2Hz,1H),4.00(d,J＝17.6Hz,1H),3.64(t,J＝6.6Hz,2H),3.62-3.51(m,9H),3.51-3.42(m,11H),3.38(t,J＝6.1Hz,3H),3.28(dd,J＝13.4,8.3Hz,1H),3.19(p,J＝5.7Hz,2H),2.62(t,J＝6.7Hz,2H),1.85(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ170.25,169.95,169.53,168.86,168.21,162.94,161.00,158.57,157.91,156.17,154.19,153.22,146.19,142.70,141.19,138.15,136.55,134.90,133.04,132.70,129.93,129.58,129.51,129.45,129.26,124.79,120.12,117.07,116.04,115.87,114.54,107.62,70.23,70.16,70.04,69.19,67.25,58.70,52.75,48.91,45.21,45.09,44.88,41.10,35.24,33.32,23.02.MS(ESI):Calcd for C54H58FN13O9S2[M+H]+1116.40,found 1116.75.
实施例3
具体制备方法同实施例1，得到的(2R)-2-乙酰氨基-3-((2-氨基-9-(4-氟苄基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-8-基)硫代)-N-(15-氧代-15-(4-(5-(3-氧代-2-(2-氧代-1-苯基-2-(噻唑-2-基氨基)乙基)异吲哚-5-基)吡啶-2-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12-四氧基十五烷基)丙酰胺(Ⅰ-3)，其结构如下：
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.71(s,1H),10.77(s,1H),8.51(d,J＝2.6Hz,1H),8.44(d,J＝8.0Hz,1H),8.10(t,J＝5.7Hz,1H),7.98-7.90(m,2H),7.86(dd,J＝8.0,1.8Hz,1H),7.61(d,J＝8.1Hz,1H),7.51-7.36(m,7H),7.28(d,J＝3.5Hz,1H),7.20(dd,J＝8.6,5.4Hz,2H),7.14(t,J＝8.8Hz,2H),6.94(d,J＝9.0Hz,1H),6.65(s,1H),6.34(s,1H),5.08(s,2H),4.78(d,J＝17.5Hz,1H),4.50(td,J＝8.1,5.2Hz,1H),4.00(d,J＝17.6Hz,1H),3.64(t,J＝6.5Hz,2H),3.62-3.52(m,9H),3.51-3.45(m,14H),3.28(dd,J＝13.3,8.3Hz,1H),3.18(h,J＝7.1,6.4Hz,2H),2.62(t,J＝6.6Hz,2H),1.84(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ170.24,169.92,169.53,168.86,168.19,161.00,158.56,156.14,154.25,153.20,146.15,142.65,141.20,138.14,136.57,134.92,133.03,132.71,129.93,129.58,129.51,129.45,129.26,124.79,124.74,120.12,117.08,116.04,115.87,114.54,107.65,70.22,70.15,70.03,69.20,67.27,58.70,52.76,48.91,45.23,45.07,44.90,41.11,39.16,35.25,33.33,23.02.MS(ESI):Calcd for C56H62FN13O10S2[M+H]+1160.43,found1160.67
实施例4
具体制备方法同实施例1，得到的(2R)-2-乙酰氨基-3-((2-氨基-9-(4-氟苄基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-8-基)硫代)-N-(12-氧代-12-(4-(5-(3-氧代-2-(2-氧代-1-苯基-2-(噻唑-2-基氨基)乙基)异吲哚-5-基)吡啶-2-基)哌嗪-1-基)十二烷基)丙酰胺，其结构如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.66(s,1H),8.52(d,J＝2.6Hz,1H),8.41(d,J＝8.1Hz,1H),8.01(t,J＝5.6Hz,1H),7.96(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),7.92(d,J＝1.7Hz,1H),7.87(dd,J＝8.0,1.8Hz,1H),7.61(d,J＝8.1Hz,1H),7.49(d,J＝3.5Hz,1H),7.48-7.42(m,3H),7.41-7.37(m,2H),7.28(d,J＝3.6Hz,1H),7.20(dd,J＝6.0,2.7Hz,2H),7.17-7.13(m,2H),6.94(d,J＝9.0Hz,1H),6.55(s,2H),6.33(s,1H),5.08(s,2H),4.78(d,J＝17.6Hz,1H),4.46(td,J＝7.9,5.5Hz,1H),4.00(d,J＝17.6Hz,1H),3.56(dq,J＝16.0,6.8Hz,8H),3.44-3.39(m,1H),3.28(dd,J＝13.3,7.9Hz,1H),3.00(qd,J＝6.9,3.7Hz,2H),2.33(t,J＝7.4Hz,2H),1.84(s,3H),1.48(q,J＝7.2Hz,2H),1.37-1.32(m,2H),1.29-1.20(m,14H).13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ171.41,169.89,169.87,168.91,168.26,163.25,160.82,158.66,157.96,156.22,154.22,153.29,146.25,142.72,141.28,138.43,138.21,136.64,134.98,133.09,133.06,132.77,130.00,129.65,129.56,129.48,129.33,124.88,124.81,120.18,117.15,116.13,115.91,114.63,107.71,58.75,48.97,45.33,45.15,45.03,39.19,35.32,32.85,29.53,29.45,29.34,26.83,23.09.MS(ESI):Calcd for C57H64FN13O6S2[M+H]+1110.46,found 1110.82.
实施例5盐酸酸的制备
以实施例1所得的I-1化合物为例，将其溶解于乙酸乙酯中，通入HCl气体至饱和，置冰浴中放置，析出固体，为化合物I-1的盐酸盐。
实施例6 EGFR蛋白降解活性测试
将药物干预过的相应细胞收集，用预冷的PBS洗涤2次，PMSF与PIPA裂解液以1:100的比例混合，冰上裂解细胞20min，4℃，12000r/min*20min离心，取上清，即细胞总蛋白，用BCA法定量检测蛋白量，用5*蛋白上样缓冲液稀释蛋白后100℃变性5分钟。蛋白在SDS-PAGE电泳分离，转膜，封闭2小时，一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜，二抗1:1000孵育2小时，化学发光后X胶片显影，结果如表1所示。
表1化合物对野生型及突变型EGFR受体的降解活性
由表1可知，化合物I-1在PC-9细胞中对EGFRDel19具有中等的降解活性，在0.1μM时可使EGFRDel19降解约54％，但在1μM的高浓度时，降解效果明显下降；化合物I-2对H1299细胞中的EGFRWT具有中等的降解活性，在0.1μM时可使EGFRWT降解约42％，并且给药浓度升高后，降解效果变好；具有更长linker的I-3和I-4对EGFRWT与EGFRDel19则仅有弱降解活性。

Claims (6)

1.一种基于EGFR变构位点的AUTAC类化合物，其特征在于，包括式Ⅰ所示的化合物及其药学上可接受的盐：
其中，
X独立地为O，NH或CH2；
n为1～7的整数。
2.根据权利要求1所述的基于EGFR变构位点的AUTAC类化合物，其特征在于，为以下结构的化合物：
3.根据权利要求1所述的基于EGFR变构位点的AUTAC类化合物，其特征在于，所述药学上可接受的盐包括：与下列酸形成的加成盐:盐酸、氢嗅酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、茶二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸或苯甲酸；以及盐酸、氢嗅酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、苯磺酸或琉拍酸的酸成盐。
4.根据权利要求1所述的基于EGFR变构位点的AUTAC类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
化合物2与化合物3缩合，并脱Boc保护后得到化合物4，再经过与化合物5缩合反应之后得到化合物I；
5.一种根据权利要求1所述的基于EGFR变构位点的AUTAC类化合物或其药学上可接受的盐在制备预防或/和治疗癌症的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的癌症为多发性骨髓瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、结肠癌、髓母细胞瘤、急性粒细胞白血病、慢性白血病、前列腺癌、肝细胞瘤、肾细胞瘤、宫颈癌、皮肤癌、卵巢癌、结肠癌、神经胶质瘤、甲状腺癌或胰腺癌。
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