CN117088946A - 一种环状细菌素as-48的全生物合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种环状细菌素AS‑48的生物合成方法。本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的AS‑48线性多肽前体，使其在大肠杆菌中的表达水平获得显著的提高。本发明还提供了所述线性多肽前体的制备方法，实现了AS‑48线性多肽前体的的高效可溶表达，所述方法简便高效，原料简单，表达量高，分离纯化易行，便于大量表达，适合工业化生产；本发明还提供了一种环状细菌素AS‑48的全生物合成方法，实现了环状AS‑48及其突变体的高效合成；所述的环状AS‑48及其突变体的结构和抑菌活性与天然AS‑48一致。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种环状细菌素AS-48的全生物合成方法。
背景技术
抗菌肽作为天然食品防腐剂的重要代表，在杀灭或抑制食源性致病菌和腐败菌，保证食品质量与安全中发挥重要作用，相较于化学防腐剂，具有绿色环保、安全高效等优势。环状细菌素AS-48是羧基端和氨基端首尾相连的环状抗菌肽，与线性抗菌肽相比，具有更高的稳定性、更广谱的抑菌性能。因其稳定性好、抑菌能力强、安全性高和不产生耐药性等优势，环状细菌素AS-48有望发展成新型多肽类天然食品防腐剂。现阶段，以控制食品病原菌或腐败菌为目的，围绕环状细菌素AS-48开展的食品防腐科学研究已取得良好成效，为环状细菌素的工业化应用进行了有益探索。然而，囿于规模化制备技术的限制，目前环状细菌素尚未广泛应用于食品领域。
造成应用进展缓慢的主要原因之一是环状细菌素AS-48的体外合成研究相对滞后。天然来源的环状细菌素含量较低，分离纯化相对繁琐。利用高密度发酵技术，并在优化培养条件的基础上，仅能从1L肠粪球菌发酵液中分离得到11.16mg的环状AS-48；环状细菌素的体内生物合成途径复杂，合成基因簇至少涉及10个以上基因，因此难以通过基因调控增加代谢合成产率。由于氨基酸组成较多，且疏水性氨基酸占比50％以上，目前化学合成环状细菌素也难以实现。近年来，以大肠杆菌、毕赤酵母和昆虫细胞为主要表达系统，开展的抗菌肽重组表达研究已取得良好成效；然而，由于特殊的环状骨架结构，较高的疏水性氨基酸组成以及潜在的宿主毒性等问题，现阶段环状细菌素的异源表达也较为困难。虽然有研究利用大肠杆菌为宿主，融合表达了环状细菌素线性多肽前体，但最终得到的线性多肽前体的产率和抑菌活性均不理想。在化学固相合成线性多肽前体的基础上，利用酶促催化线性多肽首尾连接环化，可以实现环状细菌素AS-48的化学-酶促合成。然而，受限于AS-48线性多肽前体的化学合成，化学-酶促合成环状细菌素也难以实现大规模生产。
发明内容
针对现有合成技术存在的缺点和不足，本发明的第一目的在于提供一种环状细菌素AS-48的全生物合成方法。
本发明的第二目的在于提供一种环状细菌素AS-48线性多肽前体融合蛋白。
本发明的第三目的在于提供一种环状细菌素AS-48线性多肽前体。
本发明的第四目的在于提供一种环状细菌素AS-48。
本发明的目的主要通过以下技术方案实现：
一种环状细菌素AS-48线性多肽前体，具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。所述的氨基酸序列与环状AS-48的氨基酸序列SEQ ID NO:2相比，具有以下结构和氨基酸变化：失去环状骨架结构；Asn17-Val18之间的肽键断裂；Asn17的羧基端添加HVKKK五肽氨基酸基序。
编码上述线性多肽前体的DNA分子，具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。所述的核苷酸序列基于大肠杆菌表达系统对密码子进行了优化，能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。
一种环状细菌素AS-48线性多肽前体融合蛋白，具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。所述的氨基酸序列与上述AS-48线性多肽前体相比，在N末端分别融合了MBP-SUMO和MBP标签。
上述环状细菌素AS-48线性多肽前体融合蛋白的制备方法，包括如下制备步骤：将编码所述的AS-48线性前体的核苷酸序列克隆至原核表达质粒中，构建重组表达载体；再将所述的重组表达载体转化到原核表达系统中进行诱导表达，收集菌体沉淀，破碎纯化后得到所述的AS-48线性多肽前体重组融合蛋白；所述的原核表达质粒为含有MBP或MBP-SUMO标签的表达载体。
所述的原核表达质粒优选为pET-28a-MBP或pET-28a-MBP-SUMO，可以增加目的蛋白的表达产率和溶解性。
所述的原核表达系统优选为大肠杆菌表达系统；更优选为大肠杆菌OverExpressC43(DE3)，可以有效避免宿主毒性。
所述的诱导表达具体操作步骤优选为：将阳性转化体接种于LB培养液进行培养，当菌液OD600达到0.4～0.6时，加入终浓度为0.2～0.4mmol/L的IPTG，18～37℃诱导6～20h；所述的LB培养液中含有卡那霉素50～100μg/mL。
所述的破碎纯化的步骤优选为：破碎菌体细胞后，离心收集上清组分，经金属离子亲和层析纯化后，洗脱得到AS-48线性前体重组融合蛋白。
所述的破碎细胞的方法优选为：将菌体重悬于缓冲液A中，冰浴超声破碎法裂解细胞；所述缓冲液A的配方为20±5mM NaH2PO4-Na2HPO4、100±20mM NaCl，pH＝7。
所述的缓冲液A的用量优选为每克湿重菌体加入10mL缓冲液A。
所述的超声破碎法的条件优选为：功率为100～200W，超声2～4s，间隔2～4s，持续10～20min。
所述的离心收集上清液的操作优选为：4℃条件下12000g离心40min，弃沉淀，0.22μm微孔滤膜过滤，得到上清液。
所述的金属离子亲和层析纯化优选为Ni离子亲和层析。
所述的洗脱程序优选为先用缓冲液A平衡，再用缓冲液B洗脱；所述的缓冲液A的配方为20mM NaH2PO4-Na2HPO4、100mM NaCl，pH＝7；所述的缓冲液B的配方为：20mM NaH2PO4-Na2HPO4、100mM NaCl、500mM咪唑，pH＝7。
上述环状细菌素AS-48线性多肽前体的制备方法，包括上述环状细菌素AS-48线性多肽前体融合蛋白的制备方法中的所有步骤和如下制备步骤：
将所述的线性多肽前体重组融合蛋白在缓冲体系下进行第一次透析，然后与蛋白酶预混酶切，进一步在缓冲体系下进行第二次透析，再利用金属离子亲和层析和RP-HPLC分离酶切产物，冷冻干燥后收集AS-48线性多肽前体。
第一次透析的缓冲体系优选为缓冲液C，所述缓冲液C的配方为：50±10mM Tis-HCl、50±10mM NaCl、0.5±0.1mM EDTA、1±0.5mM DTT，pH 8.0。
第二次透析的缓冲体系优选为缓冲液A，所述缓冲液A的配方为：20±5mM NaH2PO4-Na2HPO4、100±20mM NaCl，pH＝7。
当环状细菌素AS-48线性多肽前体融合蛋白的N末端融合的是MBP标签时，所述的蛋白酶为TEV；当环状细菌素AS-48线性多肽前体融合蛋白的N末端融合的是MBP-SUMO标签时，所述的蛋白酶为Ulp1。
酶切体系中，底物与蛋白酶的当量比优选为50:1～100:1。
所述的酶切的温度优选为4～30℃，时长优选为1～12h；优选在缓冲液A下进行。
所述金属离子亲和层析优选为Ni离子亲和层析。
所述的Ni离子亲和层析采用的缓冲液优选为缓冲液A和缓冲液B。
所述RP-HPLC分离程序优选为：0-5min，5％乙腈；5-35min，5-90％乙腈；35-40min，90％乙腈；40-45min，90-5％乙腈；45-50min，5％乙腈。
一种环状细菌素AS-48的全生物合成方法，包括上述环状细菌素AS-48线性多肽前体的制备方法中的所有步骤和如下制备步骤：
将收集的AS-48线性多肽前体复溶于环化缓冲液中，加入环化酶催化AS-48线性多肽前体首尾环化，所得环化产物即为环状细菌素AS-48。
所述的环化酶优选为环化酶Butelase 1。
所述的环化缓冲液优选为缓冲液D；所述缓冲液D的配方为：20±5mM NaH2PO4-Na2HPO4、100±20mM NaCl、0.5±0.1mM EDTA、1±0.5mM DTT，pH 6.5。
所述的AS-48线性多肽前体与环化酶的当量比优选为50:1～100:1。
所述的环化反应温度优选为37～45℃，反应时间优选为6～12h，pH优选为pH 6.0～6.5。
一种环状细菌素AS-48及其突变体通过以上方法制成，具有SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:11所示氨基酸序列，其中N端氨基酸残基的氨基和C端氨基酸残基的羧基以肽键的形式连接形成环状骨架。
本发明对合成的环状细菌素AS-48及其突变体的结构和功能分析，包括二级结构和抑菌活性分析。
天然环状AS-48由5个α-螺旋结构组成，圆二色光谱(CD)在208nm和220nm存在两个明显负峰，具有典型的α-螺旋结构特征光谱，并且可以抑制革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的生长和繁殖。
使用远紫外CD光谱对合成的AS-48二级结构进行分析。将AS-48线性前体和环状AS-48分别溶解于缓冲液中，然后进行圆二色光谱分析。
所述缓冲液体系优选为缓冲液E；所述缓冲液E的配方组成优选为20mM NaH2PO4-Na2HPO4，pH 7.2。
所述溶解的多肽终浓度优选为10-50μM。
所述CD测试条件优选为：扫描波长范围190-260nm、带宽1nm、扫描步长1nm、狭缝宽度0.02nm、路径1mm、扫描速度为50nm/min。以缓冲液E作为空白对照，并通过减去空白对照光谱，对多肽样品光谱进行基线校正。
将培养至对数期的指示菌用新鲜LB培养基稀释至菌体密度为107CFU/mL。将AS-48用缓冲液E梯度稀释，取100μL的多肽样品与100μL的菌液均匀混合后加入96孔板，37℃条件下培养24h，利用酶标仪测定在OD600条件下的吸光度。以观测不到明显菌体生长时所加入的细菌素浓度定义为最小抑菌浓度。
所述指示菌优选为大肠杆菌ATCC 43895、沙门氏菌ATCC 14028、副溶血弧菌ATCC17969、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、李斯特氏菌ATCC 19118、肠粪球菌ATCC 29212。
与已有技术相比，本发明具有以下优势：
1、本发明采用大肠杆菌原核表达系统，高效表达了可溶性AS-48线性多肽前体重组融合蛋白，1L发酵液目的蛋白含量超200mg，相较于现有的AS-48线性前体的重组表达技术，本发明表达量高，且分离纯化便利，简单高效，易于大量表达，适合工业化生产。
2、本发明针对原核表达体系进行了密码子优化，并在AS-48线性多肽前体的N端融合了MBP或MBP-SUMO促溶标签，C末端掺入了HVKKK五肽基序，不但有助于增加目的蛋白的表达量和可溶性，而且可以有效屏蔽AS-48的抑菌活性和宿主毒性，促进目的蛋白在大肠杆菌胞内过量表达。
3、本发明利用TEV和Ulp1蛋白酶酶切AS-48线性前体融合蛋白，可以在温和条件下除去MBP或MBP-SUMO标签，不影响AS-48线性前体的正常结构和功能，相较于化学裂解，更加高效、经济和绿色环保。
4、本发明采用环化酶Butelase 1酶促催化AS-48线性多肽前体环化，生成的环状AS-48及其突变体的结构与功能与天然提取AS-48一致。而且，与现有化学环化策略相比，本发明更加便捷、高效和绿色环保，反应体系适合放大，易于工业化生产。。
5、相较于现有的环状细菌素合成技术，本发明的生物合成方法具有高效、便捷、快速、绿色环保等特点，制备方法具有可持续性，有助于促进环状细菌素在食品、医药等领域的应用。
附图说明
图1为AS-48线性多肽前体重组融合蛋白表达的SDS-PAGE图。
图2为AS-48线性多肽前体融合蛋白酶切前后的SDS-PAGE图。
图3为AS-48线性多肽前体分离纯化示意图。
图4为AS-48线性多肽前体的MALDI-TOF-MS质谱分析图。
图5为Butelase 1催化AS-48线性多肽前体环化的RP-HPLC分析图。
图6为Butelase 1催化AS-48线性多肽前体环化的MALDI-TOF-MS质谱分析图。
图7为生物合成的AS-48及其突变体的圆二色光谱图。
图8为生物合成的AS-48及其突变体的一级序列图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
除无特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
实施例1构建表达AS-48线性多肽前体重组融合蛋白的表达载体
构建含编码AS-48线性多肽前体核苷酸序列的重组载体，包括如下步骤：
(1)根据AS-48线性多肽前体的氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)，进行基于大肠杆菌表达系统的密码子优化，获得能在大肠杆菌中进行高效表达的DNA分子，利用重叠延伸PCR技术，人工合成编码所述AS-48线性多肽前体的DNA分子，具体如SEQ ID NO:5所示。
(2)将编码AS-48线性多肽前体的DNA分子与表达载体pET-28a-MBP或pET-28a-MBP-SUMO进行同源重组。
合成引物序列如下：
AS-48-FP1：5'-gggagaacctgtacttccagGTGGTAGAAGCAGGTGGTTGGG-3'；
AS-48-RP1：5'-tcggatccgtcgacgatatcTCACACGTGATTCAGTACAGTACCC-3'；
AS-48-FP2：5'-agatgctgatgggcggccgcGGGTCGGACTCAGAAGTCAATC-3'；
AS-48-RP2：5'-tcggatccgtcgacgatatcTCACACGTGATTCAGTACAGTACCC-3'；
pET-28a-MBP-FP1：5'-GATATCGTCGACGGATCCGA-3'；
pET-28a-MBP-RP1：5'-CTGGAAGTACAGGTTCTCCCCG-3'；
pET-28a-MBP-SUMO-FP1：5'-GATATCGTCGACGGATCCGA-3'；
pET-28a-MBP-SUMO-RP1：5'-GCGGCCGCCCATCAGCAT-3'；
在高保真2×PfuMax HiFi PCR ProMix(由广州英赞生物科技有限公司生产，EnzyValley，货号P217)的作用下(12.5μL)，以AS-48线性多肽前体基因作为模板(0.5μL)，以AS-48-FP1(1μL)为上游引物，AS-48-RP1(1μL)为下游引物，补充适量的灭菌水(10μL)，扩增携带同源臂的AS-48线性前体基因片段；以pET-28a-MBP质粒作为模板(0.5μL)，pET-28a-MBP-FP1为上游引物(1μL)，pET-28a-MBP-RP1(1μL)为下游引物，补充适量的灭菌水(10μL)，线性化扩增pET-28a-MBP，同源重组AS-48线性前体基因片段和线性化的pET-28a-MBP载体基因，构建pET-28a-MBP-AS-48重组表达载体。
在高保真2×PfuMax HiFi PCR ProMix(由广州英赞生物科技有限公司生产，EnzyValley，货号P217)的作用下(12.5μL)，以AS-48线性多肽前体基因作为模板(0.5μL)，以AS-48-FP2(1μL)为上游引物，AS-48-RP2(1μL)为下游引物，补充适量的灭菌水(10μL)，扩增携带同源臂的AS-48线性前体基因片段；以pET-28a-MBP-SUMO质粒作为模板(0.5μL)，pET-28a-MBP-SUMO-FP1为上游引物(1μL)，pET-28a-MBP-SUMO-RP1(1μL)为下游引物，补充适量的灭菌水(10μL)，线性化扩增pET-28a-MBP-SUMO，同源重组AS-48线性前体基因片段和线性化的pET-28a-MBP-SUMO载体基因，构建pET-28a-MBP-SUMO-AS-48重组表达载体。重组连接产物转化至DH5α感受态细胞(购于上海唯地生物科技有限公司)中。
PCR扩增条件具体为：98℃预变性30s，98℃变性10s，65℃-55℃退火30s，72℃延伸2-4min，共10个循环，每个循环退火温度下降1℃，然后继续98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2-4min，循环30次，最后72℃延伸5min结束。
(3)挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，并将阳性单克隆送往测序公司测序验证，筛选阳性克隆菌株。挑取测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌OverExpress C43(DE3)中进行诱导表达。
实施例2AS-48线性前体重组融合蛋白在大肠杆菌中的表达、鉴定与纯化
将实施例1获得的重组表达载体转化到宿主细胞大肠杆菌OverExpress C43(DE3)(购于上海唯地生物技术有限公司)中，挑选大肠杆菌阳性转化体，接种于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养液中，在摇床中于37℃振荡培养过夜作为种子液，取种子液按体积比1:100的比例接种至含有100μg/mL卡那霉素的LB培养液中，于37℃，180r/min条件下培养至菌液OD600达到0.5，向每瓶菌液加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，于37℃诱导表达5h后，离心收集菌体沉淀。
取上述1L发酵液发酵得到的菌体，按每克菌体加入10mL缓冲液A(20mM NaH2PO4-Na2HPO4、100mM NaCl，pH 7.0)重悬菌体，用超声波细胞破碎仪冰浴裂解菌体，超声条件为：功率150W，超声4s，间隔4s，持续15min。将破碎后的菌液在4℃下12000g/min离心30min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，备用。
Ni离子亲和层析纯化AS-48线性前体重组融合蛋白。将层析柱接入快速蛋白质纯化仪柱位阀中，用超纯水清洗系统和柱子，再用缓冲液A平衡，然后用样品泵上样，用缓冲液A冲洗杂蛋白，然后用缓冲液B(20mM NaH2PO4-Na2HPO4、100mM NaCl、500mM咪唑，pH 7.0)洗脱目的蛋白。收集IPTG诱导前后的菌液，破碎离心后的上清液以及纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达情况。
结果如图1所示，箭头所指即为表达的目的蛋白，蛋白表达含量高，且均以可溶形式存在。分析收集的目的蛋白含量，1L发酵液分别纯化得到202.59mg的MBP-AS-48和175.32mg的MBP-SUMO-AS-48重组融合蛋白。
实施例3AS-48线性前体重组融合蛋白的酶切、纯化与鉴定
将实施例1获得的重组表达载体转化到宿主细胞大肠杆菌OverExpress C43(DE3)中，挑选大肠杆菌阳性转化体，接种于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养液中，在摇床中于37℃振荡培养过夜作为种子液，取种子液按体积比1:50的比例接种至含有75μg/mL卡那霉素的新鲜LB培养液中，于37℃，200r/min条件下培养至菌液OD600达到0.6，向菌液中加入IPTG至终浓度为0.3mmol/L，于37℃诱导表达6h后，离心收集菌体沉淀。向每克菌体加入10mL缓冲液A重悬菌体，用超声波细胞破碎仪冰浴裂解菌体，超声条件为：功率120W，超声5s，间隔5s，持续20min。将破碎后的菌液在4℃下12000g/min离心30min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤。将上清液加载至预先用缓冲液A平衡的Ni离子亲和层析柱中，先用缓冲液A冲洗杂蛋白，再用缓冲液B洗脱目的蛋白，制备AS-48线性前体重组融合蛋白。
将实施列2中的AS-48线性前体重组融合蛋白在缓冲液C(50mM Tis-HCl、50mMNaCl、0.5mM EDTA、1mM DTT，pH 8.0)透析过夜后，按照底物与酶比50:1当量加入TEV蛋白酶或Ulp1蛋白酶，30℃下酶切2h，即可得到AS-48线性多肽前体，SDS-PAGE蛋白电泳检测酶切效果。结果如图2所示，TEV和Ulp1蛋白酶分别可以将MBP标签和MBP-SUMO标签去除，得到AS-48线性多肽前体。
利用图3所示示意图对AS-48线性多肽前体进行分离纯化。将酶切后的产物透析至缓冲液A中，然后加载至预先用缓冲液A平衡的Ni离子亲和层析柱中，收集穿透液，并进一步继续加载至半制备RP-HPLC中，在洗脱程序为：0-5min，5％乙腈；5-35min，5-90％乙腈；35-40min，90％乙腈；40-45min，90-5％乙腈；45-50min，5％乙腈的作用下，收集目的产物峰，得到纯度达95％的AS-48线性多肽前体。
进一步采用MALDI-TOF-MS鉴定目的产物。结果如图4所示。收集的目的产物分子量分别为7786.52Da和7846.51Da，与理论分子量7788.35Da和7845.40Da一致，表明AS-48线性多肽前体制备成功。1L发酵液分别纯化得到19.48mg的AS-48线性多肽前体(如SEQ ID NO:1所示)和29.97mg的G-AS-48线性多肽前体突变体(如SEQ ID NO:10所示)。
实施例4Butelase 1催化AS-48线性多肽前体环化生成环状AS-48及其突变体
将实施例1获得的重组表达载体转化到宿主细胞大肠杆菌OverExpress C43(DE3)中，挑选大肠杆菌阳性转化体，接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，在摇床中于37℃振荡培养过夜作为种子液，取种子液按体积比1:75的比例接种至含有卡那霉素50μg/mL的新鲜LB培养液中，于37℃，180r/min条件下培养至菌液OD600达到0.4，向菌液中加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，于37℃诱导表达6h后，离心收集菌体沉淀。向每克菌体加入10mL缓冲液A重悬菌体，用超声波细胞破碎仪冰浴裂解菌体，超声条件为：功率180W，超声3s，间隔3s，持续12min。将破碎后的菌液在4℃下12000g/min离心30min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤。将上清液加载至预先用缓冲液A平衡的Ni离子亲和层析柱中，先用缓冲液A冲洗杂蛋白，再用缓冲液B洗脱目的蛋白，制备AS-48线性前体重组融合蛋白。
将实施例2中AS-48线性前体重组融合蛋白在缓冲液C中透析过夜后，按照底物与酶比100:1当量加入TEV蛋白酶和Ulp1蛋白酶，25℃下酶切4h，得到AS-48线性多肽前体。将酶切产物在缓冲液A中透析过夜后加载至预先用缓冲液A平衡的Ni离子亲和层析柱中，收集穿透液，继续加载至半制备RP-HPLC中，在洗脱程序为：0-5min，5％乙腈；5-35min，5-90％乙腈；35-40min，90％乙腈；40-45min，90-5％乙腈；45-50min，5％乙腈的作用下，得到纯度达95％的AS-48线性多肽前体，冷冻干燥后备用。
将实施例3中的AS-48线性多肽前体复溶于环化反应缓冲液D中(20mM NaH2PO4-Na2HPO4、100mM NaCl、0.5mM EDTA、1mM DTT，pH 6.5)，然后按照底物与酶比为50:1的当量加入环化酶Butelase 1，37℃下反应12h。取20μL的反应液进行RP-HPLC分析。结果如图5所示，在Butelase 1的催化作用下，AS-48线性多肽前体色谱峰降低，在其出峰位置约4min后出现新的色谱峰。通过液相峰面积计算环化产物的得率，计算反应产物得率约为50-60％。为进一步确定反应产物，接取产物峰液相的流出液，通过MALDI-TOF-MS分析鉴定。结果如图6所示，产物的分子量分别为7205.92Da和7148.71Da，与理论分子量7206.61Da和7149.56Da一致，确定该产物峰即为环化产物，反应产率即为环化产率。经计算，1L发酵液约可分别制备得到10.28mg的环状AS-48和19.22mg的环状G-AS-48突变体(图7)。
实施例5生物合成AS-48和G-AS-48的结构与功能分析
将实施例1获得的重组表达载体转化到宿主细胞大肠杆菌OverExpress C43(DE3)中，挑选大肠杆菌阳性转化体，接种于含有卡那霉素50μg/mL的LB培养液中，在摇床中于37℃振荡培养过夜作为种子液，取种子液按体积比1:100的比例接种至含有卡那霉素50μg/mL的新鲜LB培养液中，于37℃，200r/min条件下培养至菌液OD600达到0.6，向菌液中加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，于37℃诱导表达5h后，离心收集菌体沉淀。向每克菌体加入10mL缓冲液A重悬菌体，用超声波细胞破碎仪冰浴裂解菌体，超声条件为：功率160W，超声4s，间隔6s，持续20min。将破碎后的菌液在4℃下12000g/min离心30min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤。将上清液加载至预先用缓冲液A平衡的Ni离子亲和层析柱中，先用缓冲液A冲洗杂蛋白，再用缓冲液B洗脱目的蛋白，制备AS-48线性前体重组融合蛋白。
将实施例2中AS-48线性前体重组融合蛋白在缓冲液C中透析过夜后，按照底物与酶比75:1当量加入TEV蛋白酶和Ulp1蛋白酶，4℃下酶切12h，得到AS-48线性多肽前体。将酶切产物透析至缓冲液A中过夜后，再次加载至预先用缓冲液A平衡的Ni离子亲和层析柱中，收集穿透液，继续加载至半制备RP-HPLC中，在洗脱程序为：0-5min，5％乙腈；5-35min，5-90％乙腈；35-40min，90％乙腈；40-45min，90-5％乙腈；45-50min，5％乙腈的作用下，得到纯度达97％的AS-48线性多肽前体，冷冻干燥后备用。
将实施例3中的AS-48线性多肽前体复溶于环化反应缓冲液D中，然后按照底物与环化酶Butelase 1比为100:1的比例加入Butelase 1，40℃下反应8h，制备得到环状AS-48和环状G-AS-48突变体。
将实施例4中的环状AS-48和G-AS-48冷冻干燥后，取部分样品分别溶于缓冲液E中(20mM NaH2PO4-Na2HPO4，pH 7.2)至终浓度为25μM，然后进行CD分析。CD测试条件设置为：扫描波长范围190-260nm、带宽1nm、扫描步长1nm、狭缝宽度0.02nm、路径1mm、扫描速度为50nm/min。以缓冲液E作为空白对照，并通过减去空白对照光谱，对多肽样品光谱进行基线校正。结果如图8所示，合成的环状AS-48和G-AS-48均具有典型的α-螺旋特征光谱，在208和220nm处形成明显负峰，表明正确的二级结构已经形成。
将实施例4中的环状AS-48和G-AS-48冷冻干燥后，取部分样品分别溶于缓冲液E中(20mM NaH2PO4-Na2HPO4，pH 7.2)至终浓度为24μM，然后进行抑菌活性分析。结果如表1所示，本发明合成的AS-48和G-AS-48对大肠杆菌ATCC 43895、沙门氏菌ATCC 14028、副溶血弧菌ATCC 17969、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、李斯特氏菌ATCC 19118和肠粪球菌ATCC29212具有不同程度的抑菌活性，其最低抑菌浓度与天然提取AS-48类似，表明合成的环状细菌素具有正确的功能活性。
表1生物合成的AS-48及其突变体的抑菌谱与MIC值。
实施例6本发明中的AS-48合成方法与现有合成方法比较
利用高密度发酵技术，并在优化培养条件的基础上，约能从1L肠粪球菌的代谢产物中分离得到11.16mg的环状AS-48，制备产率相对较低。亦有研究利用大肠杆菌异源表达AS-48线性突变体，但最终得到的线性突变体的表达产率和抑菌活性均不理想。通过特殊的化学交联手段可以化学固相合成环状AS-48，但合成途径极为复杂，合成产率也较低，此外，较高的经济花费也让化学合成AS-48难以实现大规模制备。
本发明首次实现环状细菌素AS-48的全生物合成，与天然提取和化学合成相比，具有更高的合成产率；同时，相较于以前的大肠杆菌重组表达，本发明合成的环状AS-48具有更为正确的二级结构以及更强的抑菌活性。
实施例7表达载体的筛选
在本发明的研究过程中，曾尝试用pET-28a-SUMO、pET-28a-Trx、pET-31b-SUMO和pET-28a等4种表达载体来重组表达AS-48线性多肽前体及其融合蛋白。
构建的pET-28a-AS-48重组载体，表达的重组蛋白为甲硫氨酸M+AS-48线性多肽前体，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。将pET-28a-AS-48重组表达载体转入大肠杆菌OverExpress C43(DE3)中进行诱导表达，结果并无明显目的蛋白产生。
构建的pET-28a-SUMO-AS-48、pET-28a-Trx-AS-48重组载体，表达的重组蛋白为SUMO或Trx标签+AS-48线性多肽前体，氨基酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。将pET-28a-SUMO-AS-48、pET-28a-Trx-AS-48重组表达载体转入大肠杆菌OverExpress C43(DE3)中进行表达，结果也仅有极少量融合蛋白表达。
构建的pET-31b-SUMO-AS-48重组表达载体，表达的重组蛋白为KSI-SUMO标签+AS-48线性多肽前体，氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。将pET-31b-SUMO-AS-48重组表达载体转入大肠杆菌OverExpress C43(DE3)中表达。结果显示目标蛋白虽然高水平表达，但全部以包涵体的形式存在，需要经历复杂的变性和复性的操作后才能得到可溶的AS-48线性多肽前体融合蛋白。
构建的pET-28a-MBP-AS-48和pET-28a-MBP-SUMO-AS-48重组表达载体，表达的重组蛋白为MBP或MBP-SUMO标签+AS-48线性多肽前体，氨基酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示。将pET-28a-MBP-AS-48或pET-28a-MBP-SUMO-AS-48重组表达载体转入大肠杆菌OverExpress C43(DE3)中诱导表达。结果显示目标蛋白表达产率高、且均为可溶性表达，经纯化、酶切和环化后即可得到环状AS-48及其突变体。
综上，经过多种表达载体的筛选研究，本发明优选采用含有MBP或MBP-SUMO标签的表达载体。
实施例8表达菌株的筛选
在本发明研究过程中，曾尝试过用大肠杆菌BL21(DE3)，大肠杆菌ROSETTA(DE3)，大肠杆菌SHuffle T7和大肠杆菌OverExpress C43(DE3)表达菌株来表达AS-48线性多肽前体重组融合蛋白。
将实施例1获得的重组载体转化到宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)、ROSETTA(DE3)和SHuffle T7中，分别挑选大肠杆菌阳性转化体进行诱导表达，但在种子液扩大培养和诱导表达过程中常常出现细胞无法正常生长，甚至溶菌等情况。将大肠杆菌表达宿主替换为大肠杆菌OverExpress C43(DE3)后，宿主细胞生长和表达均正常，无明显细胞死亡等异常情况。
综上，经过表达菌株的筛选研究，得到优选表达菌株为大肠杆菌OverExpress C43(DE3)。
实施例9分子改造优化
在本发明的研究过程中，曾尝试过5种突变方案。
初期尝试表达C末端为HV二肽的MBP/MBP-SUMO-AS-48融合蛋白，但未能达到理想表达水平。为此，本发明尝试在HV的C末端继续掺入K、KK、KKK、HHHHHH和KKKHHH等5种不同的氨基酸基序。按照实施例2中的表达方法诱导表达，结果显示当C末端为KKK的MBP/MBP-SUMO-AS-48融合蛋白具有较高的表达水平。同时基于C末端KKK三肽基序对Butelase 1催化环化的有益影响，本发明优选HVKKK作为MBP/MBP-SUMO-AS-48融合蛋白的C末端氨基酸基序。
综上，以分子改造AS-48的C末端为HVKKK基序，作为优选方案。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种环状细菌素AS-48线性多肽前体，其特征在于：具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
2.编码权利要求1中所述的线性多肽前体的DNA分子，其特征在于：具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
3.一种环状细菌素AS-48线性多肽前体融合蛋白，其特征在于：具有SEQ ID NO:3或SEQID NO:4所示氨基酸序列。
4.权利要求3中所述的环状细菌素AS-48线性多肽前体融合蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下制备步骤：将编码所述的AS-48线性前体的核苷酸序列克隆至原核表达质粒中，构建重组表达载体；再将所述的重组表达载体转化到原核表达系统中进行诱导表达，收集菌体沉淀，破碎纯化后得到所述的AS-48线性多肽前体重组融合蛋白；所述的原核表达质粒为含有MBP标签或MBP-SUMO标签的表达载体。
5.根据权利要求4所述的环状细菌素AS-48线性多肽前体融合蛋白的制备方法，其特征在于：
含有MBP标签的表达载体为pET-28a-MBP；含有MBP-SUMO标签的表达载体为pET-28a-MBP-SUMO；
所述的原核表达系统为大肠杆菌表达系统；
所述的诱导表达具体操作步骤为：将阳性转化体接种于LB培养液进行培养，当菌液OD600达到0.4～0.6时，加入终浓度为0.2～0.4mmol/L的IPTG，18～37℃诱导6～20h；所述的LB培养液中含有卡那霉素50～100μg/mL；
所述的破碎纯化的步骤为：破碎菌体细胞后，离心收集上清组分，经金属离子亲和层析纯化后，洗脱得到AS-48线性前体重组融合蛋白；
所述的破碎菌体细胞的方法为：将菌体重悬于缓冲液A中，冰浴超声破碎法裂解细胞；所述缓冲液A的配方为20±5mM NaH2PO4-Na2HPO4、100±20mM NaCl，pH＝7；
所述的金属离子亲和层析纯化为Ni离子亲和层析；
所述的洗脱的程序为先用缓冲液A平衡，再用缓冲液B洗脱；所述的缓冲液A的配方为20mM NaH2PO4-Na2HPO4、100mM NaCl，pH＝7；所述的缓冲液B的配方为：20mM NaH2PO4-Na2HPO4、100mM NaCl、500mM咪唑，pH＝7。
6.权利要求1中所述的环状细菌素AS-48线性多肽前体的制备方法，其特征在于：包括权利要求4或5中所述的环状细菌素AS-48线性多肽前体融合蛋白的制备方法中的所有步骤和如下制备步骤：将所述的线性多肽前体重组融合蛋白在缓冲体系下进行第一次透析，然后与蛋白酶预混酶切，进一步在缓冲体系下进行第二次透析，再利用金属离子亲和层析和RP-HPLC分离酶切产物，冷冻干燥后收集AS-48线性多肽前体。
7.根据权利要求6所述的环状细菌素AS-48线性多肽前体的制备方法，其特征在于：
第一次透析的缓冲体系为缓冲液C，所述缓冲液C的配方为：50±10mM Tis-HCl、50±10mM NaCl、0.5±0.1mM EDTA、1±0.5mM DTT，pH 8.0；
第二次透析的缓冲体系为缓冲液A，所述缓冲液A的配方为：20±5mM NaH2PO4-Na2HPO4、100±20mM NaCl，pH＝7；
当环状细菌素AS-48线性多肽前体融合蛋白的N末端融合的是MBP标签时，所述的蛋白酶为TEV；当环状细菌素AS-48线性多肽前体融合蛋白的N末端融合的是MBP-SUMO标签时，所述的蛋白酶为Ulp1；
酶切体系中，底物与蛋白酶的当量比为50:1～100:1；
所述的酶切的温度为4～30℃，时长为1～12h，在缓冲液A下进行；
所述金属离子亲和层析优选为Ni离子亲和层析；
所述的Ni离子亲和层析采用的缓冲液为缓冲液A和缓冲液B；
所述RP-HPLC分离程序为：0-5min，5％乙腈；5-35min，5-90％乙腈；35-40min，90％乙腈；40-45min，90-5％乙腈；45-50min，5％乙腈。
8.一种环状细菌素AS-48的全生物合成方法，其特征在于：包括权利要求6或7中所述的环状细菌素AS-48线性多肽前体的制备方法中的所有步骤和如下制备步骤：将收集的AS-48线性多肽前体复溶于环化缓冲液中，加入环化酶催化AS-48线性多肽前体首尾环化，所得环化产物即为环状细菌素AS-48。
9.根据权利要求6所述的环状细菌素AS-48的全生物合成方法，其特征在于：
所述的环化酶为环化酶Butelase 1；
所述的环化缓冲液为缓冲液D；所述缓冲液D的配方为：20±5mM NaH2PO4-Na2HPO4、100±20mM NaCl、0.5±0.1mM EDTA、1±0.5mM DTT，pH 6.5；
所述的AS-48线性多肽前体与环化酶的当量比为50:1～100:1；
所述的环化的反应温度为37～45℃，反应时间为6～12h，pH为pH 6.0～6.5。
10.一种环状细菌素AS-48及其突变体，其特征在于：具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:11所示氨基酸序列，其中N端氨基酸残基的氨基和C端氨基酸残基的羧基以肽键的形式连接形成环状骨架。
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