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CN117070564B - 一种用于合成环形rna的质粒及其构建方法与一种环形rna及其体外合成方法 - Google Patents

一种用于合成环形rna的质粒及其构建方法与一种环形rna及其体外合成方法 Download PDF

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CN117070564B CN202311039316.7A CN202311039316A CN117070564B CN 117070564 B CN117070564 B CN 117070564B CN 202311039316 A CN202311039316 A CN 202311039316A CN 117070564 B CN117070564 B CN 117070564B
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intron
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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于合成环形RNA的质粒及其构建方法与一种环形RNA及其体外合成方法。本发明所述质粒包括空载载体和结构单元；所述空载载体为pcDNA3.1质粒经过酶切后的产物；所述结构单元从3'端到5'端依次包括：3'T4intron‑CVB3‑IRES、目标序列、5'6×polyAC‑CVB3‑IRES、5'T4intron arm。利用该质粒体外合成的环形RNA能抵御RNase R的降解，并能在体内翻译蛋白。

Description

一种用于合成环形RNA的质粒及其构建方法与一种环形RNA及 其体外合成方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于合成环形RNA的质粒及其构建方法与一种环形RNA及其体外合成方法。
背景技术
环形RNA(circle RNA)是真核细胞内发现的，一种单链，共价闭环的，非编码的RNA形式。相对于线性信使mRNA，环形RNA更稳定，更长的半衰期，在细胞内能更高产蛋白。近年，可翻译的环状RNA(circRNAs)正成为一种重要的蛋白瞬时表达载体，具有很高的潜力，有望替代线性信使mRNA，重塑RNA制药产业的格局。
利用Anabaena或者T4噬菌体的重排内含子-外显子(Permutated Intron-Exon,PIE)，进行RNA转录本的自我拼接，是一种有效的RNA环状化方法。以T4噬菌体胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase,Td)的PIE为例，这种I型PIE的DNA结构设计，一般从左往右，包含3'内含子同源臂(3'intron arm)，3'外显子拼接序列(E2,CTACCGTTTAATATTGCGTCACC)，目标基因cDNA编码序列，5'外显子拼接序列(E1，TTGGGT)，5'内含子同源臂(5'intron arm)。这种DNA结构可以在体外由T7/T3启动子，细胞内由U6或者CMV启动子进行RNA转录，产生的RNA转录本自带核酸酶活性，在GTP和Mg2+作用下，进行RNA拼接和环化。环化后的RNA切除了3'和5'内含子同源臂，只保留了部分外显子拼接序列(E2-E1，TTGGGTCT)，以及中间插入的目标基因cDNA。
如果在左边3'内含子同源臂-E2外显子拼接序列后面，插入核糖体重新进入序列，如IRES，该工程化的环状RNA可以在真核细胞中进行高水平的蛋白表达。但这种质粒构建策略，导致RNA拼接环化后，RNA链上仍有外显子部分序列残留(TdE2-E1，TTGGGTCT)，该序列在体内仍然能够引起一定的免疫反应。
基于此提出本发明。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的为提供一种可以大幅降低免疫反应风险，并能在细胞内翻译蛋白的环形RNA，具体涉及一种用于合成环形RNA的质粒及其构建方法与一种环形RNA及其体外合成方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于合成环形RNA的质粒，所述质粒包括空载载体和结构单元；
所述空载载体为pcDNA3.1质粒经过酶切后的产物；
所述结构单元从3'端到5'端依次包括：3'T4 intron-CVB3-IRES、目标序列、5'6×polyAC-CVB3-IRES、5'T4 intron arm；
所述3'T4 intron-CVB3-IRES的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述5'6×polyAC-CVB3-IRES的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述5'T4 intron arm的序列如SEQ ID NO.3所示。
作为优选，所述酶切为双酶切，所述双酶切为利用EcoR I和Xho I内切酶进行酶切；
所述酶切的温度为36～38℃；
所述酶切的时间为1.8～2.2h。
作为优选，扩增所述3'T4 intron-CVB3-IRES的模板为T4 intron PIE fragment；
扩增所述3'T4 intron-CVB3-IRES的引物组合为3'arm-F和3'arm-R；
所述T4 intron PIE fragment的序列如SEQ ID NO.4所示；
所述3'arm-F的序列如SEQ ID NO.5所示；
所述3'arm-R的序列如SEQ ID NO.6所示。
作为优选，扩增所述5'6×polyAC-CVB3-IRES的模板为T4 intron PIE fragment；
扩增所述5'6×polyAC-CVB3-IRES的引物组合为polyAC-F和5'arm-R；
所述T4 intron PIE fragment的序列如SEQ ID NO.4所示；
所述polyAC-F的序列如SEQ ID NO.7所示；
所述5'arm-R的序列如SEQ ID NO.8所示。
作为优选，扩增所述5'T4 intron arm的模板为T4 intron PIE fragment；
扩增所述5'T4 intron arm的引物组合为TdE2-1C-F和TdE2-1C-R；
所述T4 intron PIE fragment的序列如SEQ ID NO.4所示；
所述TdE2-1C-F的序列如SEQ ID NO.9所示；
所述TdE2-1C-R的序列如SEQ ID NO.10所示。
作为优选，所述扩增的反应体系包括如下组分：
2×Phanta Max Buffer 24～26μl、9～11mM dNTP各0.8～1.2μl、上游引物1.5～2.5μl、下游引物1.5～2.5μl、扩增的模板0.8～1.2ng、Phanta Max Super-FidelityDNAPolymerase 0.8～1.2μl、ddH2O补足至50μl；
所述扩增的反应程序如下：
94～96℃预变性2.8～3.2min；94～96℃变性14～16s、54～56℃退火14～16s、71～73℃延伸0.8～1.2min，28～32个循环；71～73℃终延伸4.5～5.5min。
本发明还提供了所述的质粒的构建方法，包括如下步骤：
将3'T4intron-CVB3-IRES、目标序列、5'6×polyAC-CVB3-IRES、5'T4intron arm克隆至空载载体上，得到重组产物；将所述的重组产物转化至感受态细胞中，培养，得到质粒；
所述克隆时还包括2×Hieff Clone Universal Enzyme Premix；
所述克隆时的反应体系如下：
3'T4intron-CVB3-IRES 0.14～0.16pmol、目标序列0.14～0.16pmol、5'6×polyAC-CVB3-IRES 0.14～0.16pmol、5'T4intron arm 0.14～0.16pmol、空载载体0.04～0.06pmol、2×Hieff Clone Universal Enzyme Premix 9～11μl、ddH2O补足至20μl；
所述克隆的温度为48～52℃；
所述克隆的时间为14～16min；
所述感受态细胞为DH5α感受态细菌；
所述培养时的培养基为含有90～110μg/mL氨苄青霉素的LB培养基。
本发明还提供了所述的质粒或所述的构建方法构建得到的质粒在合成无痕且具有翻译功效的环形RNA中的应用。
本发明还提供了一种体外合成环形RNA的方法，包括如下步骤：
(1)利用限制性内切酶将所述的质粒或所述的构建方法构建得到的质粒进行酶切，收集酶切产物，得到线性化质粒；
(2)将所述线性化质粒进行转录，得到转录RNA；
(3)将所述转录RNA进行环化、纯化，得到环形RNA；
所述限制性内切酶为Xho I；
所述酶切的温度为36～38℃；
所述酶切的时间为1.8～2.2h；
所述转录的反应体系包括如下组分：
10×Reaction Buffer1.8～2.2μl、ATP溶液1.8～2.2μl、GTP溶液1.8～2.2μl、CTP溶液1.8～2.2μl、UTP溶液1.8～2.2μl、线性化质粒500ng～1μg、T7 RNA聚合酶1.8～2.2μl、ddH2O补足至20μl；
所述转录的温度为36～38℃；
所述转录的时间为1.8～2.2h；
所述环化、纯化的步骤如下：
(3.1)将所述转录RNA置于65～75℃的条件下，处理4.5～5.5min后，冷却2.5～3.5min，得到中间物1；
(3.2)在所述中间物1中加入GTP溶液，50～60℃处理12～18min，得到中间物2；
(3.3)在所述中间物2中加入160μlddH2O、20μl醋酸钠，混匀，得到中间物3；
(3.4)将所述的中间物3与酚/氯仿混合液混合，11000～13000rpm离心4.5～5.5min，取上层水相得到中间物4；
(3.5)将所述中间物4与氯仿混合，11000～13000rpm离心4.5～5.5min，取上层水相得到中间物5；
(3.6)将所述中间物5与无水乙醇混合，孵育25～35min后，11000～13000rpm离心13～17min，弃上清后，沉淀加入450～550μl 65～75vt％乙醇，11000～13000rpm离心13～17min，弃上清，沉淀即为中间物6；
(3.7)在所述中间物6中加入20～50μlddH2O，得到RNA溶液；
(3.8)将所述的RNA溶液与RNaseR反应13～17min后，重复步骤(3.3)～(3.7)1～2次，得到环形RNA。
本发明还提供了利用所述的体外合成环形RNA的方法得到的环形RNA，所述环形RNA能抵御RNase R的降解，并能在细胞内翻译蛋白。
本发明提供了一种用于合成环形RNA的质粒及其构建方法与一种环形RNA及其体外合成方法。
利用本发明的质粒可以体外合成产量提高4倍的环形RNA，并且得到的环形RNA25％能抵御RNase R的降解，较直接转录自发形成的环形RNA只有2％能抵御RNase R的降解具有显著提高。
本发明是将T4噬菌体的重排内含子-外显子(PIE)的核心外显子拼接序列(E2-E1)，设计在CBV3病毒的核糖体重新进入序列(IRES)第677碱基位置，同时对678碱基进行T-C的碱基突变，以便兼容核心E1拼接序列。这样CVB3-IRES分为3'和5'端，左边3'CVB3-IRES接在3'intron同源臂后面，中间插入目标序列和6×PolyAC的翻译终止序列，然后右边接上5'CVB3-IRES和5'intron arm。这样的PIE结构介导的核酸酶自我催化的拼接能力，在体外或细胞体内进行自我环化，只保留了CVB3-IRES，target cDNA和蛋白翻译终止序列6×PolyAC的干净片段，并能在细胞内进行高水平的蛋白翻译。这种策略适用于任何目标基因RNA的环化。
附图说明
图1为pcDNA3-CVB3-IRES-circEGFP-6×polyAC质粒图谱。
图2为circEGFP的qPCR检测结果。
图3为circEGFP在细胞内的表达情况。
具体实施方式
SEQ ID NO.1为：GGGAGACCCTCGAATGGAATTGGTTCTACATAAATGCCTAACGACTATCCCTTTGGGGAGTAGGGTCAAGTGACTCGAAACGATAGACAACTTGCTTTAACAAGTTGGAGATATAGTCTGCTCTGCATGGTGACATGCAGCTGGATATAATTCCGGGGTAAGATTAACGACCTTATCTGAACATAATGCTATACCACTTAGCTTGAAAGAGGTTAAAACATTACAATTCATTGTTAAGTTGAATACAGCAAA。
SEQ ID NO.2为：
AAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACTTAAAACAGCCTGTGGGTTGATCCCACCCACAGGCCCATTGGGCGCTAGCACTCTGGTATCACGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTTATACCCCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTAACACACACCGATCAACAGTCAGCGTGGCACACCAGCCACGTTTTGATCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAGCGTTCGTTATCCGGCCAACTACTTCGAAAAACCTAGTAACACCGTGGAAGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCACTACCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGAAACCCATGGGACGCTCTAATACAGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACACACCCTCAAGCCAGAGGGCAGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCATTTTATTCCTATACTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAGAGATCGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGACTAATAGAGCTATTATATATCCCTTTGTTGGGT。
SEQ ID NO.3为：
TAATTGAGGCCTGAGTATAAGGTGACTTATACTTGTAATCTATCTAAACGGGGAACCTCTCTAGTAGACAATCCCGTGCTAAATTGTAGGACTAATTCCATTTATCAGATTTCTAG。
SEQ ID NO.4所述的序列为北京擎科生物科技有限公司生物合成得到的。
T4 intron PIE fragment的序列的形成方法：将T4噬菌体的重排内含子-外显子(PIE)的核心外显子拼接序列(E2-E1)，设计在CBV3病毒的核糖体重新进入序列(IRES)第677碱基位置，同时对678碱基进行T-C的碱基突变，以便兼容核心E1拼接序列。这样CVB3-IRES分为3'和5'端。3'CVB3-IRES接在3'intron同源臂后，之后为6×PolyAC的翻译终止序列、5'CVB3-IRES和5'intron arm。
SEQ ID NO.4为：
GGGAGACCCTCGAATGGAATTGGTTCTACATAAATGCCTAACGACTATCCCTTTGGGGAGTAGGGTCAAGTGACTCGAAACGATAGACAACTTGCTTTAACAAGTTGGAGATATAGTCTGCTCTGCATGGTGACATGCAGCTGGATATAATTCCGGGGTAAGATTAACGACCTTATCTGAACATAATGCTATACCACTTAGCTTGAAAGAGGTTAAAACATTACAATTCATTGTTAAGTTGAATACAGCAAAAGTAAATGAGGACATGGAGTGAAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACTTAAAACAGCCTGTGGGTTGATCCCACCCACAGGCCCATTGGGCGCTAGCACTCTGGTATCACGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTTATACCCCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTAACACACACCGATCAACAGTCAGCGTGGCACACCAGCCACGTTTTGATCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAGCGTTCGTTATCCGGCCAACTACTTCGAAAAACCTAGTAACACCGTGGAAGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCACTACCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGAAACCCATGGGACGCTCTAATACAGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACACACCCTCAAGCCAGAGGGCAGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCATTTTATTCCTATACTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAGAGATCGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGACTAATAGAGCTATTATATATCCCTTTGTTGGGTTAATTGAGGCCTGAGTATAAGGTGACTTATACTTGTAATCTATCTAAACGGGGAACCTCTCTAGTAGACAATCCCGTGCTAAATTGTAGGACTAATTCCATTTATCAGATTTCTAG。
SEQ ID NO.5为：
CTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCGGGAGACCCTCGAATGGAATTG。
SEQ ID NO.6为：
GTCGTTAATCTTACCCCGGAAT。
SEQ ID NO.7为：
TGAGGACATGGAGTGA。
SEQ ID NO.8为：
GGGCCCTCTAGACTCGAGCTAGAAATCTGATAAATGGAATTAGTC。
SEQ ID NO.9为：
ATTCCGGGGTAAGATTAACGACCTTATCTGAACATAATGCTATAC。
SEQ ID NO.10为：
GGATCCTTTGCTGTATTCAACTTAACAATGAATTG。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例以EGFP为目标序列进行说明。
本发明实施例所述的诺唯赞的总称为南京诺唯赞生物科技股份有限公司；本发明实施例所述的擎科的总称为北京擎科生物科技有限公司。
实施例1
构建pcDNA3-CVB3-IRES-circEGFP-6×polyAC质粒
(1)T4 intron PIE fragment序列的合成由北京擎科生物科技有限公司生物合成得到的。
将T4噬菌体的重排内含子-外显子(PIE)的核心外显子拼接序列(E2-E1)，设计在CBV3病毒的核糖体重新进入序列(IRES)第677碱基位置，同时对678碱基进行T-C的碱基突变，以便兼容核心E1拼接序列。这样CVB3-IRES分为3'和5'端。3'CVB3-IRES接在3'intron同源臂后，之后为6×PolyAC的翻译终止序列、5'CVB3-IRES和5'intron arm。合成的序列如SEQ ID NO.4所示。
所述E2-E1的序列如SEQ ID NO.11所示；
所述3'CVB3-IRES的序列如SEQ ID NO.12所示；
所述3'intron的序列如SEQ ID NO.13所示；
所述6×PolyAC的序列如SEQ ID NO.14所示；
所述5'CVB3-IRES的序列如SEQ ID NO.15所示。
SEQ ID NO.11为：TTGGGTCT。
SEQ ID NO.12为：CTATACCACTTAGCTTGAAAGAGGTTAAAACATTACAATTCATTGTTAAGTTGAATACAGCAAA。
SEQ ID NO.13为：
GGGAGACCCTCGAATGGAATTGGTTCTACATAAATGCCTAACGACTATCCCTTTGGGGAGTAGGGTCAAGTGACTCGAAACGATAGACAACTTGCTTTAACAAGTTGGAGATATAGTCTGCTCTGCATGGTGACATGCAGCTGGATATAATTCCGGGGTAAGATTAACGACCTTATCTGAACATAATG。
SEQ ID NO.14为：
AAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAAC。
SEQ ID NO.15为：
TTAAAACAGCCTGTGGGTTGATCCCACCCACAGGCCCATTGGGCGCTAGCACTCTGGTATCACGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTTATACCCCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTAACACACACCGATCAACAGTCAGCGTGGCACACCAGCCACGTTTTGATCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAGCGTTCGTTATCCGGCCAACTACTTCGAAAAACCTAGTAACACCGTGGAAGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCACTACCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGAAACCCATGGGACGCTCTAATACAGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACACACCCTCAAGCCAGAGGGCAGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCATTTTATTCCTATACTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAGAGATCGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGACTAATAGAGCTATTATATATCCCTTTGTTGGGT。
(2)以合成的T4 intron PIE fragment基因片段为模板，引物组合3'arm-F和3'arm-R，高保真PCR试剂盒(诺唯赞，货号P505-d1)扩增片段，用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)纯化PCR产物，得到产物为SEQ ID NO.1所示的3'T4 intron-CVB3-IRES。
以合成的T4 intron PIE fragment基因片段为模板，引物组合polyAC-F和5'arm-R，高保真PCR试剂盒(诺唯赞，货号P505-d1)扩增片段，用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)纯化PCR产物，得到产物为SEQ ID NO.2所示的5'6×polyAC-CVB3-IRES。
以合成的T4 intron PIE fragment基因片段为模板，引物组合TdE2-1C-F和TdE2-1C-R，高保真PCR试剂盒(诺唯赞，货号P505-d1)扩增片段，用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)纯化PCR产物，得到产物为SEQ ID NO.3所示的5'T4 intron arm。
以pcDNA3-EGFP(Addgene,#13031)为模板，使用引物组合CVB3-EGFP-F和/CVB3-EGFP-R，利用高保真试剂盒进行扩增，纯化后得到产物EGFP。
CVB3-EGFP-F的序列如SEQ ID NO.16所示；CVB3-EGFP-R的序列如SEQ ID NO.17所示；产物EGFP的序列如SEQ ID NO.18所示。
SEQ ID NO.16为：GAATACAGCAAAGGATCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCG。
SEQ ID NO.17为：TCACTCCATGTCCTCAGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT。
SEQ ID NO.18为：
GAATACAGCAAAGGATCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGAATTCTGAGGACATGGAGTGA。
高保真试剂盒扩增的反应体系如表1所述，高保真PCR扩增反应程序如表2所示。
表1扩增的反应体系
组成成分 用量
2×Phanta Max Buffer 25μl
dNTP(10mM each) 1μl
上游引物 2μl
下游引物 2μl
扩增的模板 1ng
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl
ddH2O 补足体系至50μl
表2扩增的反应程序
(3)取pcDNA3.1质粒共1μg，用EcoR I和Xho I内切酶(NEB公司)，37℃双酶切2h，用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)回收DNA产物(作为空载载体)；然后使用One stepcloning kit(翌圣，货号：10922ES20)按照如下体系(表3)在50℃下反应15min，完成克隆反应，得到重组产物。
表3构建pcDNA3-CVB3-IRES-circEGFP-6×polyAC质粒的克隆体系
组成成分 用量
3'T4intron-CVB3-IRES 0.15pmol
5'T4intron arm 0.15pmol
5'6×polyAC-CVB3-IRES 0.15pmol
EGFP 0.15pmol
空载载体 0.05pmol
2×Hieff Clone Universal Enzyme Premix 10ul
ddH2O 补足体系至20μl
(4)将重组产物转化DH5α感受态细菌(擎科，货号：TSC-C14)，在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上挑克隆，测序鉴定得到表达质粒pcDNA3-CVB3-IRES-circEGFP-6×polyAC。表达质粒pcDNA3-CVB3-IRES-circEGFP-6×polyAC的质粒图谱如图1所示，其序列如序列SEQ ID NO.19所示。SEQ ID NO.19：
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGGAGACCCTCGAATGGAATTGGTTCTACATAAATGCCTAACGACTATCCCTTTGGGGAGTAGGGTCAAGTGACTCGAAACGATAGACAACTTGCTTTAACAAGTTGGAGATATAGTCTGCTCTGCATGGTGACATGCAGCTGGATATAATTCCGGGGTAAGATTAACGACCTTATCTGAACATAATGCTATACCACTTAGCTTGAAAGAGGTTAAAACATTACAATTCATTGTTAAGTTGAATACAGCAAAGGATCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGAATTCAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACAAAAAACAAAAAACAAAACTTAAAACAGCCTGTGGGTTGATCCCACCCACAGGCCCATTGGGCGCTAGCACTCTGGTATCACGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTTATACCCCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTAACACACACCGATCAACAGTCAGCGTGGCACACCAGCCACGTTTTGATCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAGCGTTCGTTATCCGGCCAACTACTTCGAAAAACCTAGTAACACCGTGGAAGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCACTACCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGAAACCCATGGGACGCTCTAATACAGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACACACCCTCAAGCCAGAGGGCAGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCATTTTATTCCTATACTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAGAGATCGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGACTAATAGAGCTATTATATATCCCTTTGTTGGGTTAATTGAGGCCTGAGTATAAGGTGACTTATACTTGTAATCTATCTAAACGGGGAACCTCTCTAGTAGACAATCCCGTGCTAAATTGTAGGACTAATTCCATTTATCAGATTTCTAGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC。
将确认构建成功的质粒pcDNA3-CVB3-IRES-circEGFP-6×polyAC，取少量菌液扩大培养，提取无内毒素质粒，以备细胞实验使用。
实施例2
circEGFP的体外合成
(1)线性化质粒的制备
取质粒pcDNA3-CVB3-IRES-circEGFP-6×polyAC共3ug，使用Xho I(NEB，货号：R0146V)限制性内切酶，37℃反应2h。而后在1％琼脂糖中150V电泳30min，确认质粒被完全线性化后，使用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)切胶回收线性化质粒。
(2)体外转录
使用体外转录试剂盒(诺唯赞，货号：TR101-01)，按表4配制转录反应体系，移液器轻缓混匀各组分，37℃孵育2h。而后在反应体系中加入1μl DNase I，37℃孵育15min，用以消化转录的线性化质粒DNA模板，得到转录RNA。
表4转录反应体系
组分 用量
10×Reaction Buffer 2μl
ATP溶液 2μl
GTP溶液 2μl
CTP溶液 2μl
UTP溶液 2μl
线性化质粒 800ng
T7RNA聚合酶 2μl
RNase-free ddH2O 补足至20μl
(3)体外环化与纯化
(3.1)将体外转录所得RNA加热至70℃处理5min，而后立即置于冰上冷却3min；
(3.2)添加GTP溶液(生工，货号：A620332-0250)至终浓度2mM，55℃处理15min；
(3.3)加入160μl RNase-free ddH2O将产物稀释至180μl；
(3.4)加入20μl3M醋酸钠(pH＝5.2)到稀释后的产物中，用移液器充分混匀；
(3.5)加入200μl酚/氯仿混合液(1:1)进行抽提，室温12000rpm离心5min，将上层水相转移至新的RNase-free EP管中；
(3.6)加入与水相等体积的氯仿抽提1次，将上层水相转移至新的RNase-free EP管中；
(3.7)加入2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃孵育30min，而后4℃，12000rpm离心15min；
(3.8)弃上清后加入500μl预冷的70％乙醇洗涤RNA沉淀，4℃，12000rpm离心，弃上清；
(3.9)开盖干燥3min，加入30μl RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀，-80℃保存。
(3.10)将溶解后的RNA沉淀样品，使用RNase R 37℃反应15min，消化线性RNA，反应体系如表5所示：
RNase R处理后，按上述(3.3)-(3.9)步骤再次纯化，-80℃保存，得到circEGFP。
表5 RNase R消化的反应体系
(4)circEGFP检测
取1μg circEGFP，使用试剂盒(诺唯赞，货号：R233-01)反转录得其cDNA，而后进行qPCR检测(诺唯赞，货号：Q711-02)，反应体系与qPCR程序分别如表6和表7所示。以只经过步骤(2)的体外转录，而没有经过步骤(3)体外环化与纯化步骤，即直接体外自发转录的环状RNA产物为对照。Original代表直接体外自发转录的环状RNA产物，Recircularized代表按照本发明的方法转录后再体外环化与纯化的RNA产物，qPCR检测结果如图2所示。
表6 circEGFP的qPCR检测反应体系
组分 用量
circEGFP cDNA 0.5μL
2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μL
qPCR primer F 0.5μL
qPCR primer R 0.5μL
ddH2O 8.5μL
表7 circEGFP的qPCR检测反应程序
预变性 变性 退火与延伸 总时间
反应条件 95℃30s 95℃10s 60℃30s 90min
直接体外自发转录环状RNA产物的qPCR检测引物组合为qEGFP-F和qEGFP-R；qEGFP-F如SEQ ID NO.20所示，qEGFP-R如SEQ ID NO.21所示；本发明的方法转录后再体外环化与纯化的RNA产物的qPCR检测引物组合为qcircEGFP-F和qcircEGFP-R；qcircEGFP-F如SEQ ID NO.22所示；qcircEGFP-R如SEQ ID NO.23所示。
SEQ ID NO.20：TAAACGGCCACAAGTTCAGCGT；
SEQ ID NO.21：TAGGTCAGGGTGGTCACGAGGG；
SEQ ID NO.22：AGCGGAACCGACTACTTTGG；
SEQ ID NO.23：GTCCAGCTCGACCAGGATGG。
图2所示，本发明得到的circEGFP的产量较直接转录形成的circEGFP的产量高4倍，并且本发明环化处理的circEGFP 25％能抵御RNase R的降解，而直接体外转录形成的RNA只有2％能抵御RNase R的降解。
实施例3
circEGFP的细胞转染实验
将HEK293T细胞(购自中科院细胞库，目录号：SCSP-502)传代并铺匀于24孔板中，待细胞汇合度至70～80％时，进行转染实验。取circEGFP样品共2μg，Lipo8000试剂(碧云天，货号：C0533)1μL，DMEM培养基25μl，移液器轻缓混匀，而后均匀滴加至每孔细胞中，培养48h后，观察EGFP荧光信号。具体结果如图3所示。
图3(a、b)为CircGFP不经过RNase R处理，直接侵染细胞24h后观察的GFP荧光信号。图3(c、d)为circEGFP经过RNase R处理15min，侵染细胞24h后观察的GFP荧光信号。图3(b、d)为DAPI染色与GFP荧光叠加的图像。
图3显示，体外合成的circEGFP能经受RNase R消化，并能在细胞内翻译蛋白。
由以上实施例可知，本发明提供了一种用于合成环形RNA的质粒及其构建方法与一种环形RNA及其体外合成方法。按照本发明的方法可以得到产量提高4倍的环形RNA，并且得到的环形RNA25％能抵御RNase R的降解，较直接转录自发形成的环形RNA只有2％能抵御RNase R的降解具有显著提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种用于合成环形RNA的质粒，其特征在于，所述质粒包括空载载体和结构单元；
所述空载载体为pcDNA3.1质粒经过酶切后的产物；
所述结构单元从3'端到5'端依次包括：3'T4 intron-CVB3-IRES、目标序列、5'6×polyAC-CVB3-IRES、5'T4 intron arm；
所述3'T4 intron-CVB3-IRES的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述5'6×polyAC-CVB3-IRES的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述5'T4 intron arm的序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于，所述酶切为双酶切，所述双酶切为利用EcoR I和Xho I内切酶进行酶切；
所述酶切的温度为36~38℃；
所述酶切的时间为1.8~2.2h。
3.权利要求1或2所述的质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
将3'T4 intron-CVB3-IRES、目标序列、5'6×polyAC-CVB3-IRES、5'T4 intron arm克隆至空载载体上，得到重组产物；将所述的重组产物转化至感受态细胞中，培养，得到质粒；
所述克隆时还包括2×Hieff Clone Universal Enzyme Premix；
所述克隆时的反应体系如下：
3'T4 intron-CVB3-IRES 0.14~0.16pmol、目标序列0.14~0.16pmol、5'6×polyAC-CVB3-IRES 0.14~0.16pmol、5'T4 intron arm 0.14~0.16pmol、空载载体0.04~0.06pmol、2×Hieff Clone Universal Enzyme Premix 9~11μl、ddH2O补足至20μl；
所述克隆的温度为48~52℃；
所述克隆的时间为14~16min；
所述感受态细胞为DH5α感受态细菌；
所述培养时的培养基为含有90~110μg/mL氨苄青霉素的LB培养基。
4.权利要求1或2所述的质粒或权利要求3所述的构建方法构建得到的质粒在合成无痕且具有翻译功效的环形RNA中的应用。
5.一种体外合成环形RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）利用限制性内切酶将权利要求1或2所述的质粒或权利要求3所述的构建方法构建得到的质粒进行酶切，收集酶切产物，得到线性化质粒；
（2）将所述线性化质粒进行转录，得到转录RNA；
（3）将所述转录RNA进行环化、纯化，得到环形RNA；
所述限制性内切酶为Xho I；
所述酶切的温度为36~38℃；
所述酶切的时间为1.8~2.2h；
所述转录的反应体系包括如下组分：
10×Reaction Buffer1.8~2.2μl、ATP溶液1.8~2.2μl、GTP 溶液1.8~2.2μl、CTP溶液1.8~2.2μl、UTP溶液1.8~2.2μl、线性化质粒500ng~1μg、T7 RNA 聚合酶1.8~2.2μl、ddH2O补足至20μl；
所述转录的温度为36~38℃；
所述转录的时间为1.8~2.2h；
所述环化、纯化的步骤如下：
（3.1）将所述转录RNA置于65~75℃的条件下，处理4.5~5.5min后，冷却2.5~3.5min，得到中间物1；
（3.2）在所述中间物1中加入GTP溶液，50~60℃处理12~18min，得到中间物2；
（3.3）在所述中间物2中加入160μl ddH2O、20μl醋酸钠，混匀，得到中间物3；
（3.4）将所述的中间物3与酚/氯仿混合液混合，11000~13000rpm离心4.5~5.5min，取上层水相得到中间物4；
（3.5）将所述中间物4与氯仿混合，11000~13000rpm离心4.5~5.5min，取上层水相得到中间物5；
（3.6）将所述中间物5与无水乙醇混合，孵育25~35min后，11000~13000rpm离心13~17min，弃上清后，沉淀加入450~550μl 65~75vt%乙醇，11000~13000rpm离心13~17min，弃上清，沉淀即为中间物6；
（3.7）在所述中间物6中加入20~50μlddH2O，得到RNA溶液；
（3.8）将所述的RNA溶液与RNase R反应13~17min后，重复步骤（3.3）~（3.7）1~2次，得到环形RNA。
6.利用权利要求5所述的体外合成环形RNA的方法得到的环形RNA，其特征在于，所述环形RNA能抵御RNase R的降解，并能在细胞内翻译蛋白。
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Denomination of invention: A plasmid and its construction method for synthesizing circular RNA, and a circular RNA and its in vitro synthesis method

Granted publication date: 20240510

Pledgee: Societe Generale Limited by Share Ltd. Chongqing branch

Pledgor: Ankeli (Chongqing) Biomedical Technology Co.,Ltd.

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