CN117070532A - 一种调控菠萝果实柠檬酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种调控菠萝果实柠檬酸含量的方法，该方法包括：通过调控AcGAD5和/或AcACO1的表达从而调控菠萝柠檬酸含量。本发明中的AcGAD5在低酸品种‘Josapine’成熟期中高表达，在高酸品种‘巴厘’中低表达；AcACO1在不同时期不同部位的‘Josapine’中高表达；说明通过调节AcGAD5和/或AcACO1的表达可以有效调控菠萝果实中柠檬酸的含量。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种调控菠萝果实柠檬酸含量的方法。
背景技术
菠萝（Ananas comosus L.）是重要的热带水果之一，其包含丰富的营养价值，富含钙、钾、维生素 C 和维生素 A，其中维生素Ａ有保护人体上皮组织、提高抵抗力、明目养肝的作用；维生素Ｃ能抗氧化、抗衰老、抗癌，而钙、钾是人体生命活动所需的重要微量元素，菠萝果肉还含有丰富的菠萝蛋白酶，有助于人们消化和吸收蛋白质，此外，相关研究表明菠萝蛋白酶在化工、食品、医疗等领域也有相关的应用。
菠萝果实属于柠檬酸积累型，柠檬酸含量是影响菠萝果实风味的重要因素，也是果实品质评价的重要指标，即控制菠萝中柠檬酸含量对菠萝品质均具有重大意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明目的之一在于提供一种调控菠萝果实柠檬酸含量的方法，该方法是通过调控菠萝中AcGAD5和/或AcACO1的表达从而调控菠萝果实柠檬酸含量。
为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：
本发明一方面提供一种调控菠萝果实柠檬酸含量的方法，包括：通过调控AcGAD5和/或AcACO1的表达从而调控菠萝果实柠檬酸含量。
优选地，将AcGAD5和/或AcACO1基因的超表达载体转入到菠萝生物材料中从而降低菠萝果实柠檬酸含量。
优选地，上述转化的方法为农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法或花粉管通道法。
更优选地，上述转化的方法为农杆菌介导转化法。
优选地，通过抑制或降低菠萝生物材料中AcGAD5和/或AcACO1基因的表达从而提高菠萝果实柠檬酸含量。
优选地，上述菠萝生物材料为菠萝愈伤组织。
本发明另一方面提供一种AcGAD5和/或AcACO1基因在提高菠萝果实柠檬酸含量中的应用。
本发明有益效果至少包括：本发明中的AcGAD5在低酸品种‘Josapine’成熟期中高表达，在高酸品种‘巴厘’中低表达；AcACO1在不同时期不同部位的‘Josapine’中高表达；说明调控AcGAD5和/或AcACO1基因可以有效调控菠萝中柠檬酸的含量。
附图说明
图1a为AcACOs编码蛋白保守结构域；
图1b为 AcGADs编码蛋白保守结构域；
图2a为AcACOs种内进化树, motif 分布, 基因结构分布图；
图2b为AcGADs种内进化树, motif 分布, 基因结构分布图；
图3 AcACOs和AcGADs染色体定位图；
图4a为AcACOs蛋白序列比对；
图4b为AcGADs蛋白序列比对；
图5a为 AcACOs与MaGADs、OsGADs的共线性关系；
图5b为AcGADs 与MaGADs、OsGADs的共线性关系；
图6a为AcACOs、AcGADs系统进化树，At：拟南芥；Ac:菠萝；Os：水稻；Ci：柑橘；Gm：大豆；Sb：高梁；Zm：玉米；Ma：香蕉；Bd：二穗短柄草；Sl：番茄；
图6b为AcGADs系统进化树，At：拟南芥；Ac:菠萝；Os：水稻；Ci：柑橘；Gm：大豆；Sb：高梁；Zm：玉米；Ma：香蕉；Bd：二穗短柄草；Sl：番茄；
图7为AcACOs在菠萝果实果心中的表达模式；
图8为AcACOs在菠萝果实果肉中的表达模式；
图9为 AcACOs在菠萝果实果皮中的表达模式；
图10为 AcGADs在菠萝果实果心中的表达模式；
图11为 AcGADs在菠萝果实果肉中的表达模式；
图12为 AcGADs在菠萝果实果皮中的表达模式；
图13为 AcGAD家族在菠萝果实果柄中的表达模式；
图14a为AcACO1、AcGAD5克隆，M：Trans 2K DNA marker；1：AcACO1的扩增产物；2：AcGAD5的扩增产物；
图14b为AcACO1、AcGAD5转化大肠杆菌DH5α，M：DL5000 DNA marker；1：AcACO1的扩增产物；2：AcGAD5的扩增产物；
图14c为AcACO1、AcGAD5转化农杆菌GV3101，M：Trans 5K DNA marker；1：AcACO1的扩增产物，2：AcGAD5的扩增产物；
图15为AcACO1和AcGAD5转化菠萝愈伤组织；
图16为AcACO1、AcGAD5的相对表达量及愈伤组织柠檬酸含量，AcACO1、AcGAD5的相对表达量； b：愈伤组织柠檬酸含量；**在 p≤0.01级别（双尾），相关性显著；*在 p≤0.05级别（双尾），相关性显著；
图17a为 AcACOs顺式作用元件预测图；
图17b为 AcGADs顺式作用元件预测图；
图7至图13中，a~f、g~l、m~r、s~x分别表示果实的果心、果肉、果皮和果柄。Ⅰ-Ⅲ分别表示转色期、成熟期和后熟期。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
本发明一实施例提供一种调控菠萝柠檬酸含量的方法，包括：通过调控AcGAD5和/或AcACO1基因的表达从而调控菠萝柠檬酸含量。
优选地，将AcGAD5和/或AcACO1基因的表达载体转入到菠萝生物材料中从而降低菠萝果实柠檬酸含量。
优选地，上述转化的方法为农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法或花粉管通道法。
更优选地，上述转化的方法为农杆菌介导转化法。
优选地， 抑制或阻断菠萝生物材料中AcGAD5和/或AcACO1基因的表达从而提高菠萝果实柠檬酸含量。
优选地，上述菠萝生物材料为菠萝愈伤组织。
本发明另一实施例提供一种AcGAD5和/或AcACO1基因在提高菠萝果实柠檬酸含量中的应用。
需要说明的是，在菠萝中，分别鉴定到6个ACO和6个GAD家族成员，分别命名为AcACO1~6和AcGAD1~6。生物信息学分析结果显示，AcACOs均具有保守的IPMI结构域；AcACO1、AcACO2均包含15个内含子和14个外显子，AcACO3~6均包含20个内含子和19个外显子；根据motif可以分成两类，AcACO1、AcACO2属于一类，AcACO3~6属于另一类，推测可能具有不同的功能；AcACO1和AcACO2位于20号染色体，AcACO3~6分别位于9、14、19、8号染色体上；AcGADs均具有保守的GAD结构域，AcGAD1、AcGAD3~5均含有7个内含子和6个外显子，AcGAD2含有15个内含子和14个外显子，AcGAD6含有5个内含子和4个外显子；根据motif可以分为3类，AcGAD1属于一类，AcGAD3~5属于一类，而AcGAD6属于一类，其中AcGAD3、AcGAD4为串联重复。
另外，通过qRT-PCR分析高酸品种‘巴厘’和低酸品种‘Josapine’果实中ACOs和GADs在不同发育时期和不同部位的表达特性，结果发现，AcACO1在不同时期‘Josapine’果心、果肉达到表达高峰，而AcACO2、AcACO3、AcACO4、AcACO6在各个时期‘巴厘’均有不同程度的高表达，AcACO5在‘巴厘’成熟期各个部位均有较高的表达；AcGAD1在‘Josapine’的后熟期果心中高表达，AcGAD2在‘巴厘’、‘Josapine’成熟期表达量没有较大差异，AcGAD3~4在‘巴厘’后熟期果肉中高表达，AcGAD5在‘Josapine’的不同时期中高表达，而AcGAD6表达量的最大值在‘巴厘’后熟期果心中。并筛选表达量差异较大的AcACO1和AcGAD5基因作为主要研究对象；克隆AcACO1和AcGAD5的cDNA，并分别连接到pCAMBIA2300-35S-GFP构建超表达载体，转化‘巴厘’愈伤，结果发现转AcACO1和AcGAD5的愈伤组织中，AcACO1和AcGAD5的表达量显著高于对照，柠檬酸含量显著低于对照。可见，AcACO1和AcGAD5在柠檬酸分解反应中发挥重要作用。
为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。
一、菠萝ACO、GAD家族鉴定与生物信息学分析
（一）AcACO、AcGAD家族成员鉴定
菠萝基因组及注释数据下载于在线网站菠萝基因组数据库（），在数据库下载ACOs、GADs序列。参考序列基因组拟南芥ACO、GAD家族序列下载于Uniprot 数据库（https:sparql.uniprot.org/）。利用拟南芥 ACO、GAD基因家族成员蛋白序列进行 blastp 比对到菠萝基因组所有蛋白序列，整理数据结果，去冗余；为进一步鉴定，需要继续比对序列在NCBI Blastp页面上提交家族基因蛋白序列（https://blast.ncb i.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对到 Swissprot 数据库，去除近源基因。确定菠萝ACO和GAD的家族成员还需要比对保守结构域，利用在线网站 NCBI CD-Search （https://www.ncbinlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）和在线网络平台Pfam（http://pfam.xfam.org）以拟南芥ACO、GAD家族成员蛋白序列为参考序列，在保守结构域层面上进行比对分析，确定ACO家族成员均具有IPMI结构域，GAD家族成员具有GAD结构域。因此，在菠萝中，分别鉴定到6个ACO和6个GAD家族成员，分别命名为AcACO1~6和AcGAD1~6，详细信息见下表（表1）。
表1 AcACOs、AcGADs基本信息
| 基因名称 | 基因ID | NCBI登录号 | 染色体及位置 | CDS长度 |
| AcACO1 | Aco008077 | NC-033641.1 | LG21（8109368..8120103） | 1553 bp |
| AcACO2 | Aco008076 | NC_033641.1 | LG21（8124269..8130652 | 1524 bp |
| AcACO3 | Aco009034 | NC_033629.1 | LG09（12959303..12967780） | 2964 bp |
| AcACO4 | Aco014852 | NC_033621.1 | LG14（20767904-20762921） | 2985 bp |
| AcACO5 | Aco008433 | NC_033639.1 | LG19（10328146..10336190 | 2967 bp |
| AcACO6 | Aco011788 | NC_033628.1 | LG08（11475846..11485182 | 2996 bp |
| AcGAD1 | Aco002628 | NC_033626.1 | LG06（9844124..9848141） | 1490 bp |
| AcGAD2 | Aco019036 | NC_033640.1 | LG20（430881..438144） | 1632 bp |
| AcGAD3 | Aco014785 | NC_033640.1 | LG20（9138799..9144214） | 1356 bp |
| AcGAD4 | Aco014784 | NC_033640.1 | LG20（9145736..9149935） | 1503 bp |
| AcGAD5 | Aco025557 | NC_033621.1 | LG01（9964676..9974411） | 1497 bp |
| AcGAD6 | Aco007843 | NC_033641.1 | LG21（10064841..10068816） | 1464 bp |
（二）AcACO、AcGAD家族成员生物信息学分析
（1）AcACO、AcGAD家族成员理化性质及亚细胞定位分析
根据菠萝全基因组系统鉴定菠萝ACO、GAD家族，包括其理化性质及亚细胞定位预测（表2）。理化性质分析结果表明AcACO家族成员的CDS序列长度范围1524~2996 bp；其基因序列编码氨基酸数量不等，从507到998；与此同时，AcACO家族成员分子量是55.6~108.1kD，理论pI值则是 6.44~7.27；不稳定指数从36.78~42.99，均为稳定蛋白；亚细胞定位显示6个菠萝ACO基因在线粒体或细胞质中，值得注意的是Aco008076基因还可能位于叶绿体中。根据理化性质结果显示AcGAD家族成员的CDS序列长度范围1356bp~1632 bp；其基因序列编码氨基酸数量不等，从487到543；此外，AcGAD家族分子量是54.9~58.9 kD，差距较小。但理论 pI 值则是5.75~8.33；不稳定指数从33.98~40.24，均为稳定蛋白；预测亚细胞定位结果显示多数菠萝GAD在线粒体或细胞质中，其中，AcGAD2预测可能位于内质网中。
表2 AcACO和AcGAD家族成员理化性质
| 基因名称 | 氨基酸数目(aa) | 分子量(kD) | 等电点 | 不稳定指数 | 脂肪指数 | 总平均亲水性 | 亚细胞定位 |
| AcACO1 | 508 | 55.6 | 7.07 | 37.04 | 75.04 | -0.191 | Mit. |
| AcACO2 | 507 | 55.6 | 7.10 | 40.16 | 73.85 | -0.195 | Chl., Mit. |
| AcACO3 | 976 | 106.7 | 6.44 | 39.62 | 83.59 | -0.199 | Cyt., Mit. |
| AcACO4 | 994 | 108.4 | 6.92 | 36.78 | 85.80 | -0.143 | Cyt., Mit. |
| AcACO5 | 988 | 107.6 | 7.27 | 40.59 | 85.34 | -0.145 | Cyt., Mit. |
| AcACO6 | 998 | 108.5 | 6.49 | 42.99 | 82.63 | -0.192 | Cyt., Mit. |
| AcGAD1 | 509 | 57.7 | 6.23 | 33.98 | 88.88 | -0.242 | Mit |
| AcGAD2 | 543 | 58.9 | 8.33 | 34.33 | 97.18 | 0.046 | End |
| AcGAD3 | 492 | 55.4 | 5.39 | 36.48 | 89.92 | 0.175 | Chl、Mit |
| AcGAD4 | 500 | 56.3 | 5.8 | 37.11 | 90.22 | -0.169 | Mit |
| AcGAD5 | 498 | 56.2 | 5.75 | 36.22 | 87.15 | -0.262 | Mit |
| AcGAD6 | 487 | 54.9 | 6.45 | 40.24 | 82.03 | -0.321 | Mit |
（2）AcACO、AcGAD家族保守结构域与基因结构分析
使用NCBI中的CD-search进行保守结构域分析，结果表明AcACO家族成员编码蛋白序列都含有IPMI保守结构域（图1a），这个结构域是乌头酸酶的催化结构域。为进一步比较菠萝ACO家族序列特征，联合种间进化树、基因结构、motif分布综合分析（图2a），结果表明AcACO4、AcACO5和AcACO6属同一类群，为类群Ⅰ，其内含子数目接近，且motif、外显子-内含子组成结构相似；AcACO1和AcACO2归属同一类群，为类群Ⅱ，AcACO3单独为一类群，为类群Ⅲ。由于结构域不同，类群Ⅱ与类群Ⅰ、Ⅲ之间motif和基因结构差别较大，可见，基因结构的保守性与基因亲缘关系是基本一致的。
同理，利用NCBI中的CD search对AcGAD家族成员的保守结构域进行分析，结果显示AcGAD家族成员编码蛋白序列均含有AAT-I surperfamily结构域（图1b）。这个结构域属于谷氨酸脱羧酶催化结构域。对AcGAD家族成员的种间亲缘关系、基因结构、motif分布结合（图2b），AcGAD1、AcGAD3、AcAGD4和AcGAD5属同一类群，为类群Ⅰ，其内含子数目接近，motif、外显子-内含子组成结构相似；AcGAD2和AcGAD6 分别归属不同类群，为类群Ⅱ、Ⅲ。
（3）AcACO、AcGAD家族成员染色体定位分析
染色体定位结果显示（图3），AcACO、AcGAD家族成员一共分布在8条染色体中，其中AcACO1和AcACO2分布在同一条染色体中，在聚类分析时，该基因也归属为同一亚组。AcACO1、AcACO2还和AcGAD家族成员AcGAD6分布在21号染色体中。AcGAD家族共分布在4条染色体中，其中AcGAD3和AcGAD4为串联重复基因。在种间聚类分析时，这两个基因也归属为同一亚组；此外，AcGAD3、AcGAD4还和AcGAD2位于同一条染色体中。位于同一染色体的基因家族成员因其基因结构的差异导致基因功能的不同。
（4）AcACO、AcGAD家族蛋白序列比对分析
从菠萝全基因组获取AcACO、AcGAD基因家族成员的蛋白序列，经过Blast比对，利用Jalview可视化比对结果（图4a和图4b），结果表明AcACO、AcGAD家族成员序列相似且高度保守，其序列的缺失或是导致基因表达差异的原因。
（5）AcACO、AcGAD家族成员物种间共线性分析
共线性可视化可以更加直观的展示同源基因在物种间的分布关系。通过前期整理的同为单子叶植物香蕉和水稻乌头酸酶基因家族，通过TBtools可视化其共线性关系（图5a），结果表明，菠萝乌头酸酶基因与香蕉的共线性更强，这也表明了其关系更加紧密。同理，比较菠萝谷氨酸脱羧酶基因与水稻、香蕉的共线性（图5b），与水稻共线性更强，表明其关系更加紧密。在植物进化过程中，基因的高度保守使得植物进化过程中保留了自身的优势，分化时间较短的物种间，其积累的变异更少，会保留更多的共同特征。植物基因组中基因的共线性通常随着进化距离的增加而降低，而基因的实际数量或多或少保持恒定。
（6）AcACO家族物种间进化亲缘关系分析
物种间的进化树体现了种间关系及其进化历史。本实施例构建物种间ACO、GAD家族进化树（图6a和图6b），ACO系统进化结果表明，AcACO1、AcACO2和水稻、柑橘、大豆等物种ACO家族成员聚为一类；AcACO3则是和拟南芥ACO家族成员聚为一类；其余三个AcACO家族成员为一类群。
综上，GADs系统进化树结果表明，菠萝GAD家族与水稻亲缘性更强，其中AcGAD1、OsGAD1同为独立分支。
二、AcACO、AcGAD家族成员的表达模式分析
（一）AcACO家族基因表达模式分析
通过 qRT-PCR 对 AcACO家族成员在低酸菠萝品种‘Josapine’和高酸‘巴厘’品种果实中不同部位中的表达模式进行分析。Graphpad 绘制表达模式图。结果显示，AcACO家族成员在不同的品种时空表达呈现较大的差异。具体结果如下：
在成熟菠萝果实果心部位，AcACO1、AcACO2、AcACO4和AcACO6表达量的最高峰值出现在低酸品种‘Josapine’，而AcACO3和AcACO5表达量的最高峰值出现在后熟期‘巴厘’（图7）。
在成熟菠萝果实果肉部位，AcACO1、AcACO3和AcACO5在转色期低酸品种果肉的表达量达到峰值，AcACO2、AcACO4和AcACO6在后熟期的‘巴厘’菠萝中表达量达到最大峰值，其中，AcACO2、AcACO4的表达量是在后熟期，AcACO6的表达量峰值是在转色期（图8）。
在成熟菠萝果实果皮部位，AcACO1和AcACO3在转色期的低酸品种表达量最高，但AcACO2、AcACO4和AcACO6在转色期的‘Josapine’和‘巴厘’两个品种的表达量都没有较大差异，AcACO5表达量的最高峰值出现在后熟期‘巴厘’果肉（图9）。
在成熟菠萝果实果皮部位，AcACO1的最高峰出现在成熟期低酸品种‘Josapine’，并且后熟期‘Josapine’中的表达量比‘巴厘’高。AcACO2和AcACO3表达量的最大峰值是在后熟期‘巴厘’。但AcACO4和AcACO6的表达量在‘巴厘’果柄中的表达量较高（图10）。总之，ACO家族成员中只有AcACO1在不同时期不同部位的‘Josapine’高表达。
在成熟菠萝果实果肉部位，AcGAD1只在低酸品种的后熟期果肉中高表达，在成熟期，AcGAD3的表达量比其他家族成员的高。而AcGAD2和AcGAD4在果肉部分的表达模式刚好相反，AcGAD2在巴厘果肉表达量从高往低递减，而AcGAD3在低酸品种‘Josapine’的表达量则是逐渐递增的（图11）。
在成熟菠萝果实果皮部位，AcGAD家族在果髓的表达量差异较大，其中AcGAD1和AcGAD5在低酸果实后熟期表达量最高，AcGAD4和AcGAD6在高酸品种的表达量较高，在低酸品种中几乎不表达（图12）。
在果柄，如图13所示，除AcGAD4以外，其他家族成员均在低酸品种果柄中的表达量较高，其中，AcGAD1、AcGAD2、AcGAD5的表达量在成熟期中已达到最大，而AcGAD3的表达量最高值出现在后熟期。以上结果表明，AcGAD家族成员在菠萝果实不同部位的表达量差异较大，其中AcGAD5在低酸品种成熟期中高表达，在高酸品种中低表达。
三、AcACO1和AcGAD5基因功能验证
（一） 过表达载体构建
提取‘巴厘’果实的RNA，克隆AcACO1和AcGAD5的cDNA，获得AcACO1（1553bp）、AcGAD5（1497bp）目的条带（图14a）。将AcACO1、AcGAD5的PCR产物纯化，并将其连接到载体pCAMBIA2300-35S-GFP上构建过表达载体，经转化和菌液鉴定，获得阳性克隆（图14b）。提取质粒，并转化农杆菌GV3101，经PCR鉴定阳性克隆，获得预期大小的目的条带（图14c）。
（二） 过表达载体转化菠萝愈伤
采用真空渗透法转化‘巴厘’菠萝胚性愈伤组织材料，转化后的菠萝愈伤组织经过48小时暗培养，对照组A的颜色比试验组B、C组的浅（图15）。将转化后的愈伤组织提取RNA，通过q-PCR检测AcACO1和AcGAD5的相对表达量及愈伤组织的柠檬酸含量。实验结果表明（图16），结果表明转化愈伤中AcACO1和AcGAD5的表达量均显著高于对照，因此，过表达实验提高了AcACO1和AcGAD5在愈伤组织中的表达量。此外，通过检测实验组和对照组中愈伤组织的柠檬酸含量，结果表明转化AcACO1和AcGAD5的愈伤组织，其柠檬酸比对照组含量显著降低，可见，AcACO1和AcGAD5参与了柠檬酸降解过程，能够显著影响菠萝柠檬酸含量积累。
（三） AcACO、AcGAD家族成员启动子顺式作用元件分析
启动子的主要功能是调控基因的表达，由于AcACO、AcGAD家族在低酸和高酸菠萝材料中的表达存在较大差异，且也在过表达实验中验证了其功能，因此，为探索AcACO、AcGAD家族成员启动子，进一步做了关于顺式作用元件的生物信息学预测。
利用PlantCARE 在线工具对菠萝ACO、GAD家族前2.0 kb序列做顺式作用元件预测（图17a和图17b）。分析结果表明，菠萝乌头酸酶和谷氨酸脱羧酶基因家族上游均存在多种顺式作用元件，除了数量最多的光响应元件（Light re-sponsive element）之外，还包括一些与胁迫相关的响应元件等，如脱落酸响应件（Abscisic acid re-sponsive element）以及厌氧诱导（Anaerobic in-duction）、低温（Low-temperat ure responsive element）、干旱诱导（Drought-ind ucibility）等。因此植物可能通过脱落酸 ABA、赤霉素 GA、茉莉酸甲酯 MeJA 等多种激素对逆境胁迫的响应，从而协同调控 ACO、GAD 基因的表达以及受光照的影响，来促进果实生长发育和有机酸代谢。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。
Claims (7)
1.一种调控菠萝果实柠檬酸含量的方法，其特征在于，包括：通过调节AcGAD5和/或AcACO1的表达从而调控菠萝果实柠檬酸含量。
2.根据权利要求1所述的调控菠萝果实柠檬酸含量的方法，其特征在于，将AcGAD5和/或AcACO1的超表达载体转入到菠萝生物材料中从而降低菠萝果实柠檬酸含量。
3.根据权利要求2所述的调控菠萝果实柠檬酸含量的方法，其特征在于，转化的方法为农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法或花粉管通道法。
4.根据权利要求3所述的调控菠萝果实柠檬酸含量的方法，其特征在于，转化的方法为农杆菌介导转化法。
5.根据权利要求1所述的调控菠萝果实柠檬酸含量的方法，其特征在于，通过抑制或降低菠萝生物材料中AcGAD5和/或AcACO1基因的表达从而提高菠萝果实柠檬酸含量。
6.根据权利要求1至5中任一项权利要求所述的调控菠萝果实柠檬酸含量的方法，其特征在于，菠萝生物材料为菠萝愈伤组织。
7.AcGAD5和/或AcACO1基因在提高菠萝果实柠檬酸含量中的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN118546951A (zh) | 2024-08-27 |
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