CN117050922B - 一种含氟苯腈类化合物降解菌及其在环境治理中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含氟苯腈类化合物降解菌及其在环境治理中的应用。所述含氟苯腈降解菌为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)，菌株名为GHL4，于2022年11月07日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.26074。应用所述粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)GHL4制备得到的降解菌剂生产成本低，使用方便，降解效果好，可使废水和土壤中的3,4‑二氟苯腈、2,6‑二氟苯腈、2‑氟‑4‑羟基苯腈、4‑氟‑2‑甲基苯腈的浓度降低95%以上，解决了含氟苯腈对水体和土壤环境的污染问题。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种含氟苯腈类化合物高效降解菌及其在环境治理中的应用。
背景技术
含氟芳香族化合物是目前增长较为迅速的精细化学品，广泛应用于医药、农药、染料等领域，具有广阔的发展前景。与不含氟芳香族化合物相比，含氟芳香族化合物不但具有更强的稳定性和生物活性，还具有较高的脂溶性和疏水性，其在药物应用领域具有毒性低、用量少、药效高、代谢能力强等特点。在染料方面，引入氟原子后，使染物色泽鲜艳、不易褪色等优点。
腈类物质是一类含有氰基基团的有机化合物，天然存在于在土壤、植物和微生物中，也可以通过人工合成应用于工业生产。苯腈因其在工业生产中的广泛应用被认为是最重要的腈类物质之一，它可以作为溶剂和中间体广泛应用于药物、香水、染料、橡胶、铂织品、树脂等，但大多数腈类化合物具有高毒性，一旦经由工业生产进入环境后将对人体健康和环境保护带来严重的危害。含氟苯腈具有广泛的应用前景，但是，由于卤素元素的电负性极强，易于生命细胞中的酶系统结合，导致这类化合物稳定性高、毒性强，易在环境中迁移，造成土壤和水体严重的面源污染，一旦排入环境会环境造成危害。3,4-二氟苯腈是合成多种医药、染料、液晶材料的有机合成原料，也是选择性除草剂氰氟草酯的重要中间体。3,4-二氟苯腈还可以用作有机溶剂，它在化学分析、有机合成和表面处理等领域有广泛的应用。它还可以用于制备高分子材料，是一种重要的有机化合物，具有广泛的应用前景。随着科技的不断发展，它的应用领域还将不断扩大。但是，由于其毒性较强，使用时必须注意安全，避免对人体和环境造成危害。目前对于腈类化合物的降解报道主要集中在苯甲腈和溴苯腈，还未见对于含氟苯腈化合物降解情况的报道。相比于化学降解法，生物降解法具有高效性、高选择性、反应条件温和、环境污染小等优点，因此筛选含氟苯腈降解菌对被含氟苯腈污染的环境修复具有重要作用。
发明内容
发明目的：本发明针对环境中的由含氟苯腈造成的水污染与土壤污染的问题，对现有含氟苯腈生物降解技术的空白提供一株含氟苯腈污染修复菌，使用本菌株可以高效降解土壤和水体中3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈，快速修复含氟苯腈导致的水污染和土壤污染问题，生产成本较低。本发明还提供一种污染修复菌剂，即应用所述含氟苯腈污染修复菌制备得到一种新的菌剂。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一株含氟苯腈降解菌，菌株分类号为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)，菌株名为GHL4，于2022年11月07日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为CGMCC No.26074，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明进一步提出了一种菌剂，其包含上述含氟苯腈降解菌。
本发明还公开了上述菌剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）将含氟苯腈降解菌GHL4的平板菌种接种于LB液体培养基摇瓶中，置于恒温摇床中，30~35℃、160~180r/min振荡培养至对数期；
（2）将步骤（1）培养好的菌液按种子罐培养基的体积比的8%～10%的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，获得种子液；
（3）将达到对数期的种子液按照体积比8%～10%的接种量接种入生产罐培养，发酵完成后培养液出罐得到液体剂型的菌剂，或采用泥炭吸附得到固体剂型的菌剂。在一种实施方式中，可以直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
其中，步骤（1）中，LB液体培养基组份为：酵母膏4~6g/L、蛋白胨8~10g/L、NaCl 8~10g/L，所有培养基均在121℃高压蒸汽灭菌20 min，待冷却后使用。
种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖7~9g/L，酵母膏4~6g/L，K2HPO40.8~1.2g/L，NaCl 4~6g/L，CaCO31.5~2.5g/L，MgSO4 0.1~0.3g/L，大豆油0.1~0.12% (v/v)，pH值7.2~7.5，生产罐的培养基成分与种子罐相同。
其中，在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为0.45～0.60m3/min，搅拌速度为180~240r/min，培养温度为30~35℃，全流程培养时间为96~108h，发酵结束后发酵液中有效活菌数为109个/mL以上。
本发明进一步提出了上述含氟苯腈降解菌或者菌剂在降解含氟苯腈废水中的应用，其中，所述含氟苯腈为3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈中的任意一种或多种。
优选地，所述废水中含氟苯腈含量为100~1600mg/L；所述废水的盐浓度为0g/L~30g/L。
本发明进一步提出了上述含氟苯腈降解菌或者权菌剂在含氟苯腈污染土壤修复中的应用，所述含氟苯腈为3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈中的任意一种或多种，含氟苯腈在土壤中的含量为50~200mg/kg。
具体应用时，将含氟苯腈降解菌GHL4菌株接种于LB 液体培养基中，振荡培养至对数期，得到降解菌悬液；将上述降解菌悬液按土壤5~8%wt的接种量接入含氟苯腈污染土壤中。
有益效果：本发明的粪产碱菌(Alcaligenes faecalis) GHL4能够高效、快速降解含氟苯腈，该菌能够降解土壤和废水中的3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈，污染物降解率在95%以上。使用该细菌生产的降解菌剂具有生产使用成本低、使用方便、修复效果好的优点，适合在全国受含氟苯腈污染的化工园区、农业生产区等地推广使用。
附图说明
图1是本发明菌株GHL4的菌落形态图；
图2是本发明菌株GHL4的系统发育树；
图3是本发明菌株GHL4对3,4-二氟苯腈的生长利用和降解情况；
图4是温度对本发明菌株GHL4降解3,4-二氟苯腈的影响效果图；
图5是pH对本发明菌株GHL4降解3,4-二氟苯腈的影响效果图；
图6是NaCl浓度对本发明菌株GHL4降解3,4-二氟苯腈的影响效果图；
图7是本发明菌株GHL4对不同含氟苯腈的降解效果图；
图8是本发明菌株GHL4对土壤中含氟苯腈的降解效果图。
实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
实施例1 降解菌株的分离、筛选与鉴定。
本发明提供一种能高效降解含氟苯腈的菌株GHL4及其生产的菌剂，分离自某化工园区污水处理厂的活性污泥。
具体的菌株分离筛选方法为：取污水处理厂生化池的活性污泥5mL加入到95mL含有200mg/L 3,4-二氟苯腈的无机盐培养基中，30℃、160r/min摇床培养5天；5天后，以5%（V/V）的接种量转接到新鲜同一无机盐培养基中，连续富集转接培养4次，获得富集液。
将第五代富集液在含有200mg/L 3,4-二氟苯腈的无机盐固体培养基上，稀释涂布，30℃培养4d。用接种环挑选其中长势较好、数量较多、且呈单个分布的菌落，采用梯度平板划线法划线分离纯化。将分离纯化后的菌株转接至LB固体培养基上于4℃冰箱内保存备用。
无机盐培养基成分：NaCl 1.0g/L、(NH4)2SO41.0g/L、K2HPO41.5 g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4•7H2O 0.2g/L和水1L，pH 7.0，固体培养基中加入1.5%的琼脂，培养基121℃灭菌30min。
LB固体培养基组分为：酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，加入1.5% 的琼脂，pH 7.0，培养基121℃灭菌30min。
该菌株经活化之后，在固体营养培养基制成的平板上生长24h后，能形成直径为0.3~0.5cm淡黄色、边缘光滑、表面光滑、中间凸起、透明度低的菌落。对菌株进行革兰氏染色，染色的菌体颜色变为红色，表明菌株GHL4为革兰氏阴性菌。
将菌株GHL4的16S rRNA基因序列在GenBank数据库的NCBI核酸数据进行比对分析，结合16S rRNA基因系统发育分析（图2），菌株GHL4鉴定为粪产碱菌 (Alcaligenes faecalis)，并于2022年11月07日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.26074，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例2 降解菌剂的制备。
将本发明的含氟苯腈降解菌GHL4的菌种在LB固体平板培养基上活化，平板菌种接种于含有100mL LB液体培养基的250mL摇瓶中，置于恒温摇床中，30℃、160r/min振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐100L，投料量80L，所用培养基配方为：葡萄糖8g/L，酵母膏5g/L，K2HPO41g/L，NaCl 5g/L，CaCO32g/L，MgSO4 0.2g/L，大豆油0.1% (v/v)，pH值7.2~7.5。投料完成后在1.1Kg/cm3的压力下、121℃条件下高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的菌液按种子罐培养基的体积比的10%的接种量接种入种子罐，无菌空气的通气量为0.5m3/min，搅拌速度为200r/min，培养温度为30℃，培养至对数生长期备用。达到对数期的种子液按照体积比10%的接种量接种入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量1吨，投料量为0.08～0.1吨。投料后的生产罐，在1.1 Kg/cm3的压力下、121℃条件下高压湿热灭菌，冷却至30℃后，通无菌空气，通气量为0.5m3/min，搅拌速度为200r/min，培养温度控制在30℃，整个工艺培养流程时间为96h，发酵结束后发酵液中有效活菌数为109个/mL左右。
发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
实施例3 菌株GHL4对3,4-二氟苯腈的生长利用和降解。
将实施例1筛选获得的菌株GHL4单菌落接种至LB液体培养基中，在30℃、160 r/min条件下培养至对数生长期，所得菌液于6000r/min离心5min收集菌体，用灭菌的纯水洗涤菌体3次，制成OD600约为1.0的菌悬液作为种子液。将种子液按体积5%（V/V）的接种量接种到的3,4-二氟苯腈浓度为200mg/L的无机盐培养基中，调节培养基pH为7。在30℃、160r/min的摇床中培养，定时取样检测菌体浓度（OD600值）和3,4-二氟苯腈浓度，绘制菌株生长曲线和污染物降解曲线（如图3所示）。
由图3可知，当3,4-二氟苯腈浓度为200mg/L时，菌株可较快适应生长环境，在8h开始快速生长，菌株的生长曲线与3,4-二氟苯腈的降解规律基本一致，随着菌株的生长，3,4-二氟苯腈的浓度逐渐降低，说明菌株GHL4可以利用废水中的3,4-二氟苯腈进行生长代谢，从而降解废水中的3,4-二氟苯腈，24h时菌株GHL4对污染物的降解率达97.8%，菌株浓度为初始浓度的16倍。
实施例4 环境因素对菌株GHL4降解3,4-二氟苯腈的影响。
按体积5%（V/V）的接种量将菌株GHL4的种子液接种到3,4-二氟苯腈浓度为200mg/L的无机盐培养基中，然后分别置于不同温度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃ 和40℃)的摇床中，160r/min培养24h，取样测定3,4-二氟苯腈浓度，计算其降解率。结果如图4所示，菌株GHL4在15~40℃对3,4-二氟苯腈的降解率均在90%以上，最适降解温度为30℃。
按体积5%（V/V）的接种量将菌株GHL4的种子液接种到3,4-二氟苯腈浓度为200mg/L的无机盐培养基中，调节无机盐培养基的pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，在30℃、160r/min的摇床中培养24h，取样测定3,4-二氟苯腈浓度，计算其降解率。结果如图5所示，菌株GHL4对碱性环境的耐受性优于对酸性环境的耐受性，当环境pH<6时，菌株GHL4对3,4-二氟苯腈的降解效果明显降低，菌株GHL4在pH为7.0时对3,4-二氟苯腈的降解效果最好。
按体积5%（V/V）的接种量将菌株GHL4的种子液接种到3,4-二氟苯腈浓度为200mg/L的无机盐培养基中，调节无机盐培养基中NaCl浓度分别为0g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L和30g/L，在30℃、160r/min的摇床中培养24h，取样测定3,4-二氟苯腈浓度，计算其降解率。结果如图6所示，菌株GHL4对盐度有较好的耐受性，在NaCl浓度为0~30g/L时菌株对3,4-二氟苯腈的降解率均在90%以上。
实施例5 菌株GHL4对不同含氟苯腈的降解。
按体积5%（V/V）的接种量将菌株GHL4的种子液接种到含不同浓度污染物（3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈）的无机盐培养基中，培养基中污染物的初始浓度分别为100mg/L、400mg/L、700mg/L、1000mg/L、1300mg/L、1600mg/L，在30℃、160r/min的摇床中培养48h，取样测定各污染物浓度并计算降解率，如图7所示。
由图7可知，在各污染物浓度为100~1600mg/L的范围内，菌株GHL4对其的降解率随着污染物的浓度增大呈现先增大后减小的趋势，当污染物浓度为400mg/L时降解率最高，随着污染物的浓度提高菌株GHL4活性略受抑制，但各污染物降解率仍均在90%以上。这一结果表明菌株GHL4可以高效的降解3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈等含氟苯腈，为难降解腈类物质的污染治理提供了一种优良的微生物种质资源。
实施例6 菌株GHL4在土壤修复中的应用。
在田间选取未经污染的表层土壤（0～20cm），准确称取每份200g土壤，在每一份中分别加入3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈，使其质量终浓度分别为50、100、150和200mg/kg，按土壤5wt%的接种量将菌株GHL4的菌悬液接种到各待降解土壤中，并设不接菌的土壤为对照，置于30℃培养箱中黑暗条件下恒温培养，7天后测定其在土壤中的残留量，结果见表1所示。结果表明，菌株GHL4可以有效去除土壤中的含氟苯腈，可以有效治理土壤污染问题。
表1 菌株GHL4去除土壤中含氟苯腈效果
实施例7 不同剂量菌株GHL4对土壤中含氟苯腈的降解。
在田间选取未经污染的表层土壤（0～20cm），准确称取每份200g土壤，在每一份中分别加入100mg/kg的3,4-二氟苯腈，分别按土壤5wt%、6wt%、7wt%和8wt%的接种量将菌株GHL4的菌悬液接种到各待降解土壤中，置于30℃培养箱中黑暗条件下恒温培养，7天后测定其在土壤中的残留量，结果如图8所示。结果表明，当菌悬液质量浓度在5%~8%范围内时，菌株GHL4可以快速高效去除土壤中的含氟苯腈，随着菌悬液质量浓度增加，菌株对含氟苯腈的降解率不断增大。
本发明提供了一种含氟苯腈降解菌及其在废水治理与土壤修复中的应用，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种含氟苯腈类化合物降解菌，其特征在于，所述降解菌分类号为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)，菌株名为GHL4，于2022年11月07日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为CGMCC No.26074。
2.一种菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的含氟苯腈类化合物降解菌。
3.权利要求2所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将含氟苯腈类化合物降解菌GHL4的平板菌种接种于LB液体培养基摇瓶中，置于恒温摇床中，30~35℃、160~180r/min振荡培养至对数期；
（2）将步骤（1）培养好的菌液按种子罐培养基体积比的8%～10%的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，获得种子液；
（3）将达到对数期的种子液按照体积比8%～10%的接种量接种入生产罐培养，发酵完成后培养液出罐得到液体剂型的菌剂，或采用泥炭吸附得到固体剂型的菌剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，LB液体培养基组份为：酵母膏4~6g/L、蛋白胨8~10g/L、NaCl 8~10g/L。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖7~9g/L，酵母膏4~6g/L，K2HPO4 0.8~1.2g/L，NaCl 4~6g/L，CaCO3 1.5~2.5g/L，MgSO4 0.1~0.3g/L，大豆油0.1~0.12% (v/v)，pH值7.2~7.5，生产罐的培养基成分与种子罐相同。
6.根据权利要求3所述的菌剂的制备方法，其特征在于，在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为0.45～0.60m3/min，搅拌速度为180~240r/min，培养温度为30~35℃，全流程培养时间为96~108h，发酵结束后发酵液中有效活菌数为109个/mL以上。
7.权利要求1所述的含氟苯腈类化合物降解菌或者权利要求2所述的菌剂在降解含氟苯腈废水中的应用，其中，所述含氟苯腈为3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈中的任意一种或多种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述废水中含氟苯腈含量为100~1600mg/L；所述废水的盐浓度不高于30g/L。
9.权利要求1所述的含氟苯腈类化合物降解菌或者权利要求2所述的菌剂在含氟苯腈污染土壤修复中的应用，所述含氟苯腈为3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈中的任意一种或多种，含氟苯腈在土壤中的含量为50~200mg/kg。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将含氟苯腈类化合物降解菌GHL4菌株接种于LB 液体培养基中，振荡培养至对数期，得到降解菌悬液；将上述降解菌悬液按土壤5~8wt%的接种量接入含氟苯腈污染土壤中。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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