CN117050875A - 基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片及其电转染方法，电转染微流控芯片包括由上至下依次设置的上层检测板、中层液滴剪切板、底层电极板；中层液滴剪切板上设有检测液入口二、与检测液入口二连接的液滴操纵式介质分流通道，液滴操纵式介质分流通道的两端连接有中间层介质分流入口和检测液出口二；上层检测板上设有与检测液入口二对接的检测液入口一、与中间层介质分流入口连通的介质入口、与检测液出口二连通的检测液出口一；底层电极板上设有与液滴操纵式介质分流通道对应的双极性悬浮电极。本发明提供一种基于双极性电极极化效应的微液滴内细胞高效电转染微流控芯片及其电转染方法，能够使电转染过程简便化、高效化。
Description
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，具体涉及基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片。
背景技术
目前，生物医学领域越来越受到人们的重视，尤其是该领域中的转化医学以及基因医学，而基因医学是突破医学壁垒的一个重要方式。尤其在细胞转染技术，将外源正常基因导入靶细胞，用外源基因制造的产物治疗、纠正因异常基因导致的医学问题。
目前市面上有许多细胞转染的技术，比如病毒转染、流体动力转染和电转染等方法。目前，面向CAR-T细胞的细胞转染主要以病毒转染为主，存在以下问题：（1）病毒载体的生产更加复杂和昂贵，且存在很高的生物安全隐患；（2）CAR基因是随机插入到宿主基因组，影响正常基因的表达，存在一定的致癌风险；（3）病毒载体难以递送大分子量的核酸，也难以同时递送不同的药物。流体动力转染主要利用细胞在经过窄通道时的拉伸变形在细胞表面形成穿孔，从而其周围的核酸物质会通过表面穿孔递送进细胞内部，达到细胞转染的目的。然而，流体动力转染方法存在着细胞转染通量低、可控性差、核酸导入量低等缺点，导致其应用场景受限。
近年来，电转染在原代T细胞、干性T细胞、NK细胞等特别难转染细胞方面展现很大的优势，然而，现有电转染技术在操纵通量、细胞活性及转染可控性方面不能兼顾；对细胞群体电穿孔调控研究仍有不足；核酸利用率低、导入速度缓慢。因此，如何提高细胞电转染操纵通量、可控性及转染效率已经迫在眉睫。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提供一种基于双极性电极极化效应的微液滴内细胞高效电转染微流控芯片及其电转染方法，能够使电转染过程简便化、高效化；提高了转染速率和可控性以及细胞电转染的存活率。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片，包括由上至下依次设置的上层检测板、中层液滴剪切板、底层电极板；中层液滴剪切板上设置有至少一个检测液入口二，以及与检测液入口二连接的液滴操纵式介质分流通道，且液滴操纵式介质分流通道的一端连接有若干个中间层介质分流入口，液滴操纵式介质分流通道的另一端连接有检测液出口二；上层检测板上设置有与检测液入口二对接的检测液入口一，以及与中间层介质分流入口连通的介质入口，和与检测液出口二连通的检测液出口一；底层电极板上设置有与液滴操纵式介质分流通道对应的双极性悬浮电极。
本发明一个较佳实施例中，中层液滴剪切板上还设置有介质分流通道二，介质分流通道二与液滴操纵式介质分流通道T接连通；
检测液入口二通过主通道连通位于下层的中层液滴剪切板的介质分流通道二。
本发明一个较佳实施例中，上层检测板上还设置有条形结构的介质分流通道一，介质分流通道一与介质入口连通，且介质分流通道一的下部与中间层介质分流入口连通。
本发明一个较佳实施例中，检测液入口二和检测液出口二分别位于液滴操纵式介质分流通道的两端，且中间层介质分流入口与液滴操纵式介质分流通道直接连通，且中间层介质分流入口位于检测液入口二和检测液出口二之间。
本发明一个较佳实施例中，底层电极板上设置有电极操纵区域，电极操纵区域内设置有若干个间隔排布的双极性悬浮电极；
电极操纵区域的两端分别设置有与电极操纵区域连接的负电极接线区和正电极接线区；
负电极接线区电连接有若干片延伸至电极操纵区域的负电极片，正电极接线区电连接有若干片延伸至电极操纵区域的正电极片，双极性悬浮电极的两侧分别设置有正电极片和负电极片。
本发明一个较佳实施例中，双极性悬浮电极的宽度是80μm；双极性悬浮电极与两侧激电极的正电极片和负电极片的电气间隔间隙是20μm；中间层介质分流入口与液滴操纵式介质分流通道的支接路段距离是2mm。
本发明一个较佳实施例中，液滴操纵式介质分流通道的宽度为160μm，高度为80μm，检测液入口二的大小为1mm，相邻的检测液出口二之间的间距为8mm。
本发明一个较佳实施例中，底层电极板包括厚度为1.5mm的玻璃基底，玻璃基底上沉积有ITO电极层。
本发明一个较佳实施例中，基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片的电转染方法，包括以下步骤：
导入检测液并剪切成微液滴，包括方法：将检测液通过检测液入口一导入后进入介质分流通道一，介质流体注入到介质入口；检测液在中层液滴剪切板的中间层介质分流入口、介质分流通道二、液滴操纵式介质分流通道形成的T型结构通道被介质流体剪切成微液滴，
捕获和定位微液滴中细胞和核酸物质，包括以下方法：在底层电极板的电极操纵区域借助双极性悬浮电极和负电极片和正电极片配合形成的介电泳和交流电热流动耦合效应将检测液中的细胞和核酸物质收集在同一侧；
实现细胞的电转染，包括以下方法：将接入底层电极板的信号从高频信号变为脉冲信号，然后将电压设置为指定值，在电转染微流控芯片上建立电场分布；电场分布下，检测液中细胞的质膜会发生局部破裂，将质膜上的核酸导入细胞内部，实现细胞的电转染；
在电转染完成后，使用生理盐水清洗芯片，将细胞收集并进行离心分离和分析。
本发明一个较佳实施例中，检测液的获取方法包括：将需要进行电转染的细胞样品培养至70%-80%的密度，收集细胞，离心去除上清液，重悬于含有核酸样本的生理盐水中，使二者充分混合；
或/和，用70%的乙醇溶液对细胞电转染微流控芯片进行消毒，用无菌生理盐水洗涤细胞电转染微流控芯片表面，然后在细胞电转染微流控芯片上加入含有2%BSA的生理盐水溶液进行孵育30分钟，去除剩余的BSA溶液，用生理盐水清洗细胞电转染微流控芯片；
或/和，将细胞电转染微流控芯片上的底层电极板接入电信号源，设置高频信号频率为1MHz，脉冲信号频率为1kHz，高频电压为10V，脉冲电压为1.5V。
本发明解决了背景技术中存在的缺陷，本发明的有益效果：
解决现有技术中细胞转染面临的通量低、可控性差、效率低的问题，本发明提供了一种基于双极性电极极化效应的微液滴内细胞高效电转染微流控芯片，能够使电转染过程简便化、高效化。
本发明利用双极性电极极化产生的交流电热流动现象，能够同时捕获目的细胞和核酸物质捕获到同一区域内进行电转染；将细胞捕获和电转染相结合，提高了转染速率和可控性；利用双极性电极的可拓展性并采用合理的电极设计方式，配合多通道结构提升了整体效率，还能够区别于传统单电极的加电方式，提高了细胞电转染的存活率。从而，利用该微流控芯片系统能够实现细胞的高效可控电转染。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明优选实施例中基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片结构透视示意图；
图2是本发明优选实施例中基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片的爆炸结构示意图；
图3是本发明优选实施例中上层检测板的结构示意图；
图4是本发明优选实施例中中层液滴剪切板的结构示意图；
图5是本发明优选实施例中底层电极板的结构示意图；
图6是本发明优选实施例中底层电极板中双极性悬浮电极的放大结构示意图；
其中，1-上层检测板，11-检测液入口一，12-介质入口，13-检测液出口一，14-介质分流通道一；2-中层液滴剪切板，21-检测液入口二，22-中间层介质分流入口，23-液滴操纵式介质分流通道，24-检测液出口二，25-介质分流通道二；3-底层电极板，31-负电极接线区，32-电极操纵区域，33-正电极接线区，331-双极性悬浮电极，332-负电极片，333-正电极片。
具体实施方式
现在结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明，这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。
实施例一
如图1-图6所示，基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片，包括由上至下依次设置的上层检测板1、中层液滴剪切板2、底层电极板3。
具体的，中层液滴剪切板2上设置有至少一个检测液入口二21，以及与检测液入口二21连接的液滴操纵式介质分流通道23，且液滴操纵式介质分流通道23的一端连接有若干个中间层介质分流入口22，液滴操纵式介质分流通道23的另一端连接有检测液出口二24；中层液滴剪切板2上还设置有介质分流通道二25，介质分流通道二25与液滴操纵式介质分流通道23T接连通；检测液入口二21和检测液出口二24分别位于液滴操纵式介质分流通道23的两端，且中间层介质分流入口22与液滴操纵式介质分流通道23直接连通，且中间层介质分流入口22位于检测液入口二21和检测液出口二24之间。检测液入口二21通过主通道连通位于下层的中层液滴剪切板2的介质分流通道二25。
具体的，上层检测板1上设置有与检测液入口二21对接的检测液入口一11，以及与中间层介质分流入口22连通的介质入口12，和与检测液出口二24连通的检测液出口一13；底层电极板3上设置有与液滴操纵式介质分流通道23对应的双极性悬浮电极331。
具体的，上层检测板1上还设置有条形结构的介质分流通道一14，介质分流通道一14与介质入口12连通，且介质分流通道一14的下部与中间层介质分流入口22连通。
具体的，底层电极板3上设置有电极操纵区域32，电极操纵区域32内设置有若干个间隔排布的双极性悬浮电极331；电极操纵区域32的两端分别设置有与电极操纵区域32连接的负电极接线区31和正电极接线区33；负电极接线区31电连接有若干片延伸至电极操纵区域32的负电极片332，正电极接线区33电连接有若干片延伸至电极操纵区域32的正电极片333，双极性悬浮电极331的两侧分别设置有正电极片333和负电极片332。
更具体的，双极性悬浮电极331的宽度是80μm；双极性悬浮电极331与两侧激电极的正电极片333和负电极片332的电气间隔间隙是20μm；中间层介质分流入口22与液滴操纵式介质分流通道23的支接路段距离是2mm。液滴操纵式介质分流通道23的宽度为160μm，高度为80μm，检测液入口二21的大小为1mm，相邻的检测液出口二24之间的间距为8mm。底层电极板3包括厚度为1.5mm的玻璃基底，玻璃基底上沉积有ITO电极层。本实施例中采用的是五条液滴操纵式介质分流通道23，以及五组双极性悬浮电极331。检测液出口一13的设置数量与液滴操纵式介质分流通道23的数量对应且一一对应连通。
实施例二
在实施例一的基础上，如图1-图6所示，基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片的电转染方法，包括以下步骤：
导入检测液并剪切成微液滴，方法以下方法：将检测液通过检测液入口一11导入后进入介质分流通道一14，介质流体注入到介质入口12；检测液在中层液滴剪切板2的中间层介质分流入口22、介质分流通道二25、液滴操纵式介质分流通道23形成的T型结构通道被介质流体剪切成微液滴。具体的，检测液的获取方法包括：将需要进行电转染的细胞样品培养至70%-80%的密度，收集细胞，离心去除上清液，重悬于含有核酸样本的生理盐水中，使二者充分混合。具体的，在进行电转染方法前，用70%的乙醇溶液对细胞电转染微流控芯片进行消毒，用无菌生理盐水洗涤细胞电转染微流控芯片表面，然后在细胞电转染微流控芯片上加入含有2%BSA的生理盐水溶液进行孵育30分钟，去除剩余的BSA溶液，用生理盐水清洗细胞电转染微流控芯片。
捕获和定位微液滴中细胞和核酸物质，包括以下方法：在底层电极板3的电极操纵区域32借助双极性悬浮电极331和负电极片332和正电极片333配合形成的介电泳和交流电热流动耦合效应将检测液中的细胞和核酸物质收集在同一侧。
实现细胞的电转染，包括以下方法：将接入底层电极板3的信号从高频信号变为脉冲信号，然后将电压设置为指定值，在电转染微流控芯片上建立电场分布；电场分布下，检测液中细胞的质膜会发生局部破裂，将质膜上的核酸导入细胞内部，实现细胞的电转染。具体的，将细胞电转染微流控芯片上的底层电极板3接入电信号源，设置高频信号频率为1MHz，脉冲信号频率为1kHz，高频电压为10V，脉冲电压为1.5V。
在电转染完成后，使用生理盐水清洗芯片，将细胞收集并进行离心分离和分析。
工作原理：
本发明提出一种基于双极性电极极化效应的微液滴内细胞高效电转染微流控芯片，将流体分流、液滴生成、细胞-核酸同步捕获、细胞电穿孔及核酸导入功能集成在该芯片上。
微流控芯片主要包括三层结构，包括上层的上层检测板1、中间层的中层液滴剪切板2、底层的底层电极板3；旨在实现高通量、高效率的细胞电转染。
上层检测板1是油相流体分流PDMS通道层（PDMS即聚二甲基硅氧烷）；从而将油相（可以为硅油、十六烷等）流体分裂成多股流体进入中间层的液滴操纵式介质分流通道23，利用该方法可以减少外设微流泵的使用，仅使用一个微流泵便可产生多股相同流速的流体。
中层液滴剪切板2是中间层的微液滴生成及运动PDMS通道层；微液滴生成及运动PDMS通道层上设置有液滴操纵式介质分流通道23，液滴操纵式介质分流通道23的作用是液滴生成及运动通道，在液滴操纵式介质分流通道23内，检测液（检测液包括细胞-核酸混合物）注入检测液入口一11后经T型通道的流体剪切作用形成微液滴，之后进入电极操纵区域32（即底层电极所在区域）。
底层的底层电极板3包括玻璃基底，以及设置在玻璃基底上的ITO电极层；上层为流体分流通道，该通道与中间层的5个油相入口相连。ITO电极层包括激发电极和双极性悬浮电极331，激发电极包括负电极片332和正电极片333。且，5个双极性悬浮电极331分别置于中间层5个分支通道正中间位置，此时激发电极处于各通道两侧位置，从而可以在各个分支微通道内分别系构成电极操纵区域32，并在该区域内形成非均匀交流电场。三层结构分别通过等离子键合技术组装在一起，形成最终的微流控芯片。利用该三层微流控芯片结构设计，不仅可以在减少外设微流泵使用数量的同时增加芯片操纵通量，还可以将电场操纵技术与液滴操纵技术结合起来，增强细胞操纵的可控性。
当微液滴进入电极区域后，通过给激发电极施加高频率交流电信号，是双极性悬浮电极331产生诱导电势，并使液滴内部产生交流电热漩涡流动现象，使得细胞和核酸被流体漩涡同步捕获到通道一侧；而后对激发电极施加脉冲电信号，促使细胞发生电转染。该芯片为一三层微流控芯片结构，利用流体分流通道进行多通道分流，实现高通量操纵；利用T型通道生成液滴，将细胞-核酸混合物同时包裹进液滴内部，为其提供给独立、无污染的环境；利用交流电场诱导的交流电热流动现象操纵跨尺度细胞和核酸物质，将二者同步捕获到相同区域，旨在为高效率细胞转染提供必要的条件；利用脉冲电信号进行细胞电穿孔，其周围富集的核酸经穿孔导入细胞内；由此实现细胞的高效可控电转染，为CAR-T细胞的制备提供理论和技术支撑。
以上依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定技术性范围。
Claims (10)
1.基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片，其特征在于：包括由上至下依次设置的上层检测板、中层液滴剪切板、底层电极板；
所述中层液滴剪切板上设置有至少一个检测液入口二，以及与所述检测液入口二连接的液滴操纵式介质分流通道，且所述液滴操纵式介质分流通道的一端连接有若干个中间层介质分流入口，所述液滴操纵式介质分流通道的另一端连接有检测液出口二；
所述上层检测板上设置有与所述检测液入口二对接的检测液入口一，以及与所述中间层介质分流入口连通的介质入口，和与所述检测液出口二连通的检测液出口一；
所述底层电极板上设置有与所述液滴操纵式介质分流通道对应的双极性悬浮电极。
2.根据权利要求1所述的基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片，其特征在于：所述中层液滴剪切板上还设置有介质分流通道二，所述介质分流通道二与所述液滴操纵式介质分流通道T接连通；
所述检测液入口二通过主通道连通位于下层的所述中层液滴剪切板的介质分流通道二。
3.根据权利要求2所述的基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片，其特征在于：所述上层检测板上还设置有条形结构的介质分流通道一，所述介质分流通道一与所述介质入口连通，且所述介质分流通道一的下部与所述中间层介质分流入口连通。
4.根据权利要求3所述的基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片，其特征在于：所述检测液入口二和所述检测液出口二分别位于所述液滴操纵式介质分流通道的两端，且所述中间层介质分流入口与所述液滴操纵式介质分流通道直接连通，且所述中间层介质分流入口位于所述检测液入口二和所述检测液出口二之间。
5.根据权利要求1所述的基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片，其特征在于：所述底层电极板上设置有电极操纵区域，所述电极操纵区域内设置有若干个间隔排布的双极性悬浮电极；
所述电极操纵区域的两端分别设置有与所述电极操纵区域连接的负电极接线区和正电极接线区；
所述负电极接线区电连接有若干片延伸至所述电极操纵区域的负电极片，所述正电极接线区电连接有若干片延伸至所述电极操纵区域的正电极片，所述双极性悬浮电极的两侧分别设置有正电极片和负电极片。
6.根据权利要求1所述的基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片，其特征在于：所述双极性悬浮电极的宽度是80μm；所述双极性悬浮电极与两侧激电极的正电极片和负电极片的电气间隔间隙是20μm；所述中间层介质分流入口与所述液滴操纵式介质分流通道的支接路段距离是2mm。
7.根据权利要求6所述的基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片，其特征在于：所述液滴操纵式介质分流通道的宽度为160μm，高度为80μm，检测液入口二的大小为1mm，相邻的检测液出口二之间的间距为8mm。
8.根据权利要求7所述的基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片，其特征在于：所述底层电极板包括厚度为1.5mm的玻璃基底，玻璃基底上沉积有ITO电极层。
9.基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片的电转染方法，其特征在于：包括以下步骤：
导入检测液并剪切成微液滴，包括方法：将检测液通过检测液入口一导入后进入介质分流通道一，介质流体注入到介质入口；所述检测液在中层液滴剪切板的中间层介质分流入口、介质分流通道二、液滴操纵式介质分流通道形成的T型结构通道被所述介质流体剪切成微液滴，
捕获和定位所述微液滴中细胞和核酸物质所述，包括以下方法：在底层电极板的电极操纵区域借助双极性悬浮电极和负电极片和正电极片配合形成的介电泳和交流电热流动耦合效应将检测液中的细胞和核酸物质收集在同一侧；
实现细胞的电转染，包括以下方法：将接入底层电极板的信号从高频信号变为脉冲信号，然后将电压设置为指定值，在电转染微流控芯片上建立电场分布；电场分布下，检测液中细胞的质膜会发生局部破裂，将所述质膜上的核酸导入细胞内部，实现细胞的电转染；
在电转染完成后，使用生理盐水清洗芯片，将细胞收集并进行离心分离和分析。
10.根据权利要求9所述的基于电极极化效应的微液滴内细胞电转染微流控芯片的电转染方法，其特征在于，所述检测液的获取方法包括：将需要进行电转染的细胞样品培养至70%-80%的密度，收集细胞，离心去除上清液，重悬于含有核酸样本的生理盐水中，使二者充分混合；
或/和，用70%的乙醇溶液对细胞电转染微流控芯片进行消毒，用无菌生理盐水洗涤细胞电转染微流控芯片表面，然后在细胞电转染微流控芯片上加入含有2%BSA的生理盐水溶液进行孵育30分钟，去除剩余的BSA溶液，用生理盐水清洗细胞电转染微流控芯片；
或/和，将细胞电转染微流控芯片上的底层电极板接入电信号源，设置高频信号频率为1MHz，脉冲信号频率为1kHz，高频电压为10V，脉冲电压为1.5V。
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