CN117050191A

CN117050191A - 一种具有抑制BPIV3以及BoHV-1感染作用的抗病毒融合肽及其应用

Info

Publication number: CN117050191A
Application number: CN202310815201.6A
Authority: CN
Inventors: 高明春; 底皓晴; 郭永丽; 司明璐; 赵海宁; 耿近峰; 王君伟
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2023-07-04
Filing date: 2023-07-04
Publication date: 2023-11-14

Abstract

本发明公开了一种具有抑制BPIV3以及BoHV‑1感染作用的抗病毒融合肽及其应用。所述的抗病毒融合肽是由TAT穿膜肽与牛Viperin(BoViperin)蛋白融合后得到。本发明证实在牛源细胞内过表达BoViperin蛋白可以抑制BPIV3和BoHV‑1复制；TAT穿膜肽介导BoViperin蛋白可转导进入牛源细胞和小鼠肺中，可以抑制BPIV3和BoHV‑1的复制，表明在细胞水平和动物水平上BoViperin蛋白可迅速建立抗病毒感染状态。本发明证实，TAT穿膜肽与BoViperin融合得到的抗病毒融合肽，具有制备简单、投递便捷等优势，可为开发高效、广谱牛抗病毒药物奠定基础。

Description

一种具有抑制BPIV3以及BoHV-1感染作用的抗病毒融合肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗病毒融合肽及其在应用，特别涉及一种由TAT穿膜肽融合BoViperin蛋白组成的抗病毒融合肽及其在抑制BPIV3以及BoHV-1感染中的应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

牛呼吸道疾病(Bovine respiratory disease，BRD)是牛规模化养殖中常见疾病，发病急、死亡率高，严重威胁牛群健康，造成养牛业重大经济损失。引起该病的原因是众多病原体、环境因素和宿主因素之间一系列复杂的相互作用的结果。其中病毒性因素感染率最高，并且传播快，危害严重，参与BRD的病毒主要包括牛副流感病毒3型(Bovineparainfluenza virus type 3，BPIV3)、牛疱疹病毒1型(Bovine Herpesvirus Virus type1，BoHV-1)以及牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus，BRSV)3种，其中牛疱疹病毒1型又称牛传染性鼻气管炎病毒。

BPIV3在牛群的感染可造成呼吸道感染，临床症状主要为发热、抑郁、厌食、鼻腔和眼部出现浆液性分泌物，肺部和气管出现啰音。仅由BPIV3引起的肺炎通常是亚临床的，BPIV3感染本身导致的临床致死病例很少见。但在BPIV3感染引起的复杂性肺炎中，通常伴有细菌感染，例如溶血氏曼氏杆菌，多杀性巴氏杆菌和睡眠嗜血杆菌等，尽管有众多疫苗和抗菌药物可以应用，但仍造成较高的发病率和死亡率。

BoHV-1在牛群的感染可造成上呼吸道紊乱、结膜炎、生殖器炎症和机体免疫抑制。BoHV-1引起牛传染性鼻气管炎(Infectious Rhinotracheitis，IBR)的发生，疾病表征以发热、鼻炎、呼吸困难和上呼吸道炎症为主，导致奶牛流产及肺炎等疾病发生。该病毒与细菌混合感染，可延缓育肥牛群的生长和增重，影响成年牛的产奶量及繁殖力，若治疗不及时常常导致死亡，年龄越小，其临床症状和病理损害越严重。

牛病毒性呼吸道疾病的诊断主要分为病毒分离鉴定、病毒核酸检测以及血清学诊断。病毒分离鉴定主要是针对发病牛或病死牛，可采集鼻腔拭子或根据剖检病变采集相应病料或进行病原分离。病毒核酸检测技术具有较高的敏感性以及特异性。血清学诊断主要是通过酶联免疫吸附试验来完成，这种方法操作简单，快速准确，有利于在临床推广与应用。

免疫接种对防控BRD的流行具有重大意义。在犊牛出生后通过鼻内接种BPIV3疫苗启动黏膜免疫反应，然后在出生后2～3个月时，即犊牛的母源抗体开始衰减时，再通过肌肉注射加强疫苗。传染性鼻气管炎可以接种牛传染性鼻气管炎灭活疫苗或者减毒疫苗，在免疫接种过程中，要根据牛的体重确定疫苗剂量，以促进牛机体免疫力的增强，减少牛呼吸道疾病的发生。但目前，国内市场上还没有用于预防BPIV3以及BRSV感染的疫苗，只能依赖进口。

目前，尚无治疗BPIV3和BoHV-1感染的特效药，只能以对症治疗与辅助治疗为主。因此，研制安全、有效的抗病毒药物对于控制该病流行具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抑制BPIV3以及BoHV-1的抗病毒融合肽及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明首先将表达BoViperin的真核表达载体pcDNA3.1-3HA-BoViperin转染至牛睾丸细胞(Bovine testicular cells BT)、牛肺成纤维细胞(Bovine lung cells，BL)。Westernblot结果表明，转染36h时，BT细胞和BL细胞中BoViperin蛋白的表达量最高。在此基础上，用BPIV3和BoHV-1分别感染BT细胞、BL细胞，利用qPCR方法和病毒滴度测定法检测不同感染时间细胞样品中病毒的病毒载量和病毒滴度。试验结果表明，与对照组相比过表达的BoViperin能显著抑制BPIV3和BoHV-1的复制。其次，引入TAT穿膜肽，构建原核表达质粒pET-30a-TAT-BoViperin、pET-32a-TAT-BoViperin和pGEX-6p-TAT-BoViperin，转化至Rosetta感受态细胞中通过改变诱导时间、诱导温度以及IPTG浓度。结果表明，pET-30a-TAT-BoViperin、pET-32a-TAT-BoViperin仅有少量TAT-BoViperin蛋白的表达，pGEX-6p-TAT-BoViperin成功表达TAT-BoViperin蛋白，并用Ni²⁺-NTA琼脂糖凝胶柱纯化表达产物，将纯化后的TAT-BoViperin蛋白中的内毒素进行去除。

在细胞水平和动物水平上评价BoViperin蛋白的抗病毒活性，利用TAT穿膜肽介导BoViperin蛋白通过跨膜转导进入牛源细胞和小鼠中。用CCK-8检测结果表明45μL/mL的TAT-BoViperin蛋白对于MDBK细胞有较弱的增殖抑制和轻微的细胞毒性；4.5μL/mL及以上的TAT-BoViperin蛋白对于BL细胞有一定的增殖抑制和细胞毒性。分别选取不同浓度的TAT-BoViperin蛋白转导进入MDBK细胞、BL细胞后，用BPIV3和BoHV-1分别感染MDBK细胞和BL细胞，结果表明，TAT-BoViperin蛋白在MDBK细胞、BL细胞上能显著抑制BPIV3/BoHV-1的复制。将TAT-BoViperin蛋白免疫C57BL/6小鼠，免疫12h后用BPIV3人工感染小鼠，通过观察小鼠肺脏临床解剖变化、肺脏组织病理变化以及qPCR方法分析TAT-BoViperin蛋白在小鼠中对BPIV3复制的影响。结果表明，TAT-BoViperin蛋白在小鼠中可以抑制BPIV3的复制。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种具有抑制牛副流感病毒3型以及牛疱疹病毒1型作用的抗病毒融合肽，所述的抗病毒融合肽是由人免疫缺陷病毒反式激活因子穿膜肽与牛干扰素诱导内质网关联病毒抑制蛋白(Viperin)融合后得到。

其中，优选的，所述的抗病毒融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码所述的抗病毒融合肽的多核苷酸、含有所述的多核苷酸的表达载体以及含有所述的表达载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。

其中，优选的，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，优选的，所述的表达载体为含有所述的多核苷酸的的带有GST或其他促溶标签的载体。

其中，优选的，所述的宿主细胞为Rosetta(DE3)感受态细胞。

进一步的，本发明还提出了所述的抗病毒融合肽在制备抗副流感病毒3型及/或牛疱疹病毒1型药物中的用途。

更进一步的，本发明还提出了一种疫苗组合物，所述的疫苗中含有所述的抗病毒融合肽。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明证实在牛源细胞内过表达BoViperin可以抑制BPIV3和BoHV-1复制，利用pGEX-6p原核表达系统成功表达了TAT-BoViperin蛋白；TAT穿膜肽介导BoViperin蛋白可转导进入牛源细胞和小鼠肺中，阐明TAT-BoViperin蛋白在细胞水平上可以抑制BPIV3和BoHV-1的复制，在感染鼠中可以抑制BPIV3的复制，表明在细胞水平和动物水平上BoViperin蛋白可迅速建立抗病毒感染状态。TAT穿膜肽与BoViperin融合得到的抗病毒融合肽，具有制备简单、投递便捷等优势，可为开发高效、广谱牛抗病毒药物奠定基础。

附图说明

图1为牛Viperin的序列分析图；

注：信号切割位点用箭头标记，保守亮氨酸用灰色阴影加圆圈表示；α-螺旋结构域用灰色阴影表示，SAM中间结构域用浅灰色阴影表示，保守C末端结构域用灰色阴影加虚线表示；

图2为不同物种间Viperin氨基酸序列的多重对比图；

图3为BPIV3/BoHV-1感染MDBK细胞中BoViperin表达水平图；

其中，A：BPIV3感染MDBK细胞中BoViperin表达水平图；B：BoHV-1感染MDBK细胞中BoViperin表达水平图；

图4为正常MDBK细胞与病变MDBK细胞对比图(100×)；

其中，A：正常MDBK细胞；B：BPIV3感染MDBK细胞36h后细胞病变形态；C：BoHV-1感染MDBK细胞24h后细胞病变形态；

图5为BPIV3和BoHV-1的一步生长曲线图；

其中，A：BPIV3的一步生长曲线图；B：BoHV-1的一步生长曲线图；

图6为过表达BoViperin蛋白表达水平的鉴定图；

其中，A：HEK293T细胞中过表达BoViperin蛋白表达水平的鉴定图；B：BT细胞中过表达BoViperin蛋白表达水平的鉴定图；C：BL细胞中过表达BoViperin蛋白表达水平的鉴定图；

图7为BoViperin对BPIV3复制的影响结果图；

其中，A，B：BoViperin对BPIV3病毒载量的影响结果图；C，D：BoViperin对BPIV3滴度的影响结果图；

图8为BoViperin对BoHV-1复制的影响结果图；

其中，A，B：BoViperin对BoHV-1病毒载量的影响结果图；C，D：BoViperin对BoHV-1滴度的影响结果图；

图9为BoViperin基因扩增结果图；

其中，M.Trans 2000bp DNAMarker；1.BoViperin基因的扩增产物；2.阴性对照；

图10为重组质粒的双酶切和PCR鉴定

其中，M.Trans 2KPlusIIDNAMarker；1.重组质粒的双酶切鉴定(EcoRⅠ/XhoⅠ；)；2.重组质粒的PCR鉴定；3.PCR阴性对照；

图11为pET-30a-TAT-BoViperin诱导表达的SDS-PAGE分析结果图；

其中，M.Page RulerMarker；1.pET-30a(+)转化的E.coli诱导前裂解产物；2.pET-30a(+)转化的E.coli诱导后裂解产物3.pET-30a(+)-TAT-BoViperin转化的E.coli诱导前裂解产物；4.pET-30a(+)-TAT-BoViperin转化的E.coli诱导后裂解产物；5，6pET-30a(+)-TAT-BoViperin转化E.coli诱导后裂解产物的上清和沉淀；

图12为pET-30a-TAT-BoViperin优化诱导条件后诱导表达的SDS-PAGE分析结果图；

其中，A：诱导时间摸索的SDS-PAGE分析结果；C：低温诱导不同时间的SDS-PAGE分析结果；

M.Unstainedprotein molecularweightmarker；1.pET-30a(+)转化的E.coli诱导后裂解产物；2.pET-30a(+)-BoViperin转化的E.coli诱导后裂解产物；

3.pET-30a(+)-TAT-BoViperin转化的E.coli诱导前裂解产物；4-8.

pET-30a(+)-TAT-BoViperin转化的E.coli诱导后裂解产物；

B：IPTG浓度摸索的SDS-PAGE分析结果M.Unstainedprotein molecularweightmarker；1.pET-30a(+)转化的E.coli诱导前裂解产物；2.pET-30a(+)转化的E.coli诱导后裂解产物；3.pET-30a(+)-TAT-BoViperin转化的E.coli诱导前裂解产物；

4-7.pET-30a(+)-TAT-BoViperin转化的E.coli诱导后裂解产物；

图13为pET-32a-TAT-BoViperin诱导表达的SDS-PAGE分析结果图；

M.Page RulerMarker；1.pET-32a(+)转化的E.coli诱导后裂解产物2.pET-32a(+)-TAT-BoViperin转化的E.coli诱导前裂解产物；3.

pET-32a(+)-TAT-BoViperin转化的E.coli诱导后裂解产物；4，5.

pET-30a(+)-TAT-BoViperin转化E.coli诱导后裂解产物的上清和沉淀；

图14为pGEX-6p-TAT-BoViperin诱导表达的SDS-PAGE分析结果图；

其中，A：TAT-BoViperin蛋白表达的SDS-PAGE分析结果；M.Page RulerMarker；1.pGEX-6p(+)转化的E.coli诱导后裂解产物；2.pGEX-6p-TAT-BoViperin转化的E.coli诱导前裂解产物；3.pGEX-6p-TAT-BoViperin转化的E.coli诱导后裂解产物；4，5.pGEX-6p-TAT-BoViperin转化E.coli诱导后裂解产物的上清和沉淀；

B：IPTG浓度摸索的SDS-PAGE分析结果M.Page RulerMarker；1.pGEX-6p(+)转化的E.coli诱导后裂解产物；2.pGEX-6p-TAT-BoViperin转化的E.coli诱导前裂解产物；3-6.pGEX-6p-TAT-BoViperin转化的E.coli诱导后裂解产物；

图15为TAT-BoViperin蛋白的Westernblot鉴定结果图；

其中，M.Page RulerMarker；1.pGEX-6p(+)转化的E.coli诱导后裂解产物；2.pGEX-6p-TAT-BoViperin转化的E.coli诱导前裂解产物；3.pGEX-6p-TAT-BoViperin转化的E.coli诱导后裂解产物；4，5.pGEX-6p-TAT-BoViperin转化E.coli诱导后裂解产物的上清和沉淀；

图16为TAT-BoViperin蛋白纯化的SDS-PAGE分析结果图；

其中，A：M.Page RulerMarker；1.上样液；2.流出液；3-5.PBS洗涤液；6-9.GST洗脱液；B：M:PremixedProtein Ladder；1.上样液；2.流出液；3-7.20mM咪唑洗涤液；8-10.500mM咪唑洗脱液；

图17为TAT-BoViperin蛋白浓缩的SDS-PAGE分析结果图；

图18为TAT-BoViperin蛋白中内毒素去除的鉴定结果图；

图19为TAT-BoViperin的细胞毒性分析图；

图20为TAT-BoViperin在MDBK细胞中对BPIV3/BoHV-1复制的影响结果图；

其中，A：TAT-BoViperin蛋白抗BPIV3时最适蛋白浓度的摸索；B：不同感染时间BPIV3滴度的测定；C：TAT-BoViperin蛋白抗BoHV-1时最适蛋白浓度的摸索；D：不同感染时间BoHV-1滴度的测定；

图21为BoViperin在BL细胞中对BPIV3/BoHV-1复制的影响结果图；

图22为TAT穿膜肽对BPIV3复制的影响结果图；

图23为BPIV3感染小鼠后肺组织临床病理变化图；

图24为病理切片HE染色观察感染小鼠肺脏病理变化图(200×)；

图25为小鼠肺组织内BPIV3 mRNA转录水平的检测结果图；

图26为BPIV3感染小鼠后肺内的病毒载量变化图；

图27为小鼠肺脏中细胞因子的mRNA转录水平检测结果图；

其中，A：IL-4；B：IL-6；C：IL-10；D：IL-1β；E：IL-12；F：TNF-α；G：IFN-γ。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 TAT-BoViperin重组蛋白的制备及细胞水平抗病毒活性鉴定

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1病毒、细胞和动物

牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)和牛疱疹病毒1型(Bovine Herpesvirus Virus type 1，BoHV-1)和由东北农业大学微生物与免疫实验室(以下简称本实验室)提供。牛肾细胞系(Madin Darbybovine kidney cells，MDBK)、牛肺成纤维细胞(Bovine lung cells，BL)、牛睾丸细胞(Bovine testicular cells BT)、人胚胎肾293T细胞系(human embryonic kidney 293T cells，HEK293T)由本实验室制备并保存。

1.1.2载体、质粒

原核表达载体pET-30a(+)、pET-32a(+)、pGEX-6p-1(+)载体、感受态细胞E.coliDH5α、E.coliRosetta以及重组质粒pcDNA3.1-3HA-BoViperin均由本实验室制备并保存。

1.1.3主要溶液配制

(1)PBS(T):

配制20倍PBS母液：2.74MNacl、54mM Kcl、0.4MNa2HPO4·12H2O和35mM KH2PO4，使用时水稀释至1×，加0.05％(v/v)Tween-20。

(2)LB培养基：

去离子水溶解0.5％酵母提取物、1％NaCl和1％胰蛋白胨，定容至1L，高压灭菌后室温保存备用。

(3)DMEM细胞培养基础液

去离子水溶解10.4gDMEM(GIBCO)和3.7gNaCO3，pH调到7.2-7.4，定容至1L，滤器除菌，4℃保存备用。

(4)0.25％胰酶溶液

1×PBS溶液溶解0.25g胰酶和0.025g EDTA，调pH为7.4，定容至100mL，滤器除菌后-20℃保存备用。

(5)SDS-PAGE：

浓缩胶：去离子水、30％Acr-Bis(29:1)、1M Tris(pH6.8)、10％(w/v)SDS、10％(w/v)过硫酸铵和TEMED。分离胶：去离子水、30％Acr-Bis(29:1)、1.5M Tris pH8.8)、10％(w/v)SDS、10％(w/v)过硫酸铵和TEMED。

(6)转印缓冲液：

0.04M甘氨酸、0.04M Tris-Base、1mM SDS和5％(v/v)甲醇，还原性电泳转印液中不含SDS。

(7)电泳缓冲液：

94g C₂H₅NO₂，15.1g Tris-Base，5g SDS，定容至1L，4℃保存。

1.1.4主要引物序列

主要序列见表1。

表1 PCR引物

1.2试验方法

1.2.1 BoViperin的基因生物学特性分析

根据NCBI发表的BoViperin参考序列(登录号MN585200)，分析BoViperin分子特征，将BoViperin与其他物种的Viperin核苷酸和氨基酸序列进行相似性对比。

1.2.2 BPIV3和BoHV-1对BoViperin表达量的影响

用0.1MOI的BPIV3和BoHV-1分别感染MDBK细胞，细胞在病毒感染后于0h、1h、3h、6h、12h、24h、36h收取细胞培养物，TRIzol提取细胞样品RNA，qPCR法测定BoViperin的表达量。

1.2.3 BoViperin抗病毒活性研究

1.2.3.1 BPIV3和BoHV-1的增殖与培养

在MDBK细胞上大量繁殖BPIV3和BoHV-1,当细胞密度为70-80％时，用无菌的PBS清洗细胞三遍。按照MOI:0.01的比例用无血清DMEM细胞培养液分别稀释BPIV3和BoHV-1，分别接种于细胞瓶中，并在37℃，5％CO₂条件下培养，每日观察病变情况，当80％细胞出现病变时收取病毒。将培养瓶放入-40℃冰箱中，反复冻融三次使细胞破损以释放出病毒，将培养液以5000r/min的转数，在4℃下离心10min，弃去细胞碎片将上清中病毒于-70℃进行保存。

1.2.3.2 BPIV3和BoHV-1一步生长曲线的绘制

按照MOI＝0.01剂量将病毒接种至单层MDBK细胞，以2％胎牛血清DMEM培养基作为正常细胞对照，细胞在病毒感染后1、3、6、12、24、36、48、60和72h收获病毒液，将收集的细胞病毒混合液反复冻融3次后，12000r/min离心15min，取上清液过0.22μm滤器，按照Reed-Muench方法分别测量BPIV3和BoHV-1在上述9个时间点的病毒滴度，并绘制一步生长曲线。

1.2.3.3 BPIV3和BoHV-1病毒滴度的测定

将病毒液稀释到10^-1-10^-10分别接种于密度为70％MDBK细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度重复8个孔，每孔100μL，同时设立两列阴性对照，将96孔细胞板置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中感作1.5h后弃掉病毒液，换成含2％血清的DMEM培养液，在37℃，5％CO₂条件下培养48-72h。逐日观察细胞病变(CPE)，最后用Reed-Muench法计算各病毒的TCID50。

1.2.3.4BoViperin抗病毒活性的鉴定

将实验室保存的质粒pcDNA3.1-3HA-BoViperin首先进行转化、挑菌、大剂量培养等一系列操作后，用质粒中量提取试剂盒提取质粒，并测量质粒浓度，达到转染质粒浓度要求。

HEK293T细胞按1×10⁶个/孔铺入12孔细胞培养板，24h内转染到HEK293T细胞中，Western blot进行鉴定，然后再将BT细胞和BL细胞分别按1×10⁶个/孔铺入12孔细胞培养板，24h内进行转染。转染试剂为lipo2000，按照转染试剂说明指导进行操作。将1.2μg质粒进行转染BL细胞、BT细胞，Westernblot进行鉴定，确定蛋白表达最佳时间。再次进行转染后，分别用0.5MOI的BPIV3和BoHV-1感染细胞12h、24h、36h，收取细胞样品。一组细胞提取细胞培养物RNA，用qPCR测定不同感染时间的病毒载量；另一组细胞反复冻融三次，收取细胞样品中的病毒液，检测细胞样品中病毒的滴度。病毒滴度的测定步骤同1.2.3.3。

1.2.4TAT-BoViperin重组表达载体的构建

1.2.4.1引物设计

根据GenBank中公布的BoViperin(MN585200)序列，设计所对应的特异性引物，并在引物序列中引入TAT短肽序列、组氨酸序列(His)、保护性碱基以及限制性内酶切识别位点，引物由库美生物基因公司合成。

1.2.4.2目的基因的扩增及回收

以pcDNA3.1-3HA-BoViperin质粒为模板，用TAT-BoViperin-F引物、BoViperin.REV+His、BoViperin.REV引物进行PCR(对于连接pET-30a、pET-32a的片段，用TAT-BoViperin-F、BoViperin.REV引物(不添加His标签)，对于连接pGEX-6p载体的片段用TAT-BoViperin-F和BoViperin.REV+His引物)，扩增BoViperin的编码核酸。用DNA纯化回收试剂盒对PCR产物进行胶回收。

1.2.4.3目的基因和载体的双酶切及连接

按照质粒对应的限制性内切酶，分别对回收的扩增产物以及载体进行双酶切鉴定，酶切条件均为37℃孵育2h，用DNA纯化回收试剂盒对产物进行回收。将酶切产物与载体质粒混合，16℃金属浴连接过夜。

用10μL连接产物转化感受态细胞E.coli DH5α中，用10μL连接产物转化感受态细胞E.coli DH5α中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴5min，加入200μL灭菌LB液体培养基于感受态细胞中，37℃，220r/min振荡培养1h，然后将培养产物涂布于含有30μg/mL氨苄霉素(Amp)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。

1.2.4.4 TAT-BoViperin重组质粒的酶切鉴定

将转化后的平板pET-30a-TAT-BoViperin挑取单菌落于含有30μg/mLKan LB培养基中，pET-32a-TAT-BoViperin、pGEX-6p-TAT-BoViperin挑取单菌落于含有10μg/mLAmp LB培养基中，培养12h后，使用小剂量质粒制备试剂盒提取重组质粒pET-30a-TAT-BoViperin、pET-32a-TAT-BoViperin、pGEX-6p-TAT-BoViperin，利用EcoRⅠ和Xho I进行双酶切鉴定，双酶切鉴定参照1.2.4.3。酶切鉴定成功后，将重组质粒进行测序。

1.2.4.5 TAT-BoViperin重组质粒的PCR鉴定

将重组质粒pET-30a-TAT-BoViperin、pET-32a-TAT-BoViperin、pGEX-6p-TAT-BoViperin进行PCR鉴定，PCR体系和程序同1.2.4.1即可，PCR结束后通过核酸胶进行鉴定。

1.2.5 TAT-BoViperin蛋白的制备

1.2.5.1 TAT-BoViperin蛋白的表达

用pET-30a-TAT-BoViperin、pET-32a-TAT-BoViperin、pGEX-6p-TAT-BoViperin重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3)^TM中。挑取单个菌落接种于5mL液体LB培养基(Kan⁺/Amp⁺)，37℃，220r/min振荡培养过夜。将过夜培养物以2％的比例加入液体LB培养基(含有10μg/mLAmp或30μg/mLKan)中，对TAT-BoViperin蛋白进行诱导时间、诱导温度、IPTG浓度等诱导条件的优化。将培养物以5000r/min的速度离心10min，弃上清。菌体沉淀用PBS重悬，于冰浴中超声1h。每次超声时间为5s，间歇时间为3s。超声产物以5000r/min的速度离心10min。收集上清，沉淀用含有8M尿素的PBS溶解。

1.2.5.2 TAT-BoViperin蛋白的鉴定

样品与2×SDS上样缓冲液1:1混合，沸水浴10min，SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。在此基础上，以小鼠抗His标签单抗和小鼠抗GST标签单抗为一抗(1:5000)，HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗(1:5000)，进行Westernblot检测，鉴定BoViperin蛋白的表达形式。

1.2.5.3 TAT-BoViperin蛋白的纯化

将成功表达的TAT-BoViperin蛋白进行纯化，有两种方式进行纯化，一种是利用GST纯化介质进行纯化，另一种是利用His标签Ni²⁺-NTA亲和层析方法进行纯化。

1.2.5.4 TAT-BoViperin蛋白的透析与浓缩

纯化的TAT-BoViperin蛋白于含6M尿素、10％甘油的TGE缓冲液中进行梯度透析，去除尿素和咪唑。换液顺序为6M尿素TGE缓冲液，4M尿素TGE缓冲液，2M尿素TGE缓冲液，最后是用不含尿素的TGE透析液进行换液，每4-6小时换液一次。用蔗糖对蛋白进行浓缩。将浓缩后的蛋白用10％SDS-PAGE分析蛋白浓缩情况，并用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。

1.2.5.5TAT-BoViperin蛋白中内毒素的去除

(1)蛋白样品上样前用0.22um或0.45um滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。样品pH最好控制在7-8，是内毒素结合至柱子上的最佳pH条件。样品最好控制适当的离子强度，减少非特异性吸附，如0.15-0.5M的NaCl。

(2)活化树脂：将预装柱置于铁架台，垂直固定，去除预装柱顶部的盖子，打开流速控制器，使保护液在重力作用下流完，加入5ml再生缓冲液(遇冷)调节流速控制器，保持流速在0.25ml/min(或者1滴/6s)待再生缓冲液流完，在加入5ml再生缓冲液(预冷)，再重复操作两次。

(3)平衡树脂：活化完毕，加入6ml平衡缓冲液，流速在0.5ml/min(或者1滴/3s)，再重复操作两次。

(4)除内毒素：取1.5ml蛋白样品加到平衡后的层析柱中，调节流速在0.25ml/min(或者1滴6s)，不接流出液。当蛋白样品流完，继续添加蛋白样品，蛋白样品添加1.5ml平衡液，并与之前的流出液合并。

1.2.6TAT-BoViperin蛋白的细胞毒性分析

用CCK-8试剂盒的方法检测TAT-BoViperin蛋白对MDBK和BL细胞的毒性，将MDBK细胞、BL细胞分别接种于96孔板中，待细胞生长至70％左右时，用10倍倍比稀释的TAT-BoViperin蛋白处理细胞，37℃细胞培养箱孵育72h，加入CCK-8(10μL/孔)继续孵育1-4h，然后使用酶标仪测量450nm处的吸光度，每个处理组重复3个孔。

1.2.7TAT-BoViperin细胞水平抗病毒活性的鉴定

将MDBK细胞、BL细胞按1×10⁶个/孔铺入4个6孔细胞培养板，摸索TAT-BoViperin蛋白抗病毒的最适浓度。选取浓度为1μg/ml、100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml、1ng/ml的TAT-BoViperin蛋白分别孵育MDBK细胞、BL细胞12h后，分别用0.5MOI的BPIV3和BoHV-1感染MDBK细胞和BL细胞，并设立阴性对照和阳性对照。检测感染病毒12h、24h、36h细胞样品中的病毒滴度。病毒滴度的测定步骤同1.2.2.3。

为了探究TAT穿膜肽对病毒复制的影响，用浓度为1μg/ml的TAT-BoViperin蛋白和TAT-mScarlet蛋白分别孵育MDBK细胞12h后，用0.5MOI BPIV3感染MDBK细胞12h、24h、36h，收取细胞样品中的病毒液，检测感染病毒12h、24h、36h细胞样品中的病毒滴度，病毒滴度的测定步骤同1.2.2.3。

1.2.8统计学方法

本研究试验均重复3次，并用GraphpadPrime 8.0软件分析结果，数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示，p>0.05表示差异不显著(no significant difference,ns)，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001表示差异显著。

2结果

2.1牛Viperin(BoViperin)的基因生物学特性分析

牛Viperin由1092个碱基组成，其编码363个氨基酸，蛋白质分子量为41.5kDa，等电点为6.88。根据对牛Viperin序列进行分析可得，牛Viperin核苷酸与绵羊Viperin核苷酸相似性为96.5％，与其他动物Viperin核苷酸相似性为24.7-96.5％。牛Viperin有三个结构域，如图1所示。N-末端结构域含有α-螺旋，信号肽位于前18个氨基酸，并且五个保守的亮氨酸位点被鉴定；中间的SAM结构域含有四个Motif特征基序，SAM结构域和C末端结构域都相对保守。同源性分析结果表明(图2)，牛Viperin的氨基酸与绵羊和兔的氨基酸的相似性为99.2％和92.5％，与其他动物氨基酸的相似性为67.1-99.2％，各物种间序列差异主要存在于N末端结构域，

2.2BPIV3和BoHV-1对BoViperin表达的影响

以0.1MOI的BPIV3和BoHV-1分别感染MDBK细胞后，检测感染BPIV324h内和感染BoHV-136h内BoViperin的表达量，如图3所示。BPIV3和BoHV-1均可以显著诱导BoViperin的产生，且感染BPIV36h BoViprin的表达量最高，感染BoHV-124hBoViperin的表达量达到最高。

2.3BoViperin抗病毒活性研究

2.3.1BPIV3和BoHV-1的增殖

3.3.1.1BPIV3和BoHV-1的细胞病变

BPIV3和BoHV-1均能在MDBK细胞中很好的增殖，并且MDBK细胞在感染BPIV3和BoHV-1后24h-48h均可出现病变，病变的主要特征是细胞变圆、皱缩、脱落甚至破碎等不同于正常细胞的形态，如图4所示。

2.3.1.2BPIV3和BoHV-1一步生长曲线的绘制

BPIV3和BoHV-1一步生长曲线，如图5所示。BPIV3在感染24h-60h生长速度最迅速，感染60h达到峰值，感染60h以后BPIV3病毒滴度开始下降。BoHV-1在感染MDBK细胞12h-48h生长最迅速，感染48h-60h生长速度逐渐变缓，感染60h时达到峰值，感染60h后BoHV-1病毒滴度开始下降。

2.3.1.3BPIV3和BoHV-1病毒滴度的测定

将BPIV3和BoHV-1病毒原液作10倍倍比稀释，测定BPIV3和BoHV-1的TCID50，并用Reed-Muench法计算得到了以下数据：BPIV3的TCID50＝10^-7.445/0.1mL；BoHV-1的TCID50＝10^-8.4/0.1ml；见表2、表3。

表2BPIV3的TCID50测定结果

用Reed-Muench法计算TCID50：

距离比例d＝(66.7％-50％)/(66.7％-29.2％)＝0.445

TCID50＝-7+0.445×(-1)＝-7.445

BPIV3的TCID50＝10^-7.445/0.1mL。

表3BoHV-1的TCID50测定结果

用Reed-Muench法计算TCID50：

距离比例d＝(66.7％-50％)/(66.7％-25％)＝0.4

TCID50＝-8+0.4×(-1)＝-8.4

BoHV-1的TCID50＝10^-8.4/0.1ml

2.3.2过表达BoViperin的Westernblot鉴定

以1.2μg/孔的剂量将重组质粒pcDNA3.1-3HA-BoViperin瞬时转染293T细胞，于12h、24h收取蛋白样品进行Westernblot鉴定，如图6。BoViperin蛋白显著表达。再将重组质粒以1.2μg/孔的剂量转染至BT细胞、BL细胞，经表达时间摸索36h时，BoViperin的表达量最高。

2.3.3过表达BoViperin对BPIV3复制的影响

以1.2μg/孔的剂量将真核表达质粒pcDNA3.1-3HA-BoViperin转染至BT细胞、BL细胞36h后，用0.5MOI的BPIV3感染细胞12h、24h、36h，检测细胞样品中的病毒载量和病毒滴度。结果如图7所示。BPIV3感染BT细胞和BL细胞12h、24h时，与对照组相比，实验组中BPIV3的病毒载量下降，且病毒载量降低近10倍；与对照组相比，实验组的病毒滴度显著下降，结果表明BoViperin过表达可以抑制BPIV3的复制。

2.3.4过表达BoViperin对BoHV-1复制的影响

以1.2μg/孔的剂量将真核表达质粒pcDNA3.1-3HA-BoViperin转染至BT细胞、BL细胞36h后，用0.5MOI的BoHV-1感染细胞12h、24h、36h，收取细胞样品。检测细胞样品中的病毒载量和病毒滴度。结果显示图8所示。BT细胞感染BoHV-112h、24h时，与对照组相比，实验组中BoHV-1的病毒载量和病毒滴度均下降；BL细胞感染BoHV-112h、24h、36h时，与对照组相比，实验组中BoHV-1的病毒载量和病毒滴度均下降，其中在感染BoHV-136h时差异最显著，实验组中BoHV-1的病毒载量和病毒滴度均降低了近100倍。上述结果表明，Viperin过表达可以抑制BoHV-1的复制。

2.4 TAT-BoViperin重组表达载体的构建

2.4.1 BoViperin基因扩增

以pcDNA3.1-3HA-BoViperin质粒为模板，用TAT-BoViperin-F引物、BoViperin.REV+His引物、BoViperin.REV进行PCR，PCR产物1165bp，如图9所示。

2.4.2 TAT-BoViperin重组质粒的鉴定

构建重组表达质粒pET-30a-TAT-BoViperin、pET-32a-TAT-BoViperin、pGEX-6p-TAT-BoViperin，对原核重组质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定，结果与预期相符，如图10所示。

2.5 TAT-BoViperin蛋白的制备

2.5.1 TAT-BoViperin蛋白的表达

将构建成功的原核重组质粒pET-30a-TAT-BoViperin用E.coliRosetta(DE3)^TM感受态细胞进行转化，诱导表达TAT-BoViperin蛋白。当菌液37℃培养至OD600nm为0.4-0.6时，加入1mM IPTG，摇床转速220rpm，诱导4h，SDS-PAGE分析结果，如图11。TAT-BoViperin蛋白预期大小为50KDa，但在50KDa位置未发现特异性条带，表明TAT-BoViperin蛋白未表达。

对TAT-BoViperin蛋白的诱导时间、IPTG浓度以及诱导温度进行摸索。当诱导温度在37℃，IPTG浓度为1mM时，进行诱导时间3h、4h、5h、6h、8h的摸索，如图12。结果表明诱导时间为6h(第7泳道)有少量TAT-BoViperin蛋白表达。当诱导温度为37℃，诱导时间为6h时，进行IPTG浓度为0.5mM、0.8Mm、1.0mM、1.2mM的摸索，结果表明，在0.5mM、0.8Mm、1.0mM、1.2mMIPTG浓度诱导下，在50KDa位置处TAT-BoViperin蛋白仅有少量表达。改变诱导温度，对pET-30a-TAT-BoViperin进行诱导表达，当诱导温度为27℃，IPTG浓度为1mM的诱导条件下，进行8h、10h、12h、14h、16h的诱导表达。结果表明，TAT-BoViperin蛋白仅有少量表达。综上所述，通过改变诱导时间、诱导温度、IPTG浓度，不能大幅度提高TAT-BoViperin蛋白的表达量，TAT-BoViperin蛋白仅有少量表达。

将构建成功的原核重组质粒pET-32a-TAT-BoViperin用E.coliRosetta(DE3)^TM诱导表达TAT-BoViperin蛋白，预期蛋白大小为60KDa左右，如图13，经诱导条件优化后，TAT-BoViperin蛋白的表达量仍然很低。

将构建成功的原核重组质粒pGEX-6p-TAT-BoViperin用E.coliRosetta(DE3)^TM诱导表达TAT-BoViperin蛋白。当菌液37℃培养至OD600nm为0.4-0.6时，加入1mM IPTG，摇床转速220rpm，诱导6h。SDS-PAGE分析结果显示如图14A，在70KDa位置处发现非特异性条带，符合预期蛋白大小。为提高TAT-BoViperin蛋白的表达量，对IPTG浓度进行优化，SDS-PAGE分析结果显示如图14B，在0.6mM IPTG诱导条件下，TAT-BoViperin蛋白表达量高。因此在诱导温度为37℃、IPTG浓度为0.6mM、诱导时间为6h的诱导条件下，进行TAT-BoViperin的表达。

2.5.2TAT-BoViperin蛋白的鉴定

对表达成功的TAT-BoViperin蛋白进行鉴定，Westernblot结果显示在70kDa位置检测到了与预期相符的条带，并确定其表达形式为包涵体，如图15所示。TAT-BoViperin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.5.3TAT-BoViperin蛋白的纯化

由于TAT-BoViperin蛋白中携带GST标签和His标签，因此可采用两种方式将TAT-BoViperin蛋白进行纯化，一种是利用GST纯化介质进行纯化，另一种是利用His标签Ni²⁺-NTA亲和层析方法进行纯化，如图16所示。利用GST标签和His标签均可以纯化出TAT-BoViperin蛋白，但利用His标签Ni²⁺-NTA亲和层析方法纯化效率更高，因此，后期试验用His标签Ni²⁺-NTA亲和层析方法进行纯化。

2.5.4TAT-BoViperin蛋白的透析与浓缩

在透析TAT-BoViperin蛋白时，采用含有6M尿素、5％甘油的PBS缓冲液进行梯度透析，但由于透析过程中造成TAT-BoViperin蛋白析出。因此将TAT-BoViperin蛋白进行稀释后，采用含有6M尿素、10％甘油的TGE缓冲液进行梯度透析，去除尿素和咪唑。用蔗糖对TAT-BoViperin蛋白进行浓缩。将浓缩后的蛋白用10％SDS-PAGE分析蛋白浓缩情况如图17，TAT-BoViperin蛋白纯度可达90％以上，浓度为1mg/mL。

2.5.5TAT-BoViperin蛋白中内毒素的检测

用采用内毒素去除试剂盒高效去除TAT-BoViperin蛋白中的内毒素，检测去除内毒素前后TAT-BoViperin蛋白中的内毒素水平，并进行比较。如图18所示。去除内毒素后TAT-BoViperin蛋白中内毒素含量明显下降。

2.6TAT-BoViperin蛋白的细胞毒性分析

根据结果观察，TAT-BoViperin蛋白分别作用于MDBK细胞、BL细胞72h，其中，高剂量(45μL/mL)的TAT-BoViperin蛋白对MDBK细胞有较弱的增殖抑制和轻微的细胞毒性；4.5μL/mL及以上的BoViperin蛋白对BL细胞有一定的增殖抑制和细胞毒性，如图19。

2.7TAT-BoViperin蛋白在细胞中的抗病毒活性分析

根据观察分析结果可得，如图20所示，在MDBK细胞中，1μg/mL和100ng/mL TAT-BoViperin蛋白均能降低BPIV3和BoHV-1的病毒滴度，1μg/mLTAT-BoViperin蛋白差异更显著，因此，选择1μg/mL TAT-BoViperin蛋白进一步研究TAT-BoViperin对BPIV3/BoHV-1复制的影响。

将1μg/mL TAT-BoViperin蛋白孵育MDBK细胞12h后，用0.5MOI的BPIV3/BoHV-1分别感染MDBK细胞12h、24h和36h，收取细胞样品，检测细胞样品中的病毒滴度。结果表明，在MDBK细胞感染BPIV312h、24h时，与对照组相比，蛋白实验组中BPIV3的病毒滴度显著下降。在MDBK细胞感染BoHV-112h时，与对照组相比，蛋白实验组中BoHV-1的病毒滴度显著下降，表明1μg/mL TAT-BoViperin蛋白在MDBK细胞中可以抑制BPIV3和BoHV-1的复制，且只在感染BoHV-1早期抑制BoHV-1的复制。

根据观察分析结果可得，如图21所示，在BL细胞中，100ng/mL TAT-BoViperin蛋白可以降低BPIV3和BoHV-1的病毒滴度。将100ng/mLTAT-BoViperin蛋白孵育BL细胞12h后，用0.5MOI的BPIV3/BoHV-1分别感染BL细胞12h、24h和36h，收取细胞样品，检测细胞样品中的病毒滴度。结果表明，在感染BPIV312h、24h、36h时，蛋白实验组中BPIV3的病毒滴度显著低于对照组，在感染BoHV-112h时，蛋白实验组中病毒滴度显著低于对照组，而在感染24h和36h时蛋白实验组和对照组差异不显著。上述结果表明100ng/mL TAT-BoViperin蛋白在BL细胞中可以抑制BPIV3和BoHV-1的复制，且只在早期抑制BoHV-1的复制。

为探究TAT穿膜肽对病毒复制是否具有影响，用TAT-mScarlet蛋白做对照，结果如图16所示，TAT-BoViperin蛋白组病毒滴度低于对照组(control组)病毒滴度，而TAT-mScarlet蛋白组和对照组(control组)病毒滴度基本一致(图22)。结果表明BoViperin蛋白具有抑制BPIV3病毒复制的能力，而TAT穿膜肽对BPIV3病毒未起到抑制作用。

实施例2TAT-BoViperin蛋白在小鼠中抗BPIV3活性分析

1、实验动物

6-8周龄SPF级C57BL/6小鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司。所有动物实验过程均遵守东北农业大学动物福利与伦理规范。TAT-BoViperin蛋白由实施例1制备得到。

2、方法

(1)BPIV3的超速离心处理

按照实施例1中的1.2.3.1中BPIV3的增殖培养方法培养BPIV3病毒400mL，将病毒液进行差速离心，先将病毒液以3000r/min的转数离心30min，接着把病毒液上清转移至新的灭菌离心管中，再以5000r/min的转速离心30min，收集病毒液的上清继续进行超速离心浓缩处理。将病毒液放入超离管中，盖好盖子并配平后，放入角转子中，在4℃环境下，以35000r/min的转速离心2.5h后弃掉上清液，用预冷的PBS溶液重悬病毒沉淀，将BPIV3沉淀溶解于PBS后放于-80℃进行保存。超速离心后BPIV3的滴度按照实施例1中的1.2.3.3方法去测定。

(2)动物分组、免疫攻毒

选取6-8周龄C57 BL/6小鼠，分为三组，分别为空白对照组、BPIV3组、TAT-BoViperin组。将TAT-BoViperin组小鼠免疫TAT-BoViperin蛋白(100μg)12h后，于气管注射10⁹/0.1mL的BPIV330μL，空白对照组不注射。

(3)病料的采集

观察攻毒鼠在感染后的临床表现，并在感染后6h、12h、24h、36h、48h、72h各组分别解剖小鼠3只，采集肺脏组织。取少量肺组织，4％多聚甲醛浸泡后室温保存，用于制作病理切片；取部分肺脏加入少许液氮后研磨粉碎，用Trizol法提取基因组RNA，检测肺脏组织中BPIV3和部分细胞因子的RNA水平。

(4)病理变化观察

观察肺脏病理变化。4％多聚甲醛固定液浸泡保存的肺组织，制作病理切片和苏木精-伊红(H.E.)染色，观察眼观和镜检下的组织病理变化。

(5)Quantitative RT-PCR检测肺组织中BPIV3转录水平，分析比较各组小鼠肺组织中BPIV3的mRNA相对含量。

(6)Quantitative RT-PCR检测肺组织中细胞因子的转录水平，分析各组小鼠肺组织中细胞因子的mRNA相对含量。

3、结果

3.1肺脏临床解剖变化

与空白对照组小鼠肺组织相比，感染BPIV36h、12h、48h和72h时，各组均未出现明显肉眼可见的病理变化；感染BPIV324h时，BPIV3组肺部出现少量的出血点，肺部略显肿大，而TAT-BoViperin组未出现明显病理特征；感染BPIV336h时，BPIV3组肺部肿大，出现明显淤血，颜色暗红，而TAT-BoViperin组肉眼观察症状较轻，如图23。

3.2肺脏组织病理变化

当感染BPIV36-12h时，BPIV3组小鼠的肺脏镜下可见肺泡间隔增大，毛细血管充血，TAT-BoViperin组可见轻微毛细血管充血。当感染BPIV324-36h时，BPIV3组可观察到不同程度的肺泡上皮细胞增生，肺泡间隔毛细血管充血和出血，肺泡壁明显增厚，肺泡及其间隔内有巨噬细胞和淋巴细胞浸润，肺泡结构损伤，导致间质性肺炎。而TAT-BoViperin组发现毛细血管充血、肺泡间隔增宽，少量的炎性细胞浸润。当感染BPIV348h时，BPIV3组可观察到毛细血管的充血、出血、炎性细胞浸润等，TAT-BoViperin组可见血管出血、管壁增厚，肺泡间隔增宽。当BPIV3感染72h时，BPIV3组毛细血管出血、炎性细胞浸润、上皮细胞脱落等，TAT-BoViperin组肺泡壁间隔增宽、管壁增厚，炎性细胞浸润。综上所述，在感染6-48h时，TAT-BoViperin组小鼠肺脏的病理变化程度低于BPIV3组，如图24。

3.3肺组织中BPIV3 mRNA水平比较分析

为探讨TAT-BoViperin蛋白对小鼠机体保护水平，利用Quantitative RT-PCR方法检测了采集各组肺组织中BPIV3的mRNA水平。结果如图25所示。在感染6h、12h、24h、36h、48h的肺组织中，TAT-BoViperin组的BPIV3 mRNA水平显著低于BPIV3组，其中在感染36h的肺组织中，显著差异性最大；在感染72h的肺组织中，TAT-BoViperin组与BPIV3组的BPIV3 mRNA水平无显著差异。在感染各个时间段的肺组织中，BPIV3组和PBS组的BPIV3 mRNA水平无显著差异。上述结果表明，当BPIV3感染小鼠，TAT-BoViperin蛋白在小鼠中可以抑制BPIV3的复制。

3.4肺组织中细胞因子的检测与分析

Th1细胞分泌IFN-γ和TNF-α等，介导巨噬细胞活化，杀伤胞内病原体，在细胞免疫中发挥作用。Th2细胞分泌IL-4,IL-6和IL-10等，介导嗜酸性粒细胞活化，对抗胞外病原体。Th1-Th2比例平衡共同维持机体稳态，一旦其比例失衡，将导致多种疾病的发生和发展。通常认为Th1及其分泌的细胞因子具有促炎功能；Th2及其分泌的细胞因子具有抑炎功能。

为检测小鼠肺脏中的细胞因子反应，利用Quantitative RT-PCR检测TAT-BoViperin组、BPIV3组以及空白对照组小鼠肺脏中IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α的mRNA转录水平，结果如图27所示，在感染BPIV3过程中，BPIV3组中IL-6、IL-10、IL-1β、IL12、IFN-γ、TNF-α的转录水平显著高于对照组，其中BPIV3组IL-6、IL-1β的表达量随着感染时间增加出现下降趋势，BPIV3组IL-10、IL12、IFN-γ的表达量随着感染时间增加出现先下降后增加的趋势。BPIV3组中IL6、IL-10、IL-1β、IL-12、IFN-γ的mRNA转录水平显著高于TAT-BoViperin组。

在感染BPIV3后，BPIV3组中IL6、IL-10、IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α的mRNA转录水平升高是机体抵御病毒的正常反应，而TAT-BoViperin组中IL6、IL-10、IL-1β、IL-12、IFN-γ的mRNA转录水平显著低于BPIV3组，表明BPIV3感染TAT-BoViperin组程度较BPIV3组轻，TAT-BoViperin蛋白在小鼠中可以抑制BPIV3的复制。

Claims

1.一种具有抑制牛副流感病毒3型(Bovineparainfluenzavirustype3，BPIV3)以及牛疱疹病毒1型(BovineHerpesvirusVirustype1，BoHV-1)感染作用的抗病毒融合肽，其特征在于，所述的抗病毒融合肽是由人免疫缺陷病毒反式激活因子(Human immunodeficiencyvirustransactivator，TAT)穿膜肽与牛干扰素诱导内质网关联病毒抑制蛋白(Viperin)融合后得到。

2.如权利要求1所述的抗病毒融合肽，其特征在于，所述的抗病毒融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.编码权利要求1或2所述的抗病毒融合肽的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

5.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体中含有权利要求3或4所述的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为含有权利要求3或4所述的多核苷酸的带有GST或其他促溶标签的载体。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求5或6所述的表达载体。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为大肠杆菌Rosetta(DE3)。

9.权利要求1或2所述的抗病毒融合肽在制备抗副流感病毒3型及/或牛疱疹病毒1型药物中的用途。

10.一种疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗中含有权利要求1或2所述的抗病毒融合肽。