CN117025519B - 一种中药提取物的应用及其所制备的培养基和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种中药提取物的应用及其所制备的培养基和应用方法，属于畜牧业技术领域。该中药提取物为异麦角甾苷，本发明发现其可以降低周期蛋白Cyclin‑B1在猪卵母细胞中的蛋白表达，从而抑制体外卵母细胞的减数分裂。另外，本发明还提供了一种应用异麦角甾苷制备提高猪卵母细胞体外成熟率的培养基的方法。该培养基由含有异麦角甾苷的卵母细胞减数分裂抑制培养基和成熟培养基组成。本发明通过应用中药提取物异麦角甾苷提高了猪卵母细胞的体外成熟率，为提高畜禽体外受精和克隆技术效率提供了新的途径。

Description

一种中药提取物的应用及其所制备的培养基和应用方法

技术领域

本发明属于畜牧业技术领域，尤其涉及一种中药提取物的应用及其所制备的培养基和应用方法。

背景技术

传统的禽畜繁育主要通过自然交配或人工授精来进行。但是这些方法存在一定的局限性，如公禽质量参差不齐、人工授精效率低下等问题。因此，为改良禽畜繁殖，体外培养技术被引入禽类生殖领域。

在体外培养过程中，高质量的卵母细胞是保证整个过程成功的关键。卵母细胞需从卵巢中获得后进行体外培养与成熟，这一环节直接关系到后续受精率及胚胎质量。然而，相比体内成熟的卵母细胞，目前体外成熟的卵母细胞的发育能力还存在明显的局限性。

这主要是因为，在体内环境中，卵泡液中存在某些抑制因子，可以将卵母细胞抑制在减数分裂前期的双线期，防止其过早恢复减数分裂。在此期间，卵母细胞可以经历一个相对较长的转录和翻译过程，逐步获得细胞质成分的积累，以达到胞质成熟。直到LH激素峰出现后，抑制因子消失，卵母细胞才被诱导恢复减数分裂，完成核成熟。而在体外环境下，由于缺乏卵泡液的抑制作用，卵母细胞可以自发地过早进入减数分裂期，实现核成熟。但是，在此情况下，卵母细胞的细胞质成熟程度还不足，各种细胞质成分的合成不完全，这会直接导致受精后胚胎发育存在缺陷。因此，如何提高体外培养卵母细胞的质量是目前亟待解决的问题。

异麦角甾苷是中药材肉苁蓉中提取的一种天然产物，其化学式为C₂₉H₃₆O₁₅，现有的研究表明异麦角甾苷具有抗炎、抗菌、抗氧化和抗肿瘤等多种作用。而且，它具有增强免疫功能的功效。然而，关于其在卵母细胞减数分裂中的作用尚未可知，其在卵母细胞减数分裂中的确切作用机制与靶点有待进一步研究阐明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中药提取物的应用及其所制备的培养基和应用方法，有效的解决禽畜卵母细胞体外培养成熟率低的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

首先，本发明提供了一种中药提取物在提高畜禽繁殖能力中的应用，所述中药提取物提高禽畜卵母细胞体外成熟率，所述中药提取物为异麦角甾苷。

进一步地，所述异麦角甾苷通过减缓禽畜卵母细胞体外减数分裂来提高家畜卵母细胞体外成熟率。

进一步地，所述异麦角甾苷通过降低周期蛋白Cyclin-B1的蛋白表达来减缓禽畜卵母细胞的体外减数分裂。

其次，本发明提供了异麦角甾苷在制备提高猪卵母细胞体外成熟率的培养基中的应用。

进一步地，所述培养基包括含有异麦角甾苷的卵母细胞减数分裂抑制培养基和卵母细胞成熟培养基。

其次，本发明提供了异麦角甾苷在制备猪卵母细胞减数分裂抑制培养基中的应用。

进一步地，所述异麦角甾苷通过降低周期蛋白Cyclin-B1的蛋白表达来实现培养基对于猪卵母细胞减数分裂的抑制效果。

其次，本发明提供了一种通过降低周期蛋白Cyclin-B1的蛋白表达来抑制猪卵母细胞减数分裂的抑制培养基，每1L所述培养基的配制方法如下：

（1）按照如下组分配制基础卵母细胞培养基：9.5g TCM 199，3.0g Hepes，2.0gNaHCO₃，0.05g青霉素，0.05g链霉素，5%发情牛血清，0.1μg/ml FSH，三蒸水定容至1L，调整PH至7.2；

（2）添加异麦角甾苷，配制成含有20-80μmol/L的卵母细胞减数分裂抑制培养基。

此外，本发明提供了一种通过降低周期蛋白Cyclin-B1的蛋白表达来提高猪卵母细胞体外成熟率的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）配制卵母细胞减数分裂抑制培养基，将卵丘-卵母细胞复合体置于培养基中培养6h；

（2）将培养后的细胞取出，置于卵母细胞成熟培养基继续培养36h，得到成熟的卵母细胞；

所述卵母细胞减数分裂培养基通过上述卵母细胞减数分裂抑制培养基的配制方法配制得到。

本发明的有益效果在于：

本发明通过设计含有不同浓度异麦角甾苷的卵母细胞减数分裂抑制培养基，研究其对猪卵母细胞减数分裂及成熟的影响。本发明的结果表明，与对照组相比，使用含异麦角甾苷的抑制培养基处理猪卵母细胞后，细胞的减数分裂明显减缓，GVBD比例降低；而随后使用常规成熟培养基培养，处理组的卵母细胞成熟率显著提高。进一步的机制研究发现，异麦角甾苷能够下调卵母细胞中的Cyclin-B1的表达，从而抑制减数分裂。

综上所述，本发明首次发现异麦角甾苷可以通过抑制Cyclin-B1的表达，减缓卵母细胞的减数分裂过程，从而提高其体外成熟率。该方法为提高体外卵母细胞成熟率提供了新的思路，从而可以有效的提高禽畜的繁殖能力。

附图说明

图1为卵母细胞减数分裂抑制培养基对于猪卵母细胞减数分裂影响的检测结果图；

在图中，***表示P＜0.001；

图2为卵母细胞减数分裂抑制培养基对于猪卵母细胞成熟率影响的检测结果图；

在图中，**表示P＜0.01；

图3为异麦角甾苷对于卵母细胞减数分裂周期蛋白Cyclin-B1和CDC2影响的检测结果。

具体实施方式

实施例1：收集卵母细胞

1.将收集的猪卵巢放置于35℃的卵巢保存液中转送到实验室中，使用39.5℃的含有青霉素和链霉素的卵巢保存液清洗3次；

2.使用0.8mm细针头的10ml无菌注射器轻柔抽吸卵巢表面直径1-2mm和3-6mm的健康非闭锁卵泡。

3.抽取的卵泡液放置在预先标记好的15ml离心管中， 37℃水浴静置 15 分钟后去除上清液，留下沉淀，用预温的PBS缓冲液轻柔重悬沉淀，再次离心，重复该步骤2次，以除去卵泡液中的杂质；

4. 在无菌条件下，将洗涤后的沉淀小心移入预先放有适量PBS缓冲液的90mm细胞培养皿中，在显微镜下，收集胞质均匀、包裹有3层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。

实施例2：配制含有异麦角甾苷的卵母细胞减数分裂抑制培养基1

1. 配制基础卵母细胞培养基：9.5g TCM 199，3.0g Hepes，2.0g NaHCO₃，0.05g青霉素，0.05g链霉素，5%发情牛血清，0.1μg/ml FSH，三蒸水定容至1L，调整PH至7.2；

2.异麦角甾苷（CAS No：61303-13-7）使用基础卵母细胞培养基配制成浓度20μmol/L，得到卵母细胞减数分裂抑制培养基1（以下简称抑制培养基1）。

实施例3：配制含有异麦角甾苷的卵母细胞减数分裂抑制培养基2

1.配制基础卵母细胞培养基：9.5g TCM 199，3.0g Hepes，2.0g NaHCO₃，0.05g青霉素，0.05g链霉素，5%发情牛血清，0.1μg/ml FSH，三蒸水定容至1L，调整PH至7.2；

2.异麦角甾苷使用基础卵母细胞培养基配制成浓度40μmol/L，得到卵母细胞减数分裂抑制培养基2（以下简称抑制培养基2）。

实施例4：配制含有异麦角甾苷的卵母细胞减数分裂抑制培养基3

1. 配制基础卵母细胞培养基：9.5g TCM 199，3.0g Hepes， 2.0g NaHCO₃，0.05g青霉素，0.05g链霉素，5%发情牛血清，0.1μg/ml FSH，三蒸水定容至1L，调整PH至7.2；

2.异麦角甾苷使用基础卵母细胞培养基配制成浓度80μmol/L，得到卵母细胞减数分裂抑制培养基3。

实施例5：卵母细胞减数分裂抑制培养基对于猪卵母细胞减数分裂的影响

1.将实施例2-4所得到的卵母细胞减数分裂抑制培养基1-3置于培养孔中，每孔加入500µl，置于39℃，5% CO₂以及饱和湿度的细胞培养箱中预热4个小时，对照组添加不含异麦角甾苷的基础卵母细胞培养基，每个处理设置3个重复孔；

2.取出细胞培养板，在每孔中加入80-100个实施例1所获取的卵丘-卵母细胞复合体，置于细胞培养箱中培养6h；

3.培养结束后，使用0.1%透明质酸酶进行消化，去除卵丘细胞，得到去核卵母细胞；

4.加入4%多聚甲醛固定细胞30min，然后使用PBS轻轻的清洗细胞3次；

5. 在避光条件下，加入含10 μg/mL Hoechst33342的PBS染色液染色10分钟；

6. 染色结束后，用PBS洗涤，然后用细口径口吸管将卵母细胞移至载玻片上，盖上盖玻片。

7. 在光镜和荧光镜下分别观察核仁和核膜的状态以及染色质的形态，兵器恩根据 GV 膜完整与否、核仁是否存在以及染色质或染色体的凝集状态来判断卵母细胞是否发生生发体膜破裂（GVBD）并计算GVBD比例。

表1卵母细胞减数分裂抑制培养基对于猪卵母细胞减数分裂的影响

从表1和图1可以看出，使用含有不同浓度的异麦角甾苷的抑制培养基1-3处理后，卵母细胞的GVBD比例均显著降低。其中，随着异麦角甾苷浓度的增加，卵母细胞GVBD比例呈现逐渐降低的趋势。在最高浓度的抑制培养基3中，卵母细胞GVBD比例降低至仅为对照组的13%左右。这表明使用异麦角甾苷处理卵母细胞可以高效地抑制卵母细胞进入减数分裂过程。

实施例6：卵母细胞减数分裂抑制培养基对于猪卵母细胞成熟率的影响

1.将实施例4所得到的卵母细胞减数分裂抑制培养基3置于培养孔中，每孔加入500µl，置于39℃，5% CO₂以及饱和湿度的细胞培养箱中预热4个小时，对照组添加不含异麦角甾苷的基础卵母细胞培养基；

2. 取出细胞培养板，在每孔中加入约30个实施例1所获取的卵丘-卵母细胞复合体，置于细胞培养箱中培养6h；

3.使用常规卵母细胞成熟培养基继续培养36h，观察卵母细胞的成熟细胞数，并计算成熟率。

表2卵母细胞减数分裂抑制培养基对于猪卵母细胞成熟率的影响

从表2可以看出，使用本发明所制备的含有异麦角甾苷的卵母细胞减数分裂抑制剂培养基处理卵母细胞后，其成熟率较未处理的对照组卵母细胞提高了约19%。这说明，采用含有异麦角甾苷的抑制培养基处理卵母细胞，可以通过有效抑制卵母细胞过早进入减数分裂过程，减缓其减数分裂速度，从而为卵母细胞提供了更充分的时间完成核糖体与线粒体的合成积累，提高其细胞质的成熟度。最终促进了更多数量的卵母细胞成功转化为成熟的二极体卵母细胞。

实施例7：异麦角甾苷对于卵母细胞减数分裂周期蛋白Cyclin-B1和CDC2的影响

周期蛋白Cyclin-B1和CDC2是在卵母细胞的减数分裂中起着关键左右，为了探究异麦角甾苷如何在抑制卵母细胞减数分裂中发挥作用，本发明对其对于周期蛋白Cyclin-B1和CDC2的影响进行探究。

1.将实施例4所得到的卵母细胞减数分裂抑制培养基3置于培养孔中，每孔加入500µl，置于39℃，5% CO₂以及饱和湿度的细胞培养箱中预热4个小时，对照组添加不含异麦角甾苷的基础卵母细胞培养基；

2.取出细胞培养板，在每孔中加入约30个实施例1所获取的卵丘-卵母细胞复合体，置于细胞培养箱中培养6h；

3.去除培养基，加入蛋白裂解液，将蛋白裂解液收集至离心管中；

4.将离心管置于冰上裂解30min，每隔10min利用涡旋振荡器震荡1min，以充分裂解细胞内蛋白；

5.待蛋白裂解结束后，将离心管置于离心机中，设定离心机参数为12000rpm，4°C，15min，进行高速离心；

6.将上清分别转移到新的离心管中，使用BCA法对各组得到的蛋白进行浓度检测，并根据Western blot的要求，添加5×Loading Buffer调整蛋白样品浓度；

7.配制含12%聚丙烯酰胺的分离胶和5%聚丙烯酰胺的浓缩胶，待胶配制完成后安装胶板并置于电泳槽中，向电泳槽内加入1×SDS电泳缓冲液，然后轻轻加入各组的蛋白样品和蛋白分子量Marker；

8.在浓缩胶阶段，采用恒压80V运行，待溴酚蓝全部进入分离胶后，将电压调节为120V进行电泳分离，当溴酚蓝快要运行出胶时停止电泳；

9.按照海绵垫、3层滤纸、凝胶、NC膜、3层滤纸、海绵垫的顺序装配蠕层电泳仪的电转夹，放入电转盒内，加冰盒保持低温，设定恒流模式为250mA，进行蛋白转膜，持续1.5小时；

10.电转结束后，将NC膜取出，放入5%脱脂奶粉溶液中，室温下封闭1小时；

11. 按照1:1000的比例分别稀释anti-Cyclin-B1和anti-CDC2的一抗工作液，按照1:10000的比例稀释内参anti-β-actin的一抗工作液， 裁切NC膜后，分别加入对应的一抗液，4°C条件下孵育过夜；

12. 一抗孵育结束后，收集一抗保存，使用TBST缓冲液洗膜，每次10分钟，共洗涤3次；

13. 加入相应的二抗工作液，室温孵育1小时后弃液；

14. TBST洗膜3次，每次10分钟，最后加入ECL发光液显色，凝胶成像系统采集结果。

从图3的Western Blot结果可以看出，与未处理的对照组相比，在含有异麦角甾苷的抑制培养基中处理卵母细胞后，细胞内Cyclin-B1蛋白的表达量出现了明显的下降，而CDC2蛋白的表达水平则没有太大变化。这表明异麦角甾苷处理抑制卵母细胞减数分裂的作用机制主要是通过下调Cyclin-B1的表达，抑制Cyclin-B1/CDC2复合物的形成，从而抑制卵母细胞的减数分裂。

Claims (2)

1.异麦角甾苷在制备提高猪卵母细胞体外成熟率的培养基中的应用。

2.一种通过降低周期蛋白Cyclin-B1的蛋白表达来抑制猪卵母细胞减数分裂的抑制培养基，其特征在于，每1L所述培养基的配制方法如下：

（1）按照如下组分配制基础卵母细胞培养基：9.5g TCM 199，3.0g Hepes， 2.0gNaHCO₃，0.05g青霉素，0.05g链霉素，5% 发情牛血清，0.1μg/ml FSH，三蒸水定容至1L，调整PH至7.2；

（2）添加异麦角甾苷，配制成含有20-80μmol/L异麦角甾苷的卵母细胞减数分裂抑制培养基。