CN117018292B - 生物修复膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生物修复膜及其制备方法，包括凝胶层和脐带层；所述凝胶层由羟基磷灰石、壳聚糖和海藻酸钠交联而成；所述脐带层粘附于所述凝胶层的一面，所述脐带层是由脐带组织组成的片状结构，所述脐带组织形成于通过机械方式去除血管细胞的脐带。本发明的所述生物修复膜包含天然活性成分能够促进诱导细胞增殖分化，实现快速血管化和缺损区的修复和再生，且具有良好的生物活性、生物可降解性、组织贴合度、骨传导性和机械性能，生物相容性好，无细胞毒性，不会产生免疫原性。

Description

生物修复膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种生物修复膜及其制备方法。

背景技术

口腔科临床治疗中使用的生物修复膜，其原理是利用膜的屏障作用，将病损区与周围组织隔离，创造一个相对封闭的组织环境，并诱导成骨细胞聚集分化，最终达到组织定向修复的目的的一种机械方法。生物修复膜可以与骨粉等骨修复材料合用，用于口腔手术后牙颌骨缺损或骨量不足的填充和修复，可使种植体更好地与周边牙槽骨质结合，解决患者由于牙周病或缺牙导致的生理性骨吸收或骨量不足，提升创口恢复效果。但是屏障膜和骨修复材料通常需要依次植入，加大了组织张力且加上组织缺损处出血导致膜偏移等因素，可能会导致组织缺损处的屏障膜关闭不严以及骨修复材料的流失，削弱治疗效果。骨膜是骨表面除关节外所被覆的坚固的双层结缔组织包膜，分为纤维层和生发层。纤维层主要为粗大的胶原纤维束彼此交织成网，起固定骨膜和韧带的作用。生发层紧邻骨外表面，其纤维成分少，排列疏松，有成骨能力，故又称成骨层。骨膜作为一种物理屏障，虽然自身不能诱导新骨形成，但它可以提供支持性微环境促进新骨组织再生，对骨折、骨缺损迅速愈合尤为重要。

目前，市面上优选的可生物降解的胶原类生物修复膜，产品多为冻干的具有不同孔径大小的生物支架膜片，作用机理为简单的物理屏障，生物活性和成骨性能差。而且大多数修复膜材料较薄、易撕裂，骨传导性和机械性能存在不足，不适合单独作为口腔缺损和骨缺损的修复材料。复合高分子膜的开发是一个重要方向。

目前也有部分专利公开了双层或多层口腔修复膜的制备技术，如公开号为CN109513046A的中国专利公开了一种可吸收口腔修复膜及其制备方法，其将明胶-聚己内酯-明胶进行压合得到三层结构口腔修复膜。但是其压合温度为55-65℃，压合温度较高，仅适用于温度耐受程度较高的材料，不适用于胶原膜压合。公开号为CN104922732 A的中国专利公开了一种口腔生物膜制备方法，将胶原与硫酸软骨素制备成浆液，通过真空冷冻干燥压制成胶原复合薄膜，再向两层胶原复合薄膜中喷涂胶原—硫酸软骨素浆液，再次真空冷冻干燥，得胶原—硫酸软骨素复合口腔生物膜。该专利的口腔生物膜的结构是通过配置成浆液制成，且压制成的双层结构没有提供给膜材料更优异的力学性能等，膜之间的结合力存在不足。且现有技术中的口腔膜临床应用时均需复水，已公开的方法制备的膜层间存在结合力不足，较易分层的缺陷。

因此，有必要提供一种新型的生物修复膜及其制备方法以解决现有技术中存在的上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物修复膜及其制备方法，通过构建脐带和羟基磷灰石复合的生物修复膜，以解决现有技术中的修复膜材料较薄、易撕裂，骨传导性和机械性能存在不足，不适合单独作为口腔缺损和骨缺损修复的问题。

为实现上述目的，本发明的所述生物修复膜，包括凝胶层和脐带层；所述凝胶层由羟基磷灰石、壳聚糖和海藻酸钠交联而成；所述脐带层粘附于所述凝胶层的一面，所述脐带层是由脐带组织组成的片状结构，所述脐带组织形成于通过机械方式去除血管细胞的脐带。

本发明的所述生物修复膜的有益效果在于：通过所述凝胶层由羟基磷灰石、壳聚糖和海藻酸钠交联而成，所述脐带层粘附于所述凝胶层的一面，所述脐带层是由脐带组织组成的片状结构，所述脐带组织形成于通过机械方式去除血管细胞的脐带，其中，所述脐带层所保留的多种天然活性成分能够提高伤口的愈合能力，同时还能够减少术后产生的瘢痕；所述羟基磷灰石与骨的成分和结构相似，具有高强度和韧性，能同时提高成骨细胞的生存率和成骨矿化量，引导骨缺损修复，海藻酸钠和壳聚糖属于天然高分子材料，来源广，与细胞外基质相似，在高分子水凝胶基体中可形成互穿或半互穿网络等优异特性，双网络结构的凝胶支架可以增强水凝胶的力学性能，使其紧贴组织缺损表面吸液溶胀后仍能保持完整性而不使膜变形移位，即该生物修复膜同时具备了脐带的天然生物活性成分、羟基磷灰石的高成骨性能和骨传导性，以及海藻酸钠和壳聚糖的优异力学性能，从而使得该生物修复膜包含的天然活性成分能够促进诱导细胞增殖分化，实现快速血管化和缺损区的修复和再生，且具有良好的生物活性、生物可降解性、组织贴合度、骨传导性和机械性能，生物相容性好、无细胞毒性，不会产生免疫原性；解决了现有技术中的修复膜材料较薄、易撕裂，骨传导性和机械性能存在不足，不适合单独作为口腔缺损和骨缺损修复的问题。

优选的，所述生物修复膜应用于骨组织修复和口腔软组织修复。其有益效果为：应用范围广，通用性强，所述生物修复膜放置于口腔软组织与骨缺损之间、或骨组织与骨缺损之间时，能创造一个相对封闭的骨再生环境，所述生物修复膜朝向口腔软组织或骨组织能够阻挡迁移速度较快的软组织细胞进入骨缺损区，从而使所述生物修复膜起到很好的屏障保护作用；另外所述生物修复膜的凝胶层中的羟基磷灰石，有利于使所述生物修复膜促进成骨，且能提高所述生物修复膜的机械性能，所述生物修复膜脐带层中的生物活性物质则能很好的促进软组织修复再生，使得该生物修复膜可应用于口腔软组织修复和骨组织修复。

优选的，当所述生物修复膜应用于口腔软组织修复时，所述壳聚糖与所述海藻酸钠的质量比为(1:1)～(1:3)，在所述壳聚糖与所述海藻酸钠构成的高分子水凝胶基体中所述羟基磷灰石的浓度为0.1％(w/v)～0.3％(w/v)。其有益效果在于：海藻酸钠和壳聚糖有较好的生物相容性、生物可降解性和抗菌性能，羟基磷灰石能够保证所述生物修复膜机械性能、成骨性能；在此比例范围内，交联充分，构成凝胶层的表面更加光滑、形状更加规则，且能使生物修复膜中的孔径分布均匀，形貌平整，羟基磷灰石含量过高，冻干的生物修复膜会变脆，形貌维持不佳。

优选的，当所述生物修复膜应用于骨组织修复时，所述壳聚糖与所述海藻酸钠的质量比为(1:1)～(1:3)，在所述壳聚糖与海藻酸钠构成的高分子水凝胶基体中所述羟基磷灰石的浓度为0.2％(w/v)～0.4％(w/v)。其有益效果在于：海藻酸钠和壳聚糖有较好的生物相容性、生物可降解性和抗菌性能，羟基磷灰石能够保证所述生物修复膜机械性能、成骨性能；在此比例范围内，交联充分，构成凝胶层的表面更加光滑、形状更加规则，且能使生物修复膜中的孔径分布均匀，形貌平整，羟基磷灰石含量过高，冻干的生物修复膜会变脆，形貌维持不佳。在较大面积骨缺损的情况，脐带层自身的机械性能不能够起到足够的支撑作用，且容易受到肌肉等软组织的挤压而发生变形，很难达到较好的治疗效果，因此在所述生物修复膜应用于骨组织修复时，所述羟基磷灰石的浓度较高，有利于提高所述生物修复膜的机械性能，以对骨修复能有更好的促进作用。

优选的，所述脐带层背向所述凝胶层的一面为平滑表面，所述凝胶层背向所述脐带层的一面为压痕表面，所述压痕表面设有凸起结构和凹陷结构。其有益效果在于：双面结构能够与待修复部位良好贴合，提供一个相对封闭的组织生长环境，为骨再生提供良好的空间及时间，促进组织修复及再生。其中，所述压痕表面的所述凸起结构和所述凹陷结构能够有效增加生物修复膜与待修复部位的贴合程度以及接触表面积，提高生物修复膜与组织缺损处的贴合度，改善临床使用以及治疗效果。使得所述生物修复膜具有压痕表面和平滑表面，该双面结构不仅与待修复处贴合度良好，可选择性引导细胞长入，且能随着新生组织的重建而同步降解。解决了现有技术中两面均是光滑表面的生物膜与组织缺损处之间存在间隙，造成生长迁移速率较快的成纤维细胞与上皮细胞进入骨缺损区，与生长迁移速率较慢的成骨细胞形成竞争性抑制，对骨组织的愈合产生不利影响的问题。

优选的，所述凝胶层和所述脐带层通过模具压制冻干而粘附固定，所述模具包括相对设置的第一表面和第二表面，所述第一表面为与所述压痕表面适配的压痕面，所述压痕面设有凸起结构和凹陷结构，所述第二表面为与所述平滑表面适配的平滑面。其有益效果在于：使得使用该模具可以将生物修复膜压制冻干成双面具有不同的结构；即设有所述凸起结构和所述凹陷结构的所述压痕面使得在压制冻干成的生物修复膜的一表面具有凸起结构和凹陷结构，从而能够有效增加生物膜与待修复部位的贴合程度以及接触表面积，提高生物膜医用材料与组织缺损处的贴合度，改善临床使用以及治疗效果。解决了现有技术中两面均是光滑平整的生物膜与组织缺损处之间存在间隙，造成生长迁移速率较快的成纤维细胞与上皮细胞进入骨缺损区，与生长迁移速率较慢的成骨细胞形成竞争性抑制，对骨组织的愈合产生不利影响的问题。

优选的，所述脐带为同种异体脐带。其有益效果在于：同种异体脐带拥有多孔的双层结构，一层胶原纤维排列致密，一层胶原纤维排列较为疏松；且含有多种生物活性成分，具有低免疫原性，促进细胞贴附和组织再生、愈合的独特生物特性，在临床应用中有着重要的意义。

进一步优选的，所述脐带组织来源于人体。其有益效果在于：选用人来源脐带组织作为基底层，打破了以动物源原料制备生物修复膜的限制，能够有效避免患者产生排异反应；脐带中包含地碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血小板源性生长因子和转化生长因子等，可以作为生长因子的缓释载体，促进细胞的增殖和成骨活性；且人来源脐带具有低免疫原性，且天然活性成分主要由胶原、糖蛋白、粘多糖以及生长因子构成，不仅能为细胞提供一个仿生的三维支持载体，还能通过各种蛋白及生长因子与宿主相互作用来促进宿主细胞的迁移、增殖、分化来促进组织再生和修复。

优选的，所述脐带层为双层多孔结构，所述脐带层包括致密层和疏松层，所述致密层的孔径小于所述疏松层的孔径，所述疏松层与所述凝胶层粘附固定，所述致密层设置有所述平滑表面。其有益效果在于：生物修复膜是用于放置在口腔软组织或骨组织与骨缺损之间，以创造一个相对封闭的骨再生环境；因此孔径小的所述致密层朝向软组织能够阻挡迁移速度较快的成纤维细胞和上皮细胞进入骨缺损区，以起到屏障作用；相对于现有技术中双层膜结构中的两层不同的结构只是单纯通过压制固定，本发明中的所述疏松层与凝胶层粘合，通过反复冻融处理，使得凝胶层吸附到脐带层的疏松层的微孔内，使得增强了凝胶层和脐带层的粘合力，即大大提高了贴合界面之间的结合力，解决了现有技术中膜层间存在结合力不足，较易分层的问题。

优选的，所述疏松层的孔径为20μm～100μm。其有益效果在于：脐带本身为天然的双面结构，所述致密层保留了脐带天然的胶原纤维致密结构，用以朝向软组织，能有效防止成纤维细胞和上皮细胞长入骨缺损区内，支持软组织形成，防止软组织长入骨缺损区内；所述疏松层的胶原排列相对较稀疏，且有一定孔径，可与凝胶层在反复冻融过程中实现部分区域的紧密结合，本发明实现了复水后不分层的双层膜制备，从而在应用于组织缺损处时，能有效发挥致密层及疏松层的各自作用。

本发明所述的生物修复膜的制备方法，包括步骤：

提供原始脐带，通过机械方式去除所述原始脐带中的血管以形成待整形的脐带组织，将所述待整形的脐带组织修整为片状结构的脐带层；

分别制备海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和羟基磷灰石溶液，将所述壳聚糖溶液、所述海藻酸钠溶液和所述羟基磷灰石溶液混合均匀制得凝胶溶液后，再将所述凝胶溶液进行交联反应以制得凝胶层；

将所述脐带层粘附固定于所述凝胶层以制得所述生物修复膜。

本发明的所述生物修复膜的制备方法的有益效果在于：通过提供原始脐带，通过机械方式去除所述原始脐带中的血管以形成待整形的脐带组织，将所述待整形的脐带组织修整为片状结构的脐带层；分别制备海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和羟基磷灰石溶液，将所述壳聚糖溶液、所述海藻酸钠溶液和所述羟基磷灰石溶液混合均匀制得凝胶溶液后，再将所述凝胶溶液进行交联反应以制得凝胶层；将所述脐带层粘附固定于所述凝胶层以制得所述生物修复膜，其中，所述脐带层所保留的多种天然活性成分能够提高伤口的愈合能力，同时还能够减少术后产生的瘢痕；所述羟基磷灰石与骨的成分和结构相似，具有高强度和韧性，能同时提高成骨细胞的生存率和成骨矿化量，引导骨缺损修复，海藻酸钠和壳聚糖属于天然高分子材料，来源广，与细胞外基质相似，在高分子水凝胶基体中可形成互穿或半互穿网络等优异特性，双网络结构的凝胶支架可以增强水凝胶的力学性能，使其紧贴组织缺损表面吸液溶胀后仍能保持完整性而不使膜变形移位，从而使得制备得到的生物修复膜包含天然活性成分能够促进诱导细胞增殖分化，实现快速血管化和缺损区的修复和再生，且具有良好的生物活性、生物可降解性、组织贴合度和机械性能，生物相容性好，无细胞毒性，不会产生免疫原性。

优选的，所述将所述壳聚糖溶液、所述海藻酸钠溶液和所述羟基磷灰石溶液混合均匀制得凝胶溶液的步骤包括：将所述壳聚糖溶液按照滴注为1mL/min～2mL/min的速度滴加到所述海藻酸钠溶液中，并搅拌混合均匀制得高分子水凝胶基体；将所述羟基磷灰石溶液按照滴注为1mL/min～2mL/min的速度加入所述高分子水凝胶基体中，并搅拌混合均匀制得所述凝胶溶液。其有益效果在于：所述凝胶溶液的配置选择先配制海藻酸钠溶液，再向海藻酸钠溶液中缓慢滴加壳聚糖溶液，这种加入顺序能够避免材料内部孔相互粘结和连通性较差的问题，从而获得具有孔结构适宜、弹性和机械性能良好的多孔膜材料，且孔结构分布均匀，没有粘连，不存在大小分布不均的问题。

优选的，所述将所述凝胶溶液进行交联反应以制得凝胶层的步骤包括：超声去除所述凝胶溶液中的气泡后真空冷冻干燥12h～24h，以制得凝胶膜材料；将所述凝胶膜材料浸泡在的氯化钙溶液中交联0.1h～1h后，浸泡在交联剂溶液中1h～4h，再用去离子水浸泡清洗1～3次，且每次所述浸泡清洗的时间为5min～10min，以制得所述凝胶层。其有益效果在于：氯化钙溶液中的钙离子可以与海藻酸钠络合交联形成蛋盒结构，再经过基团堆积形成交联网络结构，使得凝胶溶液转变成水凝胶，从而使得制得的所述凝胶层具有最佳的稳定性和吸附量；而在交联剂中浸泡能进一步提高所述凝胶层的机械性能，用去离子水浸泡清洗1～3次，且每次所述浸泡清洗的时间为5min～10min，以清洗掉多余的交联剂。

优选的，所述将所述脐带层粘附固定于所述凝胶层以制得所述生物修复膜的步骤包括：在温度11℃～15℃的环境中，将所述脐带层中所述致密层的一面覆盖于所述模具的所述平滑面，将所述凝胶层的一面粘附于所述脐带层中所述疏松层的一面，再将另一所述模具的所述压痕面覆盖于所述凝胶层的另一面。其有益效果在于：脐带层的处理环境温度11℃～15℃，即在低温环境中快速处理能够最大程度保留脐带的天然活性成分；通过所述模具压制冻干处理后，所述生物修复膜呈具有压痕表面和平滑表面的双面结构，将片状脐带层的疏松层与凝胶层贴合，再通过后续的冻融循环、交联剂交联和真空冷冻干燥处理，能使所述疏松层与凝胶层结合程度更深，无明显分层，结构连续性良好；待修复部位表面通常情况下平整度是不佳的，所述压痕结构的存在能够有效增加修复膜与待修复的部位的贴合程度以及接触表面积，有利于促进组织愈合；而且带有羟基磷灰石的凝胶层朝向所述模具的所述压痕面覆盖，即使所述凝胶层具有压痕表面，从而使得带有羟基磷灰石的凝胶层的压痕表面朝向骨缺损处，能同时提高成骨细胞的生存率和成骨矿化量。

优选的，所述将所述脐带层粘附固定于所述凝胶层以制得所述生物修复膜的步骤还包括：将夹设有所述脐带层和所述凝胶层的所述模具在-10℃～-22℃温度下静置2h～6h后，再在0℃～10℃温度下静置2h～6h以进行冻融处理，且冻融循环1～3次后，依次在-20℃温度下冷冻2h，-80℃温度下冷冻4h，-70℃～-80℃的温度下冷冻2h～14h，-80±5℃温度下真空冷冻干燥4h～8h，以制得所述生物修复膜。其有益效果在于：其中在压制冻干处理过程中通过依次在-20℃温度下冷冻2h，-80℃温度下冷冻4h，-70℃～-80℃的温度下冷冻2h～14h，-80±5℃温度下真空冷冻干燥4h～8h，即进行梯度降温冷冻，可以避免温度下降过快而引起组织结构破坏，从而保留脐带组织双层多孔结构；且通过反复冻融处理，使得凝胶层吸附到脐带层的疏松层的微孔内，使得增强了凝胶层和脐带层的粘合力，即大大提高了贴合界面之间的结合力，解决了现有技术中膜层间存在结合力不足，较易分层的问题。

优选的，所述步骤将所述待整形的脐带组织修整为片状结构的脐带层的步骤包括：在温度11℃～15℃的环境中，将所述待整形的脐带组织采用清洗液清洗后，修剪为片状并用去离子水清洗1～3次，以制得所述脐带层，且所述清洗温度11℃～15℃，清洗时间15～20分钟。其有益效果在于：脐带组织采用清洗液清洗以洗去血污和破坏细胞，采用去离子水冲洗，以保持所述脐带层的湿润，以便于与凝胶层粘附，通过设置脐带层的处理环境温度11℃～15℃，清洗时间15～20分钟，即在低温环境中快速处理以便最大程度保留脐带的天然活性成分。

优选的，所述交联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、京尼平和甲醛中的任意一种或两种。其有益效果在于：所述交联剂有利于进一步提高所述凝胶层的机械性能。

进一步优选的，所述交联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液。其有益效果在于：有利于进一步提高所述凝胶层的机械性能，即能有效提高所述生物修复膜的机械性能。

优选的，所述氯化钙溶液的浓度为1％～5％。其有益效果在于：钙离子可实现海藻酸钠内部可控的凝胶化，随后在形成的该基质中加入壳聚糖溶液进行酸化以释放阳离子，从而更好地控制凝胶特性，并形成均质凝胶，钙离子浓度的增加，对多孔材料的交联效果越好，材料稳定性越高，但钙离子含量较高的凝胶层支架的脆性会更大，因此所述氯化钙溶液的浓度为1％～5％最适宜。

优选的，重复所述将所述脐带层中所述致密层的一面覆盖于所述模具的所述平滑面，将所述凝胶层的一面粘附于所述脐带层中所述疏松层的一面，再将另一所述模具的所述压痕面覆盖于所述凝胶层的另一面的步骤，按所述模具、所述脐带层、所述凝胶层、和另一所述模具的叠加顺序叠加2～6层的所述脐带层和所述凝胶层，以制得2～6层的所述生物修复膜。其有益效果在于：所述生物修复膜叠加层数一般为2～6层，避免模具的重量过大使得需冻干的所述生物修复膜被压变形，同时减少冻干所需能耗。压制冻干后得到的所述生物修复膜具有压痕面和平滑面两种结构，压痕面能够与组织缺损处紧密贴合，阻隔外界软组织细胞长入，达到良好治疗效果。

优选的，所述分别制备海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和羟基磷灰石溶液的步骤包括：称取海藻酸钠溶于去离子水中并搅拌1h～4h，以制得所述海藻酸钠溶液；称取壳聚糖溶于浓度为1wt％～2wt％的稀酸溶液中并搅拌1h～4h，以制得所述壳聚糖溶液；称取羟基磷灰石置于去离子水中，超声0.5h～2h混合均匀，以制得所述羟基磷灰石溶液。其有益效果在于：通过超声方式有利于使羟基磷灰石在后序工艺中与其他溶液的混合，能使所述羟基磷灰石均匀分散于所述高分子水凝胶基体中，即能够解决现有胶原修复膜存在的胶原粘度大或者胶原聚集形成的粘胶块导致羟基磷灰石分散不均、分散条件过于剧烈和严苛，从而对胶原的分子结构产生影响的问题，还可以在使用过程中起到缓释钙离子促进骨细胞的增殖与分化。

优选的，所述清洗液为无菌生理磷酸盐缓冲溶液、无菌氯化钠注射液和纯化水中的任意一种或多种。

附图说明

图1为本发明的生物修复膜的双层结构的纵剖面的电镜扫描示意图；

图2为本发明的生物修复膜中的脐带层的电镜扫描示意图；

图3为本发明的生物修复膜中的凝胶层的电镜扫描示意图；

图4为本发明第一种实施例的模具的示意图；

图5为本发明第二种实施例的模具的示意图；

图6为图5所示的模具中第一层体的表面的结构放大示意图；

图7为图5所示的模具中第二层体的表面的结构放大示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。

另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为普通市售品，皆可于市场购得。

羟基磷灰石作为人体骨和牙的主要无机成分，相关研究已证明羟基磷灰石材料具有良好的生物相容性、高强度和韧性，且能传导骨生长，已在临床上广泛用于骨缺损的修复和填充整形的骨材料。目前已有引入羟基磷灰石的复合生物修复膜对引导骨再生膜成骨性改良的研究，但仍存在以下不足：如存在电化学沉积法、等离子喷涂等存在操作条件严苛，矿化法等时间跨度长，涂覆法等存在无机物分布不均，共混法等存在胶原结构破坏，羟基磷灰石快速流失，无缓释等。

为克服现有技术中存在的问题，本发明实施例提供了生物修复膜及其制备方法，通过构建脐带和羟基磷灰石复合的生物修复膜，以解决现有技术中的修复膜材料较薄、易撕裂，骨传导性和机械性能存在不足，不适合单独作为口腔缺损和骨缺损修复的问题。

为实现上述目的，本发明的所述生物修复膜及其制备方法，包括凝胶层和脐带层；所述凝胶层由羟基磷灰石、壳聚糖和海藻酸钠交联而成；所述脐带层粘附于所述凝胶层的一面，所述脐带层是由脐带组织组成的片状结构，所述脐带组织形成于通过机械方式去除血管细胞的脐带。

具体的，所述生物修复膜通过所述凝胶层由羟基磷灰石、壳聚糖和海藻酸钠交联而成，所述脐带层粘附于所述凝胶层的一面，所述脐带层是由脐带组织组成的片状结构，所述脐带组织形成于通过机械方式去除血管细胞的脐带，其中，所述脐带层所保留的多种天然活性成分能够提高伤口的愈合能力，同时还能够减少术后产生的瘢痕；所述羟基磷灰石与骨的成分和结构相似，具有高强度和韧性，能同时提高成骨细胞的生存率和成骨矿化量，引导骨缺损修复，海藻酸钠和壳聚糖属于天然高分子材料，来源广，与细胞外基质相似，海藻酸钠和壳聚糖复合成的高分子水凝胶基体支架在抑菌、止血、促进成骨细胞的黏附、增殖及矿化骨基质的形成等方面具有显著效果，在高分子水凝胶基体中可形成互穿或半互穿网络等优异特性，双网络结构的凝胶支架可以增强水凝胶的力学性能，使其紧贴组织缺损表面吸液溶胀后仍能保持完整性而不使膜变形移位，同时水凝胶是良好的载体，可负载无机材料和生物活性物质，并具有可控释放的能力，且水凝胶分子具有的多官能团特性，使之易于功能化，从而提高其作为支架和载体的效能，即该生物修复膜同时具备了脐带的天然生物活性成分、羟基磷灰石的高成骨性能和骨传导活性，以及海藻酸钠和壳聚糖的优异力学性能，从而使得该生物修复膜包含的天然活性成分能够促进诱导细胞增殖分化，实现快速血管化和缺损区的修复和再生，且具有良好的生物活性、生物可降解性、组织贴合度、骨传导性和机械性能，生物相容性好、无细胞毒性，不会产生免疫原性；解决了现有技术中的修复膜材料较薄、易撕裂，骨传导性和机械性能存在不足，不适合单独作为口腔缺损和骨缺损修复的问题。

图1为本发明的生物修复膜的双层结构的纵剖面的电镜扫描示意图；图2为本发明的生物修复膜中的脐带层的电镜扫描示意图；图3为本发明的生物修复膜中的凝胶层的电镜扫描示意图。

如图1所示，所述生物修复膜为双层结构。且如图2所示，所述脐带层结构致密，孔径小，可见所述脐带层保留了脐带天然的胶原纤维致密结构，用以朝向软组织，有利于支持软组织形成，能有效防止成纤维细胞和上皮细胞长入骨缺损区内，防止软组织长入骨缺损区内，且所述脐带层所保留的多种天然活性成分能够提高牙龈伤口的愈合能力，同时还能够减少术后产生的瘢痕；而如图3所示，所述凝胶层结构疏松，所述凝胶层孔径相对所述脐带层的孔径较大，在应用于组织缺损处时，能有效引导骨组织再生。

本发明一些实施例中，所述生物修复膜应用于骨组织修复和口腔软组织修复。应用范围广，通用性强，所述生物修复膜放置于口腔软组织与骨缺损之间、或骨组织与骨缺损之间时，能创造一个相对封闭的骨再生环境，所述生物修复膜朝向口腔软组织或骨组织能够阻挡迁移速度较快的软组织细胞进入骨缺损区，从而使所述生物修复膜起到很好的屏障保护作用；另外所述生物修复膜的凝胶层中的羟基磷灰石，有利于使所述生物修复膜促进成骨，且能提高所述生物修复膜的机械性能，所述生物修复膜脐带层中的生物活性物质则能很好的促进软组织修复再生，使得该生物修复膜可应用于口腔软组织修复和骨组织修复。

本发明一些实施例中，当所述生物修复膜应用于口腔软组织修复时，所述壳聚糖与所述海藻酸钠的质量比为(1:1)～(1:3)，在所述壳聚糖与所述海藻酸钠构成的高分子水凝胶基体中所述羟基磷灰石的浓度为0.1％(w/v)～0.3％(w/v)。海藻酸钠和壳聚糖有较好的生物相容性、生物可降解性和抗菌性能，羟基磷灰石能够保证所述生物修复膜机械性能、成骨性能；在此比例范围内，交联充分，构成凝胶层的表面更加光滑、形状更加规则，且能使生物修复膜中的孔径分布均匀，形貌平整，羟基磷灰石含量过高，冻干的生物修复膜会变脆，形貌维持不佳。

本发明一些实施例中，当所述生物修复膜应用于骨组织修复时，所述壳聚糖与所述海藻酸钠的质量比为(1:1)～(1:3)，在所述壳聚糖与海藻酸钠构成的高分子水凝胶基体中所述羟基磷灰石的浓度为0.2％(w/v)～0.4％(w/v)。海藻酸钠和壳聚糖有较好的生物相容性、生物可降解性和抗菌性能，羟基磷灰石能够保证所述生物修复膜机械性能、成骨性能；在此比例范围内，交联充分，构成凝胶层的表面更加光滑、形状更加规则，且能使生物修复膜中的孔径分布均匀，形貌平整，羟基磷灰石含量过高，冻干的生物修复膜会变脆，形貌维持不佳。该浓度的羟基磷灰石有利于使形成的生物修复膜支撑性能更好，使得骨组织的修复效果更好。在较大面积骨缺损的情况，脐带层自身的机械性能不能够起到足够的支撑作用，且容易受到肌肉等软组织的挤压而发生变形，很难达到较好的治疗效果，因此在所述生物修复膜应用于骨组织修复时，所述羟基磷灰石的浓度较高，有利于提高所述生物修复膜的机械性能，以对骨修复能有更好的促进作用。

本发明一些实施例中，所述羟基磷灰石、所述壳聚糖和所述海藻酸钠的重量比为(1:4:4)～(4:10:15)。

本发明一些具体实施例中，所述生物修复膜应用于口腔软组织修复时，所述羟基磷灰石、所述壳聚糖和所述海藻酸钠的重量比为1.5:1:0.45。

本发明一些具体实施例中，所述生物修复膜应用于骨组织修复时，所述羟基磷灰石、所述壳聚糖和所述海藻酸钠的重量比为1.5:1:0.6。

本发明一些实施例中，所述脐带层背向所述凝胶层的一面为平滑表面，所述凝胶层背向所述脐带层的一面为压痕表面，所述压痕表面设有凸起结构和凹陷结构。双面结构能够与待修复部位良好贴合，提供一个相对封闭的组织生长环境，为骨再生提供良好的空间及时间，促进组织修复及再生。其中，所述压痕表面的所述凸起结构和所述凹陷结构能够有效增加生物修复膜与待修复部位的贴合程度以及接触表面积，提高生物修复膜与组织缺损处的贴合度，改善临床使用以及治疗效果。使得所述生物修复膜具有压痕表面和平滑表面，该双面结构不仅与待修复处贴合度良好，可选择性引导细胞长入，且能随着新生组织的重建而同步降解。解决了现有技术中两面均是光滑表面的生物修复膜与组织缺损处之间存在间隙，造成生长迁移速率较快的成纤维细胞与上皮细胞进入骨缺损区，与生长迁移速率较慢的成骨细胞形成竞争性抑制，对骨组织的愈合产生不利影响的问题。

本发明一些实施例中，所述凝胶层和所述脐带层通过模具压制冻干而粘附固定，所述模具包括相对设置的第一表面和第二表面，所述第一表面为与所述压痕表面适配的压痕面，所述压痕面设有凸起结构和凹陷结构，所述第二表面为与所述平滑表面适配的平滑面。使得使用该模具可以将生物修复膜压制冻干成双面具有不同的结构；即设有所述凸起结构和所述凹陷结构的所述压痕面使得在压制冻干成的生物修复膜的一表面具有凸起结构和凹陷结构，从而能够有效增加所述生物修复膜与待修复部位的贴合程度以及接触表面积，提高所述生物修复膜与组织缺损处的贴合度，改善临床使用以及治疗效果。解决了现有技术中两面均是光滑平整的所述生物修复膜与组织缺损处之间存在间隙，造成生长迁移速率较快的成纤维细胞与上皮细胞进入骨缺损区，与生长迁移速率较慢的成骨细胞形成竞争性抑制，对骨组织的愈合产生不利影响的问题。

本发明一些实施例中，所述脐带为同种异体脐带。同种异体脐带拥有多孔的双层结构，一层胶原纤维排列致密，一层胶原纤维排列较为疏松；且含有多种生物活性成分，具有低免疫原性，促进细胞贴附和组织再生、愈合的独特生物特性，在临床应用中有着重要的意义。

本发明一些实施例中，所述脐带组织来源于人体。选用人来源脐带组织作为基底层，打破了以动物源原料制备生物修复膜的限制，能够有效避免患者产生排异反应；脐带中包含地碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血小板源性生长因子和转化生长因子等，可以作为生长因子的缓释载体，促进细胞的增殖和成骨活性；且人来源脐带具有低免疫原性，且天然活性成分主要由胶原、糖蛋白、粘多糖以及生长因子构成，不仅能为细胞提供一个仿生的三维支持载体，还能通过各种蛋白及生长因子与宿主相互作用来促进宿主细胞的迁移、增殖、分化来促进组织再生和修复。

本发明一些实施例中，所述脐带层为双层多孔结构，所述脐带层包括致密层和疏松层，所述致密层的孔径小于所述疏松层的孔径，所述疏松层与所述凝胶层粘附固定，所述致密层设置有所述平滑表面。生物修复膜是用于放置在口腔软组织与骨缺损之间，以创造一个相对封闭的骨再生环境；因此孔径小的所述致密层朝向软组织能够阻挡迁移速度较快的成纤维细胞和上皮细胞进入骨缺损区，以起到屏障作用；相对于现有技术中双层膜结构中的两层不同的结构只是单纯通过压制固定，本发明中的所述疏松层与凝胶层粘合，通过反复冻融处理，使得凝胶层吸附到脐带层的疏松层的微孔内，使得增强了凝胶层和脐带层的粘合力，即大大提高了贴合界面之间的结合力，解决了现有技术中膜层间存在结合力不足，较易分层的问题。

本发明一些实施例中，所述疏松层的孔径为20μm～100μm。脐带本身为天然的双面结构，所述致密层保留了脐带天然的胶原纤维致密结构，用以朝向软组织，能有效防止成纤维细胞和上皮细胞长入骨缺损区内，支持软组织形成，防止软组织长入骨缺损区内；所述疏松层的胶原排列相对较稀疏，且有一定孔径，可与凝胶层在反复冻融过程中实现部分区域的紧密结合，实现复水后不分层的双层膜制备，从而在应用于组织缺损处时，能有效发挥致密层及疏松层的各自作用。

本发明所述的生物修复膜的制备方法，包括步骤：

提供原始脐带，通过机械方式去除所述原始脐带中的血管以形成待整形的脐带组织，将所述待整形的脐带组织修整为片状结构的脐带层；

分别制备海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和羟基磷灰石溶液，将所述壳聚糖溶液、所述海藻酸钠溶液和所述羟基磷灰石溶液混合均匀制得凝胶溶液后，再将所述凝胶溶液进行交联反应以制得凝胶层；

将所述脐带层粘附固定于所述凝胶层以制得所述生物修复膜。

具体的，所述脐带层所保留的多种天然活性成分能够提高牙龈伤口的愈合能力，同时还能够减少术后产生的瘢痕；所述羟基磷灰石与骨的成分和结构相似，具有高强度和韧性，能同时提高成骨细胞的生存率和成骨矿化量，引导骨缺损修复，海藻酸钠和壳聚糖属于天然高分子材料，来源广，与细胞外基质相似，在海藻酸钠和壳聚糖制成的高分子水凝胶基体中可形成互穿或半互穿网络等优异特性，双网络结构的凝胶支架可以增强水凝胶的力学性能，使其紧贴组织缺损表面吸液溶胀后仍能保持完整性而不使膜变形移位，从而使得制备得到的生物修复膜包含天然活性成分能够促进诱导细胞增殖分化，实现快速血管化和缺损区的修复和再生，且具有良好的生物活性、生物可降解性、组织贴合度和机械性能，生物相容性好，无细胞毒性，不会产生免疫原性。

本发明一些实施例中，所述将所述壳聚糖溶液、所述海藻酸钠溶液和所述羟基磷灰石溶液混合均匀制得凝胶溶液的步骤包括：将所述壳聚糖溶液按照滴注为1mL/min～2mL/min的速度滴加到所述海藻酸钠溶液中，并搅拌混合均匀制得高分子水凝胶基体；将所述羟基磷灰石溶液按照滴注为1mL/min～2mL/min的速度加入所述高分子水凝胶基体中，并搅拌混合均匀制得所述凝胶溶液。所述凝胶溶液的配置选择先配制海藻酸钠溶液，再向海藻酸钠溶液中缓慢滴加壳聚糖溶液，这种加入顺序能够避免材料内部孔相互粘结和连通性较差的问题，从而获得具有孔结构适宜、弹性和机械性能良好的多孔膜材料，且孔结构分布均匀，没有粘连，不存在大小分布不均的问题。

本发明一些实施例中，所述将所述凝胶溶液进行交联反应以制得凝胶层的步骤包括：超声去除所述凝胶溶液中的气泡后真空冷冻干燥12h～24h，以制得凝胶膜材料；将所述凝胶膜材料浸泡在的氯化钙溶液中交联0.1h～1h后，浸泡在交联剂溶液中1h～4h，再用去离子水浸泡清洗1～3次，且每次所述浸泡清洗的时间为5min～10min，以制得所述凝胶层。通过超声方式有利于使所述羟基磷灰石均匀分散于所述高分子水凝胶基体中，即能够解决现有胶原修复膜存在的胶原粘度大或者胶原聚集形成的粘胶块导致羟基磷灰石分散不均、分散条件过于剧烈和严苛，从而对胶原的分子结构产生影响的问题，还可以在使用过程中起到缓释钙离子促进骨细胞的增殖与分化。氯化钙溶液中的钙离子可以与海藻酸钠络合交联形成蛋盒结构，再经过基团堆积形成交联网络结构，使得凝胶溶液转变成水凝胶，从而使得制得的所述凝胶层具有最佳的稳定性和吸附量；而在交联剂中浸泡能进一步提高所述凝胶层的机械性能，用去离子水浸泡清洗1～3次，且每次所述浸泡清洗的时间为5min～10min，以清洗掉多余的交联剂。

本发明一些实施例中，所述将所述脐带层粘附固定于所述凝胶层以制得所述生物修复膜的步骤包括：在温度11℃～15℃的环境中，将所述脐带层中所述致密层的一面覆盖于所述模具的所述平滑面，将所述凝胶层的一面粘附于所述脐带层中所述疏松层的一面，再将另一所述模具的所述压痕面覆盖于所述凝胶层的另一面。脐带层的处理环境温度11℃～15℃，即在低温环境中快速处理能够最大程度保留脐带的天然活性成分；通过所述模具压制冻干处理后，所述生物修复膜呈具有压痕表面和平滑表面的双面结构，将片状脐带层的疏松层与凝胶层贴合，再通过后续的冻融循环、交联剂交联和真空冷冻干燥处理，能使所述疏松层与凝胶层结合程度更深，无明显分层，结构连续性良好；待修复部位表面通常情况下平整度是不佳的，所述压痕结构的存在能够有效增加修复膜与待修复的部位的贴合程度以及接触表面积，有利于促进组织愈合；而且带有羟基磷灰石的凝胶层朝向所述模具的所述压痕面覆盖，即使所述凝胶层具有压痕表面，从而使得带有羟基磷灰石的凝胶层的压痕表面朝向骨缺损处，能同时提高成骨细胞的生存率和成骨矿化量。

本发明一些实施例中，所述将所述脐带层粘附固定于所述凝胶层以制得所述生物修复膜的步骤还包括：将夹设有所述脐带层和所述凝胶层的所述模具在-10℃～-22℃温度下静置2h～6h后，再在0℃～10℃温度下静置2h～6h以进行冻融处理，且冻融循环1～3次后，依次在-20℃温度下冷冻2h，-80℃温度下冷冻4h，-70℃～-80℃的温度下冷冻2h～14h，-80±5℃温度下真空冷冻干燥4h～8h，以制得所述生物修复膜。其有益效果在于：其中在压制冻干处理过程中通过依次在-20℃温度下冷冻2h，-80℃温度下冷冻4h，-70℃～-80℃的温度下冷冻2h～14h，-80±5℃温度下真空冷冻干燥4h～8h，即进行梯度降温冷冻，可以避免温度下降过快而引起组织结构破坏，从而保留脐带组织双层多孔结构；且通过反复冻融处理，使得凝胶层吸附到脐带层的疏松层的微孔内，使得增强了凝胶层和脐带层的粘合力，即大大提高了贴合界面之间的结合力，解决了现有技术中膜层间存在结合力不足，较易分层的问题。

本发明一些实施例中，所述步骤将所述待整形的脐带组织修整为片状结构的脐带层的步骤包括：在温度11℃～15℃的环境中，将所述待整形的脐带组织采用清洗液清洗后，修剪为片状并用去离子水清洗1～3次，以制得所述脐带层，且所述清洗温度11℃～15℃，清洗时间15～20分钟。其有益效果在于：脐带组织采用清洗液清洗以洗去血污和破坏细胞，采用去离子水冲洗，以保持所述脐带层的湿润，以便于与凝胶层粘附，通过设置脐带层的处理环境温度11℃～15℃，清洗时间15～20分钟，即在低温环境中快速处理以便最大程度保留脐带的天然活性成分。

本发明一些实施例中，所述交联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、京尼平和甲醛中的任意一种或两种。有利于进一步提高所述凝胶层的机械性能，即能有效提高所述生物修复膜的机械性能。

进一步本发明一些实施例中，所述交联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液。有利于进一步提高所述凝胶层的机械性能。EDC交联剂具有无毒、生物相容性良好的特点，并且在很多研究报道中EDC交联的胶原基支架表现出更优异的细胞相容性，搭配NHS使用提高交联的效率。

本发明一些实施例中，所述氯化钙溶液的浓度为1％～5％。钙离子可实现海藻酸钠内部可控的凝胶化，随后在形成的该基质中加入壳聚糖溶液进行酸化以释放阳离子，从而更好地控制凝胶特性，并形成均质凝胶，钙离子浓度的增加，对多孔材料的交联效果越好，材料稳定性越高，但钙离子含量较高的凝胶层支架的脆性会更大，因此所述氯化钙溶液的浓度为1％～5％最适宜。

本发明一些实施例中，重复所述将所述脐带层中所述致密层的一面覆盖于所述模具的所述平滑面，将所述凝胶层的一面粘附于所述脐带层中所述疏松层的一面，再将另一所述模具的所述压痕面覆盖于所述凝胶层的另一面的步骤，按所述模具、所述脐带层、所述凝胶层、和另一所述模具的叠加顺序叠加2～6层的所述脐带层和所述凝胶层，以制得2～6层的所述生物修复膜。所述生物修复膜叠加层数一般为2～6层，避免模具的重量过大使得需冻干的所述生物修复膜被压变形，同时减少冻干所需能耗。压制冻干后得到的所述生物修复膜具有压痕面和平滑面两种结构，压痕面能够与组织缺损处紧密贴合，阻隔外界软组织细胞长入，达到良好治疗效果。

具体的，将第一脐带层中致密层的一面覆盖在第一块模具的平滑面，将第一凝胶层的其中一面紧密粘附在所述第一脐带层的所述疏松层的一面，再将第二块模具的压痕面覆盖在所述第一凝胶层的另一面；即采用两块模具对同一生物修复膜中的所述脐带层和所述凝胶层就行压制；采用上述叠放方式，通过3至7块模具逐层叠加压制，可制得2-6张所述生物修复膜。

本发明一些具体实施例中，将第一脐带层中致密层的一面覆盖在第一块模具的平滑面，将第一凝胶层的其中一面紧密粘附在所述第一脐带层的所述疏松层的一面，再将第二块模具的压痕面覆盖在所述第一凝胶层的另一面，将第二脐带层中致密层的一面覆盖在第二块模具的平滑面，将第二凝胶层的其中一面紧密粘附在所述第二脐带层的所述疏松层的一面，再将第三块模具的压痕面覆盖在所述第二凝胶层的另一面，如此即可制得2张所述生物修复膜。

本发明一些实施例中，所述分别制备海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和羟基磷灰石溶液的步骤包括：称取海藻酸钠溶于去离子水中并搅拌1h～4h，以制得所述海藻酸钠溶液；称取壳聚糖溶于浓度为1wt％～2wt％的稀酸溶液中并搅拌1h～4h，以制得所述壳聚糖溶液；称取羟基磷灰石置于去离子水中，超声0.5h～2h混合均匀，以制得所述羟基磷灰石溶液。通过超声方式有利于使羟基磷灰石在后序工艺中与其他溶液的混合，能使所述羟基磷灰石均匀分散于所述高分子水凝胶基体中，即能够解决现有胶原修复膜存在的胶原粘度大或者胶原聚集形成的粘胶块导致羟基磷灰石分散不均、分散条件过于剧烈和严苛，从而对胶原的分子结构产生影响的问题，还可以在使用过程中起到缓释钙离子促进骨细胞的增殖与分化。具体的，羟基磷灰石也称为羟基磷灰石钙，是人体和动物骨骼的主要无机成分，在体内有一定的溶解度，能释放无极离子参与体内代谢，对骨质增生有刺激或诱导作用，能促进缺损组织的修复，显示出生物活性。但是羟基磷灰石微溶于水，直接添加羟基磷灰石粉体，可能需要搅拌时间长/功率大，才能混合的比较均匀，因此，通过超声处理再添加到所述高分子水凝胶基体中能够分散的较为均匀。

本发明一些实施例中，所述稀酸溶液为醋酸溶液等。

本发明一些实施例中，称取壳聚糖溶于浓度为1wt％～2wt％的冰醋酸溶液中并搅拌1h～4h，以制得所述壳聚糖溶液。

本发明一些实施例中，所述清洗液为无菌生理磷酸盐缓冲溶液、无菌氯化钠注射液和纯化水中的任意一种或多种。

本发明一些实施例中，所述脐带层的制备包括步骤：将所述原始脐带进行清洗，去除血管，裁剪成所需形状，最后用去离子水清洗1～3次备用。

本发明一些实施例中，所述凝胶层，即负载羟基磷灰石的海藻酸钠和壳聚糖凝胶支架层的制备包括步骤：

S110：称取0.4g～1.5g的海藻酸钠溶于去离子水中搅拌2h，得到海藻酸钠溶液；

S120：称取0.4g～1g的壳聚糖溶于浓度为1wt％～2wt％冰醋酸溶液中搅拌2h，得到壳聚糖溶液；

S130：称取0.1g～0.4g的羟基磷灰石置于去离子水中，超声0.5h混合均匀，得到羟基磷灰石溶液；

S140：将所述S120步骤制备得到的所述壳聚糖溶液，缓慢加入到所述S110步骤制备得到的所述海藻酸钠溶液中，0.5h内加入完成后连续搅拌混合均匀制得高分子水凝胶基体；随后将S130步骤制备得到所述羟基磷灰石溶液按照滴注为2mL/min的速度加入所述高分子水凝胶基体中搅拌混合均匀制得所述凝胶溶液，超声去除凝胶溶液中的气泡后置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥12h～24h制得凝胶膜材料；

S150：将所述S140步骤制备得到的所述凝胶膜材料浸泡于2％的氯化钙溶液中交联0.1h～1h后，然后浸泡在EDC和NHS混合的交联剂溶液中1h～4h，最后用去离子水浸泡清洗1～3次备用。

本发明一些实施例中，脐带和羟基磷灰石复合的生物修复膜的制备包括步骤：将所述脐带层中致密层的一面覆盖在所述模具的平滑面，将所述凝胶层的其中一面紧密粘附在所述脐带层的另一面，即所述疏松层的一面，再将另一所述模具的压痕面覆盖在所述凝胶层的另一面；所述脐带和所述凝胶层连同所述模具在-20℃的温度中放置2h，再在4℃的温度中放置2h，以此条件进行冻融循环处理2次，依次在-20℃温度下冷冻2h，-80℃温度下冷冻4h，温度为-80℃的冰箱中冷冻4h，-80℃温度下真空冷冻干燥4h～8h，裁剪后即可得到具有双面结构的脐带/羟基磷灰石复合生物修复膜。

本发明一些具体实施例1中，所述生物修复膜的制备方法包括以下步骤：

S1、制备脐带层：

S11、以质量比计，按照料液比至少为1:5加入原始脐带和纯化水，以将所述原始脐带清洗2次；

S12、根据所述原始脐带中血管的直径选择不同内径的环形钻头去除所述原始脐带中的血管，以制得待整形的脐带组织；再沿脐带轴向方向剖开为平片，以将所述待整形的脐带组织修整为片状结构的脐带组织；具体的：所述片状结构的脐带组织的宽度大于3厘米，长度大于6厘米；脐带上皮面不得出现大于1厘米的破损，不得超过3处小于1厘米的破损，且完整面积不小于3厘米×3厘米；

S13、用去离子水浸泡清洗1次备用；

S2、制备凝胶层：

S21、称取1.5g海藻酸钠溶于50mL的去离子水中并搅拌2h，得到海藻酸钠溶液；

S22、称取1g壳聚糖溶于50mL浓度为2wt％冰醋酸溶液中并搅拌2h，得到壳聚糖溶液；

S23、称取0.45g羟基磷灰石置于50mL去离子水中，超声0.5h混合均匀，得到羟基磷灰石溶液，有利于使羟基磷灰石在后序工艺中与其他溶液的混合；

S24、将所述步骤S22制备得到的所述壳聚糖溶液缓慢加入到所述步骤S21制备得到的所述海藻酸钠溶液中并连续搅拌混匀，以制得高分子水凝胶基体；随后在搅拌状态下，将所述步骤S23制备得到的所述羟基磷灰石溶液按照滴注为2mL/min的速度加入所述高分子水凝胶基体溶液中并搅拌混匀，以制得凝胶溶液；

S25、将所述步骤S24制备得到的所述凝胶溶液超声0.5h，以去除所述凝胶溶液中的气泡后冷冻干燥12h，以制得凝胶膜材料；

S26、将所述步骤S25制备得到的所述凝胶膜材料浸泡于2％氯化钙溶液中原位交联0.2h后，浸泡在EDC和NHS混合的交联剂溶液中1h，最后用去离子水浸泡、清洗3次备用；

S3、制备生物修复膜：

S31、将所述步骤S1制得的所述脐带层中致密层的一面覆盖在第一块模具的平滑面，将所述步骤S2制得的所述凝胶层的其中一面紧密粘附在所述脐带层的另一面，即所述疏松层的一面，再将第二块模具的压痕面覆盖在所述凝胶层的另一面；即采用两块模具对同一生物修复膜中的所述脐带层和所述凝胶层就行压制；

S32、随后压制好的样品连同模具依次进行冻融循环处理、真空冷冻干燥、灭菌处理后，即得到脐带和羟基磷灰石复合的生物修复膜。

具体的，所述步骤S2制备凝胶层的步骤中，海藻酸钠和壳聚糖制成的所述高分子水凝胶基体无细胞毒性，具有抗菌活性，使得冻干得到的凝胶支架层具有微孔结构和一定的渗透性，可实现对创面渗出物的有效吸收，避免伤口处细菌引发的相关感染。

具体的，所述步骤S2制备凝胶层的步骤中，该海藻酸钠溶液中缓慢加入壳聚糖溶液的比例和顺序能够得到表面更加光滑、孔结构适宜的多孔凝胶膜材料，产生这种现象的原因是因为壳聚糖溶解更加完全，混合更加均匀，低比例浓度溶液不会过于粘连，通过冷冻形成的冰晶增加，从而使得所形成的孔结构增加、孔隙增大。

具体的，所述步骤S23和所述步骤S25中进行超声处理，可以有效去除混合过程中产生的气泡，均匀分散溶液中的羟基磷灰石。

具体的，所述步骤S31中，将所述生物修复膜的所述凝胶层一面贴至于第一块模具的压痕面，然后将第二块模具的光滑面覆盖在所述修复膜的所述脐带层一面，使生物修复膜夹持于两块模具之间，经过压制冻干处理后，使得所述凝胶层的一表面呈凹凸状，即使压制冻干后的生物修复膜的一个表面形成有凸起结构和凹陷结构，从而使得能够有效增加所述生物修复膜与待修复部位的贴合程度以及接触表面积；脐带层中致密层的一面经过压制处理后的表面呈平整光滑状，使其具有良好的机械屏障作用。

本发明一些实施例中，所述步骤S26中的EDC和NHS混合的交联剂溶液的浓度为1mg/mL，EDC和NHS质量比为4:1，该交联剂的时间和浓度选择，既能加强凝胶支架的机械性能，又能防止交联密度过大而使凝胶支架过于脆性。交联剂中EDC可以在多糖的分子内和分子间的羧基之间活化反应形成羧酐，而形成的羧酐可以很容易地与多糖的羧基继续反应生成酯基，在NHS的作用下与氨基反应生成酰胺，可以提高所述脐带层的热稳定性、形态稳定性以及抵抗降解的能力。在交联过程中，EDC和NHS是中间试剂参加反应，反应最终形成脲类化合物，可被清洗消除。

本发明一些实施例中，所述步骤S11中清洗的温度12℃，且所述脐带组织的每次清洗16分钟，以最大程度保留脐带中生物活性成分。

本发明一些实施例中，所述步骤S32包括：将压制好的样品连同模具在-20℃的温度下放置2h，再在4℃的温度下放置2h，以此视为一次冻融处理；在上述冻融处理的条件下冻融循环2次后放入温度为-80℃的冰箱中冷冻4h；最后置于真空度20帕，温度-80℃的环境中真空冷冻干燥时间24h，以制得所述脐带和羟基磷灰石复合的所述生物修复膜，冻干后水分含量不超过20％。具体的，通过冻融循环使得膜材料表面呈湿润的固-液态形式，有利于脐带层和凝胶层的紧密交联结合，形成整体进而保证在后续使用过程中结构的稳定性，降低双层结构的分层概率。冻融循环可以避免温度下降过快而破坏组织结构，有效地保留细胞外基质的超微结构，显著提高修复膜干燥效率及得到较均匀的孔隙结构，使得所述生物修复膜在保持一定封闭作用的同时又要允许氧气、血液以及生物活性物质等能进入，促进局部细胞生长和骨再生。

对所述实施例1制得的所述生物修复膜进行复水测试，具体的，将所述生物修复膜置于0.9％的生理盐水中复水15-30min。结果表面，所述生物修复膜仍保持完整状态，所述脐带层与所述凝胶层之间未出现分层现象。可见脐带层和凝胶层在反复冻融过程中实现部分区域的紧密结合，本发明实现了复水后不分层的双层膜制备。

依据标准GB/T5 528-2009硫化橡胶或热塑性橡胶拉伸应力应变性能的测定和标准GB/T1040.3-2006塑料拉伸性能的测定中生物第3部分：薄膜和薄片的试验条件对所述实施例1制得的所述生物修复膜的机械性能进行测试。共对3组样品进行了测试，测试结果如表1所示。从表1可知所述生物修复膜的平均缝合强度不小于1N，拉伸强度不小于0.5MPa，撕裂强度不小于1N。

表1

对所述实施例1制得的所述生物修复膜进行体外降解测试。实验结果显示，所述生物修复膜的组织残留率与原始脐带的组织残留率随降解时间的变化趋势基本一致，说明生物修复膜具有良好的降解性能，能够随着新生组织的重建而同步降解。

根据标准YY/T 1794-2021口腔胶原膜通用技术要求对所述实施例1制得的所述生物修复膜进行吸水性测试。共对3组样品进行了测试，测试结果如表2所示。从表2可知，所述生物修复膜的平均吸水倍数为13.1，较高的吸水率能够使生物修复膜与组织很好地贴合，便于临床使用，同时也方便临床医生在使用时与其他药物结合使用。

表2

对所述实施例1制得的所述生物修复膜进行宿主细胞残留量测试，所述生物修复膜进行组织切片并进行HE染色，显微镜下观察，不存在血管细胞残留，将潜在危险控制在最低水平。

依据GB/T 16886.5-2003的第5部分：体外细胞毒性试验测定所述生物修复膜的细胞毒性对所述实施例1制得的所述生物修复膜进行体外细胞毒性测试。分别对样品浸提液浓度为100％、50％、25％和12.5％的样品、阴性对照组、空白对照组和阳性对照组进行了测试，测试结果如表3所示。从表3可知，所述生物修复膜、空白对照和阴性对照的小鼠成纤维细胞L929的增殖率没有显著差异，而阳性对照的L929增殖率明显低于10％，可见生物修复膜具有良好的生物相容性。

表3

对所述实施例1制得的所述生物修复膜进行活性因子和成分测试，测定本发明所述生物修复膜中的脐带层和新鲜原始脐带中的各类因子和总蛋白含量。所述生物修复膜中的脐带层和新鲜原始脐带的各类因子数据见表4。所述生物修复膜中的脐带层的脐带总蛋白含量见表5。

表4

从表5分析可知，所述生物修复膜中的脐带层的脐带总蛋白含量不低于干重的90％。从表4分析可知，所述脐带测定与作为原料的新鲜原始脐带中的各类因子含量相差不大，说明本发明制备所述制备生物修复膜的方法可保留其多种天然的活性因子成分，相比单纯的胶原膜或脱细胞基质产品，更具有促进愈合的独特生物特性。

表5

本发明一些实施例中，对所述生物修复膜进行应用实验。具体的，实验组为：将本发明所述生物修复膜对实验犬进行拔牙窝填充以及修复实验，对照组为：将可吸收生物膜Geistlich Bio-Gide对实验犬进行拔牙窝填充以及修复实验。其中，实验组和对照组的术后Micro-CT数据结果如表6所示。

表6

分析表6可知，Micro CT显示在12周时，相较于对照组，实验组中的该生物修复膜的骨体积分数(BV/TV)显著增高，说明骨合成代谢大于分解代谢，骨量增加，具有显著优越性。且实验组中术后各植入位点牙龈状态良好，无感染或炎症等排异症状，无口腔膜暴露。

图4为本发明第一种实施例的模具的示意图。

本发明一些实施例中，所述模具为一体成型式结构，所述模具包括相对设置的第一表面和第二表面，参考图4，所述第一表面为压痕面1，所述压痕面1设有凸起结构(图中未标示)和凹陷结构(图中未标示)，所述第二表面(图中未标示)为平滑面。

图5为本发明第二种实施例的模具的示意图。

本发明一些实施例中，参考图5，所述模具包括第一层体11和第二层体12，所述第一层体11和所述第二层体12上下重叠固定，所述第一层体11和所述第二层体12相对的表面分别为所述第一表面111和所述第二表面(图中未标示)，且所述第一层体11和所述第二层体12均采用316L型不锈钢丝编织而成。结构简单，制造工序简易，制造成本低，且不锈钢材料本身具有抗腐蚀性和可焊性，使得所述模具具有良好的稳定性能和可塑性，以及高机械强度。

图6为图5所示的模具中第一层体的表面的结构放大示意图；图7为图5所示的模具中第二层体的表面的结构放大示意图。

本发明一些实施例中，参考图6和图7，所述第一层体11采用密纹编织方式编织而成，使得所述第一层体11的所述第一表面111为压痕面，所述压痕面设有排列有序的所述凸起结构101和所述凹陷结构102。所述密纹编织是指经丝和纬丝的丝径不同，目数也不同，特点是经稀纬密，经粗纬细。长度方向的是经丝，宽度方向是纬丝，长度方向是如图6所示的A指示的方向，宽度方向是与A垂直的方向。所述密纹编织后的具体结构如图6所示，其编织方法为本领域常规设置，在此不再赘述。所述第二层体12采用斜纹编织方式编织而成，使得所述第二层体12的所述第二表面(图中未标示)为平滑面，表面较为平整，孔径密集细小。所述斜纹编织是指每根经丝交叉地在每两根纬丝上下穿过，每根纬丝交叉地在每两根径丝上下穿过的编织方法，所述斜纹编织后的具体结构如图4所示。采用所述密纹编织方式编织而成的所述第一层体11具有良好的耐酸性、耐碱性和耐高温性，且抗压力强和耐磨性强等；采用所述斜纹编织方式编织而成的所述第二层体12具有表面平整、光滑，耐腐蚀性强，坚固耐用等特点。所述第一层体11采用密纹编织方式编织而成，使得所述第一层体11的表面能有效形成凸起结构101和凹陷结构102，所述第二层体12采用斜纹编织方式编织而成，使得所述第二层体12的表面光滑且平整。

本发明一些实施例中，编织所述第一层体的不锈钢丝的经向丝径为0.2毫米～0.28毫米，纬向丝径为0.14毫米～0.2毫米，所述第一层体的孔径为60目-100目，所述第一层体的厚度为1.2毫米～3.4毫米。使得模具的所述第一表面能更好的形成所述凸起结构和所述凹陷结构，从而使得压制冻干后的所述生物修复膜上的所述凸起结构和所述凹陷结构能够有效增加膜材料与待修复部位的贴合程度以及接触表面积。

本发明一些具体实施例中，编织所述第一层体的不锈钢丝的经向丝径为0.25毫米，纬向丝径为0.18毫米，所述第一层体的孔径为80目，所述第一层体的厚度为2毫米。

本发明一些实施例中，编织所述第二层体的不锈钢丝的丝径为0.04毫米～0.045毫米，所述第二层体的孔径为250目-300目，所述第二层体的厚度为0.3毫米～0.7毫米。使得所述第二层体的所述第二表面较为平整，孔径密集细小。

本发明一些实施例中，所述第二层体的孔径为0.0446毫米～0.0556毫米。

本发明一些具体实施例中，所述模具的所述第二层体是采用直径0.042毫米的不锈钢丝平纹编织制成，所述第二层体的孔径为0.05毫米，所述第二层体的厚度为0.5毫米。采用较细不锈钢丝编织使得模具的所述第二表面的孔径密集细小、表面平滑，可实现对所述生物修复膜材料压制出较为平整的形貌结构。

本发明一些实施例中，所述凸起结构和所述凹陷结构相间设置，且相邻所述凸起结构在经向方向的间距为0.14毫米～0.2毫米，相邻所述凸起结构在纬向方向的间距为0.2毫米～0.28毫米。使得形成的所述生物修复膜具有该所述凸起结构和所述凹陷结构，从而能够与组织缺损处紧密贴合，阻隔外界软组织细胞进入，起到隔离软组织长入骨缺损区的作用，达到良好治疗效果。

本发明一些具体实施例中，所述凸起结构和所述凹陷结构相间设置，且相邻所述凸起结构在经向方向的间距为0.15毫米，相邻所述凸起结构在纬向方向的间距为0.26毫米。

本发明一些实施例中，编织所述第一层体的不锈钢丝的纬向丝径为第一丝径，编织所述第一层体的不锈钢丝的经向丝径为第二丝径，所述凸起结构和所述凹陷结构相间设置，且相邻所述凸起结构在经向方向的间距等于所述第一丝径，相邻所述凸起结构在纬向方向的间距等于所述第二丝径。

本发明一些实施例中，编织所述第一层体的不锈钢丝的经向丝径为第二丝径，所述凸起结构和所述凹陷结构相间设置，且所述凸起结构和所述凹陷结构的高度差等于所述第二丝径。

本发明一些实施例中，所述凸起结构和所述凹陷结构相间设置，且所述凸起结构和所述凹陷结构的高度差为0.2毫米～0.28毫米。

本发明一些实施例中，所述模具的长度为6厘米～10厘米，宽度为4厘米～8厘米，厚度为1.5毫米～4.1毫米。所述模具重量较轻，在制备所述生物修复膜时不会压坏所述生物修复膜，且在保证压制效果的同时，节省了材料，降低了投入成本。

本发明一些具体实施例中，所述模具为8厘米×6厘米的薄板结构，既能满足现有所述生物修复膜压制冻干处理所需尺寸，也不会使所述生物修复膜材料会被压变形，还节省了冻干模具生产材料。

本发明一些实施例中，所述第一层体和所述第二层体之间通过采用微点电阻焊方式或无缝对焊方式焊接而成。使得模具无突出焊点和毛边，且所述第一层体和所述第二层体结合紧密无缝隙，不会出现分层和脱落现象，具有较高的稳定性能。

本发明一些实施例中，所述第一层体和所述第二层体均包括4～8层不锈钢丝网。若层数过多，透气性和渗透性差，会影响所述生物修复膜冻干效果，若层数过少，整体重量较轻，会影响模具对所述生物修复膜的压制效果。

本发明一些具体实施例中，所述模具的制备步骤包括：

步骤一，所述模具采用316L不锈钢丝分别按密纹编织方式和斜纹编织方式编织成两种不同结构的不锈钢丝网，且分别制作五张；

步骤二，将五张按密纹编织方式编织成的不锈钢丝网按表面平齐的方式叠层压制后真空烧结得到所述第一层体，将另外五张按斜纹编织方式编织成的不锈钢丝网按表面平齐的方式叠层压制后真空烧结得到所述第二层体；

步骤三，将所述第一层体和所述第二层体采用无缝对焊的焊接技术得到所述模具。

本发明一些实施例中，所述316L不锈钢丝表面进行了电解抛光处理，使得在使用、清洗等过程中不会生锈变形。

本发明一些实施例中，所述真空烧结工艺操作简便，可提高硬质合金的纯度使其具备较高的耐压性能和良好可塑性，方便后续进行加工、焊接和组装。

综上，本发明利用膜改性的技术和方法，最大程度使复合膜材料的成分和性能特征与口腔软组织或骨组织相近，提升膜的生物活性、屏障性能和成骨性能，使得生物修复膜具有最佳的修复效果。本发明将含活性成分的同种异体脐带与负载羟基磷灰石的海藻酸钠/壳聚糖支架结合，利用本发明的所述模具压制处理结合真空冷冻干燥制备出具有生物活性，骨诱导，抑菌多重作用的脐带和羟基磷灰石复合的生物修复膜。所述生物修复膜具有良好的生物相容性，有足够的机械强度以维持稳定的空间及增加可操作性，并能对软组织进行诱导再生的特性。

虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。

Claims (17)

1.一种生物修复膜，其特征在于，包括：

凝胶层，由羟基磷灰石、壳聚糖和海藻酸钠交联而成，所述壳聚糖与所述海藻酸钠的质量比为1:1～1:3；

脐带层，通过模具压制冻干粘附于所述凝胶层的一面，所述脐带层是由脐带组织组成的片状结构，所述脐带组织形成于通过机械方式去除血管细胞的脐带；

所述生物修复膜应用于口腔软组织修复时，在所述壳聚糖与海藻酸钠构成的高分子水凝胶基体中所述羟基磷灰石的浓度为0.1% w/v～0.3% w/v；

所述生物修复膜应用于骨组织修复时，在所述壳聚糖与海藻酸钠构成的高分子水凝胶基体中所述羟基磷灰石的浓度为0.2% w/v～0.4% w/v。

2.根据权利要求1所述的生物修复膜，其特征在于，所述脐带层背向所述凝胶层的一面为平滑表面，所述凝胶层背向所述脐带层的一面为压痕表面，所述压痕表面设有凸起结构和凹陷结构。

3.根据权利要求2所述的生物修复膜，其特征在于，所述凝胶层和所述脐带层通过模具压制冻干而粘附固定，所述模具包括相对设置的第一表面和第二表面，所述第一表面为与所述压痕表面适配的压痕面，所述压痕面设有凸起结构和凹陷结构，所述第二表面为与所述平滑表面适配的平滑面。

4.根据权利要求1所述的生物修复膜，其特征在于，所述脐带组织来源于人体。

5.根据权利要求2所述的生物修复膜，其特征在于，所述脐带层为双层多孔结构，所述脐带层包括致密层和疏松层，所述致密层的孔径小于所述疏松层的孔径，所述疏松层与所述凝胶层粘附固定，所述致密层设置有所述平滑表面。

6.根据权利要求5所述的生物修复膜，其特征在于，所述疏松层的孔径为20μm～100μm。

7.一种生物修复膜的制备方法，其特征在于，包括步骤：

提供原始脐带，通过机械方式去除所述原始脐带中的血管以形成待整形的脐带组织，将所述待整形的脐带组织修整为片状结构的脐带层；

分别制备海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和羟基磷灰石溶液，将所述壳聚糖溶液、所述海藻酸钠溶液和所述羟基磷灰石溶液混合均匀制得凝胶溶液后，再将所述凝胶溶液进行交联反应以制得凝胶层；

将所述脐带层粘附固定于所述凝胶层以制得所述生物修复膜。

8.根据权利要求7所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，所述将所述壳聚糖溶液、所述海藻酸钠溶液和所述羟基磷灰石溶液混合均匀制得凝胶溶液的步骤包括：

将所述壳聚糖溶液按照滴注为1mL/min～2 mL/min的速度滴加到所述海藻酸钠溶液中，并搅拌混合均匀制得高分子水凝胶基体；

将所述羟基磷灰石溶液按照滴注为1mL/min～2 mL/min的速度加入所述高分子水凝胶基体中并搅拌混合均匀后，制得所述凝胶溶液。

9.根据权利要求7所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，所述将所述凝胶溶液进行交联反应以制得凝胶层的步骤包括：

超声去除所述凝胶溶液中的气泡后真空冷冻干燥12h～24h，以制得凝胶膜材料；

将所述凝胶膜材料浸泡在的氯化钙溶液中交联0.1h～1h后，浸泡在交联剂溶液中1h～4 h，再用去离子水浸泡清洗1～3次，且每次所述浸泡清洗的时间为5min～10min，以制得所述凝胶层。

10.根据权利要求7所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，所述将所述脐带层粘附固定于所述凝胶层以制得所述生物修复膜的步骤包括：

在温度11℃～15℃的环境中，将所述脐带层中致密层的一面覆盖于模具的平滑面，将所述凝胶层的一面粘附于所述脐带层中疏松层的一面，再将另一所述模具的压痕面覆盖于所述凝胶层的另一面。

11.根据权利要求10所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，所述将所述脐带层粘附固定于所述凝胶层以制得所述生物修复膜的步骤还包括：

将夹设有所述脐带层和所述凝胶层的所述模具在-10℃～-22℃温度下静置2h～6h后，再在0℃～10℃温度下静置2h～6h以进行冻融处理，且冻融循环1～3次后，依次在-20℃温度下冷冻2h，-80℃温度下冷冻4h，-70℃～-80℃的温度下冷冻2h～14h，-80±5℃温度下真空冷冻干燥4h～8h，以制得所述生物修复膜。

12.根据权利要求7所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，所述将所述待整形的脐带组织修整为片状结构的脐带层的步骤包括：

在温度11℃～15℃的环境中，将所述待整形的脐带组织采用清洗液清洗后，修剪为片状并用去离子水清洗1～3次，以制得所述脐带层，且所述清洗温度11℃～15℃，清洗时间15～20分钟。

13.根据权利要求9所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，所述交联剂为1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺、京尼平和甲醛中的任意一种或两种。

14.根据权利要求9所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，所述氯化钙溶液的浓度为1%～5％。

15.根据权利要求10所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，重复所述将所述脐带层中所述致密层的一面覆盖于模具的所述平滑面，将所述凝胶层的一面粘附于所述脐带层中所述疏松层的一面，再将另一所述模具的所述压痕面覆盖于所述凝胶层的另一面的步骤，按所述模具、所述脐带层、所述凝胶层和另一所述模具的叠加顺序叠加2～6层的所述脐带层和所述凝胶层，以制得2～6张所述生物修复膜。

16.根据权利要求8所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，所述分别制备海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液和羟基磷灰石溶液的步骤包括：

称取海藻酸钠溶于去离子水中并搅拌1h～4 h，以制得所述海藻酸钠溶液；

称取壳聚糖溶于浓度为1wt％～2wt％的稀酸溶液中并搅拌1h～4 h，以制得所述壳聚糖溶液；

称取羟基磷灰石置于去离子水中，超声0.5h～2h混合均匀，以制得所述羟基磷灰石溶液。

17.根据权利要求12所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，所述清洗液为无菌磷酸盐缓冲溶液、无菌氯化钠注射液和纯化水中的任意一种或多种。