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CN117004496B - 一株高效降解木质素的棘孢木霉t285及其筛选方法、应用 - Google Patents

一株高效降解木质素的棘孢木霉t285及其筛选方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一株高效降解木质素的棘孢木霉T285及其筛选方法、应用。本发明所筛选的棘孢木霉T285，其保藏编号为CGMCC NO.40729，于2023年07月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明筛选得到的棘孢木霉T285具有强漆酶活性，具有耐高温特性，能够在50℃条件下高效降解木质素；避免了现有技术中多采用常温发酵菌，其在发酵过程中对发酵条件要求苛刻的问题，从而使堆肥快速发酵技术更易实现。本发明提供的棘孢木霉T285具有遗传和功能性状稳定的优势，其菌丝结构有助于菌体抵达秸秆等纤维组织内部，增加了降解酶系的可及性，使木质素快速解聚，提高腐熟效率。

Description

一株高效降解木质素的棘孢木霉T285及其筛选方法、应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株高效降解木质素的棘孢木霉T285及其筛选方法、应用。
背景技术
在全面推进乡村振兴，加快推动农业绿色低碳发展的背景下，探索可复制推广的种养循环模式是重要的攻关方向，其中对包括农作物秸秆和畜禽粪便等典型农业固废的属地无害化高效肥料化技术是亟待突破的关键技术之一。农业固废物好氧堆肥过程中，秸秆和粪便残留植物纤维中的木质素是生物发酵过程中的限速因子。这是由于天然木质纤维素结构中，木质素与半纤维素交织包裹在纤维素外部，阻碍了降解微生物的可及性。
研究表明，好氧堆肥发酵过程中参与纤维降解的微生物主要为耐高温的细菌，大部分细菌不具有木质素降解酶系。而包括白腐真菌在内的众多可降解木质素的真菌，其适应高温性能往往很差，大部分真菌的环境适应温度为40℃以下，但好氧堆肥温度一般达到45℃以上。故而，目前亟需发掘耐高温型木质素降解菌资源，以满足构建高效好氧堆肥技术的要求。目前，棘孢木霉及其菌剂主要应用于作物促生、植物病害生物防治等方面，而将其用于高温条件下的木质素降解则鲜有报道。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一株高效降解木质素的棘孢木霉T285。本发明提供的棘孢木霉T285分离筛选自农业固体废弃物堆肥发酵物，筛选得到的菌株能够在高温条件下高效降解木质素。
本发明还提供了上述棘孢木霉T285的筛选方法。
本发明的另一目的为提供了上述棘孢木霉T285在高温条件下高效降解木质素中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一株高效降解木质素的棘孢木霉T285，其保藏编号为CGMCCNO.40729，于2023年07月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
进一步的，所述T285的ITS基因序列（如SEQ ID NO.1所示）为：
ATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACATTTCAGAAAGTTGGGTGTTTTACGGACGTGGACGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTTGTGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGCCGGCACCCGTGTGAGGGGTCCCGATCCCCAACGCCGATCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAGAAATACGTCCGCGAGGGGACTACAGAAAGAGTTTGGTTGGTTCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGT
本发明还提供了一种上述棘孢木霉T285的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将不同环境中采集的农业固体废弃物堆肥发酵物进行梯度稀释至10-1～10-7倍，分别取每个梯度稀释液涂布玫瑰红钠琼脂培养基平板，恒温培养；
（2）从每个梯度稀释的平板中挑取单菌落，通过形态学显微镜观察和内源转录间隔区比对，鉴定种属，得到优势菌株棘孢木霉T285。
进一步的，步骤（1）中，所述梯度稀释采用含有0.3%吐温-80的无菌水进行。
进一步的，步骤（1）中，所述恒温培养的条件为28℃下培养3d～14d。
本发明的另一目的为提供了上述棘孢木霉T285在高温条件下降解木质素中的应用。
本发明的有益效果为：
（1）本发明筛选得到的棘孢木霉T285具有强漆酶活性，具有耐高温特性，能够在50℃条件下高效降解木质素；避免了现有技术中多采用常温发酵菌，其在发酵过程中，对发酵条件要求苛刻的问题，从而使堆肥快速发酵技术更易实现。
（2）本发明提供的棘孢木霉T285为丝状真菌，相比较常见的细菌类腐熟菌种，具有遗传和功能性状稳定的优势，其菌丝结构有助于菌体抵达秸秆等纤维组织内部，增加了降解酶系的可及性，使木质素快速解聚，从而实现腐熟效率的提高。
保藏信息
保藏时间：2023年07月11日，
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
保藏编号：CGMCC NO.40729，
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，
邮政编码：100101
分类命名：棘孢木霉（Trichodermaasperellum）。
附图说明
图1为棘孢木霉T285菌落状态图，其中，A为菌落正面图，B为菌落反面图；
图2为棘孢木霉T285在含不同底物培养基内的显色反应；
图3为木质素浓度测定的标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1菌株的分离鉴定
本发明棘孢木霉T285分离筛选自农业固体废弃物堆肥发酵物。将采集的发酵物样本用含有0.3%吐温-80的无菌水梯度稀释至10-1～10-7倍，从每个梯度稀释液中分别取100μL涂布玫瑰红钠琼脂培养基平板，在28℃恒温培养3天。从每个梯度稀释的平板中挑取不同形态的单菌落转接至PDA在28℃培养7～14天，通过形态学显微镜观察和内源转录间隔区（internally transcribed spacer，ITS）比对，鉴定种属，其中编号为T285的菌株为分离得到的优势菌株，经鉴定为棘孢木霉（Trichodermaasperellum）。
本发明棘孢木霉T285在PDA上生长最初菌丝为白色，后转为墨绿或深绿色，具有轮纹结构，菌丝呈现密集的毡状，菌落背面没有扩散性色素颜色特征而呈绿色。T285在28℃培养14天的菌落状态见图1，图中，A为菌落正面图，B为菌落反面图。
T285的ITS基因序列为：
ATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACATTTCAGAAAGTTGGGTGTTTTACGGACGTGGACGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTTGTGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGCCGGCACCCGTGTGAGGGGTCCCGATCCCCAACGCCGATCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAGAAATACGTCCGCGAGGGGACTACAGAAAGAGTTTGGTTGGTTCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGT
实施例2木质素降解酶平板测定
漆酶是贯穿于木质素解聚和矿化过程的主要木质素降解酶，对愈创木酚、单宁酸、ABTS等底物的氧化作用中会产生明显的变色反应，从而判断是否具有漆酶活性。
培养基的配制：
PDB培养基：马铃薯浸粉6.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸馏水定容至1 L；
PDA培养基：PDB培养基加入15 g/L琼脂，115℃高温高压灭菌30分钟，冷却至60℃以下备用；
愈创木酚+PDA培养基：将愈创木酚单独过滤除菌制成1%母液，无菌条件下以终浓度0.04%加入到PDA培养基中；
单宁酸+PDA培养基：将单宁酸单独过滤除菌制成20%母液，无菌条件下以终浓度0.04%加入到PDA培养基中；
2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）+PDA培养基：将ABTS单独过滤除菌制成4.4%母液，无菌条件下以终浓度0.11%加入到PDA培养基中。
菌种活化：
将-80℃保藏的T285接种于PDA固体平板，26℃活化3天，在菌落边缘取新生菌丝再次接种于PDA平板中，26℃培养3天，再重复取菌丝培养一次，即为活化的菌株T285。
T285木质素降解酶的平板测定：
用无菌直径为5 mm打孔器取活化的菌株T285，分别接种于愈创木酚+PDA、单宁酸+PDA和ABTS+PDA平板上，在26℃条件下培养5～7天，记录在上述平板上有无显色现象。
经培养，T285在含愈创木酚、单宁酸和ABTS培养基中培养，与PDA对照（图2D）相比，分别显深砖红色（图2A）、深褐色（图2B）和墨绿色（图2C）。表明具有T285强漆酶活性。
实施例3棘孢木霉T285的耐高温性能测定
培养基的配制：
PDB培养基：马铃薯浸粉6.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸馏水定容至1L，115℃高温高压灭菌30分钟，冷却至室温备用；
PDA培养基：PDB培养基加入15 g/L琼脂，115℃高温高压灭菌30分钟，冷却至室温备用；
木质素无机盐培养液：Na2HPO4, 2.8 g/L、KH2PO4, 1.0 g/L、(NH4)2SO4, 0.5 g/L、MgCl2, 0.053g/L、四水钙盐, 0.05g/L、Na2EDTA, 0.0005g/L、FeSO4·7H2O, 0.0002g/L、ZnSO4·7H2O, 0.00001g/L、MnCl2·4H2O, 0.000003g/L、H3BO3, 0.00003g/L、CoCl2·6H2O,0.0002g/L、CuCl2·2H2O, 0.000001g/L、NiCl2·6H2O, 0.000002g/L、Na2MoO4·2H2O,0.000003g/L、碱木质素1g/L，ddH2O定容至1L。木质素降解培养液经过121℃高温高压灭菌20分钟，冷却至室温备用。
在固体培养基高温培养：用无菌的直径为5 mm打孔器取新鲜活化的T285菌株，接种于PDA平板（直径150 mm）上，分别在26℃条件和50℃下培养至室温条件下刚好接触平皿边缘，设6个生物学重复，根据公式计算平板耐高温率，其中，表示平板培养耐高温性(%)，/>表示26℃培养的直径（cm），/>表示50℃培养的直径（cm）。分析结果表明，50℃平板培养耐高温性为31.12%±9.43%。
在液体培养基高温培养：将活化好的T285菌株在PDA平板上26℃、12小时光照12小时黑暗条件下培养10天，制备106个/mL的分生孢子悬液，将制备好的孢子悬液按1：100体积比分别接种于木质素无机盐培养液和PDB培养基中作为处理，以不接菌的两种培养液为对照，分别在26℃和50℃条件下180 rpm条件下培养14天，离心后测菌体干物质生物量，设6个生物学重复。根据公式，其中，/>表示液体培养耐高温性（%），/>表示26℃振荡培养的处理生物量减对照干物质的质量差（mg），/>表示50℃振荡培养的处理生物量减对照干物质的质量差（mg）。分析结果表明，在50℃木质素无机盐培养液和PDB培养基中培养的耐高温性分别为51.25%±9.22%和39.62%±8.57%。
效果实施例T285在高温条件下的木质素降解率测定
培养基的配制：
PDA培养基：马铃薯浸粉6.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂15 g，蒸馏水定容至1L，115℃高温高压灭菌30分钟，冷却至室温备用；
木质素无机盐培养液：Na2HPO4, 2.8 g/L、KH2PO4, 1.0 g/L、(NH4)2SO4, 0.5 g/L、MgCl2, 0.053 g/L、四水钙盐, 0.05 g/L、Na2EDTA, 0.0005 g/L、FeSO4·7H2O, 0.0002 g/L、ZnSO4·7H2O, 0.00001g/L、MnCl2·4H2O, 0.000003 g/L、H3BO3, 0.00003 g/L、CoCl2·6H2O, 0.0002 g/L、CuCl2·2H2O, 0.000001 g/L、NiCl2·6H2O, 0.000002 g/L、Na2MoO4·2H2O, 0.000003 g/L、碱木质素1 g/L，ddH2O定容至1L。木质素降解培养液经过121℃高温高压灭菌20分钟，冷却至室温备用。
孢子悬浮液的制备：将活化好的菌株在PDA固体平板上26℃、12小时光照12小时黑暗条件下培养10天，制备106个/mL的分生孢子悬液。
接种：将制备好的孢子悬液按1：100体积比接种于木质素无机盐培养液中为处理，不接种菌体的木质素无机盐培养液为空白对照，设6个生物学重复。50℃、160 rpm条件下振荡培养15天。
木质素浓度标准曲线的绘制：取6个不同浓度碱木质素（分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 g/L）降解培养基溶液，吸取200 μL于96孔UV板中测280 nm处吸光度，绘制标准曲线（图3）。
高温条件木质素降解率测定：在无菌环境中取混匀后的木质素降解培养基1 mL于离心管中，12000 rpm条件下离心3 min，取200 μL上清液，通过酶标仪测定对照和处理组280 nm处吸光度，将测得的数值带入标准曲线计算木质素含量，根据公式计算木质素降解率，其中，/>表示木质素降解率（%），/>表示空白对照中木质素的含量（g/L），/>表示处理中木质素的含量（g/L）。结果表明，50℃条件下棘孢木霉T285培养15天的木质素降解率为49.32±7.83%，优于现有的高温木质素降解真菌。本发明的棘孢木霉T285在高温堆肥发酵秸秆等含木质素的原料方面具有很好的应用潜力，能够促进木质纤维素组分的降解，提高堆肥效率。

Claims (2)

1.一株高效降解木质素的棘孢木霉（Trichoderma asperellum）T285，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO. 40729，于2023年07月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种如权利要求1所述的棘孢木霉T285在高温条件下降解木质素中的应用，其特征在于，所述高温条件为50℃。
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