CN117003872A - 含有突变轻链可变区骨架的单链抗体片段 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种单链抗体片段，包含重链可变区、接头、和κ轻链可变区，其中κ轻链可变区改造成在按Kabat编码系统/方法确定的第104‑106位分别包含亮氨酸、苏氨酸、和丙氨酸。

Description

含有突变轻链可变区骨架的单链抗体片段

技术领域

本申请涉及一种单链抗体片段(scFv)，包含重链可变区、接头、和κ轻链可变区，其中，按Kabat编码系统/方法，κ轻链可变区改造成包含104-106LTA、83E、83E/104-106LTA、100Q/104-106LTA、或83E/100Q/104-106LTA突变。本申请的scFv具有改善的结构稳定性、重组表达量、和/或聚集倾向。

背景技术

动物体内存在的天然抗体分子通常由两条重链和两条轻链构成，每条重链包含一个重链可变区(VH)和一个重链恒定区(CH)，每条轻链包含一个轻链可变区(VL)和一个轻链恒定区(CL)。VH和VL配对形成抗原结合域，而CH(特别是其中的CH1)和CL则对VH和VL的构型和稳定起到一定的支持作用。最早被批准用于临床治疗应用的也是这类完整的抗体分子，如PD-1抗体纳武单抗和PD-L1抗体阿替利珠单抗。

随着抗体技术领域的发展，科学家们又设计并制备出了一些小尺寸的抗体片段，如单链抗体片段(scFv)等。这些分子凭借着小巧的体型，在触及大尺寸抗体无法进入的区域方面、在缩短半衰期方面、在双特异性或多特异性分子以及嵌合抗原受体(CAR)的构建方面，有着特别的优势。然而，尽管许多基于scFv的设计在一些研究项目中显示出不错的生物活性，低产量和活性衰减阻碍了其在临床前和临床中的发展和应用。治疗性scFv抗体自1990年左右开发以来，鲜有产品上市。

scFv通常由一个VH、一个VL、以及介于中间的接头构成，可以是VH的N端与VL的C端相连，也可以是VL的N端与VH的C端相连。接头通常为15-25个氨基酸的短肽，具有一定的弹性，可以使得VH和VL在折叠后仍可配对构成单价抗原结合位点。可能是由于缺乏CH1和CL的支持和限制，一些scFv链内VH和VL不能很好地相互作用并形成稳定的构型，而可能处于一个介于开放状态和封闭状态之间的平衡状态。例如，因CH1和CL的缺乏，可能导致VH和VL上的一些氨基酸残基(如疏水性氨基酸、可糖基化氨基酸)暴露在表面，进而影响VH-VL配对形成的构型的稳定性，并影响其表达量。而因CH1和CL的缺乏，VH和/或VL表面的带电情况也可能会发生改变，从而影响VH-VL配对形成的构型的稳定性。开放状态scFv的累积，可能造成分子间VH-VL相互作用，而形成scFv低聚物。scFv低聚物会被储藏在细胞的特定部位，造成重组表达量低。而表达出来的scFv的聚集倾向，也会造成脱靶效应等，是其作为治疗性分子的主要问题。首先，抗体聚集可能会影响其抗原结合特异性，造成脱靶效应。例如，CD3抗体一般在交联状态下才引发CD3信号转导，为避免不必要的T细胞激活，双特异性抗体通常设计成靶向CD3和疾病相关抗原，并且仅在疾病相关抗原结合域与疾病相关抗原结合时才使双抗处于交联状态，进而引发CD3信号传导，产生仅针对疾病细胞的T细胞反应。而如果双抗因其中scFv具有聚集性而在非目标位置发生交联，则会引发非特异性的T细胞反应，造成严重的细胞因子释放综合征(“CRS”)，使其临床应用的价值降低。此外，抗体的聚体可能在宿主体内引发免疫反应，形成抗药抗体，加速抗体清除，降低疗效(Joubert et al.，(2012)J.Biol.Chem.287(30)：25266-25279)。如果要去除抗体中的聚集体，则会降低生产效率，增加生产成本(Cromwell et al.，(2006)AAPS Journal 8(3)：E572_E579)。

综上，scFv分子的容易分解或水解、聚集等问题，导致稳定性差和产量低。领域内亟需一种通用的可以改善scFv等缺乏恒定区的抗体或抗原结合片段的物理稳定性的方法，来提高下一代治疗抗体的发展水平。

对于本申请中任何文件的引用，并不等同于承认这些文件是本申请的现有技术。

发明内容

本申请的发明人，通过比较同一抗体的Fab和scFv构型(图1A-1C)，发现，在轻链(如κ链)的VL第三骨架区(FR)和第四骨架区，尤其是第四骨架区，存在一些疏水性氨基酸残基，在缺乏恒定区结构的情况下，这些氨基酸残基暴露在表面，可能会导致VH-VL形成的抗原结合域构型不稳定。通过将这些疏水性氨基酸残基替换为疏水性弱、或亲水性的氨基酸残基，可改善VH-VL构型的稳定性，降低scFv的聚集倾向，提升其表达量和存储稳定性。此外，还可以对轻链(如κ链)的VL第三骨架区和第四骨架区，尤其是第四骨架区的一些氨基酸残基进行替换，以改善整体电荷分布，进一步提升VH-VL抗原结合域的结构稳定性。此外，上述对于VL骨架区的改造，也可用于其他缺乏恒定区的抗体或抗原结合片段的稳定性改进。

因此，在第一个方面，本申请提供一种单链抗体片段(scFv)，包含重链可变区、接头、和κ轻链可变区，其中κ轻链可变区包含轻链可变区骨架，该轻链可变区骨架可以包含第一骨架区、第二骨架区、第三骨架区、和第四骨架区。其中，κ轻链可变区可以经突变而在按Kabat编码系统/方法确定的第104位包含亮氨酸(L)，第105位包含丝氨酸(S)或苏氨酸(T)，第106位包含丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、或苏氨酸(T)。κ轻链可变区的按Kabat编码系统/方法确定的第104-106位可以位于第四骨架区。

在一些实施方式中，κ轻链可变区可以经突变而在按Kabat编码系统/方法确定的第105位包含苏氨酸(T)。

在一些实施方式中，κ轻链可变区可以经突变而在按Kabat编码系统/方法确定的第106位包含丙氨酸(A)。

在一些实施方式中，κ轻链可变区可以经突变而在按Kabat编码系统/方法确定的第104-106位分别包含亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、和丙氨酸(A)。

轻链可变区可以经突变而在按Kabat编码系统/方法确定的第100位包含谷氨酰胺(Q)。κ轻链可变区的按Kabat编码系统/方法确定的第100位可以位于第四骨架区。

轻链可变区可以经突变而在按Kabat编码的第83位包含谷氨酸(E)。κ轻链可变区的按Kabat编码系统/方法确定的第83位可以位于第三骨架区。

按Kabat编码系统/方法，轻链可变区可以经突变而包含选自83E、100Q、104L、105T、106A、及其组合的氨基酸。

在一些实施方式中，轻链可变区可以经突变而在按Kabat编码系统/方法确定的第83位包含谷氨酸(E)。

在一些实施方式中，轻链可变区可以经突变而在按Kabat编码系统/方法确定的第100和104-106位分别包含谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、和丙氨酸(A)。

在一些实施方式中，轻链可变区可以经突变而在按Kabat编码系统/方法确定的第83位和第104-106位分别包含谷氨酸(E)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、和丙氨酸(A)。

在一些实施方式中，轻链可变区可以经突变而在按Kabat编码系统/方法确定的第83位和第100和104-106位分别包含谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、和丙氨酸(A)。

本申请scFv的轻链可变区还可以基于轻链可变区序列经由Chothia、IMGT、AbM或Contact等编码系统/方法确定，只要其确定的83、100、104-106位氨基酸与Kabat确定的一致即可。

本申请的scFv的轻链可变区骨架可以为天然的κ链(例如人κ链)的可变区骨架、或经改造天然κ链(例如人κ链)而得到的可变区骨架。κ链可以为FW1.4gen、375-FW1.4opt、435-FW1.4opt、509-FW1.4opt、511-FW1.4opt、534-FW1.4opt、567-FW1.4opt、578-FW1.4opt、1-FW1.4opt、8-FW1.4opt、15-FW1.4opt、19-FW1.4opt、34-FW1.4opt、35-FW1.4opt、42-FW1.4opt、43-FW1.4opt、或与上述κ链或上述κ链的第一、第二、第三、和/或第四骨架区具有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变的轻链。

在一个实施方式中，轻链可变区骨架可以包含FW1.4gen、375-FW1.4opt、435-FW1.4opt、509-FW1.4opt、511-FW1.4opt、534-FW1.4opt、567-FW1.4opt、578-FW1.4opt、1-FW1.4opt、8-FW1.4opt、15-FW1.4opt、19-FW1.4opt、34-FW1.4opt、35-FW1.4opt、42-FW1.4opt、43-FW1.4opt、或与上述κ链或上述κ链的第一、第二、第三、和/或第四骨架区具有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变的轻链的可变区骨架(包含第一、第二、第三和第四骨架区)，且按照Kabat编号系统/方法，使第104-106位分别包含(例如突变为)亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、和丙氨酸(A)。

在一个实施方式中，本申请的轻链可变区骨架可以包含FW1.4gen、375-FW1.4opt、435-FW1.4opt、509-FW1.4opt、511-FW1.4opt、534-FW1.4opt、567-FW1.4opt、578-FW1.4opt、1-FW1.4opt、8-FW1.4opt、15-FW1.4opt、19-FW1.4opt、34-FW1.4opt、35-FW1.4opt、42-FW1.4opt、43-FW1.4opt、或与上述κ链或上述κ链的第一、第二、第三、和/或第四骨架区具有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变的轻链的可变区骨架(即，第一、第二、第三和第四骨架区)，且按照Kabat编号系统/方法，使第110和104-106位分别包含(例如突变为)谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、和丙氨酸(A)；使第83位包含(例如突变为)谷氨酸(E)；使第83位和第104-106位分别包含(例如突变为)谷氨酸(E)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、和丙氨酸(A)；或者使第83位和第100和104-106位分别包含(例如突变为)谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、和丙氨酸(A)。

本申请的scFv的轻链可变区可以包含具有104-106LTA的第四骨架区，例如SEQ IDNOs：33(X＝G)或35所示的第四骨架区。任选地，可以在第一、第二、和第三骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。任选地，可以在第一、和第二骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。

本申请的scFv的轻链可变区可以包含具有83E的第三骨架区，和/或具有104-106LTA、或100Q/104-106LTA的第四骨架区，如SEQ ID NOs：32(X＝E)或34(X＝E)所示的第三骨架区、和/或SEQ ID NOs：33(X＝G或Q)或35所示的第四骨架区。任选地，可以在第一、第二、和第三骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。任选地，可以在第一、和第二骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。

在一些实施方式中，本申请的scFv的轻链可变区可以包含第一骨架区、第二骨架区、具有83E的第三骨架区、和具有104-106LTA或100Q/104-106LTA的第四骨架区，如SEQ IDNO：32(X＝E)所示的第三骨架区、和SEQ ID NO：33(X＝G或Q)所示的第四骨架区。在一个实施方式中，本申请的scFv的轻链可变区可以包含第一骨架区、第二骨架区、具有83E的第三骨架区、和具有104-106LTA的第四骨架区，如SEQ ID NO：34(X＝E)所示的第三骨架区、和SEQ ID NO：35所示的第四骨架区。任选地，可以在第一、第二、和第三骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。任选地，可以在第一、和第二骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。

本申请的scFv的轻链可变区可以包含SEQ ID NOs：16(X1＝V、X2＝G、X3＝L、X4＝T、X5＝A；X1＝E、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I；或X1＝E、X2＝Q、X3＝L、X4＝T、X5＝A)或24(X1＝E、X2＝T、X3＝A)中的第四骨架区、或第一至第四骨架区。本申请的轻链可变区可以包含SEQ ID NOs：16(X1＝V、X2＝G、X3＝L、X4＝T、X5＝A；X1＝E、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I；或X1＝E、X2＝Q、X3＝L、X4＝T、X5＝A)或24(X1＝E、X2＝T、X3＝A)中的第三和第四骨架区、或全部第一至第四骨架区。本申请的轻链可变区可以包含SEQ ID NOs：16(X1＝V、X2＝G、X3＝L、X4＝T、X5＝A；X1＝E、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I；X1＝E、X2＝Q、X3＝L、X4＝T、X5＝A)或24(X1＝E、X2＝T、X3＝A)中的第一、第二、第三、和第四骨架区。任选地，可以在第一、第二、和第三骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。任选地，可以在第一、和第二骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。

本申请的scFv的轻链可变区可以包含SEQ ID NOs：36、37、32(X＝V或E)、和33(X＝G或Q)所示的第一、第二、第三、和第四骨架区。任选地，可以在第一、第二、和第三骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。任选地，可以在第一、和第二骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。

本申请的scFv的轻链可变区骨架可以包含SEQ ID NOs：38、39、34(X＝F或E)、和35所示的第一、第二、第三、和第四骨架区。任选地，可以在第一、第二、和第三骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。任选地，可以在第一、和第二骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。

在一个实施方式中，本申请的scfv可以结合CD20或TIGIT。

本申请中的接头可以为10-25氨基酸的短肽，例如GS接头，如-(G₄S)₃-(SEQ ID NO：27)、-(G₄S)₄-(SEQ ID NO：28)、和-(G₄S)₅-(SEQ ID NO：29)。

在第二个方面，本申请提供一种抗体或抗原结合片段，其可以包含本申请的scFv。

抗体或抗原结合片段可以为scFv、双特异或多特异性抗体。

在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段为靶向CD20的scFv，包含重链可变区、接头、和轻链可变区，其中轻链可变区为κ链可变区，其中重链可变区依次包含分别如SEQ IDNOs：7、8、和9所示的重链可变区CDR1(VH-CDR1)、VH-CDR2和VH-CDR3，轻链可变区依次包含SEQ ID NOs：10、11、和12所示的轻链可变区CDR1(VL-CDR1)、VL-CDR2和VL-CDR3，轻链可变区还包含第一、第二、第三和第四骨架区，其中轻链可变区在按Kabat编码系统/方法确定的第104位包含亮氨酸(L)，在第105位包含丝氨酸(S)或苏氨酸(T)，在第106位包含丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、或苏氨酸(T)。在一些实施方式中，按Kabat编码系统/方法，轻链可变区可以在第104-106位分别包含亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、和丙氨酸(A)。按Kabat编码系统/方法，轻链可变区可以在第100位包含谷氨酰胺(Q)。按Kabat编码系统/方法，轻链可变区可以在第83位包含谷氨酸(E)。在一些实施方式中，轻链可变区可以包含具有104-106LTA、或100Q/104-106LTA的第四骨架区，如SEQ ID NO：33(X＝G或Q)的第四骨架区。在一些实施方式中，轻链可变区可以包含具有83E的第三骨架区，例如可以包含SEQ ID NO：32(X＝E)的第三骨架区。在一些实施方式中，轻链可变区可以包含具有83V或83E的第三骨架区、和具有104-106LTA或100Q/104-106LTA的第四骨架区，例如可以包含SEQ ID NO：32(X＝V或E)的第三骨架区、和SEQ ID NO：33(X＝G或Q)的第四骨架区。在一些实施方式中，轻链可变区可以包含83E、104-106LTA、83E/104-106LTA、100Q/104-106LTA、或83E/100Q/104-106LTA，例如可以包含SEQ ID NO：16(X1＝V、X2＝G、X3＝L、X4＝T、X5＝A；X1＝E、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I；或X1＝E、X2＝Q、X3＝L、X4＝T、X5＝A)所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，scFv可以包含重链可变区、接头、和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列，接头包含SEQ ID NOs：27、28或29的氨基酸序列，轻链可变区包含83E、104-106LTA、83E/104-106LTA、100Q/104-106LTA、或83E/100Q/104-106LTA，例如轻链可变区可以包含SEQ ID NO：16(X1＝V、X2＝G、X3＝L、X4＝T、X5＝A；X1＝E、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I；或X1＝E、X2＝Q、X3＝L、X4＝T、X5＝A)所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，scFv从N端到C端包含重链可变区、接头、和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列，接头包含SEQID NOs：27、28或29的氨基酸序列，轻链可变区包含83E、104-106LTA、83E/104-106LTA、100Q/104-106LTA、或83E/100Q/104-106LTA，例如轻链可变区可以包含SEQ ID NO：16(X1＝V、X2＝G、X3＝L、X4＝T、X5＝A；X1＝E、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I；或X1＝E、X2＝Q、X3＝L、X4＝T、X5＝A)所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以为靶向CD20和CD3的双特异性抗体，其可以包含1个CD3ε抗原结合域、和1-5个CD20抗原结合域。CD3抗原结合域可以以Fab、Fv、或scFv的形式存在，CD20抗原结合域可以以Fab、Fv或scFv的形式存在。至少一个CD20抗原结合域以scFv的形式存在，在一些实施方式中为上述靶向CD20的scFv。

本申请的CD3/CD20双特异性抗体可以包括一个特异结合CD3的Fab片段、一个特异结合CD20的Fab片段、和一个特异结合CD20的scFv。其中，特异结合CD20的scFv为本申请中包含稳定性改造的轻链可变区骨架的scFv，即轻链可变区包含选自83E、104-106LTA、83E/104-106LTA、100Q/104-106LTA、或83E/100Q/104-106LTA的氨基酸。

特异结合CD3的Fab片段可以包含SEQ ID NOs：1、2、3、4、5、和6所示的重链可变区CDR1(VH-CDR1)、VH-CDR2、VH-CDR3、轻链可变区CDR1(VL-CDR1)、VL-CDR2和VL-CDR3。特异结合CD20的Fab片段和特异结合CD20的scFv可以包含SEQ ID NOs：7、8、9、10、11和12所示的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。

特异结合CD3的Fab片段可以包含与SEQ ID NO：13具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变区以及与SEQ IDNO：14具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变区。特异结合CD20的Fab片段可以包含与SEQ ID NO：15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变区以及与SEQID NO：16(X1＝V、X2＝G、X3＝V、X4＝E、x5＝I)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变区。特异结合CD20的scFv可以包含与SEQ ID NO：15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变区以及与SEQ ID NO：16(X1＝V、X2＝G、X3＝L、X4＝T、X5＝A；X1＝E、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I；或X1＝E、X2＝Q、X3＝L、X4＝T、X5＝A)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变区。

本申请的CD3/CD20双特异性抗体，可以包含：

i)第一多肽链，(任选地从N端到C端)包含特异结合CD20的重链可变区，以及重链恒定区CH1、CH2和CH3；

ii)第二多肽链，(任选地从N端到C端)包含特异结合CD20的轻链可变区和轻链恒定区；

iii)第三多肽链，(任选地从N端到C端)包含特异结合CD20的重链可变区，特异结合CD20的轻链可变区，特异结合CD3ε的重链可变区，以及重链恒定区CH1、CH2和CH3；以及

iv)第四多肽链，(任选地从N端到C端)包含特异结合CD3ε的轻链可变区和轻链恒定区，

其中第一多肽链中特异结合CD20的重链可变区和重链恒定区CH1与第二多肽链中特异结合CD20的轻链可变区和轻链恒定区结合形成所述特异结合CD20的Fab，第三多肽链中特异结合CD20的重链可变区与特异结合CD20的轻链可变区结合形成所述特异结合CD20的scFv，第三多肽链中特异结合CD3ε的重链可变区和重链恒定区CH1与第四多肽链中特异结合CD3ε的轻链可变区和轻链恒定区结合形成所述特异结合CD3的Fab，且第一多肽链的重链恒定区与第三多肽链的重链恒定区通过例如杵-臼、共价或二硫键等作用结合在一起。

第一多肽链和第三多肽链中的重链恒定区具有降低的或消除的FcR结合活性，且其中之一具有杵结构，另一具有臼结构。

在一个实施方式中，第一多肽链中的重链恒定区为包含L234A/L235A/N297A/T366W的IgG1重链恒定区，第三多肽链中的重链恒定区为包含L234A/L235A/N297A/T366S/L368A/Y407V的IgG1重链恒定区；或者第一多肽链中的重链恒定区为包含L234A/L235A/N297A/T366S/L368A/Y407V的IgG1重链恒定区，第三多肽链中的重链恒定区为包含L234A/L235A/N297A/T366W的IgG1重链恒定区。

在一个实施方式中，本申请的靶向CD3和CD20的双特异抗体可以包含：

i)第一多肽链，含有特异结合CD20的重链可变区、和重链恒定区；

ii)第二多肽链，含有特异结合CD20的轻链可变区；

iii)第三多肽链，含有特异结合CD20的重链可变区、特异结合CD20的轻链可变区、特异结合CD3ε的重链可变区、和重链恒定区；以及

iv)第四多肽链，含有特异结合CD3ε的轻链可变区，

其中第一多肽链中特异结合CD20的重链可变区和第二多肽链中特异结合CD20的轻链可变区结合形成能够特异地结合CD20的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合CD20的重链可变区和特异结合CD20的轻链可变区结合形成能够特异结合CD20的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合CD3ε的重链可变区与第四多肽链中特异结合CD3ε的轻链可变区结合形成能够特异地结合CD3的抗原结合片段，且第一多肽链的重链恒定区与第三多肽链的重链恒定区通过例如杵-臼、共价或二硫键等作用结合在一起。

第一多肽链和第三多肽链中特异结合CD20的重链可变区可以包含SEQ ID NOs：7、8和9的VH-CDR1、VH-CDR2以及VH-CDR3。在一个实施方式中，第一多肽链中和第三多肽链中特异结合CD20的重链可变区可以包含与SEQ ID NO：15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

第二多肽链和第三多肽链中特异结合CD20的轻链可变区可以包含SEQ ID NOs：10、11和12的VL-CDR1、VL-CDR2以及VL-CDR3。第三多肽链中特异结合CD20的轻链可变区，按Kabat编码系统/方法，可以包含选自83E、104-106LTA、83E/104-106LTA、100Q/104-106LTA、或83E/100Q/104-106LTA的氨基酸改造。在一个实施方式中，第三多肽链中特异结合CD20的轻链可变区可以包含与SEQ ID NO：16(X1＝V、X2＝G、X3＝L、X4＝T、X5＝A；X1＝E、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I；或X1＝E、X2＝Q、X3＝L、X4＝T、X5＝A)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。第二多肽链中特异结合CD20的轻链可变区可以包含野生型骨架，也可以包含本申请的选自83E、104-106LTA、83E/104-106LTA、100Q/104-106LTA、或83E/100Q/104-106LTA的氨基酸改造。在一个实施方式中，第二多肽链中特异结合CD20的轻链可变区可以包含未在第83、100、或104-106位做基因突变的天然κ轻链。在一个实施方式中，第二多肽链中特异结合CD20的轻链可变区可以包含与SEQ ID NO：16(X1＝V、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

第三多肽链中特异结合CD3ε的重链可变区可以包含SEQ ID NOs：1、2、和3的VH-CDR1、VH-CDR2以及VH-CDR3。在一个实施方式中，第三多肽链中特异结合CD3ε的重链可变区可以包含与SEQ ID NO：13具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

第四多肽链中特异结合CD3ε的轻链可变区可以包含SEQ ID NOs：4、5、和6的VL-CDR1、VL-CDR2以及VL-CDR3。第四多肽链中特异结合CD3ε的轻链可变区可以包含野生型骨架，也可以包含本申请的轻链可变区骨架。在一个实施方式中，第四多肽链中特异结合CD3ε的轻链可变区可以包含与SEQ ID NO：14具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

第一多肽链的重链恒定区可以为带有杵结构的重链恒定区，例如带有T366W突变的人IgG1重链恒定区或其片段。第一多肽链的重链恒定区可以为带有杵结构且弱结合或不结合FcR的重链恒定区，如具有SEQ ID NO：19(X1＝W、X2＝L、X3＝Y)的人IgG1重链恒定区。第三多肽链的重链恒定区可以为带有臼结构的重链恒定区，例如带有T366S/L368A/Y407V突变的人IgG1重链恒定区或其片段。第三多肽链的重链恒定区可以为带有臼结构且弱结合或不结合FcR的重链恒定区，如具有SEQ ID NO：19(X1＝S、X2＝A、X3＝V)的人IgG1重链恒定区。

或者，第一多肽链的重链恒定区可以为带有臼结构的重链恒定区，例如带有T366S/L368A/Y407V突变的人IgG1重链恒定区或其片段。第一多肽链的重链恒定区可以为带有臼结构且弱结合或不结合FcR的重链恒定区，如具有SEQ ID NO：19(X1＝S、X2＝A、X3＝V)的人IgG1重链恒定区。第三多肽链的重链恒定区可以为带有杵结构的重链恒定区，例如带有T366W突变的人IgG1重链恒定区或其片段。第三多肽链的重链恒定区可以为带有杵结构且弱结合或不结合FcR的重链恒定区，如具有SEQ ID NO：19(X1＝W、X2＝L、X3＝Y)的人IgG1重链恒定区。

第三多肽链中特异结合CD20的重链可变区可以经接头与特异结合CD20的抗体轻链可变区连接。在一个实施方式中，接头可以是约15-30氨基酸长度的肽。在一个实施方式中，该接头可以是GS接头，例如包含SEQ ID NOs：27、28或29的氨基酸序列的GS接头。

在第三多肽链中，特异结合CD20的轻链可变区或特异结合CD20的重链可变区可以经接头与特异结合CD3ε的重链可变区或重链恒定区连接。在一个实施方式中，接头可以是约15-30氨基酸长度的肽。在一个实施方式中，该接头可以是GS接头，例如包含SEQ ID NOs：27、28或29的氨基酸序列的GS接头。

第一多肽链可以从N端到C端包含特异结合CD20的重链可变区和重链恒定区。

第三多肽链可以从N端到C端包含特异结合CD20的重链可变区、特异结合CD20的轻链可变区、特异结合CD3ε的重链可变区、和重链恒定区；特异结合CD20的轻链可变区、特异结合CD20的重链可变区、特异结合CD3ε的重链可变区、和重链恒定区；特异结合CD3ε的重链可变区、重链恒定区、特异结合CD20的重链可变区、和特异结合CD20的轻链可变区；或特异结合CD3ε的重链可变区、重链恒定区、特异结合CD20的轻链可变区、和特异结合CD20的重链可变区。

第二多肽链还可以在C端包含轻链恒定区，如SEQ ID NO：18所示的轻链恒定区。

第四多肽链还可以在C端包含轻链恒定区，如SEQ ID NO：17所示的轻链恒定区。

在一个实施方式中，第一多肽链可以从N端至C端含有特异结合CD20的重链可变区、和重链恒定区，该重链恒定区可以为带臼结构的重链恒定区；第二多肽链可以从N端到C端包含特异结合CD20的轻链可变区、和轻链恒定区；第三多肽链可以从N端至C端含有特异结合CD20的重链可变区、接头、特异结合CD20的轻链可变区、接头、特异结合CD3ε的重链可变区、和重链恒定区，该重链恒定区可以为带杵的重链恒定区；第四多肽链可以从N端到C端包含特异结合CD3ε的轻链可变区、和轻链恒定区。在一个实施方式中，第一、第二、第三和第四多肽链分别包含SEQ ID NOs：21、23、20(X1＝E、X2＝Q、X3＝L、X4＝T、X5＝A；X1＝V、X2＝G、X3＝L、X4＝T、X5＝A；X1＝E、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I)(即，按Kabat编码系统/方法，包含83E/100Q/104-106LTA、83E、或104-106LTA)、和22的氨基酸序列。

本申请的靶向CD3和CD20的双特异抗体，在另一实施方式中，可以包含：

i)第一多肽链，含有特异结合CD20的重链可变区、和重链恒定区；

ii)第二多肽链，含有特异结合CD20的轻链可变区；

iii)第三多肽链，含有特异结合CD3ε的重链可变区、和重链恒定区；以及

iv)第四多肽链，含有特异结合CD20的重链可变区、特异结合CD20的轻链可变区、和特异结合CD3ε的轻链可变区，

其中第一多肽链中特异结合CD20的重链可变区和第二多肽链中特异结合CD20的轻链可变区结合形成能够特异地结合CD20的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合CD3ε的重链可变区与第四多肽链中特异结合CD3ε的轻链可变区结合形成能够特异地结合CD3的抗原结合片段，第四多肽链中特异结合CD20的重链可变区和特异结合CD20的轻链可变区形成能够特异结合CD20的抗原结合片段，且第一多肽链的重链恒定区与第三多肽链的重链恒定区通过例如杵-臼、共价或二硫键等作用结合在一起。

第一、第二、第三、和第四多肽链中的各元素定义如上。其中，第四多肽链中特异结合CD20的轻链可变区具有本申请的选自83E、104-106LTA、83E/104-106LTA、100Q/104-106LTA、或83E/100Q/104-106LTA的氨基酸改造。

在一个实施方式中，第一多肽链从N端至C端含有特异结合CD20的重链可变区、和重链恒定区。第三多肽链从N端至C端含有特异结合CD3ε的重链可变区、和重链恒定区。第四多肽链从N端到C端包含特异结合CD20的重链可变区、特异结合CD20的轻链可变区、和特异结合CD3ε的轻链可变区；特异结合CD20的轻链可变区、特异结合CD20的重链可变区、和特异结合CD3ε的轻链可变区；特异结合CD3ε的轻链可变区、特异结合CD20的轻链可变区、和特异结合CD20的重链可变区；或者特异结合CD3ε的轻链可变区、特异结合CD20的重链可变区、和特异结合CD20的轻链可变区。

该双特异抗体还可以含有在特异结合CD20的轻链可变区的C端的轻链恒定区、和/或在特异结合CD3ε的轻链可变区的C端的轻链恒定区。

在第三个方面，本申请提供编码本申请的抗体或抗原结合片段的核酸分子，以及包含该核酸分子的表达载体以及包含或在其基因组中整合有该核酸分子或表达载体的宿主细胞。本申请还提供使用含有上述宿主细胞来制备本申请的抗体或抗原结合片段的方法，包括：(i)在宿主细胞中表达该抗体或抗原结合片段，以及(ii)从宿主细胞或其培养物中该抗体或抗原结合片段。

在第四个方面，本申请提供药物组合物，其包含本申请的抗体或抗原结合片段的核酸分子、本申请的编码核酸分子、本申请的表达载体、或本申请的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。

在第五个方面，提供一种用于产生抗体或抗原结合片段，例如scFv或含有scFv的抗体，的方法，包括将抗体的VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3克隆到本申请的具有选自83E、104-106LTA、83E/104-106LTA、100Q/104-106LTA、或83E/100Q/104-106LTA突变的轻链可变区的骨架区编码序列中，以及重组表达抗体或其抗原结合片段。具体地，将抗体的VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3克隆到轻链可变区骨架编码序列中，其中按Kabat编码系统/方法，轻链可变区的第104位表达为亮氨酸(L)，第105位表达为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)，第106位表达为丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、或苏氨酸(T)，任选地，按Kabat编码系统/方法，第100位表达为谷氨酰胺(Q)，且任选地，第83位表达为谷氨酸(E)。在一些实施方式中，按Kabat编码系统/方法，第105位表达为苏氨酸(T)。在一些实施方式中，按Kabat编码系统/方法，第106位表达为丙氨酸(A)。在一个实施方式中，该方法包括：i)在包含编码轻链的核酸序列的核酸构建体，特别是重组载体中，按Kabat编码系统/方法，将编码第104位的核苷酸替换为编码亮氨酸(L)的核苷酸，将编码第105位的核苷酸替换为编码丝氨酸(S)或苏氨酸(T)的核苷酸，将编码第106位的核苷酸替换为编码丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、或苏氨酸(T)的核苷酸，任选地，将第100位的核苷酸替换为编码谷氨酰胺(Q)的核苷酸，以及任选地，将第83位的核苷酸替换为编码谷氨酸(E)的核苷酸；ii)任选地将抗体的VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3克隆到上述核酸构建体中，以及iii)使核酸构建体在合适的条件下表达抗体或抗原结合片段。在一个实施方式中，该方法包括：i)在包含编码轻链的核酸序列的核酸构建体，特别是重组载体中，将编码第四骨架区的核苷酸替换为编码SEQ ID NO：33(X＝G或Q)的核苷酸，任选地将编码第三骨架区的核苷酸替换为编码SEQ ID NO：32(X＝E)的核苷酸，以及任选地将编码第一和第二骨架区的核苷酸替换为编码SEQ ID NOs：36和37的核苷酸；或者，将编码第四骨架区的核苷酸替换为编码SEQ ID NO：35的核苷酸，任选地将编码第三骨架区的核苷酸替换为编码SEQ ID NO：34(X＝E)的核苷酸，以及任选地将编码第一和第二骨架区的核苷酸替换为编码SEQ ID NO：38和39的核苷酸；ii)任选地将抗体的VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3克隆到上述核酸构建体中，以及iii)使核酸构建体在合适的条件下表达抗体或抗原结合片段。当核酸构建体中已含有轻链可变区CDR时，步骤ii)可省略。在一个实施方式中，该方法包括：i)在包含编码SEQ ID NO：16(X1＝V、X2＝G、X3＝L、X4＝T、X5＝A；X1＝E、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I；X1＝E、X2＝Q、X3＝L、X4＝T、X5＝A)或24(X1＝E、X2＝T、X3＝A)的核酸序列的核酸构建体，特别是重组载体中，用编码抗体VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3的核苷酸替换其中编码CDR区的核苷酸，以及ii)使核酸构建体在合适的条件下表达抗体或抗原结合片段。任选地，可以在第一、第二、和第三骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。任选地，可以在第一、和第二骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。抗体轻链可变区还可以基于轻链可变区序列经由Chothia、IMGT、AbM或Contact等编码系统/方法确定，只要其确定的83、100、104-106位氨基酸与Kabat确定的一致即可。

在第六个方面，本申请提供本申请的CD3/CD20双特异性抗体在受试者中治疗或减缓B细胞相关疾病的用途。在一些实施方式中，B细胞相关疾病为B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、或B细胞介导的自免疫疾病。在一些实施方式中，B细胞淋巴瘤和B细胞白血病包括但不限于，非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一个实施方式中，在双特异性分子施用前，向受试者施用CD20抗体。

在抗体或抗原结合片段中，尤其是缺乏恒定区的抗体或抗原结合片段中，按照本申请对轻链可变区骨架进行改造，如按照Kabat编码系统/方法，使得κ轻链可变区改造成包含83E、104-106LTA、83E/104-106LTA、100Q/104-106LTA、或83E/100Q/104-106LTA突变，可使得抗体的聚集性显著下降，稳定性(包括热稳定性)提高，重组表达量提高1-3倍，如1倍、1.5倍、1.9倍、2.5倍、2.9倍、3倍等。尤其值得一提的是，本申请中轻链可变区骨架的改造，不会影响抗体或抗原结合片段的抗原结合活性/亲和力。

在本申请中引用或提及的所有文件(包括但不限于本文引用的所有文献、专利、公开的专利申请)(“本申请引用文件”)，在本申请引用文件中引用或提及的所有文件，以及本申请或任意本申请引用文件中提及的任何产品的制造商手册、说明书、产品规格和产品页，均通过引用的方式并入本申请，且可能在实施本发明时采用。更具体而言，所有参考文件均通过引用的方式并入本申请，如同各文件通过引用的方式并入。在本文中提及的任何Genbank序列通过引用的方式并入本申请。

应当注意的是，在本申请中，特别是在权利要求中，术语例如“包含”、“包括”等可以具有中国专利法所赋予的意义；而术语例如“基本由……组成”具有中国专利法所赋予的意义，例如允许没有明确表述的元素的存在，但将现有技术中存在的元素、或影响本发明的基本或新的特性的元素排除在外。

基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明晰，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本申请中引用的所有文献、Genbank记录、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。

附图说明

以下以示例方式给出但不意在将本发明限制于所述具体实施方式的具体描述，可以结合附图更好地进行理解。

图1为同一抗体的Fab(A)与scFv(B)构型，以及两者在pymol软件中重叠后的显示图(C)。

图2为CD3/CD20双特异性抗体的构型示意图(A)，以及TIGIT/VEGF双特异性抗体的构型示意图(B)。

图3为示出CD3/CD20双特异性抗体MBS303及MBS303m对CD3阳性Jurkat细胞(A)的结合活性，以及对CD20阳性Raji细胞(B)的结合活性。

图4示出了TIGIT/BEGF双特异性抗体MBS310及MBS310m对HEK293A/人TIGIT(C)的结合活性，以及对人VEGFA(D)的结合活性。

具体实施方式

为更好理解本申请，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

本文中的术语“抗体”意在包括IgG、IgA、IgD、IgE和IgM全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合片段)、以及双特异性或多特异性抗体。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区(CH)构成。重链恒定区一般由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区(CL)构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的骨架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。本申请的抗体恒定区被设计成具有弱结合或不结合免疫系统细胞和补体系统蛋白。

术语“双特异性”或“双特异”分子是指特异性结合两个靶分子、或同一靶分子上两个不同表位的分子，如双特异性抗体。双特异性分子包括本申请中特异结合CD3和CD20、或特异结合TIGIT和VEGF的双特异性分子。相对而言，“单特异性”分子是指特异结合某一个靶分子，尤其是某一个靶分子上一个表位的分子。

本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，TIGIT蛋白)能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区，以及(viii)单链Fc(scFv)，由接头连接的VL和VH构成，其中VL和VH区配对形成单价分子(参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。

术语“FcR”是指在一些细胞表面表达的可以结合免疫球蛋白Fc的分子，分为两类。一类存在于效应细胞，如B淋巴细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞等的表面，引发对靶细胞的吞噬和毒性等，在免疫系统中发挥重要作用，包括Fcα受体、Fcε受体、和Fcγ受体，其中Fcγ受体属于免疫球蛋白超家族，是引发对微生物的吞噬作用的最重要的FcR，包括FcγRI(FcgRIa，CD64)、FcγRIIA(FcgRIIa，CD32A)、FcγRIIB(FcgRIIa，CD32B)、和FcγRIIIA(FcgRIIIa，CD16A)等。另一类是多聚Ig受体和新生IgG转运受体(FcRn)。FcRn主要在内皮细胞中表达，其蛋白结构和MHC-I分子类似，可以和IgG的Fc部分结合，阻止IgG分子被溶酶体裂解，可以起到增长IgG体内半衰期的作用，参与到IgG的体内转运、维持和分布代谢过程中。

术语“特异地识别”、或“特异地结合”靶标例如人CD3，是指一种结合分子如抗体或抗原结合片段能够区分这种靶生物分子与一种或多种参照分子，且与靶生物分子的结合亲和力或结合活性比其他参照分子高出例如1倍、5倍、10倍等。特异性测定方法包括但不限于蛋白质印迹法、ELISA、RIA、ECL、IRMA测试以及肽扫描。

本文中提到的“同一性”或“序列同一性”是指在进行序列比对后，一条序列中与参照序列中核苷酸/氨基酸残基相同的核苷酸/氨基酸百分比，如果需要的话，在序列对比中引入空格来达到两条序列间最大的序列一致性百分比。本领域技术人员可以通过多种方法，例如使用计算机软件，来进行两两序列对比或多序列比对，以确定两条或多条核酸或氨基酸序列之间的序列一致性百分比，此类计算机软件为例如ClustalOmega、T-coffee、Kalign和MAFFT等。

术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。

术语“CD3”是指分化簇3，包含γ链、δ链、ε链和ζ链等。术语“CD3 ε”是指CD3的ε链。该术语包括变体、同源物、直向同源物和平行同源物。例如，对人CD3(例如CD3 ε)特异的抗体可以在某些情况下与另一物种例如猴的CD3(例如CD3 ε)蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人CD3(例如CD3 ε)蛋白特异的抗体可以完全地对人CD3(例如CD3 ε)蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的CD3(例如CD3 ε)蛋白交叉反应。术语“人CD3 ε”是指具有人氨基酸序列的CD3 ε蛋白，例如具有NCBI参考号为NP_000724.1的氨基酸序列的CD3 ε蛋白(Wipa P et al.，(2020)Immunology159(3)：298-308)。

术语“CD20”是指表达在各阶段B细胞(除干细胞和浆细胞外)表面的分子标记物。“人CD20”是指具有人氨基酸序列的CD20蛋白。

本申请中与CD3抗体相关的术语“交联”是指由抗体的Fc区结合免疫细胞上的FcR而引起的抗体聚集或相互作用，或者由双特异性抗体上靶向疾病相关抗原的部分结合疾病相关抗原而引起的抗体聚集或相互作用。在体外实验中，可以通过抗体Fc结合二抗而形成抗体交联。本申请的CD3/CD20抗体仅有在交联状态下才具有T细胞激活活性。靶向CD3的抗体可能会因为其组成部分如scFv的构型不稳定，而造成分子间的聚集，从而处于交联状态。

本申请的多个方面在以下更加具体地加以描述。

抗体轻链可变区骨架的改造

若抗体的结构不稳定，可能形成分子间的相互作用，进而引起分子聚集。这种聚集现象会造成抗体的重组表达量低、存储稳定性差、免疫原性升高，在治疗应用中出现脱靶现象等。

缺乏恒定区的抗原结合片段，如scFv等，容易出现结构不稳定的现象。比如，因恒定区的缺失，VH和VL中的一些疏水性氨基酸残基可能会暴露在表面，对VH和VL相互作用形成的构型造成一定的破坏作用；VH和VL中的一些可糖基化氨基酸残基也可能暴露在表面，而糖基化会破坏抗体的结构稳定性，还会降低抗体的抗原结合活性等。此外，由于恒定区的缺乏，抗体表面的电荷分布也可能会处于不平衡的状态，也对构型稳定造成一定的不利影响。

本申请的发明人发现，在轻链可变区第三和第四骨架区，特别是第四骨架区，存在一些疏水性氨基酸残基，在缺乏恒定区结构的情况下，这些氨基酸残基暴露在表面，可能会导致VH-VL形成的抗原结合域构型不稳定。通过将这些疏水性氨基酸残基替换为疏水性弱、或亲水性的氨基酸残基，可改善VH-VL构型的稳定性，降低scFv的聚集倾向，提升其表达量和存储稳定性。此外，本申请的发明还发现，可以对轻链(如κ链)的VL第三骨架区和第四骨架区，尤其是第四骨架区，的一些氨基酸残基进行替换，以改善整体电荷分布，进一步提升VH-VL抗原结合域的结构稳定性。

氨基酸的亲疏水性主要由其侧链基团决定，亲水基团占的体积多，亲水性就强，反之，疏水基团占的体积多，则疏水性强。亲水的基团包括羧基、磺酸基、硫酸基、磷酸基、氨基、季铵基、含氧基团、醚基、羟基等，其余的基本是疏水基团。疏水性氨基酸一般存在于蛋白的内部，由于其疏水的相互作用，在保持蛋白三级结构上起重要的作用(参见疏水结合)。另外，疏水性氨基酸残基对抗体和抗原之间的相互作用也具有重要作用，例如在抗体的与抗原结合的部位上有很多疏水性氨基酸，它参与与半抗原的结合。疏水性的氨基酸包括(按疏水性高低排列)：异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸。亲水不带电荷的氨基酸包括苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸；亲水带正电的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、和组氨酸；亲水带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

具体地，本申请提供一种scFv，其包含重链可变区、接头和轻链可变区。轻链可变区可以包含第一骨架区、第二骨架区、第三骨架区、和第四骨架区，其中，按Kabat编码系统/方法，在改造(氨基酸突变)后，第104位可以为亮氨酸(L)，第105位可以为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)，优选为苏氨酸(T)，第106位可以为丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、或苏氨酸(T)，优选为丙氨酸(A)。此外，按Kabat编码系统/方法，在改造(氨基酸突变)后，第100位可以为谷氨酰胺(Q)，和/或第83位可以为谷氨酸(E)。在一个实施方式中，按Kabat编码系统/方法，在改造(氨基酸突变)后，轻链可变区的第83位可以为谷氨酸(E)。

本申请轻链可变区骨架中的第一骨架区、第二骨架区、第三骨架区和第四骨架区还可以基于轻链可变区序列经由Chothia、IMGT、AbM或Contact等编码系统/方法确定，只要其确定的83、100、104-106位氨基酸与Kabat确定的一致即可。

本申请的scfv的轻链可变区骨架为天然κ链(例如人κ链)的可变区骨架，或经改造天然κ链(例如人κ链)而得到的可变区骨架。κ链可以为FW1.4gen、375-FW1.4opt、435-FW1.4opt、509-FW1.4opt、511-FW1.4opt、534-FW1.4opt、567-FW1.4opt、578-FW1.4opt、1-FW1.4opt、8-FW1.4opt、15-FW1.4opt、19-FW1.4opt、34-FW1.4opt、35-FW1.4opt、42-FW1.4opt、43-FW1.4opt、或与上述κ链或上述κ链的第一、第二、第三、和/或第四骨架区具有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变的轻链。按照Kabat编号系统/方法，使κ链可变区的第104-106位分别为亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、和丙氨酸(A)。进一步的，按照Kabat编号系统/方法，使第100和104-106位分别包含谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、和丙氨酸(A)；使第83位和第104-106位分别包含谷氨酸(E)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、和丙氨酸(A)；使第83位和包含谷氨酸(E)；或者使第83位和第100和104-106位分别包含谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、和丙氨酸(A)。

κ链是根据序列同一性和同源性分组的抗体轻链序列家族之一。用于确定序列同源性的方法例如通过使用同源性检索矩阵诸如BLOSUM(Henikoff，S.&Henikoff，J.G.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919)，且用于根据同源性对序列进行分组的方法对于本领域普通技术人员而言是熟知的。κ链可以鉴别不同的亚家族(参见，例如，Knappik et al.，(2000)J.Mol.Biol.29657-29686，其将κ链分组为Vκ1至Vκ4，并将λ链分组为Vλ1至Vλ3)。

在一个实施方式中，轻链可变区骨架得自κ链，例如人κ链，例如Vκ1、Vκ2、Vκ3以及Vκ4，特别Vκ1。

经稳定性改造(例如氨基酸突变)后，按照Kabat编号系统/方法，本申请scFv的轻链可变区骨架可以包含选自83E、100Q、104L、105T、106A、及其组合的氨基酸取代。在一个实施方式中，按照Kabat编号系统/方法，本申请的轻链可变区骨架可以包含83E、104-106LTA、83E/104-106LTA、100Q/104-106LTA、或83E/100Q/104-106LTA突变。如果改造前的κ轻链可变区已经在上述这些位点中的一个或多个包含所需的氨基酸残基，则可以仅对剩余的其他位点进行改造，如氨基酸突变。即，只要上述氨基酸位点在改造后具有所需的氨基酸残基即可。

经改造后，scFv的轻链可变区骨架可以包含SEQ ID NOs：33(X＝G)或35所示的第四骨架区。本申请的轻链可变区骨架可以包含SEQ ID NOs：32(X＝E)或34(X＝E)所示的第三骨架区、和/或SEQ ID NOs：33(X＝G或Q)或35所示的第四骨架区。在一个实施方式中，经改造后，轻链可变区可以包含第一骨架区、第二骨架区、第三骨架区、和SEQ ID NO：33(X＝G或Q)所示的第四骨架区。在一个实施方式中，轻链可变区可以包含第一骨架区、第二骨架区、SEQ ID NO：32(X＝E)所示的第三骨架区、和SEQ ID NO：33(X＝G或Q)所示的第四骨架区。在一个实施方式中，轻链可变区可以包含第一骨架区、第二骨架区、第三骨架区、和SEQID NO：35所示的第四骨架区。在一个实施方式中，轻链可变区可以包含第一骨架区、第二骨架区、包含SEQ ID NO：34(X＝E)所示的第三骨架区、和SEQ ID NO：35所示的第四骨架区。任选地，可以在第一、第二、和第三骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。任选地，可以在第一、和第二骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。

本申请scFv的轻链可变区可以包含SEQ ID NOs：16(X1＝V、X2＝G、X3＝L、X4＝T、X5＝A；X1＝E、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I；X1＝E、X2＝Q、X3＝L、X4＝T、X5＝A)或24(X1＝E、X2＝T、X3＝A)中的第四骨架区、或第一至第四骨架区。本申请的轻链可变区骨架可以包含SEQ ID NOs：16(X1＝V、X2＝G、X3＝L、X4＝T、X5＝A；X1＝E、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I；X1＝E、X2＝Q、X3＝L、X4＝T、X5＝A)或24(X1＝E、X2＝T、X3＝A)中的第三和第四骨架区、或全部第一至第四骨架区。任选地，可以在第一、第二、和第三骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。任选地，可以在第一、和第二骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。

本申请scFv的轻链可变区可以包含SEQ ID NOs：36、37、32(X＝V或E)、和33(X＝G或Q)所示的第一、第二、第三、和第四骨架区。任选地，可以在第一、第二、和第三骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。任选地，可以在第一、和第二骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。

本申请scFv的轻链可变区可以包含SEQ ID NOs：38、39、34(X＝F或E)、和35所示的第一、第二、第三、和第四骨架区。任选地，可以在第一、第二、和第三骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。任选地，可以在第一、和第二骨架区含有一个或多个(例如1-5个)氨基酸突变。

上述氨基酸突变优选为保守的氨基酸突变，即该突变不会显著影响或改变抗体的物理/化学特性，特别是结合特性。这样的保守突变包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请的轻链可变区骨架中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本申请骨架区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换，且得到的骨架区可以装配到抗体和抗原结合片段中，并使用本文所述的功能检测对这些抗体或抗原结合片段进行功能(例如抗原结合能力、稳定性、聚合倾向等)测试。

对于本申请scFv的轻链可变区骨架，还可以对其进行其他方面的改造，以进一步改善scFv等的稳定性。例如，可以选择合适的接头。VH和VL之间的接头的长度也可能影响scFv的稳定性，过短的接头会限制链内VH和VL的相互作用面的形成，过长的接头影响蛋白表达和限制整体刚性。此外，可以在VH-VL互作面上引入二硫键，以增加VH-VL界面上的相互作用，这对于将scFv更好地处于封闭状态，从而抑制多聚物的形成。

具有改造轻链可变区骨架的抗体或抗原结合片段的制备

本申请提供一种用于制备抗体或抗原结合片段的方法，包括将抗体的VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3克隆到本申请的轻链可变区骨架区编码序列中。

当需要进行抗体的人源化时，可以将轻链可变区骨架改造融入CDR植入过程中。具体地，可以先从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献中获得合适的骨架序列。例如，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Vbase人种系序列数据库(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及Kabat et al.，(1991)，同上；Tomlinson et al.，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24：827-836中获得。作为另一实施方式，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中得到。例如，下列HCo7 HuMAb小鼠中的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109，NT--024637&BC070333)、3-33(NG--0010109&NT--024637)和3-7(NG--0010109&NT--024637)。作为另一例子，以下来自Hco12 HuMAb小鼠的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109，NT--024637&BC070333)、5-51(NG--0010109&NT--024637)、4-34(NG--0010109&NT--024637)、3-30.3(CAJ556644)和3-23(AJ406678)。可以通过使用本领域公知的称为空格(gap)BLAST的序列相似性搜索方法之一(Altschul et al.，(1997))，将蛋白序列与蛋白序列数据库进行比较，选出结构上与原始抗体的骨架序列相似的那些。将重链CDR1、CDR2、和CDR3序列植入到与得到该骨架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的骨架区中，或者将重链CDR序列植入到包含有与种系序列相比具有一个或多个突变的骨架区中。例如，在一些情况下，将骨架区中的残基进行突变是有益的，以保持或增强抗体的抗原结合性(参见例如U.S.Pat.Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。对于轻链的CDR植入，可以经由本领域技术人员所知的方法，在包含编码所选轻链的核酸序列的核酸构建体，特别是重组载体中，按Kabat编码系统/方法，将编码第104位的核苷酸替换为编码亮氨酸(L)的核苷酸，将编码第105位的核苷酸替换为编码丝氨酸(S)或苏氨酸(T)的核苷酸，将编码第106位的核苷酸替换为编码丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、或苏氨酸(T)的核苷酸，任选地，将第100位的核苷酸替换为编码谷氨酰胺(Q)的核苷酸，以及任选地，将第83位的核苷酸替换为编码谷氨酸(E)的核苷酸，然后将VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3克隆到上述核酸构建体中，使核酸构建体在合适的条件下表达抗体或抗原结合片段。或者，可以在包含编码轻链的核酸序列的核酸构建体，特别是重组载体中，将编码第四骨架区的核苷酸替换为编码SEQ ID NO：33(X＝G或Q)的核苷酸，任选地将编码第三骨架区的核苷酸替换为编码SEQID NO：32(X＝E)的核苷酸，以及任选地将编码第一和第二骨架区的核苷酸替换为编码SEQID NOs：36和37的核苷酸；或者，将编码第四骨架区的核苷酸替换为编码SEQ ID NO：35的核苷酸，任选地将编码第三骨架区的核苷酸替换为编码SEQ ID NO：34(X＝E)的核苷酸，以及任选地将编码第一和第二骨架区的核苷酸替换为编码SEQ ID NO：38和39的核苷酸，然后将VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3克隆到上述核酸构建体中，使核酸构建体在合适的条件下表达抗体或抗原结合片段。

如果选用天然抗体进行例如scFv的构建，而无需CDR植入时，则可以直接对轻链可变区骨架进行改造。即，只需要在轻链表达载体中对第三、或第三与第四骨架区关键氨基酸的编码核酸进行替换即可。

在重组构建的过程中，按照Kabat系统/方法，如果原始的轻链可变区已经在本文所述的几个关键氨基酸改造位点具有所需的氨基酸残基，则只需对剩余其他几个氨基酸位点进行改造。

双特异性抗体

本申请还提供靶向CD3和CD20的双特异性抗体，其中全部或部分的抗原结合域包含本申请的轻链可变区骨架。

该双特异抗体可以包含1个特异结合CD3的Fv或Fab、1个特异结合CD20的Fv或Fab、和1个特异结合CD20的scFv。特异结合CD20的scFv可以包含本申请的经改造的轻链可变区骨架。

本申请的CD20×CD3双特异抗体可以为IgG样抗体。IgG样抗体是指在IgG抗体基础上略作修饰的抗体，例如在IgG抗体的重链和/或轻链的N端或C端连接肽链如scFv而得到的抗体。在一个实施方式中，该双特异抗体包含特异结合CD3的IgG半抗体、特异结合CD20的IgG半抗体、以及与特异结合CD3的IgG半抗体的重链可变区或轻链可变区的N端或C端连接的特异结合CD20的scFv。

在一个实施方式中，该双特异抗体可以包含：

i)第一多肽链，含有特异结合CD20的重链可变区、和重链恒定区；

ii)第二多肽链，含有特异结合CD20的轻链可变区；

iii)第三多肽链，含有特异结合CD20的重链可变区、特异结合CD20的轻链可变区、特异结合CD3ε的重链可变区、和重链恒定区；以及

iv)第四多肽链，含有特异结合CD3ε的轻链可变区，

其中第一多肽链中特异结合CD20的重链可变区和第二多肽链中特异结合CD20的轻链可变区结合形成能够特异地结合CD20的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合CD20的重链可变区和特异结合CD20的轻链可变区形成能够特异结合CD20的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合CD3ε的重链可变区与第四多肽链中特异结合CD3ε的轻链可变区结合形成能够特异地结合CD3ε的抗原结合片段，且第一多肽链的重链恒定区与第三多肽链的重链恒定区通过例如杵-臼、共价或二硫键等作用结合在一起。

在另一实施方式中，双特异抗体可以包含：

i)第一多肽链，含有特异结合CD20的重链可变区、和重链恒定区；

ii)第二多肽链，含有特异结合CD20的轻链可变区；

iii)第三多肽链，含有特异结合CD3ε的重链可变区、和重链恒定区；以及

iv)第四多肽链，含有特异结合CD20的重链可变区、特异结合CD20的轻链可变区、和特异结合CD3ε的轻链可变区，

其中第一多肽链中特异结合CD20的重链可变区和第二多肽链中特异结合CD20的轻链可变区结合形成能够特异地结合CD20的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合CD3ε的重链可变区与第四多肽链中特异结合CD3ε的轻链可变区结合形成能够特异地结合CD3ε的抗原结合片段，第四多肽链中特异结合CD20的重链可变区和特异结合CD20的轻链可变区形成能够特异结合CD20的抗原结合片段，且第一多肽链的重链恒定区与第三多肽链的重链恒定区通过例如杵-臼、共价或二硫键等作用结合在一起。

在双特异抗体中，特异结合CD20的重链可变区可以经接头与特异结合CD20的轻链可变区连接。特异结合CD20的重链可变区或特异结合CD20的轻链可变区可以经接头与特异结合CD3的抗体或抗原结合片段连接。

接头可以由肽键连接的氨基酸构成，优选肽键连接的5-30个氨基酸，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。这些氨基酸中的一种或多种可以糖基化，如本领域技术人员所了解的。在一个实施方式中，15-30个氨基酸可以选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和赖氨酸。在一个实施方式中，接头由大部分有空键位阻的氨基酸构成，例如甘氨酸和丙氨酸。示例性的接头为多聚甘氨酸，特别是多聚(Gly-Ala)、以及多聚丙氨酸。本申请中的示例性接头可以如SEQ ID NOs：27、28或29所示。

接头也可以是非肽类接头。例如，可以使用烷基接头，例如-NH-、-(CH₂)s-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基接头还可以经任何非空间位阻基团例如低级烷基(例如C_1-6低级酰基)、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH₂、苯基等进行取代。

本申请的双特异性分子包含与本申请分子存在一个或多个保守修饰的重链和/或轻链可变区序列或CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失。参见，例如，Brummell et al.，(1993)Biochem 32：1180-8；de Wildt et al.，(1997)Prot.Eng.10：835-41；Komissarov et al.，(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870；Hall et al.，(1992)J.Immunol.149：1605-12；Kelley and O′Connell(1993)Biochem.32：6862-35；Adib-Conquy et al.，(1998)Int.Immunol.10：341-6and Beers et al.，(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43。

本文所用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变双特异性分子结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请双特异性分子中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。

基因修饰的双特异性分子

本申请双特异性分子中用到的抗体或其抗原结合部分可以以具备本申请双特异性分子的一个或多个VH/VL序列的抗体作为起始材料，制备成基因修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)内(例如，在一个或多个CDR区和/或一个或多个骨架区)的一个或多个残基来进行基因修饰，以改善结合亲和力和/或增加与某些物种天然产生的抗体的相似性。例如，抗体可以通过修饰恒定区中的残基进行基因修饰，例如改变抗体的效应功能。

另一类的可变区修饰是将VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入本领域所知的保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常改变CDR区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个的残基。

本申请的基因改造抗体包括在VH和/或VL的骨架残基中做出基因修饰以例如改变抗体特性的那些。通常而言，这些骨架修饰用来降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个骨架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可能包含不同于得到抗体的种系序列的骨架残基。这些残基可以通过将抗体骨架序列与得到抗体的种系序列相比较而识别出来。

另一类的骨架修饰包括对骨架区的、或者甚至一个或多个CDR区的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而减少抗体的可能导致的免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。

此外，作为骨架或CDR区内修饰之外的另一种选择，本申请的双特异性分子可以基因改造成在Fc区包括基因修饰，通常来改变双特异性分子的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，本申请的双特异性分子可以进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学功能基团)，或者修饰成改变其糖基化，来改变双特异性分子的一个或多个功能特性。

在一个实施方式中，CH1的铰链区进行修饰，改变，例如增加或减少铰链区的半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中进一步描述。改变C_H1铰链区的半胱氨酸残基，来例如促进重链轻链的组装或增加/降低抗体的稳定性。

在另一个实施方式中，对双特异性分子的Fc铰链区进行突变，以降低双特异性分子的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的C_H2-C_H3连接区，从而抗体相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合而言，具有减弱的SpA结合力。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。

在另一实施方式中，修饰双特异性分子的糖基化。例如，可以制备去糖基化的双特异性分子(即，双特异性分子缺少糖基化)。可以改变糖基化，来例如增加双特异性分子对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变双特异性分子序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以做出一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区骨架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。

本文双特异性分子的另一修饰是聚乙二醇化(PEG化)。双特异性分子可以PEG化，例如来增加生物(例如，血清)半衰期。为使双特异性分子PEG化，双特异性分子通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛类衍生物，在使一个或多个PEG基团附于双特异性分子的条件下反应。优选地，PEG化通过与反应性PEG分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”包括任何形式的用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C₁-C₁₀)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要PEG化的双特异性分子是去糖基化的双特异性分子。PEG化蛋白的方法在领域内已知，且可以应用到本申请的双特异性分子。参见，例如EPO 154316和EP 0401 384。

编码本申请的抗体或抗原结合片段的核酸分子

在另一方面，本申请提供编码本申请的抗体或抗原结合片段如scFv和双特异性分子或其片段的核酸分子。

核酸可以存在整细胞中，在细胞裂解液中，或处于部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来后，核酸是“分离的”或“基本纯的”。本申请的核酸可以为例如DNA或RNA，且可能包含或可能不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。

本申请的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。例如，编码CDR的DNA片段可以与骨架区(例如本申请的轻链可变区骨架)可操作地连接；编码VH和VL的DNA片段可以与编码重链恒定区和本申请轻链恒定区的DNA片段可操作地连接。术语“可操作地连接”是指两个DNA片段连接在一起，从而两个DNA片段编码的氨基酸序列都在阅读框内。

编码VH区的分离DNA可以通过可操作地连接VH编码DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是优选为IgG1恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH区的DNA可以可操作地与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子连接。

编码VL区的分离DNA可以通过可操作地连接VL编码DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子而转变成全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，其可以根据需要做出本申请所述的氨基酸改造，以提高scFv的稳定性，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。

为创建scFv基因，编码VH和VL的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头的另一片段连接，从而VH和VL序列可以作为连续的单链蛋白进行表达，其中VH和VL区域通过该柔性接头连接(参见，例如Bird et al.，(1988)Science242：423-426；Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCaffertyet al.，(1990)Nature 348：552-554)。

编码各多肽链的序列可以插入一个或多个表达载体，其中一个或多个表达载体与转录和翻译调控序列可操作地连接。表达载体可以转导或转染宿主细胞，从而表达各多肽链。

术语“调控序列”包括控制基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒的启动子和/或增强子，如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复(Takebe et al.，(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。表达载体和表达控制序列选为与所使用的表达宿主细胞相容。

表达载体可以编码促进双特异性分子多肽链从宿主细胞分泌的信号肽。多肽链基因可以克隆到载体中，从而信号肽在阅读框内连接到多肽链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。

本申请的表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因可用于选择已导入载体的宿主细胞(参见，例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞以药物抗性，例如G418、潮霉素、或氨甲喋呤抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。

表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多个形式的术语“转染”包括多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达抗体分子在理论上是可行的，优选抗体分子在真核细胞中表达，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且有免疫活性的抗体分子。

本申请可用的表达载体的例子包括但不限于质粒、病毒载体、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、可转化人工染色体(TAC)、哺乳动物人工染色体(MAC)和人工附加染色体(HAEC)。

优选的用于表达本申请双特异性分子的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起施用的dhfr-CHO细胞，在Urlaub and Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中有过描述，DHFR可选择标记物在例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别在使用NSO骨髓瘤细胞时，另一优选的表达系统是GS基因表达系统，记载于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841。

药物组合物

在另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含轻链可变区骨架经改造以改善稳定性的抗体或抗原结合片段、编码这些抗体或抗原结合片段的核酸分子、包含该核酸分子的表达载体、和/或包含该核酸分子的宿主细胞，与药学上可接受的载体配制在一起。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上的有效成分，例如另一抗肿瘤抗体。

药学组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适赋形剂的选择和使用在Gennaro，ed.，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中有教导。

药物组合物适合于经口、静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。基于施用途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其不受酸和可能使其失活的其他自然条件的影响。“肠道外施用”是指不同于肠道和局部外用的方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。或者，本申请的双特异性分子可以通过非肠道外路径施用，例如外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。优选地，本申请的药物组合物经口施用。

药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高浓度药物的有序结构中。

与载体材料一起制备成单剂型的有效成分的量将随着治疗主体和特定施用模式而变，且基本上而言是产生疗效的组合物的量。以百分比计，该量为约0.01-约99％的与药学上可接受载体结合的有效成分，优选为约0.1％-约70％，最预选为约1％-约30％的有效成分。

给药方案经调整提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀的剂量单位型配置肠道外组合物。剂量单位型是指物理上分开的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，本申请抗体或抗原结合片段可以以缓释剂施用，这种情况下所需的施用频率降低。

对于药物组合物的施用，具体可以由医学工作者，如医生，根据受试者的具体情况，如性别、年龄、既往病史等进行确定。

“治疗有效量”的本申请抗体或抗原结合片段，引起疾病症状严重程度的降低、或无症状期频率和持续时间的增加。例如，对于肿瘤患者，“治疗有效量”优选地，与对照受试者相比，将肿瘤减少至少约20％、更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，且更优选地至少约80％，甚至完全消除肿瘤。

药物组合物可以是缓释试剂，包括植入体、和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drag Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)。

在某些实施方式中，本申请的抗体或抗原结合片段以经配制，以确保合适的体内分布。例如，为确保本申请的双特异性分子穿越血脑屏障，双特异性分子可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685；Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038；Bloeman et al.，(1995)FEBSLett.357：140；M.Owais et al.，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoe et al.，(1995)Am.J.Physiol.1233：134；Schreier et al.，(1994)J.Biol.Chem.269：9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；和Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4：273。

本申请的用途和方法

本申请的轻链可变区骨架可以经改造，以用于构建scFv等缺乏恒定区的抗体或抗原结合片段，以改善其稳定性、降低聚集倾向、提高表达量、减少临床应用时的脱靶效应和免疫原性等。

轻链可变区骨架经本申请所述改造的抗体或抗原结合片段，例如本申请的CD3/CD20双特异性抗体，具有减少的聚集倾向。这样的CD3/CD20双特异性抗体可以减少非肿瘤特异性的T细胞激活，减少副作用，更好地可以用于肿瘤疾病的治疗和缓解。

本申请的CD3/CD20双特异性抗体可以用于治疗或减缓B细胞相关疾病的用途。在一些实施方式中，B细胞相关疾病为B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、或B细胞介导的自免疫疾病。在一些实施方式中，B细胞淋巴瘤和B细胞白血病包括但不限于，非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一个实施方式中，在双特异性分子施用前，向受试者施用CD20抗体。

本文讨论的治疗剂的组合可以作为在药学可接受载体中的单一组合物同时施用，或者作为分开的组合物同时施用，其中各药剂处于药学可接受载体中。在另一个实施方式中，治疗剂的组合可以按序施用。

此外，如果进行多次联合疗法施用，且药剂按序施用，则在各时间点的按序施用的次序可以反转或保持相同，按序施用可以与同时施用或其任何组合相结合。

本申请的各方面和实施方式将参照附图和以下实施例进行讨论。其他方面和实施方式对于本领域技术人员是清楚的。在本文中描述的所有文献通过引用的方式全部并入本文。尽管本申请已经结合示例性实施方式进行了描述，很多等同修改和变化在给出本申请时对于本领域技术人员是清楚的。因而，本申请的示例性实施方式是示例性的，非限制性的。可以对所述实施方式做出多种变化，而不脱离本申请的宗旨和范围。

实施例

实施例1.基于稳定性增强的scFv突变体结构的设计

通常来说，Fab抗体片段的结构稳定性要大于对应的scFv。

选取公知抗体的已分析出来的Fab和scfv对比结构图，例如ixekizumab抗体的Fab(PDB号6nov，图1A)和scFv(PDB号6NOU，图1B)结构，在软件pymol中，将两者重叠在一起(图1C)进行比对。从图1C可以看出，VH和VL的构型在scFv与Fab这二者中几乎没有差别，但是scFv中VL的C末端有疏水氨基酸的暴露，具体如图1B所示，可能导致整体结构稳定性变差，而Fab在该处的疏水面则被CL所掩蔽(图1A)。

为解决可能因VL的C末端结构而导致的scFv聚集倾向，以及由聚集体产生的免疫原性高、生产效率低、存在脱靶效应等的问题，本申请的发明人尝试在VL的C末端进行结构改造。

具体地，对上述scFv的VL(κ链)的C末端的结构进行分析，83位(编号系统Kabat)通常是一个暴露在外的疏水氨基酸残基，例如可能是苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、或异亮氨酸(I)，106位通常也是暴露在外的疏水残基，例如异亮氨酸(I)。83位和106位的残基通常与陷在内部的104位疏水氨基酸，即亮氨酸(L)或者缬氨酸(V)，存有一定的相互作用。在改造中，为降低疏水性，将83位的氨基酸替换成亲水的丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬氨酸(D)、或谷氨酸(E)，优选E；将106位的氨基酸替换成疏水性弱的丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、或苏氨酸(T)，优选A；105位的谷氨酸(E)暴露在scFv的表面，带负电，为了整体结构的电荷均一性考虑，将105位替换成不带电荷的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。表1示出设计的VL骨架区突变体。

表1.scfv中κ轻链的骨架区突变位点设计

	骨架区III	骨架区IV
			野生型骨架区	无突变	无突变
骨架区突变体1	无突变	104-106LTA
			骨架区突变体2	83E	无突变
骨架区突变体3	83E	104-106LTA
			骨架区突变体4	83E	100Q、104-106LTA

实施例2.基于野生型scFv和稳定性增强scFv突变体的双特异性抗体的构建、表 达、纯化和组装

将实施例1的VL骨架区设计应用于CD3/CD20双特异性抗体以及TIGIT/VEGF双特异性抗体的构建中，并进行稳定性验证。

CD3/CD20双特异性抗体和TIGIT/VEGF双特异性抗体的结构如图2所示。

其中，CD3/CD20双特异性抗体为不对称结构，含有一个CD20半抗体、和一个CD3半抗体，另有一个靶向CD20的scFv，其连接在CD3半抗体的重链N端。当scFv含有野生型VL骨架时，CD3/CD20双特异性抗体命名为MBS303，当scFv的VL骨架具有实施例1中所述改造时，双抗命名为MBS303m。以GS载体(具体信息见ZL200510064335.0)为表达载体，构建CD3×CD20双特异性抗体中的CD20半抗体MIL220(用于MBS303和MBS303m，含有SEQ ID NO：21所示的CD20抗体重链(重链恒定区带臼)、SEQ ID NO：23所示的CD20抗体轻链)、MIL221-2(用于MBS303，含有SEQ ID NO：30所示的CD20抗体VH-接头-CD20抗体VL-接头-CD3抗体VH-带杵重链恒定区、SEQ ID NO：22所示的CD3抗体轻链)、和MIL221-3(用于MBS303m，含有SEQ ID NO：20(X1＝V、X2＝G、X3＝L、X4＝T、X5＝A；X1＝E、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I；X1＝E、X2＝Q、X3＝L、X4＝T、X5＝A)所示的CD20抗体VH-接头-(含有V104L/E105T/I106A、V83E、或V83E/G100Q/V104L/E105T/I106A突变)的CD20抗体VL-接头-CD3抗体VH-带杵重链恒定区、SEQ IDNO：22所示的CD3抗体轻链)。

TIGIT/VEGF双特异性抗体为对称结构，含有一个VEGF全抗体、和两个靶向TIGIT的scFv，这两个scFv分别与VEGF抗体重链的C端连接。当scFv含有野生型VL骨架时，TIGIT/VEGF双特异性抗体命名为MBS310，当scFv的VL骨架具有实施例1中所述改造时，双抗命名为MBS310m。具体地，MBS310包含SEQ ID NOs：25(X1＝F、X2＝E、X3＝L)、26、25(X1＝F、X2＝E、X3＝L)、26所示的4条链；MBS310m包含SEQ ID NOs：25(X1＝E、X2＝T、X3＝A)、26、25(X1＝E、X2＝T、X3＝A)、26所示的4条链，其中scFv的VL含有F83E/L104L/E105T/L106A。

全基因合成MIL220、MIL221-2、MIL221-3、MBS310和MBS310m双特异性抗体的长(重)链(包括可变区和恒定区)和短(轻)链(包括可变区和恒定区)DNA序列，分别采用Cla I和Hind III酶切短(轻)链全长基因；采用EcoRI和XhoI酶切长(重)链全长基因；HindIII和EcoRI酶切pCMV-质粒获得启动子基因片段，采用ClaI和XhoI酶切GS-载体。将回收的DNA片段进行连接、转化并挑取单克隆进行测序，获得含有正确序列的表达载体，MBS310和MBS310m采用单细胞表达体系进行抗体表达，MBS303和MBS303m采用双细胞表达系统纯化单抗后体外组装。

将上述获得的表达载体通过PEI转染HEK-293F细胞(Cobioer，中国)。简单而言，使用聚乙烯亚胺(PEI)，用所得的载体转染HEK293F细胞，DNA∶PEI比为1∶3。用于转染的总DNA为1.5μg/ml。转染后的HEK-293F细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中以120RPM转速培养。10-12天后，收集细胞培养上清，3500rpm离心5分钟，并通过0.22μm滤膜过滤除去细胞碎片。MBS分子通过预平衡的蛋白-A亲和柱(Cat#：17040501，GE，美国)来富集纯化，后用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸，pH3.0-pH3.5)进行洗脱。之后，抗体保存在PBS(pH 7.0)中，并通过NanoDrop检测抗体浓度。

对于MBS303和MBS303m的体外组装，将纯化的半抗体进一步通过体外方式进行组装，分别将MIL220和MIL221-2半抗体、以及MIL220和MIL221-3半抗体以1∶1的摩尔比混合，用Tris碱缓冲溶液调节至pH 8.0，添加一定量的还原型谷胱甘肽溶液，在25℃反应并低速搅拌过夜。反应结束后用2M醋酸溶液调节pH值至5.5。通过超滤去除还原剂，终止反应。装配后的抗体首先进行阴离子纯化：通过将装配后的样品调至低盐Tris缓冲溶液(pH 8.0)中，用0.2μm的过滤膜过滤。首先采用低盐Tris缓冲溶液(pH8.0)平衡阴离子层析柱，然后将样品装载到阴离子层析柱，收集流穿组分，随后使用低盐Tris缓冲溶液(pH8.0)进行冲洗直至UV280趋向于基线。用醋酸溶液将收集的流穿样品pH调至5.5。随后双抗通过阳离子进行进一步的纯化：将阴离子收集的样品用30kDa超滤管浓缩至1mL，用0.2μm的过滤膜过滤。采用低浓度乙酸盐缓冲溶液(pH5.5)平衡阳离子层析柱，将样品上样到阳离子层析柱中。上样完毕后，再用低浓度乙酸盐缓冲溶液(pH5.5)平衡柱子，然后进行线性梯度洗脱，0-100％高浓度醋酸盐(pH 5.5)，20CV，收集洗脱组分。

抗体及半抗的表达情况利用NaoDrop进行蛋白含量检测后，经换算后，表达情况总结在以下表2中。

如表2所示，将scFv的VL骨架区改造后，双特异性抗体的表达水平大幅提高，其中含有LTA核心突变位点的MIL221-3的表达量分别提高了1.9倍(104-106LTA)、和2.9倍(83E、100Q、104-106LTA)，含有LTA核心突变位点的MBS310m较MBS310的表达量提高了1.9倍(83E、104-106LTA)。以上结果表明，经过VL骨架区改造的scFv可能让双抗有了更好的结构稳定性，从而提高了其重组表达量。

表2.对称结构全抗体及不对称结构半抗体的表达情况总结

实施例3.双特异性抗体的生物物理数据检测——均一性

通过尺寸排阻-高效液相色谱法(SEC)分析初步纯化后的MBS303、MBS303m、MBS310和MBS310m的聚集性。在研究之前，将样品浓缩为2mg/ml，通过G3000SW分子排阻色谱柱进行样品分离，按面积百分比法计算单体、聚体及碎片含量。结果总结在表3中。

表3.经初步纯化后的双抗的聚集性检测结果

如表3所示，通过scFv的VL骨架区的改造，含有LTA核心突变位点的双特异性抗体在初步纯化后单体含量比对应的未改造抗体得到了提高，其中MBS303m(83E、100Q、104-106LTA)的单体含量提高了14.7％，MBS310m(83E、104-106LTA)的单体含量提高了16.9％。

实施例4.双特异性抗体的生物物理数据检测——热稳定性

将纯化后的MBS303和MBS303m单体经高温(42度)储存两周，随后经尺寸排阻-高效液相色谱法(SEC)分析其聚集性的改变情况。同样，在研究之前将样品浓缩为2mg/ml，通过G3000SW分子排阻色谱柱进行样品分离，按面积百分比法计算单体、聚体及碎片含量。结果总结在表4中。

表4.双抗单体经高温储存两周后的聚集性检测结果

如表4所示，scFv改造后的双特异性抗体有更好的高温稳定性，其在高温处理的情况下，单体的含量基本没有减少，但是scFv未经改造的双特异性抗体在高温处理后聚体成分显著提高。

实施例5.双特异性抗体的亲和力检测

检测经scFv改造的双抗的生物学活性是否受到影响。通过FACS检测MBS303和MBS303m对Raji细胞(CD20阳性肿瘤细胞)和Jurkat细胞(CD3阳性肿瘤细胞)的结合力，以及MBS310和MBS310m对HEK293A/TIGIT细胞(过表达人TIGIT的HEK293A细胞系)的结合力。此外，通过ELISA检测MBS310和MBS310m对人VEGF的结合力。

HEK293A/TIGIT细胞的构建如下所述。简单而言，合成人TIGIT的cDNA序列(氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：31所示)，并经酶切克隆到pLV-EGFP(2A)-Puro载体(北京英茂盛业生物科技有限公司，中国)中。将得到的pLV-EGFP(2A)-Puro-TIGIT与psPAX和pMD2.G质粒通过脂质体转染的方式转染到HEK293T细胞(南京科佰公司，中国)中，产生慢病毒，具体转染方法与Lipofectamine 3000试剂盒(Thermo Fisher Sciemific，美国)说明书步骤完全一致。转染三天后，从HEK293T细胞的细胞培养基(DMEM培养基(Cat#：SH30022.01，Gibco)，补充有10％FBS(Cat#：FND500，Excell))中收获慢病毒。然后用慢病毒转染HEK293A细胞(南京科佰公司，中国)，得到稳定表达人TIGIT的HEK293A细胞(称为HEK293A/人TIGIT)。转染的HEK293A细胞培养在含有0.2μg/ml嘌呤毒素(Cat#：A11138-03，Gibco)的DMEM+10％FBS培养基中7天。人TIGIT的表达使用市售可得的TIGIT抗体(PE-人TIGIT抗体，Cat#：372703，Biolegend，美国)通过流式分析仪经FACS分析。

首先，经FACS确定MBS303和MBS303m抗体与Raji细胞以及Jurkat细胞的结合活性。简单而言，将100μl培养基中的10⁵个细胞在96孔板上铺板，并分别加入50μl梯度稀释的MBS303和MBS303m抗体。4℃孵育1个小时后，96孔板用PBST清洗3遍。之后，加入500倍稀释的APC-山羊抗小鼠IgG(Cat#：405308，BioLegend，美国)。4℃孵育1小时后，96孔板用PBS清洗3遍，然后使用FACS检测仪(BD)检测细胞荧光。

其次，经FACS检测MBS310和MBS310m与上述HEK293A/TIGIT细胞的结合活性。具体检测步骤与上述检测MBS303和MBS303m抗体与Raji细胞以及Jurkat细胞结合的描述一致。

最后，经ELISA检测MBS310和MBS310m与重组人VEGF蛋白的结合力。ELISA板用100μl 500ng/ml人VEGF-A蛋白(Cat#：11066-HNAN，义翘神州，中国)4℃包被过夜。各孔用200μl封闭液(PBS+1％BSA+1％山羊血清+0.05％吐温20)室温封闭2个小时，然后加入100μl梯度稀释的MBS310和MBS310m双抗(最高浓度40μg/ml)，室温孵育1小时。ELISA板用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗3遍后加入5000倍稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(Cat#：A9309-1ml，Simga，美国)，室温孵育1小时。ELISA板用新鲜配制的Ultra-TMB(BD，美国，Cat#no.：555214)室温显色5分钟。之后用SpectraMaxR i3X(Molecular Devies，美国)在450nm读值。

MBS303和MBS303m(83E、100Q、104-106LTA)抗体与Raji细胞以及Jurkat细胞的结合力显示在图3中。如图所示，MBS303和MBS303m(83E、100Q、104-106LTA)对CD20阳性Raji细胞和CD3阳性Jurkat细胞具有相当的亲和力，可见本申请对scFv中VL骨架区的改造并没有影响双抗的靶点结合性。

MBS310和MBS310m(83E、104-106LTA)与TIGIT以及VEGF的结合力显示在图4中。如图所示，MBS310和MBS310m(83E、104-106LTA)与TIGIT以及VEGF的结合力也完全一致，表明本申请对scFv中VL骨架区的改造并没有影响双抗的靶点结合性。

本申请的示例性序列信息如下。

尽管本发明已结合一个或多个实施方式进行了描述，应当理解的是，本发明不限于这些实施方式，且上述描述意在涵盖包括在所附权利要求的精神和范围内的所有其他可选择形式、修饰和等同物。本文引用的所有文献均通过引用的方式全部并入本文。

序列表

<110> 北京天广实生物技术股份有限公司

<120> 含有突变轻链可变区骨架的单链抗体片段

<130> 55556 VL

<160> 39

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3抗体的VH-CDR1

<400> 1

Thr Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3抗体的VH-CDR2

<400> 2

Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ile Ser

1 5 10 15

Val

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3抗体的VH-CDR3

<400> 3

His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Tyr Trp Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3抗体的VL-CDR1

<400> 4

Gln Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Asn Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3抗体的VL-CDR2

<400> 5

Gly Thr Lys Gln Arg Ala Pro

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3抗体的VL-CDR3

<400> 6

Val Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20抗体的VH-CDR1

<400> 7

Tyr Ser Trp Ile Asn

1 5

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20抗体的VH-CDR2

<400> 8

Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

1 5 10 15

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20抗体的VH-CDR3

<400> 9

Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20抗体的VL-CDR1

<400> 10

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20抗体的VL-CDR2

<400> 11

Gln Met Ser Asn Leu Val Ser

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20抗体的VL-CDR3

<400> 12

Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 13

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3抗体的VH

<400> 13

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ile

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Tyr Trp

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 14

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3抗体的VL

<400> 14

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gln Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Asn

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly His Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Lys Gln Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 15

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20抗体的VH

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20抗体的VL

<220>

<221> 其他特征

<222> (88)..(88)

<223> Xaa可以是Val、或Glu

<220>

<221> 其他特征

<222> (105)..(105)

<223> Xaa可以是Gly或Gln

<220>

<221> 其他特征

<222> (109)..(109)

<223> Xaa可以是Val、或Leu

<220>

<221> 其他特征

<222> (110)..(110)

<223> Xaa可以是Glu、或Thr

<220>

<221> 其他特征

<222> (111)..(111)

<223> Xaa可以是Ile或Ala

<400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Xaa Xaa Xaa Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3抗体的轻链恒定区

<400> 17

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20抗体的轻链恒定区

<400> 18

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 19

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链恒定区

<220>

<221> 其他特征

<222> (249)..(249)

<223> Xaa可以是Trp或Ser

<220>

<221> 其他特征

<222> (251)..(251)

<223> Xaa可以是Leu或Ala

<220>

<221> 其他特征

<222> (290)..(290)

<223> Xaa可以是Tyr或Val

<400> 19

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Xaa Cys Xaa Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Xaa Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 20

<211> 721

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3/CD20抗体MBS303m中MIL221-3的长链

<220>

<221> 其他特征

<222> (227)..(227)

<223> Xaa可以是Glu或Val

<220>

<221> 其他特征

<222> (244)..(244)

<223> Xaa可以是Gln或Gly

<220>

<221> 其他特征

<222> (248)..(248)

<223> Xaa可以是leu或Val

<220>

<221> 其他特征

<222> (249)..(249)

<223> Xaa可以是Thr或Glu

<220>

<221> 其他特征

<222> (250)..(250)

<223> Xaa可以是Ala或Ile

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

130 135 140

Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile

145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr

165 170 175

Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile

180 185 190

Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220

Glu Asp Xaa Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr

225 230 235 240

Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Xaa Xaa Xaa Lys Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

275 280 285

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg

290 295 300

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys

305 310 315 320

Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ile Ser Val Lys Asp Arg Phe

325 330 335

Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

340 345 350

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly

355 360 365

Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

370 375 380

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

385 390 395 400

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

405 410 415

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

420 425 430

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

435 440 445

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

450 455 460

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

465 470 475 480

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

485 490 495

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

500 505 510

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

515 520 525

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

530 535 540

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

545 550 555 560

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val

565 570 575

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

580 585 590

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

595 600 605

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

610 615 620

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

625 630 635 640

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

645 650 655

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

660 665 670

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

675 680 685

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

690 695 700

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

705 710 715 720

Lys

<210> 21

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MBS303中MIL220长链

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

355 360 365

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 22

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MIL221-2和MIL221-3短链

<400> 22

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gln Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Asn

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly His Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Lys Gln Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 23

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MIL220短链

<400> 23

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 24

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TIGIT抗体VL

<220>

<221> 其他特征

<222> (84)..(84)

<223> Xaa可以是Phe或Glu

<220>

<221> 其他特征

<222> (107)..(107)

<223> Xaa可以是Glu或Thr

<220>

<221> 其他特征

<222> (108)..(108)

<223> Xaa可以是Leu或Ala

<400> 24

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Thr

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ala Ser Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Thr Gln Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Gly Tyr Pro

85 90 95

Leu Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Xaa Xaa Lys Arg

100 105 110

<210> 25

<211> 713

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MBS310长链

<220>

<221> 其他特征

<222> (687)..(687)

<223> Xaa可以是Phe或Glu

<220>

<221> 其他特征

<222> (710)..(710)

<223> Xaa可以是Glu或Thr

<220>

<221> 其他特征

<222> (711)..(711)

<223> Xaa可以是Leu或Ala

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

450 455 460

Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

465 470 475 480

Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

485 490 495

Phe Thr Ser Tyr Asn Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly

500 505 510

Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Leu Ala Thr Ser Tyr

515 520 525

Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr

530 535 540

Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

545 550 555 560

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

565 570 575

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

580 585 590

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr

595 600 605

Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Met

610 615 620

Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Thr Tyr Leu His Trp Tyr

625 630 635 640

Gln Gln Lys Pro Gly Ala Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Thr Gln

645 650 655

Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

660 665 670

Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Xaa Ala

675 680 685

Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Gly Tyr Pro Leu Ile Thr Phe Gly

690 695 700

Ala Gly Thr Lys Leu Xaa Xaa Lys Arg

705 710

<210> 26

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MBS310和MBS310m的短链

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 27

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 28

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 28

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 29

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 29

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

<210> 30

<211> 716

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3/CD20抗体MBS303中MIL221-2的长链

<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser

130 135 140

Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

145 150 155 160

Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu

165 170 175

Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn

180 185 190

Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly

225 230 235 240

Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu

260 265 270

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

275 280 285

Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

290 295 300

Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Thr Tyr Tyr Ala Ile Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

325 330 335

Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

340 345 350

Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser

355 360 365

Tyr Leu Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

370 375 380

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

385 390 395 400

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

405 410 415

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

420 425 430

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

435 440 445

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

450 455 460

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

465 470 475 480

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

485 490 495

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

500 505 510

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

515 520 525

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

530 535 540

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

545 550 555 560

Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

565 570 575

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

580 585 590

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

595 600 605

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

610 615 620

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly

625 630 635 640

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

645 650 655

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

660 665 670

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

675 680 685

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

690 695 700

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

705 710 715

<210> 31

<211> 244

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 31

Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala

1 5 10 15

Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn

20 25 30

Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser

35 40 45

Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln

50 55 60

Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser

65 70 75 80

Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln

85 90 95

Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr

100 105 110

Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu

115 120 125

Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly

130 135 140

Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val

145 150 155 160

Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu

165 170 175

Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser

180 185 190

Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala

195 200 205

Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp

210 215 220

Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe

225 230 235 240

Thr Glu Thr Gly

<210> 32

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL第三骨架区

<220>

<221> 其他特征

<222> (27)..(27)

<223> Xaa可以是Val或Glu

<400> 32

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 33

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL第四骨架区

<220>

<221> 其他特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是Gly或Gln

<400> 33

Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Leu Thr Ala Lys

1 5 10

<210> 34

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL第三骨架区

<220>

<221> 其他特征

<222> (27)..(27)

<223> Xaa可以是Phe或Glu

<400> 34

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL第四骨架区

<400> 35

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Ala Lys Arg

1 5 10

<210> 36

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL第一骨架区

<400> 36

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys

20

<210> 37

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL第二骨架区

<400> 37

Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 38

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL第一骨架区

<400> 38

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Met Thr Cys

20

<210> 39

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL第二骨架区

<400> 39

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ala Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

Claims (15)

1.一种单链抗体片段(scFv)，包含重链可变区、接头、和κ轻链可变区，其中κ轻链可变区包含第一骨架区、第二骨架区、第三骨架区、和第四骨架区，其中κ轻链可变区经突变而在按Kabat编码系统/方法确定的第104-106位分别包含亮氨酸、苏氨酸和丙氨酸。

2.如权利要求1所述的scFv，其中κ轻链可变区经突变而在按Kabat编码系统/方法确定的第83位包含谷氨酰胺。

3.如权利要求1所述的scFv，其中κ轻链可变区经突变而在按Kabat编码系统/方法确定的第100位包含谷氨酸。

4.如权利要求1所述的scFv，其中第四骨架区包含SEQ ID NO：33(X＝G或Q)或35所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的scFv，其能够结合CD20或TIGIT。

6.如权利要求1所述的scFv，其中接头为-(G₄S)₃-(SEQ ID NO：27)、-(G₄S)₄-(SEQ IDNO：28)、或-(G₄S)₅-(SEQ ID NO：29)。

7.如权利要求1所述的scFv，其中接头为-(G₄S)₄-(SEQ ID NO：28)，重链可变区包含SEQID NOs：7、8、和9所示的重链可变区CDR1(VH-CDR1)、VH-CDR2、和VH-CDR3，轻链可变区包含SEQ ID NOs：10、11和12所示的轻链可变区CDR1(VL-CDR1)、VL-CDR2和VL-CDR3。

8.如权利要求7所述的scFv，其中重链可变区包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO：16(X1＝V、X2＝G、X3＝L、X4＝T、X5＝A；X1＝E、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I；或X1＝E、X2＝Q、X3＝L、X4＝T、X5＝A)所示的氨基酸序列。

9.一种CD3/CD20双特3异性抗体，包含特异结合CD3的Fab片段、特异结合CD20的Fab片段、和特异结合CD20的scFv，其中特异结合CD20的scFv为权利要求7或8所述的scFv。

10.如权利要求9所述的CD3/CD20双特异性抗体，其中特异结合CD3的Fab片段包含SEQID NOs：1、2、3、4、5、和6所示的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，特异结合CD20的Fab片段包含SEQ ID NOs：7、8、9、10、11和12所示的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。

11.如权利要求10所述的CD3/CD20双特异性抗体，其中

特异结合CD3的Fab片段包含SEQ ID NO：13所示的重链可变区和SEQ ID NO：14所示的轻链可变区，

特异结合CD20的Fab片段包含SEQ ID NO：15所示的重链可变区和SEQ ID NO：16(X1＝V、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I)所示的轻链可变区。

12.如权利要求11所述的CD3/CD20双特异性抗体，包含

i)第一多肽链，包含特异结合CD20的重链可变区，以及重链恒定区CH1、CH2和CH3；

ii)第二多肽链，包含特异结合CD20的轻链可变区和轻链恒定区；

iii)第三多肽链，包含特异结合CD20的重链可变区，特异结合CD20的轻链可变区，特异结合CD3ε的重链可变区，以及重链恒定区CH1、CH2和CH3；以及

iv)第四多肽链，包含特异结合CD3ε的轻链可变区和轻链恒定区，

其中第一多肽链中特异结合CD20的重链可变区和重链恒定区CH1与第二多肽链中特异结合CD20的轻链可变区和轻链恒定区结合形成所述特异结合CD20的Fab片段，第三多肽链中特异结合CD20的重链可变区与特异结合CD20的轻链可变区结合形成所述特异结合CD20的scFv，第三多肽链中特异结合CD3ε的重链可变区和重链恒定区CH1与第四多肽链中特异结合CD3ε的轻链可变区和轻链恒定区结合形成所述特异结合CD3的Fab片段。

13.如权利要求12所述的CD3/CD20双特异性抗体，

第一多肽链中的重链恒定区为包含L234A/L235A/N297A/T366W的IgG1重链恒定区，第三多肽链中的重链恒定区为包含L234A/L235A/N297A/T366S/L368A/Y407V的IgG1重链恒定区；或者

第一多肽链中的重链恒定区为包含L234A/L235A/N297A/T366S/L368A/Y407V的IgG1重链恒定区，第三多肽链中的重链恒定区为包含L234A/L235A/N297A/T366W的IgG1重链恒定区。

14.如权利要求13所述的CD3/CD20双特异性抗体，其中

第一多肽链从N端到C端包含特异结合CD20的重链可变区，以及重链恒定区CH1、CH2和CH3，

第二多肽链从N端到C端包含特异结合CD20的轻链可变区和轻链恒定区；

第三多肽链从N端到C端包含特异结合CD20的重链可变区，特异结合CD20的轻链可变区，特异结合CD3a的重链可变区，以及重链恒定区CH1、CH2和CH3，

第四多肽链从N端到C端包含特异结合CD3ε的轻链可变区和轻链恒定区。

15.如权利要求14所述的CD3/CD20双特异性抗体，其中，

第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链、和第四多肽链分别包含21、23、20(X1＝E、X2＝Q、X3＝L、X4＝T、X5＝A；X1＝V、X2＝G、X3＝L、X4＝T、X5＝A；或X1＝E、X2＝G、X3＝V、X4＝E、X5＝I)、和22所示的氨基酸序列。