CN117003679A

CN117003679A - 新型抑制剂化合物

Info

Publication number: CN117003679A
Application number: CN202210464329.8A
Authority: CN
Inventors: 保罗·安德森; 安德烈·斯金格; 刘兆鹏
Original assignee: University of South Australia
Current assignee: University of South Australia
Priority date: 2022-04-29
Filing date: 2022-04-29
Publication date: 2023-11-07
Also published as: WO2023205857A1

Abstract

本公开涉及一种新化合物，它是维生素D的类似物。本公开还涉及包含该新化合物的药物组合物，以及该新化合物在治疗和/或预防与低水平维生素D有关的疾病、尤其是响应CYP24A1酶的抑制的疾病中的用途。

Description

新型抑制剂化合物

技术领域

本公开涉及一种新化合物，它是维生素D的类似物。本公开还涉及包含该新化合物的药物组合物，以及该新化合物在治疗和/或预防与低水平维生素D有关疾病，尤其是响应CYP24A1酶的抑制的疾病中的用途。

背景技术

CYP24A1酶是线粒体内膜细胞色素P450组分，其天然作用以分解代谢 25-羟基胆钙化醇(25(OH)D₃)和1,25-二羟基胆钙化醇(1,25(OH)₂D₃)以控制维生素D激素在不同组织中的作用(Anderson,P.H.,Curr.Osteoporos.Rep.,2017.15(5):p.443-449)。这种分解代谢通过25(OH)D₃和1,25(OH)₂D₃(结构如下)的脂肪族侧链的C23或C24 发生羟基化，导致活性较低的分解代谢物并最终形成骨化酸(St-Arnaud,R.and G.Jones, CYP24A1:structure,function,and physiological role,in Vitamin D.2018,Elsevier.p.81-95)。健康个体中的CYP24A1基因表达受1,25(OH)₂D₃、甲状旁腺激素(PTH)和成纤维细胞生长因子23(FGF23)的影响(Jones,G.,Prosser,D.E.and Kaufmann,M.Arch.Biochem.Biophys.,2012.523(1):p.9-18)，其中1,25(OH)₂D₃是主要的表达刺激物(Zierold,C.,etal.,Arch.Biochem.Biophys.,2000.381(2):p.323-327)。

慢性肾病(CKD)是一种以肾功能逐渐恶化为特征的进行性疾病。CKD是一个日益严重的公共健康问题，高血压和糖尿病等合并症是主要病因(Webster,A.C.,et al., TheLancet,2017.389(10075):p.1238-1252.；Patel,U.D.,et al.,Am.J.Kidney Dis.,2005.46(3):p.406-414)。CKD中不可避免的事件是肾脏维生素D代谢途径的紊乱，其中涉及25-羟基维生素D1α-羟化酶(CYP27B1)和CYP24A1。肾功能的逐渐下降转化为 CYP27B1活性的逐渐下降，导致循环1,25(OH)₂D₃的产生减少(St-Arnaud，R.和G. Jones，同上)。此外，血清FGF23水平升高会抑制肾脏CYP27B1表达并刺激肾脏 CYP24A1表达，这会导致1,25(OH)₂D₃产生不足(Helvig,C.F.,et al.,Kidney Int.,2010. 78(5):p.463-472)。据报道，作为1,25(OH)₂D₃前体底物的25(OH)D₃循环水平由于蛋白尿等因素在CKD中下降(Caravaca-Fontán,F.,et al.,Nefrología(英文版),2016.36(5): p.510-516)。1,25(OH)₂D₃水平过低会导致肠道钙吸收受损和低钙血症，进而导致继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT)(Elder,G.,J.Bone Miner.Res.,2002.17(12):p.2094-2105； Martinez,I.,et al.,Am.J.KidneyDis.,1997.29(4):p.496-502)。

1,25(OH)₂D₃或VDR激活维生素D类似物(如阿法骨化醇、马沙骨化醇、多克骨化醇或帕立骨化醇)通常用于肾功能下降的患者，目的是降低PTH水平 (Drüeke,T.B.,Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.,2005.14(4):p.343-349；J.M.,et al.,Am.J.Kidney Dis.,2000.36(3):p.550-561)。然而，一些因素限制了活性维生素D或维生素D类似物治疗的有效性，例如由此产生的高钙血症和CYP24A1活性水平过高，除了使1,25(OH)₂D₃失活外，还可能导致使维生素D类似物失活(Posner,G.H., et al.,J.SteroidBiochem.Mol.Biol.,2010.121(1-2):p.13-19)。

维生素D缺乏还直接影响系统，包括免疫功能、心血管健康和生殖健康。维生素D缺乏与癌症发病率之间的关联也已在许多不同的环境中得到证实，包括乳癌 (Feldman,D.et al.,Nat.Rev.Cancer,2014.14:p.342-357；O’Brien,K.M.et al.,Environ. HealthPerspect.2017.125:p.077004)。此外，一些报告表明维生素D可能在乳癌治疗中发挥作用(O’Brien,K.M.et al.,Environ.Health Perspect.2017.125:p.077004；Swami, S.etal.,Endocrinology,2012.153:p.2576-2587)和预测疾病复发和生存。据称维生素D 发挥乳癌保护作用的机制多种多样(Welsh,J.J.Steroid Biochem.Mol.Biol.2017)。据报道，VDR对雌激素受体(ER)活性的直接相互作用和基因组抑制是维生素D在乳癌细胞中发挥生长抑制作用的一种机制(Swami,S.et al.,Endocrinology,2012.153:p.2576- 2587)。除了VDR，目标组织水平的维生素D活性调节受CYP24A1的分解代谢作用控制。在浸润性乳癌细胞和组织中，CYP24A1基因扩增(Davis,L.M.et al.,2007.9:p. 327-336；Albertson,D.G.et al.,2000.:p.144-146；Rennstam,K.and Hedenfalk,I.Breast Cancer Res,2006.8(213))以及更高的CYP24A1 mRNA和蛋白质表达，与正常或原位对应物相比，并且独立于1,25(OH)₂D₃诱导(Lopes,N.et al.,BMC Cancer,2010.10(483)； Townsend,K.et al.,Clin.Cancer Res.2005.11:p.3579-3586)。虽然不确定CYP24A1过度活性是否是癌症进展的原因或结果，但维生素D或维生素D类似物的治疗使用在 CYP24A1活性异常高的乳癌中可能相对无效。

1,25(OH)₂D₃还在肠道中表现出免疫调节和抗炎作用并预防多种胃肠道疾病(Almerighi,C.et al.,Cytokine,2009.45(3):p.190-197；Froicu,M.and Cantorna,M.T.,BMC Immunol.,2007.8(30):p.5)。它通过调节肠道微生物群和通过VDR发挥作用来保护肠道，并通过改善溃疡、红斑和疼痛在肠道中显示出保护作用(Anand,A.et al.,Contemp.Oncol.(Pozn),2017.21(2):p.145-151；Meeker,S.et al.,Cancer Res.,2014.74(16):p.4398- 4408)。化疗药物如5-氟尿嘧啶(5-FU)导致胃肠道粘膜炎(GM)的高发病率，成为接受化疗的癌症患者的重要临床问题。GM的特征是消化道中的严重溃疡，表现为由于肠道吸收不良而引起的疼痛、腹泻、呕吐和体重减轻等症状(Harris,D.J.,Ther.Clin.RiskManag.,2006.2(3):p.251-258)。因此，粘膜炎会显着影响患者的生活质量，并且是一种剂量限制性并发症，因为它通常会导致癌症治疗的减少或停止，严重影响患者的生存结果(Iacovelli,R.,et al.Critical Reviews in Oncology/Hematology,2016.98(2016/02):p.24- 28)。目前可用于GM的治疗选择有限。

防止1,25(OH)₂D₃分解以改善1,25(OH)₂D₃的半衰期可以提供一种可以提高维生素D活性和提高对维生素D疗法的反应性的策略。在导致本公开的工作中，发明人研究了在维生素D活性低的条件下具有预期治疗价值的靶向CYP24A1抑制方法。本发明人合成了一种新型的1,25(OH)₂D₃的C-24O-甲基肟类似物，它具有特定的 CYP24A1抑制特性，因此可用于治疗和/或预防与低水平生理维生素D相关的疾病或病症，特别是在响应CYP24A1抑制的疾病或病症中。

发明内容概述

在第一方面中，本公开提供了式(I)化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药:

其中:

R₁选自H和OH,

R₂,R₃和R₄各自独立地选自CH₃和F。

所述式(I)化合物可以为式(Ia)化合物：

或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药。

在第二方面中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含式(I) 化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药，和一种或者多种药学上可接受的赋形剂。所述药物组合可适于口服给药。所述药物组合物可适于皮下给药。

在第三方面中，本公开提供了一种治疗和/或预防与受试者的低水平生理维生素D相关的疾病或者病症，所述方法包括给所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药，和任选的药学上可接受的赋形剂。

所述疾病或者病症可以是响应CYP24A1抑制的疾病或者病症。

因此，本公开还提供了一种治疗和/或预防受试者的响应CYP24A1抑制的疾病或者病症的方法，所述方法包括给所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药，和任选的药学上可接受的赋形剂。

所述疾病或者病症可以是慢性肾病(CKD)、或者与CKD有关的疾病或者病症。所述与CKD有关的疾病或者病症可以是继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT)。

所述疾病或者病症可以是化疗致胃肠道粘膜炎。特别地，所述疾病或者病症可以是5-氟尿嘧啶诱导的胃肠道粘膜炎。

所述疾病或者病症可以是与炎症和改变的微生物组有关的肠道功能失调，例如炎症性肠病、肠易激综合征或者憩室炎。

所述疾病或者病症可以是癌症。特别地，所述疾病或者病症可以是乳癌。

所述式(I)化合物可以与另一药剂联合施用，例如，另一药剂：用于治疗和 /或预防所述疾病或者病症；在所述治疗和/或预防疾病或者病症中可以提高所述式(I) 化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药的活性；和/或在所述治疗和/或预防疾病或者病症中其效果可以通过所述式(I)化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药得以加强的药剂。

在第四方面中，本公开提供了式(I)化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药在治疗和/或预防与低水平生理维生素D相关的疾病或者病症中的用途。

本公开还提供了式(I)化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药在治疗和/或预防响应CYP24A1抑制的疾病或者病症中的用途。

在第五方面中，本公开提供了用于治疗和/或预防与低水平生理维生素D相关的疾病或者病症的式(I)化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药。

本公开还提供了用于治疗和/或预防响应CYP24A1抑制的疾病或者病症的式 (I)化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药。

在第六方面中，本公开提供了式(I)化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药在制备用于治疗和/或预防与低水平生理维生素D相关的疾病或者病症的药品(例如药物组合物)中的用途。

本公开还提供了式(I)化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药在制备用于治疗和/或预防响应CYP24A1抑制的疾病或者病症的药品(例如药物组合物) 中的用途。

在第七方面中，本公开提供了用于治疗和/或预防与低水平生理维生素D相关的疾病或者病症的包含式(I)化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

本公开还提供了用于治疗和/或预防响应CYP24A1抑制的疾病或者病症的包含式(I)化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

附图说明

图1显示了结合的1nM Fluormone^TM/3.62nM VDR全长蛋白与十六种测试浓度(0.0007至1×10⁴nM对于三种测试化合物(1,25(OH)₂D₃,25(OH)D₃和VD1- 6)中的每一种，均以对数标度表示)。误差线表示与平均值的标准偏差。连接点的实线表示使用具有不同斜率的S型剂量反应模型拟合的曲线。

图2显示了CYP24A1活性口袋中1的1,25(OH)₂D₃(左)和VD1-6(右)的模拟对接位置。

图3提供的结果显示了VD1-6(10^-7M)、1,25(OH)₂D₃(10^-7M)和它们各自在 (10^-7M)处的组合处理对mRNA的影响HEK293T细胞培养物中24小时产生的 CYP24A1、CYP27B1和VDR水平。*p<0.05与空白对照相比；#p<0.05对比 1,25(OH)₂D₃(10^-7M)处理。数值表示为平均值±SD。

图4显示了在10^-8M和10^-7M下，在不存在和存在VD1-6的情况下， HEK293T细胞培养物中0、8和24小时的1,25(OH)₂D₃水平。平均值±标准差，n＝4/ 组；a p<0.05vs 0h；b p<0.05与1,25(OH)₂D₃单独在8小时；c p<0.05与 1,25(OH)₂D₃单独在24小时。

图5提供了在不存在和存在VD1-6(10^-11-10^-7M)的情况下，在HEK293T 细胞培养物中72小时提供24,25(OH)₂D₃水平(A)和相对CYP24A1 mRNA水平(B)。平均值±标准差，n＝4/组；^ap<0.05与仅25(OH)D₃治疗相比；^bp<0.05vs.25(OH)D₃ +10^-11M VD1-6处理；^cp<0.05vs.25(OH)D₃+10^-10M VD1 6处理；^dp<0.05vs. 25(OH)D₃+10^-9M VD1-6处理；^ep<0.05vs.25(OH)D₃+10^-8M VD1 6处理。

图6提供：A)Cre介导的CYP24A1基因外显子5切除和引物放置的示意图；B) 肠道和肾脏(维生素D处理组织)的DNA分析显示CYP24A1在IntCYP24A1^-/-肠道组织(十二指肠、空肠和结肠)中仅缺失，但存在于肾脏中。CYP24A1存在于CYP24A1^fl/fl小鼠的所有组织中；C)与CYP24A1^fl/fl小鼠相比，IntCYP24A1^-/-小鼠中CYP24A1相对于Rplp0的mRNA表达在小肠中可忽略不计(平均值±SEM)。

图7提供：A)用CYP24A1^fl/fl盐水(分别为A、E、I)、CYP24A1^fl/fl5-FU(B、 F、J、分别)、IntCYP24A1^-/-生理盐水(分别为C、G、K)或IntCYP24A1^-/-5-FU(分别为D、H、L)(以20倍物镜拍摄的显微照片)；B)十二指肠绒毛(A，B)和隐窝(C，D)，空肠绒毛(E，F)和隐窝(G，H)和结肠隐窝(I，J，分别)的组织学测量(每个点代表每只小鼠的平均值±SEM；*p<0.5、**p<0.01和***p<0.001与 CYP24A1^fl/fl盐水对照)。

图8提供：A)用盐水、VD1-6(“Polara 1”)、5-FU或VD1-6+5-FU处理的十二指肠和结肠的H&E染色切片(以20x物镜拍摄的显微照片)；B)十二指肠绒毛(A，B) 和隐窝(C，D)，空肠绒毛(E，F)和隐窝(G，H)和结肠隐窝(I，J，分别)的组织学测量(数据显示为平均值±SEM。*p<0.5、**p<0.01和***p<0.001与未处理的对照(盐水)相比。

图9提供了阿尔新蓝染色，显示了在5-FU给药之前CYP24A1缺失对肠中杯状细胞计数总数的影响(数据显示为平均值±SEM。*p<0.5，**p<0.01和 ***p<0.001与CYP24A1^fl/fl盐水对照；在40倍物镜下拍摄的显微照片)。

图10提供了5-FU给药后肠道中Ki-67的免疫染色：用CYP24A1^fl/fl盐水(分别为A、F、K)处理的十二指肠、空肠和结肠的Ki-67抗体染色切片， CYP24A1^fl/fl5-FU(分别为B、G、L)、IntCYP24A1^-/-盐水(分别为C、H、M)或 IntCYP24A1^-/-5-FU(分别为D、I、N)；十二指肠(E)、空肠(J)和结肠(O)的每个半隐窝的Ki-67阳性细胞计数(每个点代表每只小鼠的平均值±SEM；*p<0.5，**p <0.01和***p<0.001与CYP24A1^fl/fl盐水对照；在40倍物镜下拍摄的显微照片)。

图11提供了5-FU给药后肠道中Ki-67的免疫染色：用盐水(分别为A、 F、K)、VD1-6处理的十二指肠、空肠和结肠的Ki-67抗体染色切片(“Polara 1”)(分别为B、G、L)、5-FU(分别为C、H、M)或VD1-6+5-FU(分别为D、I、N)；十二指肠(E)、空肠(J)和结肠(O)的每个半隐窝的Ki-67阳性细胞计数(数据显示为平均值±SEM。*p<0.5，**p<0.01和***p<0.001与未经处理的对照(盐水)；以40 倍物镜拍摄的显微照片)。

图12提供了在5-FU给药期间VD1-6(“Polara 1”)对被治疗的小鼠的结肠中维生素D响应基因表达的影响：CYP24A1(A)、CYP27B1(B)的平均mRNA表达)和VDR(C)，相对于对照基因RPLP0(数据显示为平均值±SEM。*p<0.5， **p<0.01和***p<0.001与未处理的对照(盐水)相比)。

图13提供了VD1-6(“Polara 1”)在5-FU给药期间对被治疗的小鼠的结肠中炎症基因表达的影响：TNF-α(A)和NF-κB的平均mRNA表达(B)相对于 RPLP0(数据显示为平均值±SEM。所有组的p<0.5)。

图14提供了VD 1-6(“Polara 1”)在5-FU给药期间对被治疗的小鼠结肠中先天免疫相关基因表达的影响：脂质运载蛋白-2(A)的平均mRNA表达、TLR4(B) 和TLR5(C)相对于RPLP0(数据显示为平均值±SEM。*p<0.5、**p<0.01和 ***p<0.001与未处理的对照(盐水)相比)。

图15提供了存在于小鼠的结肠内容物中的家族分类水平的相对丰度：数据显示为A)特定治疗组中的个体动物和B)每组中个体的总结。

图16提供了用5-FU和/或VD1-6(“Polara 1”)处理的小鼠中肠道微生物群的α多样性(每个点代表每个动物的香农指数，表示为中值(实线)，平均值(虚线)，四分位间距和范围(晶须))。

图17提供了用5-FU和/或VD1-6(“Polara 1”)处理的小鼠中肠道微生物群的β多样性：主成分分析三维图，PCo1对PCo2对PCo3(A)和主成分分析二维图， PCo1与PCo2(B)，建议仅将化疗(红色圆圈，5-FU治疗)聚类到右侧。Pearson的相关性(C,D)表明由阿克曼氏菌科(Akkermansiaceae)(R²＝0.764,p<0.0001)和较小程度的Mariniflaceae科(R²＝0.183,p＝0.0415)驱动PCo1的变化。

具体实施方式

发明人已经发现式(I)化合物可以选择性地抑制CYP24A1。特别地，式(I)化合物不与维生素D受体(VDR)结合，因此避免了可能导致高钙血症(在VDR激活的情况下) 或低钙血症(当VDR失活时)的脱靶效应，这可能导致佝偻病和骨软化症。此外，通过降低25(OH)D₃和1,25(OH)₂D₃的内源性分解代谢，可以使用人体自身的维生素D。这使身体能够补偿或自我调节维生素D的作用。随着内源性维生素D活性升高，身体尝试驱动更多维生素D生产(通过PTH)的需求降低，从而导致维生素D的下降。PTH水平。如果式(I)化合物的水平稳定，则身体可以在PTH水平较低的情况下达到新的维生素D活性设定点，与施用外源性维生素D(或任何类似物)。此外，与1,25(OH)₂D₃相比，式(I)化合物与CYP24A1的结合力更强，因此即使在存在内源性1,25(OH)₂D₃的情况下，它也是一种有效的CYP24A1抑制剂。因此，发明人发现式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药在治疗和/或预防与低水平生理维生素D相关的疾病或病症方面显示出相当大的前景。

因此，在第一方面中，本公开提供了式(I)化合物：

其中:

R₁选自H和OH,

R₂,R₃和R₄各自独立地选自CH₃和F，

或者其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。R₁可以是OH。R₂,R₃和R₄可以是CH₃。

式(I)化合物可以是式(Ia)化合物：

或者其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指保留式(I)化合物的所需生物活性的盐，并且包括药学上可接受的酸加成盐和碱加成盐。式(I)化合物的合适的药学上可接受的碱加成盐可以由无机碱或有机碱制备。这种无机碱的例子是钠、钾、钙、铝和镁。关于药学上可接受的盐的其他信息可以在Remington's Pharmaceutical Sciences, 第19版,Mack Publishing Co.,Easton,PA 1995中找到。

“前药”是指在生物系统内经历转化为式(I)化合物的化合物，通常通过代谢方式(例如，通过水解、还原或氧化)。例如，式(I)化合物的酯前药可通过体内水解转化为式(I)化合物。式(I)化合物的合适的酯可以是例如乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、丙二酸盐、草酸盐、水杨酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、羟乙基磺酸盐、二对甲苯甲酰酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐和奎宁酸盐。“Prodrugs:challenges and rewards”，Valentino J Stella(ed)， Springer，2007中提供了前药的示例。

在式(I)化合物为固体的情况下，本领域技术人员将理解，化合物(或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药)可以不同的结晶或多晶型形式存在，所有这些都包含在本发明的范围内。

术语“溶剂化物”是指由与合适溶剂的溶剂化产生的任何形式的式(I)化合物。这种形式可以是例如结晶溶剂化物或可在溶剂和溶解的化合物之间形成的络合物。

本发明进一步提供了一种合成式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药的方法。

关于下文描述的合成方法的描述以及在用于制备起始材料的参考合成方法中，本领域技术人员将理解所有提出的反应条件，包括溶剂的选择、反应气氛、反应温度、实验持续时间和后处理程序，可以很容易地选择。此外，本领域技术人员将理解分子的不同部分上存在的官能团必须与所使用的试剂和反应条件相容。

必要的起始材料可以通过有机化学的标准程序获得。这些起始材料的制备结合以下代表性方法变体以及在下文的实施例中进行描述。或者，必要的起始材料可以通过与所示那些在本领域技术人员的普通技术范围内的那些类似的程序获得。此外，应当理解，在化合物的合成过程中，在下文描述的方法中，或在某些起始材料的合成过程中，可能需要保护某些取代基以防止它们发生不希望的反应。本领域技术人员将容易地认识到何时需要这种保护，以及如何将这种保护基置于适当位置并随后除去。例如，Theodora Green的Protective Groups in Organic Synthesis(出版商：John Wiley&Sons)中描述了保护基团的例子。保护基可以通过本领域技术人员熟知的适合于去除所讨论的保护基的任何便利方法去除，选择这样的方法以便在对保护基团的其他地方的干扰最小的情况下实现保护基的去除分子。因此，如果反应物包括例如氨基、羧基或羟基等基团，则可能需要在本文提到的一些反应中保护该基团。

用于合成本发明化合物的特别合适的方法的一个实例显示在下面的方案1中。式(I)化合物在方案1中称为VD1-6。碘VD1-1，按照先前报道的方法从维生素D2 中获得(Posner,G.H.,et al.,J.Org.Chem.,1997.62(10):p.3299-3314；Kahraman,M.,et al.,J.Med.Chem.,2004.47(27):p.6854-6863)，与原位形成的烯醇化物反应从3,3-二甲基-2-丁酮，以72％的收率得到酮VD1-2。使用在吡啶中的甲氧基胺盐酸盐安装O甲基肟官能团，得到VD1-3，产率为69％。在室温下使用樟脑磺酸(CSA)脱硅烷化1小时显示仲醇，然后使用铬酸吡啶鎓(PDC)将其氧化得到酮VD1-4，两步的产率为68％。然后使用Horner-Wadsworth-Emmons(HWE)化学方法在碱性条件下将酮VD1-4与市售膦酸酯VD1-5反应，通过烯烃接头将两个片段结合。再次使用CSA去除甲硅烷基保护基团，在两步中以43％的产率揭示了VD1 6中的反平面羟基基团。

在本发明的另一方面，提供了一种合成式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药的方法，其中该方法包括方案1中列出的步骤。

可以使用本领域技术人员熟知的技术分离和纯化所得的式(I)化合物。

式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药可以与药学上可接受的赋形剂一起配制成药物组合物。因此，在第二方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

适用于不同形式的药物组合物的赋形剂的实例为本领域技术人员所熟知，并且描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA1995 和Handbook of Pharmaceutical Excipients，第2版，(1994年)，由A Wade和PJWeller编辑。可以根据预期的给药途径和标准药学实践来选择赋形剂。

包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药的药物组合物可包含任何合适的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂和增溶剂。合适的载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨糖醇等。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。合适的粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的例子包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。药物组合物中可以提供防腐剂、稳定剂、染料甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。

包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药的药物组合物可适用于口服、直肠、阴道、肠胃外、肌肉内、腹膜内、动脉内、鞘内、支气管内、皮下、皮内、静脉内、鼻腔、口腔或舌下给药途径。该药物组合物可适用于口服给药。对于口服给药，可以特别使用压缩片剂、丸剂、片剂、凝胶剂、滴剂和胶囊剂。对于其他形式的给药，药物组合物可以包含溶液或乳液，其可以静脉内、动脉内、鞘内、皮下、皮内、腹膜内或肌肉内注射，并且由无菌或可灭菌溶液制备。该药物组合物可以适于皮下给药。包含本发明化合物的药物组合物还可以是栓剂、阴道栓剂、混悬剂、乳剂、洗剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、喷雾剂、溶液剂或撒粉剂的形式。药物组合物可以配制成单位剂量形式(即，以包含单位剂量或单位剂量的多个或亚单位的离散部分的形式)。

如上所述，式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药可用于治疗和/或预防与生理维生素D水平低相关的疾病或病症。因此，在另一个方面，本公开提供了一种治疗和/或预防受试者中与低生理维生素D水平相关的疾病或病症的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，任选与药学上可接受的赋形剂组合。

在疾病或病症的上下文中，“相关”是指由与之相关的疾病或病症导致的疾病或病症，或者导致(或促成)与之相关的疾病或病症的疾病或者病症。例如，SHPT与 CKD相关联，因为CKD导致SHPT。在与低水平生理维生素D相关的疾病或病症的情况下，低水平生理维生素D可能是疾病或病症的结果。导致或导致生理维生素D水平低的疾病的实例包括囊性纤维化、克罗恩病、乳糜泻、肥胖症、癌症(例如乳癌)和肝脏和肾脏疾病，例如CKD。相反，低生理维生素D水平会导致骨密度降低，因此可能是骨质疏松症、骨折、佝偻病和骨软化症等疾病和病症的原因。生理性维生素D水平低也会导致肠道屏障保护能力的消耗或丧失以及肠道黏膜内层的消耗，从而导致胃肠道粘膜炎的发展。抑制维生素D分解代谢还可以维持肠道微生物群的组成，这有助于预防用5-氟尿嘧啶(5-FU)治疗后的肠道损伤，还可能有助于预防或治疗与炎症相关的肠道疾病和改变微生物组，例如炎症性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)或憩室炎。

本领域中使用的术语“低水平生理维生素D”与血清25(OH)D₃水平相关，并且基于骨骼健康参数。低于50nmol/L的25(OH)D₃水平被认为是低水平，并可能导致骨质疏松症。低于10-20nmol/L被认为非常低，可能导致儿童佝偻病。

该方法可以应用于预防或治疗CKD或与CKD相关的疾病或病症。CKD的特征是肾功能缓慢而进行性丧失，当疾病或病症损害肾功能时发生，导致肾损伤在数月或数年内恶化。一些导致CKD的疾病和病症包括：1型和2型糖尿病；高血压；肾小球肾炎；间质性肾炎；多囊肾病或其他遗传性肾病；尿路长期阻塞(来自前列腺肥大、肾结石和某些癌症等疾病)；膀胱输尿管反流和肾盂肾炎。

CKD分为五个阶段。这些阶段主要基于估计的肾小球滤过率(eGFR)测试结果。随着阶段数的增加，肾功能恶化。通常，阶段指定如下：

1.第1阶段-eGFR 90或更高(轻度肾损伤)；

2.第2阶段-eGFR介于60和90之间(轻度肾损伤，但有其他体征，例如尿液中的蛋白质和/或对肾脏的物理损伤)；

3.第3阶段-eGFR在30到59之间(对肾脏有一些损害，症状可能包括手脚肿胀、背痛、尿频或尿频、高血压、贫血、骨病)；

4.第4阶段-eGFR介于15和29之间(中度至重度肾损伤，以及与第3阶段相似的症状)；

5.第5阶段-eGFR低于15(非常接近肾衰竭，或已发生肾衰竭)。

根据本发明的治疗可用于第1阶段和第2阶段，并且在某些情况下可用于第3阶段。

如上所述，在CDK中观察到的肾脏活动逐渐降低会导致肾脏维生素D代谢途径的紊乱，导致维生素D水平过低。这会导致肠道钙吸收受损和低钙血症，这反过来会导致继发性甲状旁腺功能亢进症(SHPT)。发明人发现，通过抑制参与 1,25(OH)₂D₃分解代谢的一种酶(CYP24A1)，有可能将维生素D恢复到正常水平(即 25(OH)D₃水平)为50nmol/L或以上)。

因此，本公开还提供治疗和/或预防受试者中响应于CYP24A1抑制的疾病或病症的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，任选地与药学上可接受的赋形剂组合。

因此，疾病或病症可以是CKD，或与CKD相关的疾病或病症。与CKD相关的疾病或障碍可能是SHPT。因此，本公开还提供治疗和/或预防受试者中的CKD或与CKD相关的疾病或病症的方法，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的式(I) 化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，任选地与药学上可接受的赋形剂组合。与CKD相关的疾病或障碍可能是SHPT。

所述疾病或病症可以是化疗致胃肠道粘膜炎(GM)。化疗致胃肠道粘膜炎的主要原因之一是高剂量的癌症治疗。化疗致胃肠道粘膜炎的发生和持续涉及特定化疗药物、免疫系统和肠道微生物之间的交叉传播，导致粘膜完整性丧失，导致肠道屏障功能障碍。它被定义为胃肠道的炎症和/或溃疡性病变，其特征是隐窝丢失、绒毛萎缩、更新能力丧失和肠道功能受损。在一些实施方案中，如本文所定义的“胃肠道”不包括口腔或口腔。术语“胃肠道”也可能不包括咽、食道和胃。术语“胃肠道”可以指从幽门括约肌到直肠的胃肠道部分。

存在用于测量口腔粘膜炎的多种评估量表。最常用的两个量表是WHO和国家癌症研究所(NCI)不良事件通用术语标准(CTCAE)量表(Peterson,D.E.et al., Ann.Oncol.,2011.22(suppl.6):p.vi78-vi84):

WHO口腔粘膜炎量表

等级0＝无口腔粘膜炎

等级1＝红斑和酸痛

等级2＝溃疡，能吃固体

等级3＝溃疡，需要流质饮食(由于粘膜炎)

等级4＝溃疡，无法供给营养(由于粘膜炎)

NCI不良事件通用术语标准(CTCAE)4.0版:

等级1＝无症状或轻微症状；未指明干预

等级2＝中度疼痛；不干扰口服摄入；改良饮食指示

等级3＝严重的疼痛；干扰口服

等级4＝危及生命的后果；需要紧急干预

等级5＝死亡。

用于临床护理的大多数量表包含口腔症状、体征和功能障碍的集体测量(Peterson，D.E.等人，同上)。根据本发明的预防在任何症状发作之前是有用的，即在 WHO量表的0级或NCI量表的1级。在某些症状已经出现的情况下，预防也可能是有用的，例如，在WHO量表的1级或2级，或NCI量表的2级。鉴于实施例中讨论的增殖数据(Ki67抗体)，即使在发生一些损伤之后，施用式(I)化合物也可以增加增殖以在损伤后恢复肠绒毛，并且还防止后续轮次化疗中的GM。

本发明人已发现式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药有效预防化疗致GM。因此，本公开还提供了一种在受试者中预防化疗致GM的方法，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，任选与药学上可接受的赋形剂组合。涉及5-FU的化学疗法的实例包括乳癌的化学疗法(例如，5-FU、多柔比星和环磷酰胺的组合)和结肠癌的化学疗法(例如，5- FU、亚叶酸和奥沙利铂的组合，或5-FU的组合)、亚叶酸和伊立替康)。

式(I)化合物有效预防由涉及使用5-氟尿嘧啶(5-FU)的化疗致GM。因此，本公开还提供了在受试者中预防5-FU诱导的GM的方法，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或药学上可接受的盐、溶剂化物或其前药，任选地与药学上可接受的赋形剂组合。在该方法中，式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药可以在化疗之前给药，可以与化疗同时给药，和/或可以在化疗后不久给药。

本发明人还发现，式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药可有效防止肠道微生物群的组成改变，包括在化疗治疗的情况下(例如，涉及5-FU)。由 5-FU等化疗药物引起的DNA损伤会激活先天免疫系统，导致胃肠道受损细胞释放与损伤相关的分子模式分子(Cinausero,M.et al.,Front.Pharmacol.,2017.8:p.354；Sonis,S., NatureReviews Cancer,2004.4:p.277-284)。先天反应的过度激活通过募集巨噬细胞和上调转录因子NF-κB来破坏细胞膜，导致促炎细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的分泌；这一系列事件导致黏膜上皮细胞凋亡，导致肠内隐窝消融(Cinausero,M.et al.,ibid；Keefe,D.M,K.,etal.,Seminars in Oncology Nursing,2004.20(1):p.38-47)。结肠中的隐窝发育不全破坏了胃肠道上皮的屏障功能，允许腔内细菌侵入并定植到粘膜中，从而引起感染和溃疡(Naidu,M.U.et al.,Neoplasia,2004.6(5):p.423-431)。维持多样化和共生的肠道微生物群是非常可取的，因为它在调节宿主炎症、稳态免疫反应和增强肠道完整性方面发挥着关键作用(Pickard,J.M.et al.,Immunol.Rev.,2017.279(1):p.70-89)。5-FU 等化疗药物对肠道微生物群具有不利影响，因为它们将微生物的组成从共生菌转变为致病菌，导致生态失调(Stringer,A.M.et al.,J.Support Oncol.,2007.5(6):p.259-267)。本发明人发现，当施用式(I)的化合物时，有益细菌(例如毛螺菌科和双歧杆菌)的相对丰度显着增加，而病原菌(例如疣微菌和粪杆菌)的丰度显着降低。如前所述，1,25(OH)₂D₃在肠道中表现出免疫调节和抗炎作用，可预防多种胃肠道疾病。然而，1,25(OH)₂D₃被 CYP24A1分解代谢。因此，作为CYP24A1抑制剂并导致肠道中循环1,25(OH)₂D₃水平延长的式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药可以预防或通过维持肠道微生物群的组成，减轻化疗药物(如5-FU)引起的肠道损伤。

因此，本发明还提供了一种治疗和/或预防受试者中与炎症和改变的微生物组相关的肠道病症的方法，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物)或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，任选与药学上可接受的赋形剂组合。式(I)化合物有效治疗和/或预防与炎症和改变的微生物组相关的肠道功能失调，其中该失调是由化疗诱导的。因此，本公开还提供了一种治疗和/或预防受试者中与炎症和改变的微生物组相关的肠道功能失调的方法，其中该失调是由化疗诱导的，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，任选地与药学上可接受的赋形剂组合。在该方法中，式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药可以在化疗之前为患者给药，可以与化疗同时给药，或者可以在化疗后不久给药。化疗可能涉及使用5-氟尿嘧啶(5-FU)。因此，本公开还提供了一种预防和/或治疗受试者中与炎症和改变的微生物组相关的肠道疾病的方法，其中该疾病由涉及5-FU的化学疗法诱导，该方法包括给所述受试者施用治疗性的有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，任选地与药学上可接受的赋形剂组合。在该方法中，式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药可以在化疗之前为受试者给药，可以与化疗同时给药，和/或可以在化疗后不久给药。

与炎症和改变的微生物组相关的肠道功能失调可以是炎症性肠病(IBD)。IBD 是一个通用术语，用于描述许多涉及消化道慢性炎症的疾病，IBD的类型包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。因此，本发明还提供治疗和/或预防受试者IBD的方法，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或药学上可接受的盐、溶剂化物或前药其，任选地与药学上可接受的赋形剂组合。

与炎症和改变的微生物组相关的肠道功能失调可以是肠易激综合征(IBS)。 IBS是一种影响大肠的常见慢性疾病。体征和症状包括痉挛、腹痛、腹胀、胀气、腹泻或便秘，或两者兼而有之。因此，本发明还提供治疗和/或预防受试者的IBS的方法，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或药学上可接受的盐、溶剂化物或前药其，任选地与药学上可接受的赋形剂组合。

与炎症和改变的微生物组相关的肠道功能失调可以是憩室炎。当消化道中出现小而隆起的小袋(憩室)时，就会发生憩室炎。当这些小袋中的一个或多个发炎或感染时，这种情况称为憩室炎。体征和症状包括严重的腹痛、发烧、恶心和排便习惯的显着改变。因此，本发明还提供治疗和/或预防受试者憩室炎的方法，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或药学上可接受的盐、溶剂化物或前药其，任选地与药学上可接受的赋形剂组合。

本发明人还发现，通过使用式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药抑制CYP24A1来预防维生素D分解代谢降低了乳癌和肺转移的发生率。特别地，式 (I)的化合物可以降低乳癌的侵袭性，减少转移的发生，并减小肿瘤的大小。式(I)化合物不仅在CYP24A1活性异常高时可能有用。如果1,25(OH)₂D₃的合成因CYP27B1低而低，则式(I)化合物可以帮助保存所产生的1,25(OH)₂D₃。此外，全身给药的式(I)化合物可能有助于保持循环25(OH)D₃水平，有助于其有益效果。

本发明还提供治疗受试者的癌症的方法，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，任选与药学上可接受的赋形剂组合。特别地，癌症可以是乳癌。

受试者通常是人类受试者，然而该方法也适用于兽医学领域，因此，受试者也可以选自例如家畜(例如，牛、马、猪、羊)和山羊)、伴侣动物(例如狗和猫)和外来动物(例如非人类灵长类动物、老虎、大象等)。

在另一方面，本公开提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药用于治疗和/或预防与低水平生理维生素D相关的疾病或病症的用途。

本公开还提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药用于治疗和/或预防对应CYP24A1抑制的疾病或病症的用途。

另一方面，本公开提供了式用于治疗和/或预防与低水平生理维生素D相关的疾病或病症的(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。

本公开还提供了用于治疗和/或预防对应CYP24A1抑制的疾病或病症的式(I) 化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。

在另一方面，本公开提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药在制备用于治疗/或预防与低水平生理维生素D相关的疾病或病症的药物(例如药物组合物)中的用途。

本公开还提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药在制备用于治疗和/或预防对应CYP24A1抑制的疾病或病症的药物(例如药物组合物)中的用途。

在另一方面，本公开提供了用于治疗和/或预防与低水平生理维生素D相关的疾病或病症的药物组合物，其包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，以及药学上可接受的赋形剂。

本公开还提供了用于治疗和/或预防对应CYP24A1抑制的疾病或病症的药物组合物，其包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，以及药学上可接受的赋形剂。

如本文所用，短语“制备药物”包括使用式(I)的化合物直接作为药物或将其用在药物(例如药物组合物)制备的任何阶段中，所述药物包含一种或更多的式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。

在式(I)化合物为固体的情况下，本领域技术人员将理解，化合物(或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药)可以不同的结晶或多晶型形式存在，所有这些都包含在本公开的范围内。

术语“治疗有效量”或“有效量”是足以实现有益临床或期望结果的量。治疗有效量可以一次或多次给药。通常，治疗有效量足以治疗和/或预防疾病或病症或以其他方式减轻、改善、稳定、逆转、减缓或延迟疾病或病症的进展。仅举例来说，式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药的治疗有效量可包括每天约10mcg至约 50mcg，例如约10至约每天40微克。然而，尽管如此，本领域技术人员将理解，治疗有效量可以变化并取决于多种因素，包括特定化合物(或其盐、溶剂化物或前药)的活性、代谢稳定性特定化合物(或其盐、溶剂化物或前药)的作用时间、年龄、体重、性别、健康状况、给药途径和时间、特定化合物(或其盐、溶剂化物或前药)的排泄速率，以及例如与低水平生理维生素D相关的疾病或病症的严重程度。

根据本公开，式(I)化合物或其盐、溶剂化物或前药可用于治疗和/或预防疾病或病症。因此，应当理解，本公开的范围包括预防以及减轻疾病或病症的既定症状。因此，根据本公开的式(I)化合物激动剂的方法和用途包括：(1)预防或延缓疾病或病症的临床症状的出现，或在患病者中发展的疾病或病症学科；(2)抑制疾病或病症(即，阻止、减少或延迟疾病或病症的发展或其复发(在维持治疗的情况下)或至少一种临床或亚临床症状；和(3)缓解或减轻疾病或病症(即，导致疾病或病症或其临床或亚临床症状中的至少一种消退)。

式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药可以与另一种药剂组合施用，例如，另一种药剂：治疗和/或预防疾病或病症；其可增强式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药在治疗和/或预防疾病或病症中的活性；和/或通过式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药可增强其在治疗和/或预防疾病或病症中的作用。例如，如果受试者的维生素D水平低并且对仅通过补充维生素D来提高维生素D水平存在抵抗力，则维生素D补充剂与式(I)化合物的组合可能是有用的。此外，一些受试者由于过度分解代谢而对类似物治疗产生抗药性，因此该类似物与式(I)化合物的组合可增强该类似物的作用。关于上述癌症(包括乳腺癌)的治疗，化疗法和式(I) 化合物的组合可以治疗癌症并限制副作用(即粘膜炎)。

因此，在一些实施方案中，式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药将用于与一种或多种药剂的联合治疗中。该药剂可以是维生素D补充剂，例如麦角钙化醇(维生素D2)或胆钙化醇(维生素D3)。该药剂可以是维生素D类似物，例如阿法骨化醇、马沙骨化醇、多克骨化醇、ED-71或帕立骨化醇。该药剂可以是化疗剂，例如5-FU，或5-FU与其他化疗剂的组合，例如多柔比星和环磷酰胺、亚叶酸和奥沙利铂，或亚叶酸和伊立替康。

当与另一种药剂组合使用时，式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，以及另一种药剂可以在相同的药物组合物中或在单独的药物组合物中施用。如果以单独的药物组合物给药，式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，以及其它药剂可以同时或以任何顺序(例如，在几秒或几分钟甚至几小时内)相继给药(例如，1到2小时))。

本公开的化合物、用途和组合物在下文中参考以下非限制性实施例进一步描述。

实施例

实施例1–化学合成和纯化

试剂和化学品

用于合成式(I)化合物(简称VD1-6)的所有其他试剂，包括VD1-5和溶剂，均购自国药化学试剂有限公司(上海)。¹H和¹³C NMR光谱在室温下在作为溶剂的CDCl₃中在 Bruker400MHz NMR或Bruker 600MHz NMR光谱仪上记录。MS光谱数据由API 4000质谱仪采集。在硅胶(200-300目)上进行柱层析。对VD1-1、VD1-2等的引用对应于方案1中给出的化合物的引用。

VD1-6的合成规程

如上所述，碘-VD1-1是按照先前报道的方法从维生素D2中获取的。

(6R)-2,2-二甲基-6-((1R,4S,7aR)-7a-甲基-4-((三乙基甲硅烷基)氧基)八氢- 1H-茚-1-基)庚-3-酮(“VD1-2”)

在氮气气氛下，在0℃下将正丁基锂(1.09mL，2.5M的正己烷溶液)溶液缓慢加入二异丙胺(0.27mL，2.22mmol)中。在-78℃下使用THF(5mL)稀释混合物并搅拌20分钟。然后加入3，3-二甲基-2-丁酮(0.37mL，2.10mmol)并搅拌30分钟，然后加入 HMPA(1.71mL，7.74mmol)并再搅拌15分钟。向搅拌的混合物中加入碘-VD1-1(130mg, 0.30mmol)，搅拌2小时，然后升温至室温。用H₂O(1.0mL)淬灭反应并用EtOAc(3 ×20mL)萃取。合并有机部分并用盐水(10mL)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并浓缩。粗物质使用柱色谱法(正己烷)纯化，得到VD1-2(85mg，72％)，为无色油状物。¹H NMR (400MHz,CDCl₃)δ4.03(s,1H),2.54–2.33(m,2H),1.99–1.90(m,1H),1.87–1.76(m, 2H),1.75–1.63(m,2H),1.59–1.50(m,1H),1.43–1.18(m,9H),1.13(s,9H),0.99–0.84 (m,15H),0.54(q,J＝8.0Hz,6H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ216.8,56.8,53.2,44.4, 42.3,40.9,35.2,34.8,33.5,30.2,27.4,26.6,23.2,18.6,17.8,13.7,7.1,5.1.MS(ESI)计算对于C₂₅H₄₈NaO₂Si[M+Na]⁺:431.33,发现:431.43,839.21[2M+Na]⁺。

(6R,E)-2,2-二甲基-6-((1R,4S,7aR)-7a-甲基-4-((三乙基甲硅烷基)氧基)八氢-1H-茚-1-基)庚-3-酮-O-甲基肟(“VD1-3”)

向VD1-2(300mg,0.74mmol)的吡啶(6mL)溶液中加入NH₂OCH₃·HCl(1.23g,14.70mmol)。将混合物在室温下搅拌4小时，然后用H₂O(10mL)淬灭并用EtOAc(3× 30mL)萃取。合并有机部分并用盐水(20mL)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并浓缩。使用柱色谱法(2-10％CH₂Cl₂的正己烷溶液)纯化粗物质，得到VD1-3(220mg，69％)，为无色油状物。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.03(s,1H),3.78(s,3H),2.38–2.25(m, 1H),2.08–1.89(m,2H),1.91–1.74(m,2H),1.72–1.18(m,12H),1.10(s,9H),1.00–0.90 (m,15H),0.55(q,J＝8.0Hz,6H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ167.6,69.6,61.1,56.5, 53.5,42.3,41.0,37.4,36.5,34.8,32.6,28.0,27.4,23.4,23.3,18.5,17.9,13.7,7.1,5.1.MS (ESI)计算对于for C₂₆H₅₂O₂Si[M+H]⁺:438.38,发现:438.62。

(1R,7aR)-1-((R,E)-5-(甲氧基亚氨基)-6,6-二甲基庚烷-2-基)-7a-甲基八氢- 4H-茚-4-酮(“VD1-4”)

将混合物在室温搅拌1小时，然后用饱和溶液淬灭反应。NaHCO₃(5毫升)。混合物用EtOAc(3×20mL)萃取，合并有机部分，用盐水(20mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，浓缩。将粗物质溶解在CH₂Cl₂(5mL)中并加入PDC(415mg，0.32mmol)。将混合物在室温下搅拌40分钟，然后用CH₂Cl₂(20mL)稀释并通过硅藻土过滤。收集滤液并用饱和NaHCO₃ (10mL)和盐水(10mL)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并浓缩。使用柱色谱法(5％EtOAc的正己烷溶液)纯化粗物质，得到无色油状的VD1-4(110mg,68％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃) δ3.78(s,3H),2.47–2.42(m,1H),2.34–2.20(m,3H),2.12–2.09(m,1H),2.06–1.98(m, 2H),1.96–1.87(m,2H),1.77–1.69(m,1H),1.57–1.49(m,3H),1.47–1.40(m,2H),1.36– 1.29(m,2H),1.10(s,9H),1.01(d,J＝6.0Hz,3H),0.64(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃) δ212.1,167.1,62.1,61.1,56.3,50.0,41.1,39.1,37.4,36.6,32.5,28.0,27.6,24.2,23.2,19.3, 18.6,12.6.MS(ESI)计算对于C₂₀H₃₆NO₂[M+H]⁺:322.27,发现:322.76。

(6R,E)-6-((1R,7aR,E)-4-((Z)-2-((3S,5R)-3,5-二羟基-2-亚甲基亚环己基)- 亚乙基)-7a-甲基八氢-1H-茚-1-基)-2,2-二甲基庚-3-酮-O-甲基肟(“VD1-6”)

在-78℃和氮气氛下，向搅拌的VD1-5(286mg，0.49mmol)在无水THF(6mL)中的溶液中滴加n-BuLi(0.2mL，0.50mmol，2.5M的正己烷溶液).将混合物在-78℃搅拌15分钟，然后加入VD1-4(110mg，0.35mmol)的无水THF(3mL)溶液。在-78℃继续搅拌 4小时，然后在0℃搅拌12小时。用饱和淬灭反应。NH4Cl(1mL)并用EtOAc(3×20 mL)萃取。合并有机部分并用盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩。使用柱色谱法(1％EtOAc的正己烷溶液)纯化粗物质，得到溶解在MeOH(3mL)中的无色油状物 (60mg)。向该溶液中加入CSA(60mg,0.32mmol)，并将混合物在室温下搅拌3h，然后用饱和溶液淬灭。NaHCO₃(2毫升)。混合物用EtOAc(3×10mL)萃取，合并有机部分，用盐水(5mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，浓缩。粗物质使用柱色谱法(50％EtOAc的正己烷溶液)纯化，得到无色油状VD1-6(30mg，43％，两步)。¹HNMR(600MHz,CDCl₃)δ6.39(d,J＝11.2Hz,1H),6.03(d,J＝11.2Hz,1H),5.33(s,1H),5.00(s,1H),4.46–4.40(m, 1H),4.27–4.19(m,1H),3.79(s,1H),2.84–2.81(m,1H),2.61–2.59(m,3H),2.33–2.28 (m,2H),2.05–1.97(m,4H),1.94–1.88(m,2H),1.72–1.67(m,2H),1.51–1.40(m,6H), 1.33–1.25(m,5H),1.11(s,9H),0.99(d,J＝6.5Hz,3H),0.55(s,3H)；¹³C NMR(150MHz, CDCl₃)δ167.4,147.6,143.3,132.8,125.04,117.01,111.8,70.8,66.9,61.0,56.3,55.9,45.9, 45.3,42.9,40.4,37.2,37.1,32.5,29.1,27.9,27.5,23.6,23.2,18.6,12.0.MS(ESI)计算对于 C₂₉H₄₈NO₃[M+H]⁺:458.36,发现:458.65。

实施例2–VD1-6的生物学评价

VDR竞争性结合分析

规程

采用PolarScreen^TMVDR竞争性分析盒，红色(Life Technologies Australia PtyLtd, Thermo Fischer Scientific,Scoresby,Victoria,Australia)进行所述分析。试剂盒制造商提供的VDR重组人蛋白(32,100nM)、Fluormone^TMVDR Red示踪剂(100nM)和二硫苏糖醇(DTT)溶液在使用前在冰上解冻30分钟。制备足量的完整VDR Red筛选缓冲液“完整缓冲液”(每1mL VDR Red筛选缓冲液加入5μL DTT)并保持在冰上直至使用。在DMSO中分别制备1,25(OH)₂D₃、25(OH)D₃(Sigma Aldrich，Castle Hill，NSW， Australia)和VD1-6的初级储备溶液(106nM)。从这些溶液中，为DMSO中的三种化合物中的每一种制备了15种另外的三倍系列稀释液，该系列中的最低浓度为0.07 nM。为了进行测定，每种化合物的16种DMSO稀释液中的每一种都使用完全缓冲液进一步稀释50倍，得到的最高和最低浓度分别为2×104nM和0.0014nM，稀释后DMSO浓度为2％。为了制备VDR/Fluormone^TM复合物，分别制备4nMFluormone ^TM和14.48nM VDR全长蛋白质溶液，方法是使用完全缓冲液适当稀释制造商的储备溶液，然后将Fluormone^TM溶液涡旋混合10秒并倒置混合仅适用于VDR解决方案。将足量等体积的Fluormone^TM和VDR稀释液合并并通过倒置混合，最终溶液(2nM Fluormone^TM/7.24nM VDR)保持在冰上直至使用。

在384微孔板(4511，低容量，黑色，聚苯乙烯，圆底，未灭菌，未处理)中，16种(0.0014–2×104nM)系列稀释液中的每一种均取10μL等分试样对于三种测试化合物中的每一种，将其移液到一式三份的相邻孔中。然后向这些孔中加入10μL(2nMFluormone^TM/7.24nM VDR)溶液，使测试化合物的最终浓度范围为 0.0007至1×104nM，Fluormone^TM最终浓度为1nM，最终VDR完整长度浓度为 3.62nM(制造商推荐的批次特定浓度)。将Fluormone^TM/VDR复合物添加到含有10μL 空白2％DMSO完全缓冲液的孔柱和10μL2×104nM 1,25(OH)₂D₃，分别。每个孔中的最终DMSO浓度为1％，以匹配制造商推荐的分析溶剂耐受性。将板盖上盖子并在轨道摇床上以60rpm的速度水平摇动5分钟，然后在室温下孵育3小时。然后在配备红色荧光偏振滤光片(激发/发射，530/590nm)的酶标仪Cytation^TM5多模式 (Biotek，Winooski，VT，美国)上在25℃下测量荧光偏振值(mP).使用GraphPad8.3.0for Windows,GraphPad Software,San Diego，美国加利福尼亚州，www.graphpad.com。

结果和讨论

重要的是要确定VD1-6在生物学评估中使用的浓度是否对VDR结合具有亲和力。VD1-6、1,25(OH)₂D₃和25(OH)D₃的VDR竞争对手测定实验结果如图1所示。使用 S型剂量反应(可变斜率)曲线(Carpenter，V.T.,et al.,Bone,2012.50(3):p.688-94)对 1,25(OH)₂D₃、25(OH)D₃和VD1-产生0.93、56.2和438nM的模拟结合IC50值6、分别。这些浓度是从其VDR结合中置换一半高亲和力荧光示踪剂所需的浓度，这导致平均荧光偏振相应下降50％。结果表明，VD1-6与VDR活性位点的结合亲和力比 1,25(OH)₂D₃低约470倍(438/0.93)。此外，VD16与VDR的结合仅在浓度大于10- 7M时才明显(图1)。25(OH)D₃与VDR结合的亲和力明显低于1,25(OH)₂D₃，其对 VDR的结合亲和力比1,25(OH)₂D₃降低60倍，这与之前的报道一致并表明VD1-6对 VDR的亲和力低于25(OH)D₃。

1,25(OH)₂D₃和VD1-6与CYP24A1的计算机对接比较

由于结合而发生的分子自由能变化(相对结合自由能)的计算机辅助模拟测量被认为是小配体分子与蛋白质分子靶标的结合亲和力的一种潜在可靠的衡量方式(Cournia,Z.,B.Allen,and W.Sherman,J.Chem.Inf.Model.,2017.57(12):p.2911-2937；Wan, S.,et al.,Interface Focus,2020.10(6):p.20200007)。进行VD1-6与CYP24A1结合口袋的计算机对接，以评估与1,25(OH)₂D₃相比对CYP24A1结合位点的亲和力。在PDB中没有人CYP24A1的晶体结构的情况下，可用的大鼠CYP24A1蛋白用于对接研究。据报道，人和大鼠CYP24A1之间的相似性为85％，大鼠变体匹配13个关键氨基酸中的11个用于底物结合和催化(Annalora,A.J.,et al.,J.Mol.Biol.,2010.396(2): p.441-451；Jayaraj,J.M.,etal.,J Biomol Struct Dyn,2019.37(7):p.1700-1714)。

规程

使用与两性离子表面活性剂共结晶的大鼠线粒体细胞色素P450 24A1的晶体结构：蛋白质数据库(PDB)ID：3K9V(和)(Annalora，A.J.等人，同上)。通过首先确定1,25(OH)₂D₃和VD1-6的适当SMILES字符串来获得用于对接的配体结构。3D构象异构体的枚举通过OMEGA 3.3.0.3进行，具有默认的最大构象异构体数(200)(Hawkins,P.C.D.,et al.,J.Chem.Inf.Model.,2010.50(4):p.572-584； OMEGA3.3.0.3.2019,OpenEye Scientific Software:Santa Fe,NM,USA)。VD1-6和 1,25(OH)₂D₃分别产生60和62个构象。使用选定的CYP24A1晶体结构，使用 Make Receptor 3.3.0.3(Make Receptor 3.3.0.3.2019，OpenEye Scientific Software：Santa Fe，NM，USA)获得结合口袋。选择了蛋白质和共结晶配体的适当部分，并且根据默认设置不包括自动生成的约束。没有改变场地形状潜力。使用FRED 3.3.0.3作为OE 对接套件的一部分对受体进行对接研究(FRED 3.3.0.3.2019,OpenEye Scientific Software: Santa Fe,NM,USA；McGann,M.,J.Chem.Inf.Model.,2011.51(3):p.578-596；McGann,M., J.Comput.Aided Mol.Des.,2012.26(8):p.897-906)。对接分辨率设置为“高”，姿势数限制为1。两个配体成功对接，并使用VIDA 3.3.0.3(VIDA 3.3.0.3.2019,OpenEye Scientific Software:Santa Fe,NM,USA)在3D空间中检查了预测的取向。生成的chemgauss4分数根据对接的1,25(OH)₂D₃和VD1-6与受体袋的拟合优度以及与周围残基的相互作用进行排名。

结果和讨论

CYP24A1结合口袋中1,25(OH)₂D₃和VD1-6的模拟对接位置如图2所示。配体结合位点表现出与Jayaraj等人指出的相似的氨基酸残基。(同上)即GLU 329和THR 330用于CYP24A1主动结合隧道。1,25(OH)₂D₃在其末端C-25羟基和THR 330之间具有一个氢键，而VD1 6显示出从C-1羟基到MET 246的单个氢键。1,25(OH)₂D₃的对接姿势与Annalora等人的研究结果一致。(同上)，其中C-1和C-3羟基位于 THR 395残基附近。

模拟对接到CYP24A1的活性结合袋中显示VD1-6的结合涉及氢键模式相对于1,25(OH)₂D₃的变化。这可能归因于VD1-6的C-25末端缺乏末端羟基部分，这也可以解释图2中所见的结合袋内方向的预测反转。对接分数显示VD1-6排名更高与内源性配体1,25(OH)₂D₃(-12.30和-11.64相对chemgauss4对接分数)相比，它们与CYP24A1活性结合位点对接，这表明VD1-6与CYP24A1的相对结合亲和力更高。

值得注意的是，为了使1,25(OH)₂D₃在CYP24A1活性位点的C-23或C-24 处被分解代谢羟基化，末端侧链(C-21至C-25)需要定位于酶的血红素部分 (Schuster,I.,BiochimBiophys Acta,2011.1814(1):p.186-99)。本文进行的对接实验表明， 1,25(OH)₂D₃和VD1-6的模拟姿势似乎与这一概念一致，脂肪族侧链向血红素部分倾斜并具有适当的相互作用灵活性。从代谢的角度来看，VD1-6的C-24O-甲基肟部分可能会阻止C-24羟基化，使其只能沿着C-23途径进行。另一方面，内源性配体 1,25(OH)₂D₃可以通过C-23和C-24分解代谢途径进行。除了占据的C-24外，VD1- 6与CYP24A1相互作用的更大潜力表明VD1-6是一种更有效的CYP24A1结合剂，具有部分分解代谢免疫，即可能是维生素D分解代谢的抑制剂，半衰期可能比内源性配体。

HEK293T细胞培养实验

HEK293T细胞在包含最低必需培养基α(α-MEM)(Thermo-Fisher Scientific,Scoresby,VIC,Australia)、10％v/v胎牛血清(FBS)(Thermo-Fisher)和组织培养添加剂的标准使用的生长培养基中维持在37℃，所述添加剂包括25nM HEPES、2 mM L-谷氨酰胺和抗生素：100U/mL青霉素G/链霉素。对于实验，细胞以30％的融合度接种在24孔组织培养板中，并在处理应用前允许附着24小时。

实验1–对VD1-6的遗传反应

规程

细胞附着后，将培养孔(n＝5)暴露于载体对照(0.2％v/v乙醇(Sigma Aldrich,Castle Hill,NSW,Australia))或VD1-6(10^-7M)、1,25(OH)₂D₃(10^-7M)和VD1-6和 1,25(OH)₂D₃的混合物，均为10^-7M。三种处理中的每一种都来自复制孔的细胞然后按照制造商的方案(ThermoFisherScientific.TRIzol Reagent User Guide.[Accessed July 2021]；Available from:https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf)。简而言之，在去除培养基后，将200μL添加到每个孔中未洗涤的细胞中以裂解它们。然后将每个孔的裂解物转移到1.5mL Eppendorf管中，然后加入40μL氯仿 (Sigma Aldrich，Castle Hill，NSW，Australia)，然后通过倒置混合管内容物并在4℃下以12,000rpm离心15分钟。将上层水层转移至新试管中，加入100μL异丙醇(SigmaAldrich，Castle Hill，NSW，Australia)并将试管内容物孵育10分钟，然后在4℃下以 12,000rpm离心10分钟C，然后弃去上清液。洗涤时，将200μL 70％乙醇(Sigma Aldrich，CastleHill，NSW，Australia)加入RNA沉淀中，涡旋5秒，然后在4℃下以7,500rpm离心5分钟，然后弃去上清液，将RNA沉淀风干10分钟。将RNA沉淀重新悬浮在25μL无RNase的水(SigmaAldrich，Castle Hill，NSW，Australia)中，然后将试管在60℃水浴中孵育10分钟，然后在-80℃下储存用于实时PCR分析。

结果和讨论

图3显示了VD1-6与1,25(OH)₂D₃单独和组合对在HEK293T细胞中于24小时CYP24A1、CYP27B1和VDR的mRNA水平的影响的比较研究。在10^-7M，与空白对照相比，VD1-6不影响CYP24A1 mRNA水平(图3A)。然而，等效浓度的 1,25(OH)₂D₃与CYP24A1 mRNA水平的显着升高(p＜0.05)相关，是载体对照的3.5 倍。VD1-6和1,25(OH)₂D₃的组合导致对CYP24A1表达的刺激更大，达到使用载体对照观察到的基线mRNA水平的6倍(p＜0.05)，同时也显着高于对应于1,25(OH)₂D₃处理的mRNA水平1.7倍(p＜0.05)(图3A)。另一方面，与空白对照所观察到的mRNA 水平相比，CYP27B1(图3B)和VDR(图3C)的mRNA水平在使用VD1-6、 1,25(OH)₂D₃或其联合治疗时没有显示出任何显着变化。

VD1-6与内源性配体(如上所述)相比的体外无细胞VDR结合测定和计算机对接结果的组合清楚地表明VD1-6具有成为CYP24A1抑制剂的潜力，而没有显着的 VDR结合，至少高达10^-7M的浓度。与此一致，VD1-6在10^-7M超过24小时不诱导CYP24A1 mRNA，不像1,25(OH)₂D₃，表明不存在VDR通过VD1-6结合。然而， VD1-6与1,25(OH)₂D₃的结合导致CYP24A1mRNA水平更显着增加，这表明VD1-6 可能通过与1,25(OH)₂D₃的结合和抑制CYP24A1，从而增加1,25(OH)₂D₃的半衰期。此外，VD1-6不影响CYP27B1和VDR mRNA水平，这表明VD1-6的作用对 1,25(OH)₂D₃活性具有特异性。

实验2–通过VD1-6保存1,25(OH)₂D₃

为了确定VD1-6处理是否发生减少的1,25(OH)₂D₃分解代谢，测试了 1,25(OH)₂D₃在HEK293T细胞培养物中长达24小时的保存。

规程

将培养的孔(n＝4)暴露8和24小时于载体(0.2％v/v乙醇)和10^-7M的VD1-6作为对照，并在5x10^-10M分别处理1,25(OH)₂D₃，不存在和存在10^-8M和10^-7M的VD1- 6情况下。在处理后8和24小时收集对照孔和处理孔的上清液，并在-80℃下与时间为零的样品一起储存1,25(OH)₂D₃ LC-MS/MS分析。

结果和讨论

LC-MS/MS分析添加到HEK293T细胞培养物中的1,25(OH)₂D₃浓度的结果，在不存在和存在浓度为10^-8和10^-7M的VD1-6的情况下，时间为零、以及在处理后8小时和 24小时，如图4所示。在没有VD1-6的情况下，1,25(OH)₂D₃浓度在8小时内表现出83pM(p＜0.05)的快速平均下降，至达到451±27.7pM的平均浓度。发现这种下降速度超过8小时(即一阶速度)，在接下来的16小时内进一步但不显着的平均下降29pM。这导致24小时的平均1,25(OH)₂D₃水平为422±11.9pM，这与时间零平均水平(p＜0.05)显着不同。

包含VD1-6导致添加的1,25(OH)₂D₃水平的剂量依赖性保存。与在类似时间不存在VD1-6情况下的水平相比，10^-8M的VD1-6对在8小时时就平均1,25(OH)₂D₃水平而言的分解代谢没有显着抑制。然而，在VD1-6浓度下，在8小时观察到的分解代谢抑制水平似乎持续到24小时，这导致1,25(OH)₂D₃的平均浓度为480±28.3pM，这是显着不同的(p＜0.05)与没有VD1-6的24小时相比。然而，在VD1-6浓度较高时，即10^-7M，分解代谢显着抑制在8小时内明显，平均1,25(OH)₂D₃浓度为534 ±25.9，差异显着(p＜0.05)与不存在VD1-6时8小时的平均浓度相比，与零时的平均浓度没有显着差异。这种对分解代谢的抑制作用持续至24小时(即，与8小时和零时的情况无显着差异)，平均1,25(OH)₂D₃浓度为506±28.9pM，有显着差异(p＜ 0.05)来自没有VD1-6时24小时的平均浓度。在24小时，10^-8M和10^-7M VD1-6 的平均1,25(OH)₂D₃浓度没有显着差异，表明这两种浓度的长期保存效果可能相当。

总之，虽然1,25(OH)₂D₃水平在8小时前下降了16％，在24小时前下降了 22％，但在10^-7M时，VD1-6阻止了1,25(OH)₂D₃的这种下降24小时期间。虽然在 10^-8M时，VD1 6在8小时对1,25(OH)₂D₃下降的预防效果较差，但该VD1-6浓度对 24小时1,25(OH)₂D₃水平的保护作用与10^-7M VD1-6的效果。

实验3–VD1-6对HEK293T细胞培养中24,25(OH)₂D₃产生的影响

为了评估VD1-6对25(OH)D₃分解代谢的影响，HEK293T细胞用25(OH)D₃处理超过72小时，24,25(OH)₂D₃的培养基水平和CYP24A1的mRNA水平为在 VD1-6不存在和存在的情况下测量。

规程

对上述实验2的类似对照进行培养孔(n＝4)72h暴露，以及在没有和有10^-11、10^-10、10^-9、10^-8、10^-7M VD1-6分别作为单独处理的情况下对10^-6M 25(OH)D₃进行培养孔(n ＝4)72h暴露。在处理结束时，从每组一式四份的孔中收集上清液并储存在-80℃以进行24,25(OH)₂D₃ LC-MS/MS分析。然后按照实验1中的描述对细胞进行总RNA 分离处理。

结果和讨论

在存在25(OH)D₃(10^-6M)的情况下，HEK293T细胞产生24,25(OH)₂D₃，比载体处理细胞中的水平高约170倍(图5A)。包含VD1-6导致对平均累积24,25(OH)₂D₃浓度的双相浓度依赖性影响。在10^-10M VD1-6时，与单独使用25(OH)D₃处理的水平相比，观察到平均24,25(OH)₂D₃浓度增加了14％(p＜0.05)。然而，在较高浓度下，VD1-6处理不会增加24,25(OH)₂D₃水平，10^-8M VD1-6处理导致水平没有变化，而在10^-7M VD1- 6下，显着与单独使用25(OH)D₃处理(16％，p＜0.05)、VD1-6 10^-11M(20％，p＜0.05) 相比，24,25(OH)₂D₃水平下降，10^-10MVD1-6(27％p<0.0001),VD1-6 10^-9M(24％,p＜ 0.0001)或VD1-6 10^-8M(15％,p＜0.05)。尽管25(OH)D₃处理增加了HEK293T细胞中的CYP24A1 mRNA水平，但VD1-6的加入并未进一步提高CYP24A1 mRNA水平 (图5B)。尽管在10^-10M VD1-6时升高的24,25(OH)₂D₃水平似乎与升高的CYP24A1 mRNA水平相关，但这没有统计学意义。与仅25(OH)D₃处理中的mRNA水平相比，使用10^-7M VD1-6的25(OH)D₃处理中24,25(OH)₂D₃水平的下降并不对应于CYP24A1 mRNA水平的变化，这表明24,25(OH)₂D₃下降不是由于CYP24A1表达减少。

因此，10^-7M的VD1-6还能够减少25(OH)D₃分解代谢，如通过形成 25(OH)D₃分解代谢的第一个产物24,25(OH)₂D₃所测量的，很可能是通过对CYP24A1 活性位点的重大竞争和占领。有趣的是，VD1-6在10^-10M时24,25(OH)₂D₃水平升高可能是由于1,25(OH)₂D₃的保存使CYP24A1活性反升高所致。虽然在本实验中，无法区分25(OH)D₃的作用、1,25(OH)₂D₃的合成以及VD1-6对CYP24A1 mRNA表达的抗分解代谢作用，但VD1-6的抗分解代谢作用加剧CYP24A1诱导是合理的，给予 VD1-6治疗，当与1,25(OH)₂D₃结合时可增强CYP24A1表达(图3A)。

其他通用实验规程

实时PCR分析

通过定量PCR分析从2.4.1中描述的实验培养孔获得的重复总RNA样品的CYP24A1、CYP27B1和VDR mRNA，而从2.4.3中提取的四份RNA仅对 CYP24A1 mRNA进行定量。使用iScript^TMcDNA合成试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA, USA)按照制造商的方案[46]输入来自每个样品的2000ng总RNA进行逆转录 (RT)，并结合基因组DNA清洗。然后使用Forget-Me-Not^TM qPCR Master Mix(Biotium,Fremont,CA,USA)将12.5ng总RNA等量的RT产物输入每个实时 PCR反应以确定靶基因mRNA水平。使用CFX Connect实时PCR检测系统(Bio- Rad，California，USA)进行实时PCR。所用引物组的序列为：CYP24A1基因、正向 -5'-CCTGCTGCCAGATTCTCTGGAA-3'、反向-5'-TTGCCATACTTCTTGTGG TACTCC-3'；CYP27B1基因、正向-5'-CAGACAAAGACATTCATGTGGG-3'、反向-5'- GTTGATGCTCCTTTCAGGTAC-3'；VDR基因，正向-5'-CCAGTTCGTG TGAATGATGG-3'，反向-5'-GTCGTCCATGGTGAAGGA-3'和肌动蛋白B(ACTB)基因(用于对三个监测基因中的每一个进行相对定量的管家基因)，正向-5'-AAGAGATGGCCACGGCT-3'，反向-5'-CAATGATCTTGATCTTCATTGTGC-3'。

LC-MS/MS分析

如前所述，使用DAPTAD衍生化和LC-MS/MS分析来自实验3的细胞培养样品中的24,25(OH)₂D₃浓度(Alshabrawy,A.K.,et al.,J.Chromatogr.B,2021.1173:p.122654)。校准品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备，并用PBS适当稀释样品以使它们进入测定的线性范围。相同的LC-MS/MS方法针对1,25(OH)₂D₃分析进行了修改，以通过使用更高的初始样品体积(200μL而不是50μL)和将最终衍生的1,25(OH)₂D₃在20μL并注入 15μL(而不是在25μL中重新溶解并注入5μL)到LC-MS/MS色谱柱上。如先前报道的，多反应监测(MRM)离子对用于量化1,25(OH)₂D₃-DAPTAD衍生物及其氘代同位素(1,25(OH)₂D₃-d₆)的衍生物(Ishige,T.,etal.,Clin.Chim.Acta,2017.473:p.173-179)。还获得了衍生物的R和S异构体(Ishige,T.等人,同上)的类似双色谱峰，并类似地用于定量。

统计分析

使用GraphPad8.3.0用于Windows,GraphPad Software,San Diego,California USA,www.graphpad.com，对非参数数据使用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析，并使用二次Tukey多重比较检验来确定治疗组之间的差异。

实施例3–VD1-6在5-FU诱导的胃肠道粘膜炎中的作用

规程

CYP24A1敲除小鼠

为了选择性地从肠上皮细胞中删除Cyp24a1，Villin-Cre转基因小鼠(由阿德莱德大学的Joanne Bowen教授友情捐赠)与纯合Cyp24a1 floxed(Cyp24a1fl/fl)小鼠在C57Bl/6背景上繁殖。随后培育表达Cre重组酶转基因的纯合Cyp24a1fl/fl和Villin-Cyp24fl/fl后代以产生含有Cre重组酶转基因和floxed Cyp24a1等位基因(IntCyp24a1-/-) 纯合的小鼠。

使用引物p1(5'-GCGCATAACGATACCACGAT-3')与引物p2(5'-CCAGCCCCAGGTTTTAATGT-3')组合，通过PCR确认重组Cyp24a1敲除等位基因。两种引物的位置如图6A所示，在CYP24A1基因的外显子5缺失后，得到的PCR 扩增子为369bp。

将雄性Villin-Cre-CYP24A1纯合基因敲除(IntCyp24a1-/-)和CYP24A1 floxed对照(Cyp24a1fl/fl)小鼠(8周龄，每个基因型分别n＝10和8)用于缺失研究。获得野生型C57Black6(n＝36)(Animal Resource Centre,Perth,Australia)用于治疗抑制研究。所有小鼠均喂食含有标准维生素D(1000IU/kg)和钙(1％)的标准AIN- 93半合成饮食，自由饮水，并在22±1℃调节的动物设施中饲养，并受制于14:10 小时的明暗循环。

所有实验小鼠在注射单次亚致死剂量的450mg/kg 5-FU腹膜内(i.p.)体积为200μL之前，用吸入异氟烷(2％在100％氧气中)进行麻醉，以诱发粘膜炎而无死亡。对照小鼠腹腔注射。用等体积的无菌生理盐水。

每天对小鼠称重并在施用5-FU后每天监测两次的毒性标准：无光泽/皱褶的皮毛、无光泽/凹陷的眼睛、刺激时缺乏运动、驼背和腹泻。在5-FU给药后48小时，通过深吸入麻醉和心脏穿刺，人道地杀死小鼠，然后进行颈椎脱位。胃肠道从幽门括约肌到直肠解剖，分成小肠(幽门括约肌到回盲部括约肌)和结肠(升结肠到直肠)。用冷冻的无菌PBS冲洗小肠并称重。在近端(十二指肠)和25％(空肠)长度处收集样本 (1厘米)用于组织学，随后收集2厘米样本用于DNA和RNA分析。结肠也用冷冻的无菌PBS冲洗并称重。在近端收集样本(1cm)用于组织学，随后收集2cm样本用于RNA分析。组织学样品固定在10％中性缓冲福尔马林中，加工并包埋在石蜡中。用于RNA分析的样品在液氮中速冻并储存在-80℃。从心脏穿刺收集的血液以11,000 rpm的速度离心，血清储存在-20℃。

DNA分离和分析

为了证明CYP24a1在肠道中被选择性删除，分析了来自Cyp24a1fl/fl和IntCyp24-/- 小鼠的组织样本，包括肠道(十二指肠、空肠和结肠)、肾脏和肝脏。将每个组织(0.5 g)切成小块，然后放入500μL消化混合物中，其中含有1x TES(2-[(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)氨基]乙磺酸)缓冲液，30μg/μL蛋白酶K和20％十二烷基硫酸钠 (SDS)，然后在55℃下孵育过夜。

随后将消化的器官置于冰上10分钟以允许沉淀，然后在4℃以13,000rpm 离心10分钟。收集上清液，加入1mL异丙醇和3uL糖原沉淀DNA。将样品在4℃ 下以13,000rpm离心1分钟，弃去上清液。DNA沉淀在1mL 70％乙醇中洗涤并在 4℃下以13,000rpm离心1分钟。除去上清液，将沉淀在室温下风干30分钟。然后将DNA重新悬浮在100μL TE缓冲液(pH 8)中并在4℃下储存过夜。用NanoDrop 分光光度计(NanoDrop Technologies,Wilmington,Del.,USA)分析DNA以确定纯度和浓度。使用TE缓冲液(pH 8)将DNA以含有20ng DNA的工作溶液等分试样在- 20℃下储存。

RNA分离

根据制造商的说明，使用NucleoSpin^TMRNA分离试剂盒(Machery-Nagel，Düren，Germany)从空肠和结肠中分离和纯化RNA。简而言之，将组织(40mg)均质化并添加到裂解溶液中。通过以11,000rpm的转速离心1分钟，将裂解物涡旋并过滤。将上清液与350μL70％乙醇混合以调整RNA结合条件。将匀浆溶液转移到RNA结合柱中并离心。将膜脱盐以提高DNA消化的有效性。将DNase溶液添加到用于DNA消化的结合柱中，并分别用高和低严格度洗涤缓冲液去除残留的DNA，在洗涤之间进行离心。用不含RNase的H₂O从膜上洗脱RNA。用NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technologies,Wilmington,Del.,USA)分析RNA以确定纯度和浓度。RNA完整性数 (RIN)值由南澳大利亚健康与医学研究所(SAHMRI)的SA基因组学中心作为外部服务确定。只有RIN值大于7的样品用于下游分析。

cDNA转化

使用Transcriptor^TMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Roche MolecularSystems Inc.,Basel, Switzerland)将RNA转化为cDNA。简而言之，将4μL Transcriptor^TM脱氧核苷酸混合物、1μL Transcriptor^TM逆转录酶和1μL RNA模板加入到无核酸酶水中，使反应体积为20μL。样品在25℃下变性10分钟进行变性，在50℃下退火60分钟，在85℃ 下延伸5分钟。通过PCR扩增目标cDNA 39个循环。使用NanoDrop(NanoDrop Technologies,Wilmington,Del.,USA)分析转录的样品。

实时PCR分析

使用CFX Connect实时PCR检测系统(Bio Rad，California，USA)进行实时PCR。扩增混合物包含1μL cDNA、5μL 2X SYBR green(Bio-Rad Laboratories Inc.USA)、 3μL PCR级水和0.5μL正向和反向引物(GeneWorks，Adelaide，Australia)，形成最终体积10微升。

热循环条件针对每个引物组进行了单独优化(表1)。Rlpl0被用作管家基因，分别对肠道和肾脏样本中每个感兴趣的基因进行相对定量。所有样品一式两份重复，实验阈值(Ct)由CFX Connect程序计算。

表1.肠引物序列

Wang,F.et al.,Anal.Biochem.,2010.399(2):p.211-217；Bai,X.,et al.,J.Clin. Invest.,2016.126(2):p.667-680。

历史

使用常规H&E染色分析肠道的结构完整性(如前所述，参考)。使用20倍物镜在Nanozoomer(细节)上扫描切片，并使用NDP.view2软件(日本滨松)分析图像。测量绒毛高度(绒毛基部到绒毛顶端)每个切片至少15个完整绒毛。还测量了每个部分至少15个完整的隐窝的隐窝深度(隐窝底部到隐窝-绒毛连接处)。

免疫组织化学

为了确定CYP24A1缺失或抑制是否影响增殖细胞数量，使用抗ki-67抗体(Sigma-Aldrich)进行免疫组织化学。将切片(4μm)置于涂有硅烷的载玻片(HD Scientific,Sydney,New South Wales,Australia)上，并在60℃下加热2小时。切片在二甲苯中脱蜡，并通过分级乙醇和蒸馏水再水化，然后是PBS。抗原修复是通过酶促修复在37 ℃下使用蛋白酶K消化20分钟进行的。然后在含有1％Tween-20的PBS中清洗切片。用甲醇中的3％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶1分钟。用封闭溶液(BioLegend， Dedham，USA)封闭非特异性抗体结合30分钟。在PBS中洗涤后，使用Avidin and Biotin试剂盒(Vector Laboratories，California，USA)封闭内源性抗生物素蛋白和生物素。切片在4℃下用0.1mg/mL抗Ki-67抗体在2％正常山羊血清的PBS中稀释过夜。

将切片在PBS中洗涤(3x5分钟)，与连接试剂(BioLegend,Dedham,USA) 一起孵育30分钟，然后在PBS中洗涤(3x5分钟)。然后使用标记试剂30分钟，然后在PBS中洗涤(3×5分钟)。使用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)可视化染色并使用苏木精复染，然后用增加浓度的乙醇脱水，用二甲苯清除并用DePex封固剂盖玻片。在Nanozoomer上使用20倍物镜扫描切片。使用NanoZoomer的NDP.view2查看软件，在每个半隐窝中至少计数15个完整隐窝中的阳性(棕色)细胞。

用于杯状细胞分析的阿尔新蓝染色

为了确定5-FU、肠特异性CYP24A1基因缺失和VD1-6对杯状细胞的影响，我们进行了杯状细胞特异性爱新蓝染色。分析了所有小鼠的十二指肠、空肠和结肠切片。

切片在二甲苯中脱蜡并通过分级乙醇溶液和蒸馏水再水合。切片在新鲜的阿新蓝溶液中染色5分钟，并用蒸馏水洗涤至透明。切片在1％高碘酸水溶液中氧化 10分钟，然后在流水中洗涤。然后通过增加乙醇溶液对切片进行脱水，然后用二甲苯清除并用DPX封片。NanoZoomer(日本滨松)的NDP.view2查看软件用于捕获图像。我们对每个切片至少15个完整绒毛和隐窝中的染色杯状细胞进行计数，并针对相应绒毛和隐窝的周长进行标准化计数。

统计分析

使用GraphPad Prism 7.03(Graphpad software,Califorina,U.S.A)对非参数数据使用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析，并使用二次Tukey范围检验来确定平均等级之间的差异。平均等级之间的差异在p<0.05时被确定为显着。

结果和讨论

肠上皮细胞中的CYP24A1缺失不影响存活或生长

通过PCR确认重组CYP24A1敲除等位基因(图6B)。CYP24A1已成功从小鼠基因组中删除，并验证了Cre促进的重组。在研究期间，在Cyp24^fl/fl和IntCyp24a1^-/-小鼠之间没有观察到幼犬存活、生长或血清1,25(OH)₂D₃水平的差异。

还在Cyp24a1^fl/fl和IntCyp24a1^-/-的空肠中测量CYP24A1表达。实时 RT-PCR分析证实CYP24A1表达在Cyp24a1^fl/fl小鼠中低，而在IntCyp24a1^-/-小鼠中不存在，与5-FU治疗无关(图6C)。

对用VD1-6抑制CYP24A1的响应

与盐水(载体对照)相比，向wt小鼠施用VD1-6总共7天导致体重、血清1,25(OH)₂D₃水平或肠道组织学参数没有变化。

对5-FU治疗的响应

所有小鼠(野生型、Cyp24a1^fl/fl和IntCyp24a1^-/-)都耐受5-FU，给药后48小时内没有死亡。在小鼠实验组中未观察到恶化的临床迹象。在研究期间，没有观察到任何小鼠出现腹泻。5-FU给药导致给药后48小时体重显着降低。给予5-FU后，肠道缺失 CYP24A1和抑制CYP24A1均未显着改善体重。小肠、结肠、肝脏和肾脏的器官湿重 (相对于动物体重百分比)在各组之间没有显着差异。

肠道CYP24A1缺失减少了5-FU诱导的肠道损伤 5-FU对肠道结构造成重大损害。在Cyp24a1^fl/fl小鼠中，与盐水对照相比，在5-FU给药后48小时，十二指肠绒毛面积显着减少(p＝0.0334)(图7)。IntCyp24^-/-小鼠的绒毛区域在空肠中没有变化，并且不受5-FU的影响。绒毛高度、隐窝深度和隐窝面积不受基因型或治疗的影响。空肠和结肠参数不受5-FU给药的显着影响。

用VD1-6治疗性抑制CYP24A1可减少5-FU诱导的肠损伤在野生型小鼠中，与盐水对照相比，5-FU给药后48小时十二指肠绒毛高度和面积显着降低(分别为p＝0.0002和p＝0.0006)(图8)。与单独使用5-FU相比，VD1-6 与5-FU联合给药显着增加绒毛高度(p＝0.043)并降低5-FU对绒毛面积的影响(5- FU/VD1-6组合相比无显着差异生理盐水对照)。隐窝深度和面积不受5-FU或VD1- 6的影响。

与盐水对照相比，在5-FU处理后48小时空肠绒毛高度和面积也显着降低 (分别为p＝0.0451和p＝0.0180)。与其他组相比，VD1-6与5-FU联合给药导致绒毛高度和隐窝深度的一些微小变化，但并未显着降低5-FU对绒毛高度和面积的影响。空肠中的隐窝深度和面积不受5-FU的影响。

与盐水对照相比，在大肠中，结肠隐窝深度和面积在5-FU给药后48小时显着降低(分别为p＝0.0034和p＝0.0136)。与单独使用5-FU相比，VD1-6联合 5-FU显着增加了隐窝深度(p＝0.0068)并降低了5-FU对隐窝面积的影响，因此5-FU 和VD1之间没有显着差异-6隐窝区域与盐水控制隐窝区域相比(图8)。

5-FU耗尽小肠中的杯状细胞

在野生型和Cyp24a1^fl/fl小鼠中，在小肠中施用5-FU后48小时，绒毛杯状细胞计数显着下降。在野生型小鼠中，与盐水对照组相比，5-FU治疗小鼠的十二指肠杯状细胞计数显着降低(p＝0.0002)。当用针对绒毛周长标准化的杯状细胞计数进行相同的比较时，没有显着差异。同样，在空肠中，与盐水对照组相比，5-FU处理的小鼠的杯状细胞计数显着降低(p＝0.003)。然而，当杯状细胞计数相对于绒毛周长标准化时，没有显着差异。结肠杯状细胞计数在治疗组之间没有显着差异。

与十二指肠和空肠中的盐水对照相比，在Cyp24a1^fl/fl小鼠中，绒毛杯状细胞计数在5-FU给药后48小时显着降低(分别为p＝0.0403和p＝0.0107)(图9)。当针对绒毛周长进行标准化时，5-FU处理的小鼠的杯状细胞计数仍然与十二指肠中的盐水对照有显着差异(p＝0.0377)，并且在空肠中趋于显着性(p＝0.0581)(图9)。结肠杯状细胞计数在基因型或治疗之间没有差异。

肠CYP24A1缺失在5-FU给药后维持杯状细胞

在IntCyp24a1^-/-小鼠中，对于实际计数和针对绒毛周长标准化的那些，5-FU处理的小鼠和盐水对照之间的十二指肠或空肠杯状细胞计数没有显着差异(图9)。

用VD1-6治疗性抑制CYP24A1对用5-FU治疗的小鼠的杯状细胞没有影响

与单独用5-FU治疗的小鼠相比，用5-FU和VD1-6治疗的野生型小鼠的杯状细胞计数没有显着差异，但与十二指肠和空肠中的盐水对照小鼠相比有显着差异(p＝0.0063 和p<0.0001，分别)。当针对绒毛周长标准化时，杯状细胞计数在任何组之间没有显着差异。然而，当杯状细胞计数相对于绒毛周长标准化时，用5-FU和VD1-6治疗的小鼠与盐水对照相比没有显着差异。结肠中治疗组之间的杯状细胞计数没有显着差异。

肠CYP24A1缺失维持5-FU给药后的隐窝细胞增殖

用Ki-67抗体对十二指肠、空肠和结肠进行免疫染色以鉴定增殖细胞。在十二指肠隐窝中，用5-FU处理的Cyp24a1^fl/fl小鼠每个半隐窝的增殖细胞数量显着低于用盐水处理的Cyp24a1^fl/fl小鼠(p＝0.0004)和用5-FU处理的IntCyp24a1^-/-小鼠(p＝0.0130)。与盐水相比，用5-FU处理的IntCyp24a1^-/-小鼠的隐窝中的Ki-67阳性细胞没有显着差异(图10)。在空肠隐窝中，用5-FU处理的Cyp24a1^fl/fl小鼠显示每个半隐窝的 Ki-67阳性细胞数量最少，显着低于用盐水处理的Cyp24a1^fl/fl小鼠(p＝0.0015)和用 5-FU处理的IntCyp24a1^-/-小鼠-FU(p＝0.0255)(图10)。在结肠隐窝中，用5-FU 处理的Cyp24a1^fl/fl小鼠每个半隐窝的Ki-67阳性细胞显着低于用盐水处理的 Cyp24a1^fl/fl小鼠(p＝0.0104)和用5-处理的IntCyp24a1^-/-小鼠FU(p＝0.0127)。

CYP24A1的治疗性抑制维持用5-FU处理的小鼠小肠中的隐窝细胞增殖用Ki-67抗体对十二指肠、空肠和结肠进行免疫染色，以确定Cyp24a1抑制对增殖的隐窝细胞的影响。在十二指肠中，每个半隐窝的Ki-67阳性细胞数量最多记录在盐水对照小鼠中。与盐水对照组相比，用VD1-6处理的小鼠每个半隐窝的Ki-67阳性细胞数量显着减少(p＝0.0059)。用5-FU处理的小鼠表现出每个半隐窝的Ki-67阳性细胞数量最少，显着低于盐水对照组(p<0.0001)。然而，与用5-FU处理的小鼠相比，用VD1-6和5-FU处理的小鼠每个半隐窝的Ki-67阳性细胞显着增加(p<0.0001) (图11)。与盐水对照小鼠(p<0.0001)和仅用VD1-6处理的小鼠(p＝0.0267)相比，用VD1-6和5-FU处理的小鼠显示每个半隐窝的Ki-67阳性细胞较低。

在空肠中，用5-FU处理的小鼠表现出最低的Ki-67阳性细胞计数，显着低于盐水对照(p<0.0001)。用VD1-6和5-FU处理的小鼠记录的Ki-67计数低于盐水对照(p<0.0001)和单独使用VD1-6(p＝0.0001)。然而，与用5-FU处理的小鼠相比，用VD1-6和5-FU处理的小鼠表现出显着更高数量的Ki-67阳性细胞(p<0.0001)(图 11)。

在结肠中，用5-FU处理的小鼠显示每个半隐窝的Ki-67阳性细胞显着低于盐水对照(p＝0.0006)(图11)。尽管与用5-FU治疗的小鼠相比，用VD1-6和5-FU 治疗的小鼠中Ki-67阳性细胞的数量有增加的趋势，但没有显着差异。盐水对照小鼠与用VD1-6和5-FU两者治疗的小鼠之间也没有显着差异。

本发明人开发了一种新型的CYP24A1竞争性抑制剂(VD1-6)，其被证明可有效预防由5-FU引起的胃肠道损伤。

CYP24A1的肠特异性缺失不影响幼崽的生长或存活，也不影响血清 1,25(OH)₂D₃水平，类似于wt小鼠中CYP24A1的抑制。如上所述，VD1-6对VDR的亲和力较低，表明它不是通过激活VDR响应途径直接起作用。

与5-FU诱导的粘膜炎相关的发现与先前的发现一致(Inomata,A.,Horii,I.andSuzuki,K.,Toxicol.Lett.,2002.133(2-3):p.231-240；Logan,M.et al.,CancerChemother. Pharmacol.,2009.63(2):p.239-251)，其中在i.p.推注给药后48小时出现损伤。450 毫克/公斤5-FU。无论基因型如何，5-FU都是耐受的，并且在本研究中没有记录到死亡率。然而，在野生型和Cyp24a1fl/fl小鼠中，5-FU给药导致十二指肠绒毛高度显着降低，结肠隐窝深度显着降低，功能丧失可能伴随这种结构丧失，导致在接受5-FU 治疗的癌症患者中观察到明显的胃肠道症状，例如严重腹泻(Stein,A.,Voigt,W.and Jordan,K.,Ther.Adv.Med.Oncol.,2010.2(1):p.51-63)和更长持续时间的动物研究(Zang, S.etal.,Biomed.Pharmacother.,2018.106:p.910-916)。

当向IntCyp24a1-/-小鼠施用5-FU时，与施用5-FU的Cyp24a1fl/fl小鼠或施用盐水的IntCyp24a1-/-小鼠相比，十二指肠绒毛高度没有显着差异，提示肠道 Cyp24a1表达可能在5-FU诱导的胃肠道粘膜炎的发展中发挥作用。此外，与生理盐水相比，当给予5-FU时，在wt小鼠中CYP24A1与VD1-6的竞争性抑制也导致十二指肠绒毛高度没有显着差异。与盐水对照小鼠相比，同时施用VD1-6和5-FU的小鼠的结肠隐窝深度也没有显着差异，这表明在整个小肠和大肠中都有作用，并表明 CYP24A1抑制对5-FU诱导的GM具有广泛的肠道保护作用。

5-FU还耗尽了wt和floxed小鼠中的杯状细胞，其效果是由wt小鼠中绒毛高度的降低驱动的(当针对绒毛周长标准化时没有差异)，但在CYP24A1中情况并非如此，剩余的杯状细胞与盐水处理的Cyp24a1fl/fl小鼠相比，在5-FU处理中显着耗尽。5-FU后肠道中CYP24A1的缺失维持杯状细胞，在十二指肠、空肠或结肠的盐水和5-FU处理的小鼠之间没有观察到显着差异，表明CYP24A1缺失有助于保护肠道免受5-FU诱导通过保存杯状细胞和粘蛋白储存进行转基因。先前的研究表明，维生素D 消耗会降低muc2表达(Zeng,Y.et al.,Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.,2020. 318(3):p.G542-G553)，因此CYP24A1缺失可能保持muc2表达，保持粘液层的组成和完整性。然而，用VD1-6抑制CYP24A1对杯状细胞和粘蛋白储存没有显着影响，这表明在没有CYP24A1的情况下保存杯状细胞和粘蛋白储存可能是需要更长治疗时间的长期效果。

已知化疗剂，包括5-FU，可减少由靶向细胞周期的特定阶段引起的细胞增殖。在用5-FU处理的小鼠中，十二指肠、空肠和结肠隐窝中Ki-67阳性细胞的减少意味着增殖细胞减少，这些细胞沿着隐窝向绒毛-隐窝轴迁移，随后减少了可用于填充上皮细胞的数量绒毛表面，降低绒毛高度。在从肠道中删除CYP24A1的小鼠和在5-FU后用 VD1-6治疗的小鼠中维持增殖细胞向上迁移表明，通过CYP24A1的缺失或抑制观察到的肠道结构的保护可能是通过保护增殖细胞来驱动的防止5-FU损坏。这种现象的确切机制尚不清楚，但与Ki-67阳性(增殖)细胞相关的改进的绒毛和隐窝结构之间的联系已经确定(Wu et al.,JRadiat Res,2019.60(6):740-746)。Riehl及其同事的一项研究表明，TLR4调节肠道中的增殖(Riehl,T.T.et al.,American Journal of Physiology– Gastrointestinal andLiver Physiology,2015.309(11):p.G874-887)和TLR4的驱动因子活化可以是透明质酸(Riehl,T.T.et al.,ibid；Riehl,T.T.et al.,American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology,2020.319(1):p.G63-G73)，而不是微生物活化通过脂多糖(LPS)。维生素D和VDR信号传导对于Lgr5+干细胞功能至关重要(Peregrina,K.et al.,Carcinogenesis,2015.36(1):p.25-31)，并直接或间接调节参与肠上皮细胞增殖和迁移(Kuhne,H.et al.,Lipids in Health and Disease,2014.13(1):p.1- 9)，表明抑制维生素D的分解代谢并延长其在肠道中的存在可能有助于Ki67阳性细胞和隐窝细胞增殖的维持或恢复。

1,25(OH)₂D₃的延长存在可能通过调节尾部相关的同源框转录因子2(CDX-2) 活性来促进肠上皮细胞分化。CDX-2通过介导肠细胞分化在肠发育中发挥重要作用 (Gao,N.etal.,Developmental Cell,2009.16(4):p.588-599)，表明细胞分化也可能发挥作用保持绒毛和隐窝结构。

目前的结果表明，抑制CYP24A1可能是化疗引起的粘膜炎的替代干预方法，通过延长1,25(OH)₂D₃在肠道中的半衰期来增强维生素D的免疫调节和肠道健康作用，并且可以克服与许多癌症相关的异常增加的CYP24A1水平(Anderson,M.G.et al., CancerChemotherapy and Pharmacology,2006.57(2):p.234-240；Sun,H.et al.,HumanPathology,2016.50:p.101-108)。最近的研究表明，1,25(OH)₂D₃的许多信号通路存在于正常肠道中，这表明维持足够的肠道1,25(OH)₂D₃会干扰胃肠道粘膜炎的发病机制(Hassanshahi,M.et al.,Experimental Biology and Medicine,2019.244(12):p.1040-1052)。

目前的研究结果表明，CYP24A1可能通过过度分解1,25(OH)₂D₃，消除肠道中1,25(OH)₂D₃的稳态功能，随后降低隐窝细胞增殖和迁移，从而促进胃肠道损伤的发展。

实施例4–VD1-6对肠道菌群的影响

规程

动物

体重在20-25克之间的8周大的野生型雄性C57BL/6雄性C57BL/6小鼠(每个治疗组6只)接受皮下(s.c.)注射VD1-6(500ng/kgBW/天)或载体对照(0.9％生理盐水，当量体积，i.p.)前5天和单剂量5-氟尿嘧啶(5-FU)给药后2天。

实验小鼠在注射前每天用吸入异氟烷(100％氧气中3％)麻醉，单次亚致死剂量450mg/kgBW 5-FU(DBL 5-氟尿嘧啶注射液BP,Hospira,500mg in 100毫升)， i.p.在200μL体积的无菌0.9％盐水中，诱导粘膜炎而不致死亡。然后给对照小鼠注射200μL无菌盐水。给小鼠喂食含有标准维生素D(1000IU/kg)和钙(1％)的标准AIN-93半合成饮食，并自由饮水。将小鼠分组饲养在温度为22±1℃的动物设施中，并接受14:10小时的明暗循环。

在给予5-FU后48小时，通过深吸入麻醉和心脏穿刺，然后进行颈椎脱位，人道地处死小鼠。胃肠道(GIT)从幽门括约肌到直肠被解剖，分成小肠(幽门括约肌到回盲部括约肌)和结肠(升结肠到直肠)。将内容物小心地从大肠(结肠)中取出并无菌收集到无菌的1.5mL管中。结肠用冷冻的无菌PBS冲洗，在近端收集1cm样本，25％和75％用于组织学，随后收集2cm样本用于RNA分析。储存所有小鼠的结肠内容物以供进一步分析。将用于RNA分析的样品浸入RNAlater中并储存在 -80℃下，以便以后使用NucleoSpin^TMRNA分离试剂盒(MACHEREY-NAGEL， Düren，Germany)进行RNA提取。

RNA分离

根据制造商的说明，使用NucleoSpin^TMRNA分离试剂盒(MACHEREY-NAGEL， Düren，Germany)从肠和肾组织中提取RNA。简而言之，将肠组织(约40mg)均质化并添加到含有裂解溶液的1.5mL无RNase管中。然后将裂解物混合物涡旋并通过柱离心过滤，以11,000rpm的速度离心1分钟。将上清液与350μL 70％乙醇混合以调整RNA结合条件。然后将匀浆溶液倒入RNA结合柱/洗涤管中，并离心30秒。将RNA与硅胶膜结合后，使用350μL膜脱盐缓冲液对膜进行脱盐，并以11,000rpm 的速度离心1分钟。这样做是为了提高DNA消化步骤的有效性。

在室温下用rDNA酶处理结合柱15分钟用于DNA消化。通过分别用200μL高严格性洗涤缓冲液和600μL低严格性洗涤缓冲液洗涤/干燥，从硅胶膜上去除残留的DNA。每次洗涤后以11,000rpm离心30秒。通过在1.5mL加盖微量离心管中的结合柱中加入不含RNAse的H₂O，从硅胶膜上洗脱RNA，然后以11,000rpm的速度离心1分钟。

用NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technologies,Wilmington,Del.,USA) 分析RNA以确定浓度。样品纯度由独立研究小组在SAMHRI(North Terrance, Adelaide,SA)进行的RIN分析确定。样品纯度平均在7.5-8左右，任何得分低于7的样品都从进一步分析中丢弃。

cDNA转化

使用Transcriptor^TMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Roche MolecularSystems Inc.,Basel, Switzerland)将RNA转化为cDNA。简言之，加入4μL Transcriptor^TM脱氧核苷酸混合物、1μL Transcriptor^TM逆转录酶和1μL RNA模板。用无核酸酶水将样品定容至20μL。然后将样品在25℃下孵育10分钟以进行变性，在50℃下退火60分钟，在85℃下延伸5分钟。目标cDNA通过PCR扩增39个循环。使用NanoDrop (NanoDrop Technologies,Wilmington,Del.,USA)分析转录的样品。

实时PCR分析

使用CFX Connect实时PCR检测系统(Bio Rad,California,USA)进行实时PCR。扩增混合物包含1μL cDNA、5μL 2X SYBR绿色(Bio-Rad Laboratories Inc.USA)、3 μL PCR级水和0.5μL正向和反向引物(GeneWorks,Adelaide,Australia)，形成最终体积10微升。针对每个引物组单独优化热循环条件(表2)。

表2.肠和肾引物序列

Wang,F.et al.,Anal.Biochem.,2010.399(2):p.211-217；Bai,X.et al.,J.Clin.Invest., 2016.126(2):p.667-680；Ranch,D.et al.,J.Bone Miner.Res.,2011.26(8):p.1883-1890； Reyes-Fernandez,P.C.和Fleet,J.C.,J.Bone Miner.Res.,2016.31(1):p.143-151；Liu,Y.et al.,Int.J.Biol.Macromol.,2020.162:p.935-945；Kang,Z.et al.Syst.Biol.Reprod.Med., 2017.63(6):p.364-369；Yamakawa,I.et al.,Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.,2011. 301(5):p.E844-852；Shen,Y.et al.,J.Ethnopharmacol.,2020.259:p.112919；Romano,K.A. et al.,Cell Host&Microbe,2017.22(3):p.279-290.

所有样品一式两份重复，实验阈值(Ct)由CFX Connect程序计算。RT-PCR分析用于研究脂质运载蛋白-2、NF-kB、TLR4和TLR5的表达，因为它们都是维生素D 依赖性参与钙调节。TNF-α是一种参与全身炎症的细胞信号蛋白，可能是5-FU在肠道中作用的靶标。RPLP0被用作看家基因(HKG)。

微生物组分析

从23只小鼠中收集的结肠内容物被送往澳大利亚基因组研究机构(AGRF)进行DNA提取和16S rRNA Illumina测序，专门针对16S rRNA的V3-V4区域，从而将微生物组成测序到属水平。测序数据由AGRF处理，并作为每个样本的fastq文件提供，并在电子表格中提供操作分类单元(OTU)相对丰度数据。比较从AGRF收到的数据在治疗组之间的相对丰度，同时查看单个样本和组合组数据。

然后使用香农熵计算分析测序数据的α多样性(个体样本内的多样性)，使用Bray-Curtis分析的β多样性(群体中样本之间的多样性)并使用具有多轴的原理坐标分析(PCoA)图进行可视化(PCo1、PCo2和PCo3)。

统计分析

除微生物群(16S rRNA)数据外，所有数据均使用GraphPad Prism 8.0版进行分析。使用D'Agostino和Pearson检验以及Kolmogorov-Smirnov检验分析连续数据的正态性。当正态性得到确认时，使用双向方差分析(ANOVA)或混合模型(当数据点缺失时)来识别统计学上的显着差异。当未确认正态性时，使用具有Dunn校正的Kruskal- Wallis进行多重比较。在可能的情况下，配对或重复测量被优先考虑并使用折线图表示。在不可能的情况下，使用终止时收集的生物样本并通过分组数据(柱形图/条形图) 表示。在所有情况下，P<0.05被认为具有统计学意义。

结果和讨论

VD1-6给药不会上调结肠中维生素D反应性或炎症基因的表达

VD1-6单独和/或与5-FU组合不会增加大肠(即结肠)中CYP24A1和CYP27B1的表达(图12A-B)。然而，与所有其他组相比，盐水对照组的结肠中VDR mRNA表达显着高于所有其他组，包括单独的VD1-6(p＝0.0472)、单独的5-FU(p＝0.0141)和5- FU和VD1-6组合组(p＝0.0063)(图12C)。其余组之间没有显着差异。NF-KB表达不受VD1-6或5-FU存在的影响(图13B)。VD1-6组有更高的NF-KB表达趋势，但这没有达到显着性。TNF-αmRNA表达不受VD1-6或5-FU存在的影响(图13A)。

VD1-6刺激先天免疫基因脂质运载蛋白-2(LCN2)在结肠中的表达

与5-FU组(p＝0.0324)和盐水对照组(p＝0.0139)相比,VD1-6治疗组的LCN2表达显着增加(图14A)。组间TLR4或TLR5表达没有显着差异(图14B-C)。

结肠微生物群中家族分类水平的相对丰度被5-FU和VD1-6改变

与对照小鼠相比，5-FU处理的小鼠和VD1-6处理的小鼠在包含小鼠肠道微生物群的家族分类水平上的细菌相对丰度存在差异。尽管每个单独的处理引起了变化，但当5-FU与VD1-6组合时，家族分类水平的相对丰度仍与对照组相似(图15)。在组内的个体小鼠中观察到结肠微生物群的组成差异(图15A)。

微生物多样性在5-FU和/或VD1-6后没有显着改变

香农熵用于评估alpha多样性(样本内的物种多样性)。5-FU和/或VD1-6对香农熵没有显着影响，表明5-FU给药48小时后α多样性没有变化。观察到载体对照和5- FU组中每个样品的香农熵值之间的高范围。观察到VD1-6和5-FU+VD1-6组的范围较小(图16)。主成分分析显示β多样性没有显着变化。然而，当PCo1、PCo2和 PCo3值被分析为最有可能解释微生物群的任何变化时，来自5-FU处理的小鼠的样本向更高的PCo1聚集(图17A、17B)。为了确定特定微生物群是否促成了这种转变，进行了Pearson的相关性分析，揭示了PCo1与阿克曼氏菌科(Akkermansiaceae)家族之间的直接相关性(R2＝0.761；p<0.0001)，以及PCo1和Marinifilaceae家族之间的弱相关性(R2＝0.18；p＝0.041)(图17C,17D)。

虽然在5-FU处理后48小时对微生物多样性的破坏最小，但在跨组比较微生物分类群时观察到一些细菌种类的变化。与空白对照相比，5-FU处理导致梭菌属 K4410.MGS-306(p＝0.003)的丰度增加了12.2倍，以及鼠乳杆菌(p＝0.039)和啮齿类粪杆菌(p＝0.047)的丰度分别降低了4.4倍和10.1倍。与空白对照相比，仅VD1-6 处理导致拟杆菌属细菌(p＝0.021)的丰度增加6.3倍，毛螺菌科细菌28-4(p＝0.002) 和啮齿类杆菌(p＝0.031)的丰度分别降低了16.1倍和12.4倍。与空白对照相比，与 5-FU一起使用的VD1-6导致梭菌属物种K4410.MGS-306(p＝0.013)的丰度增加8.9倍，毛螺菌科细菌A4(p＝0.044)的丰度增加了14.2倍(图15)。与单独使用VD1-6相比，与5-FU一起使用的VD1-6导致毛螺菌科细菌A4(p＝0.035)的丰度降低16.2 倍。当校正错误发现率时，数值不再被认为是显着的(<0.05)。然而，由于微生物群固有的个体间变异性和低样本量，这些物种引起了人们的兴趣。

这些数据表明，虽然在施用5-FU 48小时后多样性没有显着改变，但发生了许多可能具有下游免疫信号作用的微生物转变。5-FU给药在给药后48小时没有显着改变CYP24A1或CYP27B1相对于RPLP0在结肠中的mRNA表达(图12)。然而，与所有其他组相比，盐水对照组中结肠中的VDR表达显着上调。5-FU对VDR mRNA 表达的影响先前已被证明是次要的。Milczarek，M.，等人(Oncol.Rep.,2014.32(2):p. 491-504)发现在肿瘤模型和体外细胞培养中，当与维生素D类似物结合时，VDR表达仅在5-FU组中升高。

这种上调的一个可能解释是正常稳态机制的作用是抑制VD1-6处理组中的 VDR表达，其中CYP24A1表达被抑制，减缓或阻止1,25(OH)₂D₃分解代谢并导致维生素D水平降低保持高位。生理盐水对照组缺乏CYP24A1和CYP27B1上调或下调似乎不支持这一点，但先前的工作确实证实CYP24A1 mRNA水平在十二指肠或空肠施用5-FU和/或VD1-6后没有变化.或者，这种上调似乎是由于个别异常值，可能不代表整个群体。特别是一个值作为剩余样本(0.04)的异常值出现，这些样本紧密聚集在一起(0.015)并且可能更能代表真实的平均值。可以说，单只小鼠的这一高值解释了盐水对照小鼠与所有其他组的统计学显着差异，否则不会达到统计学显着性。上述与VD1- 6VDR结合和计算机对接研究讨论的工作意味着VD1-6不与VDR结合，因此上调不是由于VD1-61与VDR活性结合并可能阻断VDR活性。

VD1-6组中缺乏VDR上调进一步支持了VD1-6不像许多维生素类似物那样诱导维生素D响应途径。在研究的促炎标志物NF-κB和后续的TNF-α中，所有组之间在结肠中的RNA表达方面没有差异。有或没有5-FU治疗的VD1-6组具有增加NF- KB mRNA表达的趋势，但这没有达到显着性。这表明促炎细胞因子可能不是5-FU给药后炎症的主要驱动因素。用5-FU治疗缺乏NF-κB升高与Logan,R.M.等人。 (Cancer Biol.Ther.,2008.7(7):p.1139-1145)的现有证据一致，其中5-FU给药未导致结肠中NF-κB mRNA的统计学显着升高。

抑制维生素D分解代谢可以改善肠道微生物群的组成，可能通过增加脂质运载蛋白-2的表达。数据表明，抗菌蛋白脂质运载蛋白-2在用VD1-6治疗的小鼠中显着上调，因此可能正在调节存在的微生物群。脂质运载蛋白-2与铁载体结合，限制了它们促进细菌吸收铁的能力，限制了细菌的增殖和存活(Lim,D.et al.,2020.8(5))。循环 1,25(OH)₂D₃水平与脂质运载蛋白-2水平呈正相关，因此，抑制1,25(OH)₂D₃分解代谢可能是VD1-6组中脂质运载蛋白-2上调的原因(图14)(Metheniti,D.et al.,Hormones (Athens),2013.12(3):p.397-404)。

脂质运载蛋白-2受到Toll样受体(TLR)4和5分别识别细菌脂多糖(LPS) 和鞭毛蛋白的刺激(Mori,K.et al.Crit.Care,2013.17(Suppl 2):p.P14；Toyonaga,T.et al.,Sci.Rep.,2016.6:p.35014)。TLR在检测病原体和激活促炎途径中的作用使它们成为先天免疫系统的重要组成部分；它们的激活导致适应性免疫反应的刺激，诱导肠上皮细胞产生IgA抗体(Bahadur,T.et al.,J Family Med.Prim.Care,2019.8(5):p.1567-1570)。因此，VD1-6可能通过上调脂质运载蛋白-2(一种抗菌肽)来保护肠道免受粘膜炎，从而产生其他抗菌作用，例如免疫记忆和促炎途径的下调。

VD1-6对结肠中的TLR4或TLR5基因表达模式没有影响。TLR4上调与GM 急性期增加的小肠黏膜上皮通透性和促炎作用相关(图14)(Hamada,K.et al.,CancerChemother.Pharmacol.,2013.72(4):p.757-765)。已发现TLR4 mRNA表达在黏膜损伤高峰期间在肠道中增加，而在愈合阶段无法检测到(Wardill,H.R.et al.,Mol.Cancer Ther.,2016.15(6):p.1376-1386)。对TLR4缺陷小鼠的广泛研究表明，与施用伊立替康后的野生型小鼠相比，TLR4减少与腹泻、体重减轻和肠道细胞凋亡的显着减少相关 (Coller,J.K.etal.,Cancer Chemother.Pharmacol.,2017.79(2):p.431-4；Wardill et al.,ibid)。5-FU缺乏上调最有可能解释为GM期间的峰值损伤发生在5-FU给药后约24小时，然后降至基础水平(Hamada，K.et al.,ibid)。

目前的证据表明TLR5上调在肠道中具有保护作用，因为已发现TLR5激动剂对粘膜上皮细胞提供显着的保护，使其免受辐射和化学疗法造成的损伤(Burdelya,L. G.etal.,Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.,2012.83(1):p.228-234；Burdelya,L.G.et al.,Science,2008.320(5873):p.226-230)。VD1-6组缺乏上调表明TLR5介导的上皮保护可能不是VD1-6作用的主要驱动力。虽然TLR4和TLR5的表达在VD1-6组中没有显着增加，但这可能是由于TLR激活和结肠组织收集之间的延迟，因为先天免疫是短暂的(Boraschi,D.&Italiani,P.,Front.Immunol.,2018.9(799))。

1,25(OH)₂D₃已显示可调节肠道微生物群的组成，而5-FU已显示可将肠道微生物组成转变为更具致病性的特征(图15、16和17)(Hong,B.Y.et al.Microbiome,2019. 7(1):p.662019；Ooi,J.H.et al.,The Journal of nutrition,2013.143(10),p.1679-1686)。5-FU显着降低厚壁菌门的丰度并增加拟杆菌门的丰度，这与文献中先前的报道一致(Carvalho,R.et al.Sci.Rep.,2018.8(1):p.15072 2018；Li,H.L.et al.,Front CellInfect. Microbiol.,2017.7:p.455)。厚壁菌门是有益的抗炎微生物，与健康状况有关，而副杆菌与发炎的病理状况有关(Ooi,J.H.et al.,ibid)。肠道中低丰度的厚壁菌门会增加肠道对炎症的敏感性(Natividad,J.M.et al.,Inflammatory bowel diseases,2015.21(8):p.1883-1893)。 VDR基因敲除小鼠的厚壁菌门细菌丰度较低，包括毛螺菌属的细菌，这突出了维生素 D在维持健康肠道微生物群中的重要性(Ooi,J.H.et al.,ibid)。肠道中较高丰度的毛螺菌科已被证明具有抗炎作用，并通过增加紧密连接的产生来增强结肠的屏障(Geirnaert,A. et al.,Sci.Rep.,2017.7(1):p.11450)。毛螺菌科物种的低丰度也与炎症状态相关 (Natividad,J.M.et al.,ibid)，突出了它们在保护BVD1-6治疗小鼠肠道中可能发挥的作用。

VD1-6显著地降低在门水平上的疣微菌的丰度，其主要由粘蛋白降解细菌组成(Hamouda,N.et al.,Basic Clin.Pharmacol.Toxicol.,2017.121(3):p.159-168)。已发现患有 5-FU诱导的粘膜炎的发炎动物中的疣微菌显着增加(Carvalho,R.et al.,ibid)；已知属于该门的细菌通过降解结肠的保护性粘液层来促进肠道炎症，这表明它们在5-FU诱导的粘膜炎发病机制中起重要作用(Derrien,M.et al.,Frontiers in Microbiology,2011.2(166))。小鼠缺乏维生素D会导致结肠黏膜层变薄，而已发现补充维生素D显著地降低粪便样本中疣微菌的丰度并维持结肠粘膜屏障(Zhu,W.et al.,Gut pathogens,2019.11:p.8)。然而，四个组之间来自疣微菌门的阿克曼菌(Akkermansia)属的丰度没有显着差异，因此在VD1-6组中看到的该门的显着减少可能在更高级别的分类单元内。

NF-κB的上调信号传导和TNF-α、IL-1和IL-6的扩增是化疗诱导的GM 发病机制的标志(Cario,E.,Curr.Opin.Support Palliat.Care,2016.10(2):p.157-164；Sonis,S.Nature Reviews Cancer,2004.4:p.277-284)。已证明来自放线菌门的双歧杆菌等共生细菌可抑制NF-κB活化，从而导致促炎细胞因子水平降低(Ewaschuk,J.B.et al.,Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.,2008.295(5):p.G1025-1034；Riedel,C.U.etal.,World J.Gastroenterol.,2006.12(23):p.3729-3735)。目前的数据表明，VD1-6治疗的小鼠的双歧杆菌丰度显着增加，这可能抑制了参与化疗诱导的粘膜炎发病机制的初始NF-κB炎症途径。粪杆菌(Faecalibaculum)菌属，属于厚壁菌门，也已显示通过分泌刺激抗炎细胞因子IL-10产生的物质来减少NF-κB的活化，从而减少炎症(Sokol,H.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2008.105(43):p.16731-16736)。

粪杆菌(Faecalibaculum)在5-FU和VD1-6治疗组中均显着减少，然而，在联合治疗组中似乎恢复了，因为丰度与对照组没有显着差异。先前已经表明，NF-κB 和TNF-α的浓度分别在5-FU治疗后12小时和90分钟达到峰值，并在48小时后恢复到基线(Logan,R.M.etal.,Cancer Biol.Ther.,2008.7(7):p.1139-1145)。因此，在化疗后48小时对小鼠实施安乐死之前，由于NF-κB和TNF-α的浓度已恢复到基线，因此在四组之间未观察到表达的显着差异。

这些数据表明，VD1-6在用5-FU处理后在野生型小鼠系中防止损伤/恢复绒毛结构。结肠中的VDR、TNF-α和NF-κB表达没有变化，表明VD1-6给药不会改变钙吸收。抑制1,25(OH)₂D₃分解代谢已被证明可以维持肠道微生物群的有益组成，这可以通过上调脂质运载蛋白-2的表达来实现。VD1-6增加抗炎微生物的丰度并减少粘蛋白降解、炎症诱导细菌的丰度。5-FU会增加病原菌的丰度并降低有益菌的丰度，但是当与VD1-6一起给药时，这种情况会有所缓解。

在整个说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和“包括”以及诸如“包括”和“包括”的变体将被理解为暗示包含所陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。

在本说明书中对任何现有技术的引用不是并且不应被视为承认此类现有技术构成公知常识的任何形式的暗示。

本领域技术人员将理解，本文公开的化合物、用途和组合物不受所描述的特定应用的限制。化合物、用途和组合物在它们的优选实施方案中也不受本文描述或描绘的特定元素和/或特征的限制。还应当理解，本文公开的化合物、用途和组合物不限于所公开的一个或多个实施方案，而是能够在不背离由以下阐述和定义的本公开范围的情况下进行多种重排、修改和替换。

以下权利要求仅是临时权利要求，并且作为可能的权利要求的示例提供，并且不旨在限制基于本申请的任何未来专利申请中可能要求保护的范围。以后可以在示例性权利要求中添加或省略整数，以便进一步定义或重新定义如本文所公开的化合物、用途和组合物。

Claims

1.式(I)化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药:

其中:

R₁选自H和OH,

R₂,R₃和R₄各自独立地选自CH₃和F，

或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药。

2.根据权利要求1的化合物，其中R₁为OH。

3.根据权利要求1或者权利要求2的化合物，其中R₂,R₃和R₄为CH₃。

4.根据前述权利要求中任一项的化合物，其中式(I)化合物为式(Ia)化合物：

5.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项的化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药，和一种或者多种药学上可接受的赋形剂。

6.根据权利要求5的药物组合物，其中所述药物组合物适于口服给药。

7.根据权利要求5的药物组合物，其中所述药物组合物适于皮下给药。

8.一种治疗和/或预防与受试者的低水平生理维生素D相关的疾病或者病症的方法，所述方法包括给所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至4中任一项的化合物，和任选的药学上可接受的赋形剂。

9.根据权利要求8的方法，其中所述疾病或者病症是响应CYP24A1抑制的疾病或者病症。

10.根据权利要求8或者9的方法，其中所述疾病或者病症是慢性肾病(CKD)、或者与CKD有关的疾病或者病症。

11.根据权利要求10的方法，其中所述与CKD有关的疾病或者病症是继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT)。

12.根据权利要求8或者9的方法，其中所述疾病或者病症是化疗致胃肠道粘膜炎。

13.根据权利要求12的方法，其中所述疾病或者病症是5-氟尿嘧啶诱导的胃肠道粘膜炎。

14.根据权利要求8或者9的方法，其中所述疾病或者病症是与炎症和改变的微生物组有关的肠道功能失调。

15.根据权利要求14的方法，其中所述肠道功能失调是炎症性肠病、肠易激综合征或者憩室炎。

16.根据权利要求8或者9的方法，其中所述疾病或者病症是癌症。

17.根据权利要求16的方法，其中所述癌症是乳癌。