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CN116987577B - 一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法及其制备系统 - Google Patents

一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法及其制备系统 Download PDF

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CN116987577B CN202311255801.8A CN202311255801A CN116987577B CN 116987577 B CN116987577 B CN 116987577B CN 202311255801 A CN202311255801 A CN 202311255801A CN 116987577 B CN116987577 B CN 116987577B
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供了一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法及其制备系统。本方法通过往噬菌体粗滤液中加入脱氧胆酸钠溶液来解离内毒素LPS，通过控制三通阀和蠕动泵，往得到的小分子LPS的噬菌体粗滤液中补充脱氧胆酸钠溶液并超滤去除LPS，补充0.9%NaCl并超滤去除残留的脱氧胆酸钠，得到低内毒素噬菌体制剂，能有效缩短从噬菌体粗滤液到获得噬菌体制剂的时间，并且制备得到的制剂噬菌体滴度高、内毒素含量低，成本低以及适用性广。此外，本发明通过检测单元能实时观测到噬菌体样品的质量和内毒素含量，简单明了，确保制备的噬菌体制剂内毒素低于临床使用标准。

Description

一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法及其制备系统
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法及其制备系统。
背景技术
噬菌体作为一种新型抗菌制剂有许多优势，例如分布广泛、靶向特异性强、副作用小等，在噬菌体制剂的制备过程中，宿主菌被裂解后释放的大量的内毒素，内毒素会刺激人体产生发烧等免疫反应，更严重的会导致休克，所以在噬菌体的大规模生产应用中，如何有效去除内毒素是必须要解决的一大难题。
常用的内毒素去除方法主要包括：物理性方法，通过超滤法、密度梯度离心法或活性炭吸附等方法将LPS分离；化学性方法，根据LPS的化学特性，使用多粘菌素B、脱氧胆酸盐或TritonX-100等解离或清除LPS。物理性方法分离效果好，但难以分离大分子LPS或与噬菌体结合的LPS，且回收率低，过程复杂，对样品、设备、人员有较高要求；化学性方法往往单独使用时效果不理想，不能完全清除LPS，去除新引入的溶剂使制备过程更加复杂。目前可通过切向流系统结合氯化铯密度梯度离心快速制备噬菌体制剂，但该方法尚不完备，原因如下：1.引入了毒性有机溶剂，如氯仿和正辛醇；2.实验设备要求高，需要超速离心机，且会引入氯化铯，轻度毒性可能导致低血压、胃肠不适、麻木和晕厥；3.步骤繁琐，需要经过沉淀、透析等步骤；4.制备时间长，从噬菌体粗滤液上清液到获得噬菌体制剂需要较长时间。
因此，我们需要开发出一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法及其制备系统，能在短时间内制得内毒素浓度低、噬菌体滴度高的噬菌体制剂，并且所用设备简单，能控制成本，保证方案的普适性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法及其制备系统，以解决上述背景技术中提到的现有制备方法耗时长、设备要求高以及制备过程繁琐等问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的一个方面，提供一种低内毒素噬菌体制剂的制备系统，所述制备系统包括：
三个储液罐，第一储液罐和第二储液罐分别用于存放对噬菌体粗滤液进行处理的脱氧胆酸钠溶液和体积浓度为0.9% NaCl溶液，第三储液罐作为样品瓶，用于存放噬菌体粗滤液；
切向流超滤膜包，用来对所述噬菌体粗滤液进行超滤；
无菌废液罐，用来存放所述噬菌体粗滤液的超滤废液；
两个蠕动泵，第一蠕动泵用于将所述脱氧胆酸钠溶液和四次等体积的所述0.9%NaCl溶液转移进所述噬菌体粗滤液，第二蠕动泵用于转移所述噬菌体粗滤液进所述切向流超滤膜包进行超滤；
样品收集管，用来收集制备最终得到的低内毒素噬菌体制剂。
进一步地，还包括两个两位三通电磁阀：
第一三通阀连接所述第一储液罐和所述第二储液罐、所述样品瓶，用来控制所述脱氧胆酸钠溶液和所述0.9% NaCl溶液的转移；
第二三通阀连接所述切向流超滤膜包、所述样品收集管和所述样品瓶，用来控制噬菌体超滤液回流进所述样品瓶和收集进所述样品收集管。
进一步地，还包括质量感应器和内毒素检测器，分别用来检测所述噬菌体粗滤液的质量和内毒素的含量。
进一步地，还包括以下连接管道：
第一管道，连接所述第一储液罐、所述第二储液罐、所述第一蠕动泵以及所述样品瓶，用作所述脱氧胆酸钠溶液和0.9% NaCl溶液从所述第一储液罐和第二储液罐转移进入样品瓶的管路；
第二管道，连接所述样品瓶、所述第二蠕动泵、所述切向流超滤膜包以及所述无菌废液罐，用作所述噬菌体粗滤液从所述样品瓶转移进入所述切向流超滤膜包进行超滤的管路和所述超滤废液进入所述无菌废液罐的管路；
第三管道，连接所述切向流超滤膜包、所述第二三通阀、所述样品收集管以及所述样品瓶，用作所述噬菌体粗滤液从所述切向流超滤膜包转移进入所述样品瓶的管路和所述低内毒素噬菌体制剂从所述样品瓶经过所述切向流超滤膜包转移进入所述样品收集管的管路。
进一步地，还包括操作显示屏，用来控制整个系统和显示系统运作情况。
根据本发明的一个方面，提供一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法，所述方法具体步骤如下：
将脱氧胆酸钠溶液存放在所述第一储液罐中，体积浓度为0.9%NaCl溶液存放在所述第二储液罐中，噬菌体粗滤液存放在所述样品瓶中，通过控制所述第一三通阀和所述第一蠕动泵，往所述噬菌体粗滤液中加入所述脱氧胆酸钠溶液，使大分子LPS解离成小分子LPS，通过所述第二蠕动泵转移所述噬菌体粗滤液进所述切向流超滤膜包进行超滤处理；
通过控制所述第一三通阀和所述第一蠕动泵，往所述小分子LPS的噬菌体粗滤液中补充两次等体积的所述脱氧胆酸钠溶液，且每次补充后都将所述噬菌体粗滤液转移进所述切向流超滤膜包进行超滤去除LPS，得到低内毒素噬菌体滤液；
通过控制所述第一三通阀和所述第一蠕动泵，往所述低内毒素噬菌体滤液中补充四次等体积的所述0.9%NaCl，且每次补充后都将所述低内毒素噬菌体滤液转移进所述切向流超滤膜包进行超滤去除残留的所述脱氧胆酸钠，得到低内毒素噬菌体制剂。
进一步地，所述脱氧胆酸钠溶液的质量浓度为0.25%-2%，所述补充两次等体积的所述脱氧胆酸钠溶液的补液体积为所述噬菌体粗滤液的2-5倍，所述低内毒素噬菌体制剂体积为所述噬菌体粗滤液的1/5-1/50；
进一步地，所述低内毒素噬菌体制剂中内毒素含量为5 EU/mL及以下，所述低内毒素噬菌体制剂的滴度最高可达所述噬菌体粗滤液中噬菌体滴度的10%-500%。
根据本发明的一个方面，提供一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法在制备铜绿假单胞菌噬菌体制剂、大肠杆菌噬菌体制剂、沙门菌噬菌体制剂、鲍曼不动杆菌噬菌体制剂、肺炎克雷伯菌噬菌体制剂、嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体制剂中的应用。
由上述技术方案可知，本发明与现有技术相比至少具备以下优点和积极效果：
（1）从噬菌体粗滤液到获得低内毒素噬菌体制剂的时间短，大大缩短了低内毒素噬菌体制剂的制备周期；
（2）所需引入的溶剂少，只引入脱氧胆酸钠一种溶剂，且可以通过超滤有效去除，最终得到的低内毒素噬菌体制剂中，脱氧胆酸钠残留远低于中国药典要求的浓度；
（3）本发明制备得到的低内毒素噬菌体制剂中噬菌体滴度较高，内毒素浓度较低；
（4）本发明所用设备简单智能，使用质量感应器，能实时观测噬菌体粗滤液的质量，使用操作显示屏便于操作，能很好地控制噬菌体制剂的质量；
（5）本发明制备低内毒素噬菌体制剂的方案成本低，适用性广，易于规模化工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1示出了本发明实施例的低内毒素噬菌体制剂的制备系统图；
图2示出了本发明实施例的快速制备低内毒素噬菌体制剂制备技术路线；
图3示出了本发明实施例的不同浓度脱氧胆酸钠处理后噬菌体粗滤液中噬菌体滴度的柱形图；
图4示出了本发明实施例的不同超滤次数处理后噬菌体粗滤液中噬菌体滴度的柱形图；
图5示出了本发明实施例的不同超滤次数处理后噬菌体粗滤液中内毒素浓度的柱形图；
图6示出了本发明实施例的不同样品中噬菌体滴度的柱形图；
图7示出了本发明实施例的不同样品中内毒素浓度的柱形图。
具体实施方式
为了更加清楚的阐释本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的范例；相反，提供这些实施方式使得本发明将更加全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。
此外，所描述的特征、结构或特性可以以任何合适的方式结合在一个或更多实施例中。在下面的描述中，提供许多具体细节从而给出对本发明的实施例的充分理解。然而，本领域技术人员将意识到，可以实践本发明的技术方案而没有特定细节中的一个或更多，或者可以采用其它的方法、组元、装置、步骤等。在其它情况下，不详细示出或描述公知方法、装置、实现或者操作以避免模糊本发明的各方面。
附图中所示的流程图仅是示例性说明，不是必须包括所有的内容和操作/步骤，也不是必须按所描述的顺序执行。例如，有的操作/步骤还可以分解，而有的操作/步骤可以合并或部分合并，因此实际执行的顺序有可能根据实际情况改变。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明：
实施例1
本发明实施例提供了一种低内毒素噬菌体制剂的制备系统，如附图1所示，该系统包括：
三个储液罐，第一储液罐和第二储液罐分别用于存放对噬菌体粗滤液进行处理的脱氧胆酸钠溶液和0.9% NaCl溶液，第三储液罐作为样品瓶，用于存放噬菌体粗滤液；
切向流超滤膜包，用来对所述噬菌体粗滤液进行超滤；
无菌废液罐，用来存放所述噬菌体粗滤液的超滤废液；
两个蠕动泵，第一蠕动泵用于将所述脱氧胆酸钠溶液和四次等体积的所述0.9%NaCl溶液转移进所述噬菌体粗滤液，第二蠕动泵用于转移所述噬菌体粗滤液进所述切向流超滤膜包进行超滤；
样品收集管，用来收集制备最终得到的低内毒素噬菌体制剂；
两个两位三通电磁阀：第一三通阀连接所述第一储液罐和所述第二储液罐、所述样品瓶，用来控制所述脱氧胆酸钠溶液和所述0.9% NaCl溶液的转移；第二三通阀连接所述切向流超滤膜包、所述样品收集管和所述样品瓶，用来控制噬菌体超滤液回流进所述样品瓶和收集进所述样品收集管。
质量感应器和内毒素检测器，分别用来检测所述噬菌体粗滤液的质量和内毒素的含量；
操作显示屏，用来控制整个系统和显示系统运作情况。
具体地，在本实施例中，使用脱氧胆酸钠溶液即Na-DC去除噬菌体粗滤液中的LPS，使用0.9%NaCl去除Na-DC、残留的LPS以及其他杂质；
进一步地，还包括连接管道，具体为：
第一管道，连接所述第一储液罐、所述第二储液罐、所述第一蠕动泵以及所述样品瓶，用作所述脱氧胆酸钠溶液和0.9% NaCl溶液从所述第一储液罐和第二储液罐转移进入样品瓶的管路；
第二管道，连接所述样品瓶、所述第二蠕动泵、所述切向流超滤膜包以及所述无菌废液罐，用作所述噬菌体粗滤液从所述样品瓶转移进入所述切向流超滤膜包进行超滤的管路和所述超滤废液进入所述无菌废液罐的管路；
第三管道，连接所述切向流超滤膜包、所述第二三通阀、所述样品收集管以及所述样品瓶，用作所述噬菌体粗滤液从所述切向流超滤膜包转移进入所述样品瓶的管路和所述低内毒素噬菌体制剂从所述样品瓶经过所述切向流超滤膜包转移进入所述样品收集管的管路。
具体地，本实施例所用切向流超滤膜包的孔径为100 kDa，其中超滤清除小分子LPS和Na-DC的工作方式包括：将第三管道的进样管和回流管置于样品瓶的上清液中，第二管道的滤出管通过超滤膜包后放入无菌废液罐内；通过第二蠕动泵将样品瓶内噬菌体溶液转移进入切向流超滤膜包，超滤操作将含有小分子LPS、Na-DC和其他杂质的滤出液通过第二管道的滤出管滤进无菌废液罐，并把噬菌体超滤液通过第二三通阀后经过第三管道的回流管流回到样品瓶内。
具体地，以500mL噬菌体粗滤液制备低内毒素噬菌体制剂为例，制备系统如附图1所示，使用该系统制备噬菌体制剂的具体制备过程包括：
（1）将500mL噬菌体粗滤液放入样品瓶中，质量感应器输出数值为500，通过控制第一蠕动泵和第一三通阀，将第一储液罐中液体即脱氧胆酸钠溶液转移至即样品瓶中，使噬菌体粗滤液中LPS解离成小分子LPS，开启第二蠕动泵，样品经第二管道进入超滤膜包处理后，超滤废液经第二管道流至无菌废液罐，其余液体经第三管道的a路回流到样品瓶中；
（2）待质量感应器输出数值为50时，暂停第二蠕动泵、超滤膜包的工作，第一三通阀连接的第一管道的a路打开，启动第一蠕动泵，将第一储液罐中液体即脱氧胆酸钠溶液转移至即样品瓶中，质量感应器输出数值为500时停止；
（3）启动第二蠕动泵，样品经第二管道进入超滤膜包处理后，超滤废液经第二管道流至无菌废液罐，其余液体经第三管道的a路回流到样品瓶中；
（4）重复步骤（2）和（3）一次；
（5）待质量感应器输出数值为50时，暂停第二蠕动泵、超滤膜包的工作，第一三通阀连接的第一管道的b路打开，启动第一蠕动泵，将第二储液罐中液体即0.9%NaCl溶液转移至样品瓶中，质量感应器输出数值为500时停止；
（6）再次启动第二蠕动泵，样品进入超滤膜包处理后，超滤废液经第二管道流至无菌废液罐，其余液体经第三管道的a路回流到样品瓶中；
（7）重复步骤（5）和（6）三次，待质量感应器输出数值为25时，停止第二蠕动泵；
（8）第二三通阀连接的第三管道的a路关闭，连接的第三管道的b路打开，启动第二蠕动泵，将样品瓶、管道以及超滤膜包中所有液体转移至样品收集管，获得低内毒素噬菌体制剂。
在本实施例中，使用噬菌体制剂自动化制备装置来缩短制备时间，从加入样品到最后得到低内毒素噬菌体制剂仅需要90分钟，并且此装置使用一次性超滤膜包，确保噬菌体制剂的安全性和稳定性，此装置包含的内毒素检测生物感应器可以实时检测样品中内毒素含量，确保制备的噬菌体制剂中内毒素低于临床使用标准。
实施例2
如附图2所示，本发明实施例提供了一种快速制备低内毒素噬菌体制剂制备技术路线，具体步骤如下：
1.噬菌体PaP1的扩增，具体包括：
宿主菌活化：取出-80℃保存的铜绿假单胞菌PAO1，LB无抗平板划线，37 ℃静置培养16小时后，挑单菌落到10mL LB培养基中，37℃ 200 rpm培养过夜；
10 mL PaP1噬菌体增殖培养：取过夜菌液1:20转接至新鲜10 mL LB中，37℃ 200rpm培养1~2 h，加入噬菌体溶液；噬菌体与宿主菌数量的比值约为1:10不同噬菌体该比值可不同，37℃ 150 rpm培养2h至菌液变清，获得小体系噬菌体混合培养液；
300 mL噬菌体增殖培养：以1:20将菌液转接至300 mL新鲜LB中，37℃ 150 rpm培养1~2 h；加入10 mL小体系噬菌体混合培养液，37℃ 150 rpm培养约2 h至菌液变清，获得大体系噬菌体混合培养液。
2.通过0.22μm抽滤装置获得无细胞杂质的噬菌体粗滤液：连接一次性抽滤装置与真空泵，将噬菌体混合培养液倒入一次性抽滤装置顶部容器，打开真空泵，抽滤获得噬菌体粗滤液；
此步操作目的及作用：利用0.22μm的抽滤装置将噬菌体混合培养液进行初步的过滤，以去除细胞残渣和其他可能存在的杂质，从而可以获得无细胞杂质的噬菌体粗滤液；此过滤作用能够有效去除大部分的细菌、真菌、病毒和其他细胞组分等微小杂质，确保噬菌体制剂的纯度和高质量；连接一次性抽滤装置与真空泵的操作能使得抽滤更加方便和高效，同时也能避免手动过滤时可能造成的误差和污染。
3.使用1%Na-DC解离LPS：通过第一三通阀和第一蠕动泵，在存放噬菌体粗滤液的样品瓶中加入第一储液罐中浓度为1%的脱氧胆酸钠（Na-DC），并在37℃，150 rpm环境下处理1 h，将大分子LPS解离成小分子LPS。
此步操作目的及作用：降低大分子LPS对噬菌体培养、提取和检测的干扰，以提高噬菌体制备的质量和精度；通过将大分子LPS解离成小分子LPS，方便后续去除，同时也能减少LPS的干扰对检测结果的影响，从而使得噬菌体培养和提取过程更加可靠和准确。
4.补充两次等体积的1%Na-DC进行超滤去除LPS：基于第一管道，通过第一三通阀和第一蠕动泵，先后进行两次等体积的1%Na-DC补充，每次补充完之后通过第二蠕动泵和第二三通阀，将样品瓶中噬菌体原始液转移到超滤膜包中进行超滤操作，通过第二管道将LPS和其他杂质分离出来并滤除进无菌废液罐，噬菌体超滤液通过第三管道回流进样品瓶；
具体地，在本实施例中，上一步中对噬菌体粗滤液进行LPS解离后，开始超滤，当样品瓶中噬菌体原始液剩余30 mL左右时，暂停超滤操作，加入1% Na-DC到样品瓶至体积与噬菌体粗滤液相同，继续超滤操作，当样品瓶中的噬菌体原始液又剩余30 mL左右时，暂停超滤操作，再次加入1%Na-DC到样品瓶至体积与噬菌体粗滤液相同，继续超滤操作，直到噬菌体粗滤液剩余30 mL左右；补充两次等体积的所述脱氧胆酸钠溶液的补液体积为所述噬菌体粗滤液的2-5倍；
此步操作目的及作用：进一步去除噬菌体制备中可能残留的LPS，以提高噬菌体制剂的纯度；在此过程中，使用等体积1%Na-DC为超滤液提供适宜的溶液环境，以便LPS可以充分溶解和去除，超滤操作利用滤芯的孔径大小，将LPS和其他杂质分离滤除，可以实现对LPS的高效去除，同时滤去其他杂质，而小分子的噬菌体及溶液则通过滤芯流出，有利于提高噬菌体制备的稳定性和准确性；因此，这一步操作是保证噬菌体制剂内毒素浓度低、噬菌体滴度高的关键步骤之一。
5.补充四次等体积生理盐水进行超滤去除Na-DC和残留的LPS：先后进行四次等体积的生理盐水补充，每次补充完之后进行超滤操作，将Na-DC、残留的LPS及其他杂质分离出来并滤除；
具体地，在本实施例中，在上一步的基础之上，储液罐中噬菌体粗滤液剩余30mL时，基于第一管道，通过控制第一三通阀和第一蠕动泵，向30 mL噬菌体粗滤液中依次加入4次300 mL的0.9% NaCl，通过控制第二蠕动泵和第二三通阀，将样品瓶中噬菌体粗滤液转移到超滤膜包中进行超滤操作，通过第二管道将LPS和其他杂质分离出来并滤除进无菌废液罐，噬菌体超滤液通过第三管道回流进样品瓶，依次获得第一次超滤液、第二次超滤液、第三次超滤液、第四次超滤液，充分去除噬菌体粗滤液中的Na-DC和残留的LPS；所述低内毒素噬菌体制剂体积为所述噬菌体粗滤液的1/5-1/50；
此步操作目的及作用：利用超滤操作中对滤芯大小的控制来选择滤除范围，进一步去除在前一步操作中添加的Na-DC和残留的LPS，以提高噬菌体制备的纯度和稳定性；经过四次等体积含0.9%NaCl的生理盐水补充，加上每次进行超滤操作来分离出Na-DC、残留的LPS和其他杂质，可以将Na-DC和LPS滤除，同时保留噬菌体和其他溶液分子，这种处理可以更加彻底地去除Na-DC和LPS，有助于避免它们的干扰作用对后续检测和应用的影响，同时可以提高噬菌体制备的稳定性和一致性，以确保最终产品的质量和精度；因此，这一步操作是制备高质量和可靠噬菌体产品的重要步骤之一。
6.获得超低内毒素的PaP1噬菌体制剂并进行内毒素检测：通过上述步骤，超滤去除Na-DC、LPS及其他杂质后获得内毒素浓度低、滴度高的PaP1噬菌体制剂；
进一步地，对获得的超低内毒素PaP1噬菌体制剂进行内毒素检测，均采用厦门鲎试剂生物科技有限公司（EC80545）革兰氏阴性菌脂多糖检测试剂盒，是一种试管定量显色基质法，该试剂盒能够准确定量溶液中内毒素的含量，标曲范围为：0.1~1 EU/mL，测得内毒素浓度为4.41EU/mL；
具体地，获得的噬菌体制剂滴度为11.8211pfu/mL；且将噬菌体滴度调整至11.829pfu/mL 后，制剂中内毒素含量为0.0441 EU/mL。
在本实施例中，通过使用1%Na-DC对PaP1噬菌体粗滤液中大分子LPS进行解离成小分子，并结合超滤法对解离后的LPS进行滤除，使用含0.9%NaCl的生理盐水结合超滤法对Na-DC、残留的LPS和其他杂质进行滤除，获得低内毒素噬菌体制剂，有效缩短了噬菌体的制备周期，从获得耐药细菌、筛选获得靶向噬菌体到完成制剂制备仅需要2天时间，且制得的噬菌体制剂内毒素含量低、噬菌体滴度高，其中噬菌体滴度高于1011pfu/mL，内毒素浓度低于 5EU/mL，且将噬菌体滴度调整至临床所需的 109pfu/mL 后，制剂中内毒素含量低于0.05 EU/mL；制备时所需设备也较为简单，只需引入脱氧胆酸钠一种溶剂，有效降低了制备成本，适用性广，对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌噬菌体的裂解液均有良好的内毒素去除效果，且对其他细菌发酵制备产品有普遍使用性，易于规模化工业化生产。
实施例3
本实施例为使用Na-DC溶液对PaP1噬菌体滴度影响的安全性验证，仅使用Na-DC溶液对噬菌体制剂进行处理，各组区别在于Na-DC的浓度不同，验证0%-2%Na-DC浓度包括0%、0.25%、0.5%、1%以及2%浓度的Na-DC溶液对噬菌体制剂影响。
实验结果如附图3所示，由图中柱形图数据可知，Na-DC浓度从0.25%-2%不会对PaP1噬菌体滴度、侵染性造成不利影响。
实施例4
本实施例为使用多次超滤对PaP1噬菌体滴度影响的安全性验证，本实施例中以1%Na-DC为例，实际可以选取0.25%-2%Na-DC；往存放噬菌体原始液的储液罐加入五次生理盐水并超滤去除1%Na-DC，依次获得第一次超滤液、第二次超滤液、第三次超滤液、第四次超滤液、第五次超滤液。
实验结果如附图4所示，由图中柱形图数据可知，每一次超滤后噬菌体滴度几乎没有变化，说明多次超滤包括五次超滤去除Na-DC并不会对噬菌体滴度造成影响。
实施例5
本实施例为使用多次超滤对内毒素含量滤除效果的有效性验证，本实施例中以1%Na-DC为例，实际可以选取0.25%-2%Na-DC；往存放PaP1噬菌体原始液的储液罐加入五次生理盐水并超滤去除1%Na-DC和残留的LPS，依次获得第一次超滤液、第二次超滤液、第三次超滤液、第四次超滤液、第五次超滤液。
实验结果如附图5所示，由图中柱形图数据可知，随着超滤次数的增多，噬菌体制剂的LPS含量逐渐降低，并在超滤4次后达到稳定，所以本发明其他实施例选择补充四次生理盐水超滤四次。
实施例6
本实施例为使用0%和1%两种不同浓度的不同浓度Na-DC溶液，对比这两种情况下超滤对PaP1噬菌体制剂滴度和内毒素含量的影响，并记录实验结果。
对噬菌体制剂滴度影响的实验结果如附图6所示，由图中柱形图数据可知，超滤后可以增加噬菌体原始液的噬菌体滴度。
对内毒素含量影响的实验结果如附图7所示，由图中柱形图数据可知，使用了1%Na-DC的噬菌体原始液中内毒素含量大量减少，而使用0% Na-DC的噬菌体原始液中内毒素含量几乎不变，说明1% Na-DC可用于制备低内毒素的噬菌体制剂。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由权利要求指出。应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims (3)

1.一种低内毒素噬菌体制剂的制备系统，其特征在于，包括：
三个储液罐，第一储液罐和第二储液罐分别用于存放对噬菌体粗滤液进行处理的浓度为1%脱氧胆酸钠溶液和体积浓度为0.9%NaCl溶液，第三储液罐作为样品瓶，用于存放噬菌体粗滤液；
切向流超滤膜包，用来对所述噬菌体粗滤液进行超滤，所述切向流超滤膜包的孔径为100kDa；
无菌废液罐，用来存放所述噬菌体粗滤液的超滤废液；
两个蠕动泵，第一蠕动泵用于将所述浓度为1%脱氧胆酸钠溶液和四次等体积的所述0.9%NaCl溶液转移进所述噬菌体粗滤液，第二蠕动泵用于转移所述噬菌体粗滤液进所述切向流超滤膜包进行超滤；
样品收集管，用来收集制备最终得到的低内毒素噬菌体制剂；
还包括两个两位三通电磁阀：
第一三通阀连接所述第一储液罐和所述第二储液罐、所述样品瓶，用来控制所述浓度为1%脱氧胆酸钠溶液和所述0.9%NaCl溶液的转移；
第二三通阀连接所述切向流超滤膜包、所述样品收集管和所述样品瓶，用来控制噬菌体超滤液回流进所述样品瓶和收集进所述样品收集管；
还包括以下连接管道：
第一管道，连接所述第一储液罐、所述第二储液罐、所述第一三通阀、所述第一蠕动泵以及所述样品瓶，用作所述浓度为1%脱氧胆酸钠溶液和0.9%NaCl 溶液从所述第一储液罐和第二储液罐转移进入样品瓶的管路；
第二管道，连接所述样品瓶、所述第二蠕动泵、所述切向流超滤膜包以及所述无菌废液罐，用作所述噬菌体粗滤液从所述样品瓶转移进入所述切向流超滤膜包进行超滤的管路和所述超滤废液进入所述无菌废液罐的管路；
第三管道，连接所述切向流超滤膜包、所述第二三通阀、所述样品收集管以及所述样品瓶，用作所述噬菌体粗滤液从所述切向流超滤膜包转移进入所述样品瓶的管路和所述低内毒素噬菌体制剂从所述样品瓶经过所述切向流超滤膜包转移进入所述样品收集管的管路；
操作显示屏，用来控制整个系统和显示系统运作情况；
还包括质量感应器和内毒素检测器，分别用来检测所述噬菌体粗滤液的质量和内毒素的含量；
将浓度为1%脱氧胆酸钠溶液存放在第一储液罐中，体积浓度为0.9%NaCl溶液存放在第二储液罐中，噬菌体粗滤液存放在样品瓶中，通过控制第一三通阀和第一蠕动泵，往所述噬菌体粗滤液中加入所述浓度为1%脱氧胆酸钠溶液，使大分子LPS解离成小分子LPS，通过第二蠕动泵转移所述噬菌体粗滤液进切向流超滤膜包进行超滤处理；
通过控制所述第一三通阀和所述第一蠕动泵，往所述小分子LPS的噬菌体粗滤液中补充两次等体积的所述浓度为1%脱氧胆酸钠溶液，且每次补充后都将所述噬菌体粗滤液转移进所述切向流超滤膜包进行超滤去除LPS，得到低内毒素噬菌体滤液；
通过控制所述第一三通阀和所述第一蠕动泵，往所述低内毒素噬菌体滤液中补充四次等体积的所述0.9%NaCl溶液，且每次补充后都将所述低内毒素噬菌体滤液转移进所述切向流超滤膜包进行超滤去除残留的所述浓度为1%脱氧胆酸钠溶液，得到低内毒素噬菌体制剂；
所述补充两次等体积的所述浓度为1%脱氧胆酸钠溶液的补液体积为所述噬菌体粗滤液的2-5倍，所述低内毒素噬菌体制剂体积为所述噬菌体粗滤液的1/5-1/50。
2.一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法，其特征在于，包括：
低内毒素噬菌体制剂的制备系统：
三个储液罐，第一储液罐和第二储液罐分别用于存放对噬菌体粗滤液进行处理的浓度为1%脱氧胆酸钠溶液和体积浓度为0.9%NaCl溶液，第三储液罐作为样品瓶，用于存放噬菌体粗滤液；
切向流超滤膜包，用来对所述噬菌体粗滤液进行超滤，所述切向流超滤膜包的孔径为100kDa；
无菌废液罐，用来存放所述噬菌体粗滤液的超滤废液；
两个蠕动泵，第一蠕动泵用于将所述浓度为1%脱氧胆酸钠溶液和四次等体积的所述0.9%NaCl溶液转移进所述噬菌体粗滤液，第二蠕动泵用于转移所述噬菌体粗滤液进所述切向流超滤膜包进行超滤；
样品收集管，用来收集制备最终得到的低内毒素噬菌体制剂；
还包括两个两位三通电磁阀：
第一三通阀连接所述第一储液罐和所述第二储液罐、所述样品瓶，用来控制所述浓度为1%脱氧胆酸钠溶液和所述0.9%NaCl溶液的转移；
第二三通阀连接所述切向流超滤膜包、所述样品收集管和所述样品瓶，用来控制噬菌体超滤液回流进所述样品瓶和收集进所述样品收集管；
还包括以下连接管道：
第一管道，连接所述第一储液罐、所述第二储液罐、所述第一三通阀、所述第一蠕动泵以及所述样品瓶，用作所述浓度为1%脱氧胆酸钠溶液和0.9%NaCl 溶液从所述第一储液罐和第二储液罐转移进入样品瓶的管路；
第二管道，连接所述样品瓶、所述第二蠕动泵、所述切向流超滤膜包以及所述无菌废液罐，用作所述噬菌体粗滤液从所述样品瓶转移进入所述切向流超滤膜包进行超滤的管路和所述超滤废液进入所述无菌废液罐的管路；
第三管道，连接所述切向流超滤膜包、所述第二三通阀、所述样品收集管以及所述样品瓶，用作所述噬菌体粗滤液从所述切向流超滤膜包转移进入所述样品瓶的管路和所述低内毒素噬菌体制剂从所述样品瓶经过所述切向流超滤膜包转移进入所述样品收集管的管路；
操作显示屏，用来控制整个系统和显示系统运作情况；
还包括质量感应器和内毒素检测器，分别用来检测所述噬菌体粗滤液的质量和内毒素的含量；
具体步骤如下：
将浓度为1%脱氧胆酸钠溶液存放在第一储液罐中，体积浓度为0.9%NaCl溶液存放在第二储液罐中，噬菌体粗滤液存放在样品瓶中，通过控制第一三通阀和第一蠕动泵，往所述噬菌体粗滤液中加入所述浓度为1%脱氧胆酸钠溶液，使大分子LPS解离成小分子LPS，通过第二蠕动泵转移所述噬菌体粗滤液进切向流超滤膜包进行超滤处理；
通过控制所述第一三通阀和所述第一蠕动泵，往所述小分子LPS的噬菌体粗滤液中补充两次等体积的所述浓度为1%脱氧胆酸钠溶液，且每次补充后都将所述噬菌体粗滤液转移进所述切向流超滤膜包进行超滤去除LPS，得到低内毒素噬菌体滤液；
通过控制所述第一三通阀和所述第一蠕动泵，往所述低内毒素噬菌体滤液中补充四次等体积的所述0.9%NaCl溶液，且每次补充后都将所述低内毒素噬菌体滤液转移进所述切向流超滤膜包进行超滤去除残留的所述浓度为1%脱氧胆酸钠溶液，得到低内毒素噬菌体制剂；
所述补充两次等体积的所述浓度为1%脱氧胆酸钠溶液的补液体积为所述噬菌体粗滤液的2-5倍，所述低内毒素噬菌体制剂体积为所述噬菌体粗滤液的1/5-1/50。
3.如权利要求2所述的制备方法在制备铜绿假单胞菌噬菌体制剂、大肠杆菌噬菌体制剂、沙门菌噬菌体制剂、鲍曼不动杆菌噬菌体制剂、肺炎克雷伯菌噬菌体制剂、嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体制剂中的应用。
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