CN116970070B - 一种iii型人胶原蛋白的植物表达方法、含有内含子的编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种III型人胶原蛋白的植物表达方法、含有内含子的编码基因及其应用。包括：步骤A:将内含子片段添加到胶原蛋白的16个基因片段中，对胶原蛋白COL3A1基因进行搭建；步骤B:连接合成，同时，通过添加信号肽的方式实现III型人胶原蛋白靶向质外体，实现III型人胶原蛋白胞外表达；步骤C:对胶原蛋白转基因表达；步骤D:将步骤C中表达最好植株种子进行培养，纯化。本发明将III型人胶原蛋白表达在质外体，简化纯化步骤，降低成本，添加了内含子的优化显著增强了胶原蛋白表达的稳定性。

Description

一种III型人胶原蛋白的植物表达方法、含有内含子的编码基 因及其应用

技术领域

本发明属于生物医药重组蛋白领域，具体涉及一种植物源重组III型胶原蛋白，特别涉及一种III型人胶原蛋白的植物表达方法、含有内含子的编码基因及其应用。

背景技术

胶原蛋白具有抗拉强度高，能够生物降解，低抗原活性低刺激性和低毒性以及属性促进细胞生长、细胞粘附和协调新的细胞重建。目前，它被用于敷料、人工再生器官、组织工程、皮肤护理等领域。胶原蛋白可以分为传统的动物提取方法和胶原蛋白重组方法，这取决于不同的来源。随着人类文明的发展，陆地上的环境污染越来越严重，疯牛病、禽流感和口蹄疫等严重的传染病也逐渐出现。因此，由陆地动物制成的胶原蛋白产品具有巨大的潜在安全风险。与从动物组织中提取的天然胶原蛋白相比，重组胶原蛋白具有更好的控制能力(如水溶解度和乳化)，更好地控制病原体传播的风险。重组胶原蛋白根据来源可分为植物源胶原蛋白、动物源胶原蛋白、酵母胶原蛋白、大肠杆菌胶原蛋白、昆虫杆状病毒胶原蛋白。随着国家双碳政策的提出，植物源胶原蛋白以更低廉更环保的优势引起各界的关注。

在全基因组分析中，在人类、小鼠和拟南芥基因中，mRNA稳定性与内含子数量呈正相关。将内含子插入到含有不稳定性决定因素的cDNA构建中，可增加其在人类细胞中的稳定性。内含子还可以增强初始RNA转录本3 '端加工和多聚腺苷酸化。这种效应是由剪接调节物多嘧啶束结合蛋白(PTB)介导的，并导致受影响转录本的半衰期显著增加。此外，与5 'SS结合的U1 snRNA抑制过早裂解和多聚腺苷酸化，并决定mRNA长度，这也可能影响转录稳定性。

现阶段重组胶原蛋白的表达体系主要以大肠杆菌和酵母为主，利用大肠杆菌以及酵母所产生重组胶原蛋白虽然产量高，但大多数不具备三螺旋结构，无法进行医美和填充等应用。而动物和昆虫表达体系产量较低、成本较高，利用植物来生产高产的具有三螺旋结构的重组人源性胶原蛋白，符合国家“双碳”战略，具有显著优势。

关于胶原蛋白在植物源表达的研究，早有研究学者对其进行报道，以色列再生医学公司CollPlant成功实现将I型胶原蛋白α1链、α2链基因、脯氨酰4-羟化酶 (P4H) 基因、赖氨酰羟化酶 (PLOD3) 基因在植物液泡表达。但是其技术缺乏添加内含子的优化操作，且胞内表达分离纯化复杂、成本高。植物源胶原蛋白技术虽然能表达出完整的三螺旋结构，但与其他表达系统相比，植物源表达胶原蛋白仍具有含量低，纯化难度困难的缺陷。

发明内容

基于此，有必要提供一种III型人胶原蛋白的植物表达方法、含有内含子的编码基因及其应用。

一种III型人胶原蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

相应的，本发明还提供了编码III型人胶原蛋白的基因COL3A1。

优选的，所述的III型人胶原蛋白，其内含子片段：内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6、内含子7、内含子8、内含子9、内含子10、内含子11、内含子12、内含子13、内含子15、内含子15的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 8-22所示。

优选的，一种III型人胶原蛋白的表达框，包括：COL3A1基因、脯氨酰4-羟化酶β亚基基因、脯氨酰4-羟化酶α亚基基因、PLOD3基因、胶原蛋白N端酶基因、胶原蛋白C端酶基因。

优选的，本发明还提供一种III型人胶原蛋白转基因的表达方法，包括如下几个步骤：

步骤A: 将内含子片段内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6、内含子7、内含子8、内含子9、内含子10、内含子11、内含子12、内含子13、内含子15、内含子15，将其添加到胶原蛋白COL3A1 16个基因片段中，对胶原蛋白COL3A1基因进行搭建；

步骤B: 将脯氨酰4-羟化酶β亚基基因、脯氨酰4-羟化酶α亚基基因、PLOD3基因、胶原蛋白N端酶基因、胶原蛋白C端酶基因、COL3A1基因进行连接合成，同时，通过向搭建好的基因通过添加信号肽的方式实现III型胶原蛋白靶向质外体，实现III型人胶原蛋白胞外表达；

步骤C: 对III型人胶原蛋白转基因表达；

步骤D: 将步骤C中表达最好植株种子进行培养，纯化。

优选的，所述步骤B中，靶向胞外质体的信号肽为马铃薯(potato) PinII信号肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

优选的，所述步骤B中，所述III型人胶原蛋白载体的引物为Coll正向引物和Coll反向引物，所述Coll正向引物和Coll反向引物分别是：

Coll正向引物：CTGGACCTAGAGGACAACCT

Coll反向引物：CTCTATCTCCAGACTTTCCAG。

本发明还提供了所述的III型人胶原蛋白在皮肤修复中的应用。

本发明的有益效果如下：

本发明将表达III型人胶原蛋白基因通过添加多个内含子、添加信号肽表达质外体的方式，提高mRNA稳定性，进而提高植物源III型人胶原蛋白的表达量，降低纯化胶原蛋白的风险。

本发明将III型人胶原蛋白表达在质外体，简化纯化步骤，降低成本，添加了内含子的优化显著增强了胶原蛋白表达的稳定性。

附图说明

图1 是相关基因连接方式图，用来揭示相关基因具体连接方式。

图2是转化体的PCR鉴定图，其中，a显示pYLTAC380H-nTU转化PCR鉴定图，b显示pYLTAC380H-iTU转化PCR鉴定图。

图3是转基因烟草长势图，其中，A部分代表转pYLTAC380H -iTU载体烟草幼苗，B部分代表转入pYLTAC380H-nTU载体烟草幼苗。

图4转基因植株叶片条带对比图，其中，A部分代表转入pYLTAC380H -iTU载体叶片，B部分代表转入pYLTAC380H-nTU载体烟草叶片，P部分野生型叶片，T0代表的是转基因植物的初代。

图5是转基因种子长势图，其中，A部分代表转入pYLTAC380H -iTU载体烟草后代，B部分代表转入pYLTAC380H-nTU载体烟草后代。

图6是III型人胶原蛋白蛋白印迹图，其中，A部分代表转入pYLTAC380H -iTU载体叶片，B部分代表转入pYLTAC380H-nTU载体烟草叶片，T1代表的是转基因植物第一代后代。

图7是胶原蛋白活性检测，其中，A部分为本发明所生产胶原蛋白细胞活性检测，B部分为国外某公司所生产胶原蛋白细胞活性检测。

图8是胶原蛋白皮肤效果检测，其中A部分为本发明产生胶原蛋白皮肤效果检测，B部分为生理盐水皮肤效果检测。

具体实施方式

实施例1：植物源III型人胶原蛋白表达框搭建

含有内含子III型人胶原蛋白具体搭建思路，将内含子片段内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6、内含子7、内含子8、内含子9、内含子10、内含子11、内含子12、内含子13、内含子15、内含子15 （SEQ ID NO：8～22）通过内含子插入位点GU-AG规则（即平均400bp之间的GU-AG位点插入一个内含子，若在400bp范围内没有GU-AG位点，可通过碱基互补原则将其他碱基位点替换成GU-AG位点）将其添加到III型人胶原蛋白基因COL3A1中，对III型人胶原蛋白COL3A1基因进行搭建。同样，完成对不含内含子III型人胶原蛋白NCOL3A1基因搭建。

将脯氨酰4-羟化酶β亚基（P4H-β）基因、脯氨酰4-羟化酶α亚基(P4H-α)基因、PLOD3基因、胶原蛋白N端酶基因（ADAMTS2）、胶原蛋白C端酶基因（BMP1）、COL3A1基因进行连接合成，具体连接方式见图1。

表1 相关基因说明

名称	氨基酸	简称	SEQ ID NO编码
				胶原α1(III)链（含内含子）	2095	COL3A1	1
脯氨酰4-羟化酶β亚基	534	小鼠P4H β	2
				脯氨酰4-羟化酶α亚基	572	小鼠P4Hα	3
前胶原III C-蛋白酶	986	蛋白酶C	4
				前胶原III N-蛋白酶	1211	蛋白酶N	5
赖氨酰羟化酶	767	猪PLOD3	6
				胶原α1(III)链（不含内含子）	2095	NCOL3A1	23

其中，表1中脯氨酰4-羟化酶(P4H)酶指的是小鼠脯氨酰4-羟化酶(P4H)酶，赖氨酰羟化酶（PLOD3）指的是猪赖氨酰羟化酶。含有人前胶原C-蛋白酶合成序列、含有人前胶原N-蛋白酶合成序列分别对应表1中前胶原III C-蛋白酶和前胶原III N-蛋白酶。

同时，相关基因通过前端添加信号肽基因的方式成功实现III型人胶原蛋白(含内含子、不含内含子)靶向质外体，实现III型人胶原蛋白(含内含子、不含内含子)胞外表达。所搭建的载体命名为pYLTAC380H-iTU（含内含子）、pYLTAC380H-nTU（不含内含子）。

所选用靶向胞外质体的信号肽为马铃薯(potato) PinII信号肽SEQ ID NO.7质粒构建。

对植物源III型人胶原蛋白载体(含内含子、不含内含子)利用引物进行PCR鉴定，所述引物被设计为能够扩增含内含子III型人胶原蛋白的2000bp片段以及不含内含子的1400bp片段 (表2)。图2举例说明了PCR鉴定结果。具体PCR反应程序如下：Coll正向引物1 μL、Coll反向引物1 μL、鉴定载体3 μL、Taq扩增酶5 μL，ddH2O补齐至10 μL。

表2 PCR鉴定引物

Coll正向引物：	CTGGACCTAGAGGACAACCT（如SEQ ID No.24 所示）
		Coll反向引物：	CTCTATCTCCAGACTTTCCAG（如SEQ ID No.25 所示）

实施例2：植物源III型人胶原蛋白转基因表达

利用农杆菌法侵染烟草种子实现III型人胶原蛋白转基因表达。

种子：选取表皮光滑、无病斑的湘烟7号烟草种子。

基质：选取湘正农科育苗基。

营养液：选用Hoagland培养液。

农杆菌：将带有Rif（利福平）（稀释倍数1/2000）的LB固体培养基稀释涂布带有目标载体pYLTAC380H -iTU与pYLTAC380H-nTU的农杆菌，在28℃恒温培养箱暗培养（1-2 d）。挑长势最好的单菌落转至3 mL LB液体培养基（带Rif抗生素），在温度28 ℃，转速220rpm振荡培养（1d）。将菌液转入2 L锥形瓶（200mL培养基），在温度28℃，转速180r振荡培养1 d(稀释100倍OD600>0.5)。

转染：载体pYLTAC380H -iTU与 pYLTAC380H-nTU的农杆菌采用叶盘法转化烟草，使烟草再生，从而获得转基因苗（T0），通过可知烟草长势良好，说明转基因方法不影响烟草的生长（图3）。方法参见文献 ：STEIN H, WILENSKY M, TSAFRIR Y, et al. Productionof Bioactive, Post-Translationally Modified, Heterotrimeric, HumanRecombinant Type-I Collagen in Transgenic Tobacco [J]. Biomacromolecules,2009, 10(9): 2640-5。并在阳性烟草苗上剪取适量的叶片，将两者叶片剪碎分别放入1.5ml离心管中，使用棒子将叶子往下戳，在两个离心管中加入500 μL蛋白提取液，放在冰上，冰浴10min。随后将两离心管通过4℃高速离心机，在转速为15000g的条件下，离心10分钟,获取两种表达III型胶原类型蛋白上清液。将有pYLTAC380H-iTU载体转基因植物的上清液、pYLTAC380H-nTU转基因植物上清、各取5 μL加入30 μL蛋白上样缓冲液，在温度为100℃的金属浴加热5min；随后将加热样品立即放冰上降温；同时按照标准WB实验进行操作。通过WB实验（图4）证实，两种载体的转基因作物的叶片均有表达III型人胶原蛋白，但pYLTAC380H -iTU转基因植物所表达III型人胶原蛋白的含量高于pYLTAC380H-nTU转基因植物所表达III型人胶原蛋白的含量,表达分子量为130 kDa，符合预期表达量。WB实验证获得两种载体转基因烟草。

继代：将鉴定出的含载体pYLTAC380H-nTU与pYLTAC380H-iTU转基因烟草在MS培养基上培养，每3-4周继代一次，培养条件为25℃。将部分转基因苗和对照苗炼苗后移栽至草炭：蛭石体积比为1:1的基质中，在温室中栽培，并套袋收种。

种子播种；按营养液与土按体积比1:6将育苗基质拌潮，以能挤出水为宜，将拌潮基质土装入泡沫板，轻轻颠动泡沫板紧实土壤。使用吸管吸取种子播撒至基质，每格2-3颗。托盘预先加入托盘体积三分之二的营养液，将带有拌潮基质土的泡沫板放入托盘中。在环境温度25℃，湿度80%，16 h光照/ 8 h黑暗色温6500 k，光强200坎德拉的条件下培养转基因种子14天，使其生长出具有良好生长状态的幼苗（T1）。

T1代转基因植株表达验证：（1）配置10×PBS缓冲液1 L，并加水稀释至10 L,得到1×PBS缓冲液；（2）称取2g具有表达型烟草转化体的叶片，并加入1×PBS缓冲液，形成初步提取液；（3）将初步提取液通过0.5Mpa的冷冻干燥离心机离心并通过甩水机甩干叶片表面的水分，收集质外体粗体液（Tris-HCl（pH7.5） 50 mM、NaCl 150 mM、NP40 0.1%、Urea 4 M、PMSF 1 mM）；（4）收集质外体粗体溶液置于冰上，加入2% 体积0.5M EDTA（终浓度10 mMpH8.0）。（5）通过高速离心机在转速为10000r/min，环境温度为4 ℃的条件下，离心25 min，保留离心上清液；（6）离心上清液加入甘油混匀至为甘油浓度10%，并放入-80℃环境下保存。（7）取20 μL上清液加载到10％聚丙烯酰胺凝胶中，并在标准蛋白质印迹程序中用单克隆抗-胶原蛋白，III型小鼠抗(来自Sigma-Aldrich Inc.的C7805)与羊抗鼠二抗（来自全式金公司的HS201）进行测试(图6)，采用来自人胎盘的500ng III型胶原(来自Chemicon Inc.的#CC054)的阳性对照条带代表来自转基因植物的样品中的约5％总可溶性蛋白(约500mg/kg鲜叶)。同时，通过蛋白质印迹可以证实pYLTAC380H -iTU基因植物的T1-4植株所表达III型人胶原蛋白含量最高（分子大小为130kDa）；而野生型不表达胶原蛋白。说明含内含子III人胶原蛋白表达初代转基因可实现最高表达量。同时可以发现，pYLTAC380H -iTU转基因植物植株的III人胶原蛋白表达量远大于pYLTAC380H-nTU转基因植物植株表达量，说明添加内含子确实能一定程度提高III型人胶原蛋白表达量。

最后选取表达III型人胶原蛋白最好的植株（pYLTAC380 -iTU-T1-i4）进行人工授粉保留优良品种。

实施例3：转基因胶原蛋白提取与纯化

对上述所研究表达最好植株（pYLTAC380 -iTU-T1-i4）种子进行培养，获得成熟烟草叶片，对其进行纯化。纯化步骤如下：

粗提液提取：烟叶(1kg)在冷冻提取缓冲液(1800 mL 100 mM Tris-HCl, pH 7.5，含4.5 mM甲基亚硫酸钾和7.5 mM EDTA)中混合，添加15g聚乙烯吡啶酮(PVPP)和6g活性炭。混合分5次进行，每次1分钟，同时温度保持在15℃以下。粗提物通过纱布垫过滤，离心30分钟，26000g, 5℃。收集上清液，加入CaCl₂至终浓度为10 mM，活性炭浓度为1 g/L。加入5mg/L的ficin (Sigma #F4125;15℃，搅拌3小时)。然后通过离心（30分钟，22000g，15℃）去除不溶性污染物。将回收的上清液中III型人胶原蛋白逐渐加入结晶NaCl，沉淀至终浓度为3.13 M (25 min, rt，持续搅拌)。将溶液在冷藏室中不搅拌孵育8小时。在离心（26000 g,2 h, 5℃）后收集含有III型人胶原蛋白（rhCOL III）的颗粒。

将微球重悬于250 mM乙酸+ 2m NaCl的200 mL溶液中，磁力搅拌5 min，然后离心(26000 g, 40 min, 5℃)。丢弃上清，将微球重悬于200 mL 0.5 M醋酸中(1 h, rt)。

通过离心(16000 g, 30 min, 15℃)去除不溶性物质。将上清液通过12层纱布垫。在室温下，缓慢加入终浓度为3 M的NaCl，持续搅拌20 min，沉淀rhCOL III。

将溶液孵育(8 h, O.N, 4℃)，离心(26000g, 2 h, 5℃)后收集rhCOL III。去除所有上清痕迹。颗粒再溶和rhCOL III沉淀步骤分别在乙酸和NaCl溶液中重复上述步骤。

透析：在孵育和收集含有III型人胶原蛋白的微球后，通过强力移液和在室温下旋转5 min，将样品重新溶解在80 mL的10mm HCl中。将溶液转移到透析袋(MWCO 13000 Da)中，在4L的10 mm HCl中透析4小时，4℃。立即进行了额外的透析。

过滤：III型人胶原蛋白用30 mL注射器通过0.2 µm过滤器过滤灭菌。然后使用Vivaspin PES 20 mL滤管(Vivascience， #VS2041, MWCO 100000)浓缩III型人胶原蛋白。离心至体积减少至0.75 mL (45 min, 5000 g, 5℃)。对纯化出III型人胶原蛋白进行活性分析，如下表3所示。

表3 纯化活性成分对比

氨基酸	本发明	国外某公司	人类胶原蛋白
				羟（基）脯氨酸	9.86	7.55	10.3
苏氨酸	1.68	1.86	1.7
				丝氨酸	3.32	3.27	3.3
脯氨酸	12.4	15.03	12.0
				甘氨酸	33.2	32.32	33.5
丙氨酸	10.46	11.36	11.1
				缬氨酸	2.53	2.29	2.6
异亮氨酸	0.9	0.92	0.9
				亮氨酸	2.43	2.55	2.3
酪氨酸	0.24	0.36	0.2
				苯基丙氨酸	1.33	1.35	1.2
羟赖氨酸	0.87	0.74	1.0
				赖氨酸	2.54	2.85	2.3
组氨酸	0.64	0.31	0.6
				精氨酸	4.80	4.81	5.0
半胱氨酸	ND	ND	ND
				蛋氨酸	0.57	ND	0.6
色氨酸	ND	ND	ND
				Asp+Asn	4.56	4.78	4.3
Glu+Gln	7.18	7.64	7.1

纯化出胶原蛋白活性与国外某公司所生产的胶原蛋白以及人本身胶原蛋白对比可知，本发明所纯化出胶原蛋白的氨基酸成分与国外某公司相比，更接近人体胶原蛋白氨基酸组成成分，说明本发明所生产胶原蛋白活性较高，更有利于人体吸收，具有更好的应用前景。

将新分离的细胞接种于未包被板或包被200µg/mL本发明重组III型人胶原蛋白或国外某公司胶原蛋白的板上（图7）。培养7天后计数细胞。两个供体的结果显示，本发明胶原蛋白相对于国外某公司胶原蛋白更有利于细胞生长。

实施例4：胶原蛋白皮肤修复应用

选取14只雄性大鼠作为研究对象，其中雄性大鼠为200周龄，体重250±22g进行体内研究，将所有大鼠饲养在动物实验室设施（24-50°C，湿度的12%）中，在7小时光照/黑暗循环下7天，以适应注射前的环境。同时将冻干的rhCol III易于溶解在灭菌的盐水中，在注射前获得所需浓度的rhCol III溶液（2.0mg/mL），以灭菌的生理盐水（0.9%）作为阳性对照溶液。

将雄性大鼠分为两批实验组：一批雄性大鼠（7只）注射1mL rhCol III溶液（2.0mg/mL）；另一批雄性大鼠（7只）1mL注射生理盐水（0.9%）作为空白对照。对雄性大鼠皮肤状况分别在一周后进行分析。

根据参考文献：CAO Y, YANG J-P, ZHU X-G, et al. A ComparativeInVivoStudy on Three Treatment Approaches to Applying Topical Botulinum Toxin Afor Crow’s Feet [J]. BioMed Research International, 2018, 2018: 6235742.采用CBS皮肤分析系统对皮肤状况进行无创评估。在显微镜下捕获皮肤光学图像并进一步处理成负片。CBS皮肤分析系统的原理是基于光谱（445 nm）的颜色渐变识别和纹理扫描，并辅以统计基础。本研究中使用的CBS皮肤分析仪器配备了放大皮肤检测器（放大倍率，50×），可以有效地检测皮肤状况。代表皮肤状况的三个主要参数，即皮肤弹性，胶原蛋白含量和皮肤油脂含量，在注射和紫外线照射前每周测量一次。选取均匀分布在背侧皮肤上的3个测量点，每个点测量3次，以减少测量误差。根据实测数据计算平均值，利用处理前后获得的值之差进行进一步统计分析。

对雄性大鼠皮肤状况分别在注射后第一周进行分析可知（图8），注射1mL III型人胶原蛋白溶液（2.0 mg/mL）有助于提高雄性大鼠的皮肤状况，经过1周培养皮肤弹性提高了4.5%、胶原蛋白含量提高了20.8%、皮肤油脂含量提高了10.2%；而注射1 mL生理盐水（0.9%）的雄性大鼠的皮肤状况基本保持不变，皮肤弹性下降了2.3%。说明本公司生产III型人胶原蛋白有利于皮肤的修复，提高皮肤性能。

工业实用性

通过添加向III型人胶原蛋白基因添加内含子的步骤，有利于提高III型人胶原蛋白表达含量，降低III型人胶原蛋白纯化风险。运用向胶原蛋白添加内含子的手段能有效促进我国植物源重组胶原蛋白医美事业的发展，实现我国“双碳”任务，对于实现添加内含子手段在植物源胶原蛋白的广泛应用，为提高胶原蛋白表达效率提供切实有效的解决方案。

本申请相关说明：

内含子名称、来源及序列

网页http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/分析内含子

1、intron rbcS1-1来自Chrysanthemum x morifolium ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit gene（GenBank: AY163904.1）

gtacaatatataacttaaataataacgtgaacacttattataatgcagtagatataatgactaacattttataaaatatatatatag（如SEQ ID No.26 所示）

2、intron E2f5-4：来自E2F5 family transcription factor 的第4个内含子（GenBank: AC007017.4），调整部分碱基以使其更符合拟南芥内含子的共同序列。

gtaaggatttttatgatatagtatgcttatgtattttgtactgaaagcatatcctgcttcattgggatattactgaaagcatttaactacatgtaaactcacttgatgatcaataaacttgattttgcag（如SEQ ID No.27所示）

3、intron atbg11，来自Arabidopsis thaliana beta-glucosidase基因（At2g44460）的第11个内含子(GenBank: AC004521.3)：

gtaaatcctggtccacacttttacgataaaaacacaagattttaaactatgaactgatcaataatcattcctaaaagaccacacttttgttttgtttctaaagtaatttttactgttataacag（如SEQ ID No.28 所示）

4、intron atatp2，来自Arabidopsis thaliana vesicle transfer ATPase基因的第2个内含子（GenBank: AL161499.2）

gtaagaggtcaaaaggtttccgcaatgatccctctttttttgtttctctagtttcaagaatttgggtatatgactaacttctgagtgttccttgatgcatatttgtgatgagacaaatgtttgttctatgttttag（如SEQ IDNo.29 所示）

5、Intron Rlk7，来自Arabidopsis thaliana receptor-like protein kinase基因的第7个内含子（GenBank: AC006068.4）

gtaaagcaactgtgttttaatcaatttcttgtcaggatatatggattataacttaatttttgagaaatctgtagtatttggcgtgaaatgagtttgctttttggtttctcccgtgttatag（如SEQ ID No.30 所示）

6、intron atatp11，来自Arabidopsis thaliana vesicle transfer ATPase基因的第11个内含子（GenBank: AL161499.2）：

gtaaagtttccaactttcctttaccatatcaaactaaagttcgaaactttttatttgatcaacttcaaggccacccgatctttctattcctgattaatttgtgatgaatccatattgacttttgatggttacgcag（如SEQ IDNo.31 所示）

7、intron e2f5-8，来自E2F5 family transcription factor 的第8个内含子（GenBank: AC007017.4），调整部分碱基以使其更符合拟南芥内含子的共同序列。

gtctgtctttcctatttcatatgtttaatcctaggaatttgatcaattgattgtatgtatgtcgatcccaagactttcttgttcacttatatcttaactctctctttgctgtttcttgcag（如SEQ ID No.32 所示）

8、intron atsug1：来自Arabidopsis thaliana sugar transporter基因的第1个内含子（GenBank: AL161501.2）：

gtgagttcctaagttccatttttttgtaatccttcaatgttattttaacttttcagatcaacatcaaaattaggttcaattttcatcaaccaaataatatttttcatgtatatatag（如SEQ ID No.33 所示）

9、intron atbg3，来自Arabidopsis thaliana beta-glucosidase基因（At2g44460）的第3个内含子(GenBank: AC004521.3)：

gtaaaatattggatgccagacgatattctttcttttgatttgtaactttttcctgtcaaggtcgataaattttattttttttggtaaaaggtcgataatttttttttggagccattatgtaattttcctaattaactgaaccaaaattatacaaaccag（如SEQ ID No.34 所示）

10、intron atipl3，来自Arabidopsis thaliana Ipomoea nil leaf protein基因（AT4g04790）的第3个内含子（GenBank: AF118223.2）：

gtaaggacttctcatgaatattagtggcagattagtgttgttaaagtctttggttagataatcgatgcctcctaattgtccatgttttactggttttctacaattaaag（如SEQ ID No.35 所示）

11、Intron psk7-7，来自Petunia hybrid PSK7基因的第7个内含子（GenBank:AJ224165.1），调整部分碱基以使其更符合拟南芥内含子的共同序列。

gtatgtagtgtttttggataactgagtttgcctatgattttgtatttactgagatgtttgtcctctttctgcag（如SEQ ID No.36 所示）

12、intron atgt4，来自Arabidopsis thaliana glucosyltransferase(At2g35650) 基因的第4个内含子（GenBank: AC006068.4）：

gtaacattccttagttacctttcttttctttttccatcataagtttatagattgtacatgctttgagatttttctttgcaaacaatctcag（如SEQ ID No.37 所示）

13、intron atcdpk4-3: 来自Arabidopsis thaliana calmodulin-domainprotein kinase CDPK isoform 4（AT4g09570）基因的第3个内含子（GenBank:AL161831.1）：

gtaagttgttacttatgattgttttcctctctgctacatgtattttgttgttcatttctgtaagatataagaattgagttttcctctgatgatattattag（如SEQ ID No.38 所示）

14、intron attog11: 来自Arabidopsis thaliana similar to ch-TOG proteinfrom Homo sapiens（At2g35630）基因的第11个内含子（GenBank: AC006068.4）：

gttagtatcatatgaagaaatacctagtttcagttgatgaatgctattttctgacctcagttgttctcttttgagaattatttcttttctaatttgcctgatttttctattaattcattag（如SEQ ID No.39所示）

15、intron rccat1：来自 Ricinus communis (castor bean) CAT1 geneencoding catalase（GenBank: AB489142.1）：

Gtaaatttctagtttttctccttcattttcttggttaggacccttttctctttttatttttttgagctttgatctttctttaaactgatctattttttaattgattggttatggtgtaaatattacatagctttaactgataatctgattactttatttcgtgtgtctatgatgatgatgatagttacag（如SEQ ID No.40 所示）。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.编码III型人胶原蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，其包含核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8-22所示的内含子片段：内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6、内含子7、内含子8、内含子9、内含子10、内含子11、内含子12、内含子13、内含子14、内含子15。

3.一种III型人胶原蛋白的转基因表达框，其特征在于，包括如权利要求1所述的基因、脯氨酰4-羟化酶β亚基基因、脯氨酰4-羟化酶α亚基基因、PLOD3基因、胶原蛋白N端酶基因、胶原蛋白C端酶基因。

4.一种III型人胶原蛋白的转基因表达方法，其特征在于，包括如下几个步骤：

步骤A: 将核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8-22所示的内含子片段内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6、内含子7、内含子8、内含子9、内含子10、内含子11、内含子12、内含子13、内含子14、内含子15添加到胶原蛋白COL3A1基因的16个片段间，同时通过添加靶向质外体的信号肽实现III型人胶原蛋白胞外表达，获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的编码III型人胶原蛋白的基因；

步骤B: 将脯氨酰4-羟化酶β亚基基因、脯氨酰4-羟化酶α亚基基因、PLOD3基因、胶原蛋白N端酶基因、胶原蛋白C端酶基因、COL3A1基因进行连接合成，获得III型人胶原蛋白表达载体；

步骤C: 利用农杆菌法侵染烟草种子实现III型人胶原蛋白转基因表达；

步骤D:将步骤C中表达III型人胶原蛋白的植株种子进行培养，纯化。

5.如权利要求4所述的表达方法，其特征在于，所述步骤A中，靶向质外体的信号肽为马铃薯PinII信号肽，编码该信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

6.如权利要求4所述的表达方法，其特征在于，所述步骤B中， 利用Coll正向引物和Coll反向引物鉴定III型人胶原蛋白表达载体，所述Coll正向引物和Coll反向引物分别是：

Coll正向引物：CTGGACCTAGAGGACAACCT，

Coll反向引物：CTCTATCTCCAGACTTTCCAG。