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CN116963751A - 皮肤益生菌 - Google Patents

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CN116963751A
CN116963751A CN202280019206.1A CN202280019206A CN116963751A CN 116963751 A CN116963751 A CN 116963751A CN 202280019206 A CN202280019206 A CN 202280019206A CN 116963751 A CN116963751 A CN 116963751A
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CN
China
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skin
bioactive agent
peptide
bacteria
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CN202280019206.1A
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A·扎噶尔
J·D·凯斯林
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Original Assignee
University of California San Diego UCSD
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Abstract

一种局部皮肤益生菌制剂，其包含经基因工程化以生产皮肤生物活性剂的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)细菌的活菌群和用于所述细菌的营养源。

Description

皮肤益生菌
本发明是在国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的授权号为GM125179的政府支持下完成的。政府对本发明拥有某些权利。
引言
现有的皮肤局部治疗存在半衰期短的问题并且重复多次应用是不可行的。对于大皮肤面积，递送持续治疗的贴片是不舒服的并且是不切实际的。通过皮肤益生菌持续递送肽、抗菌肽和蛋白来治疗皮肤病和皮肤老化可能是皮肤病、皮肤护理和更广泛的健康护理领域中变革性的改进。
WO2015184134(US10,702,558)涉及采用工程化的皮肤共生微生物，如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidia)来治疗皮肤病。US9234204涉及通过在皮肤共生生物中在质粒中重组表达类菌孢素氨基酸来保护人的皮肤。US10293007涉及采用工程化的人皮肤微生物如痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)来治疗皮肤病。
在提供可持续感染的同时，皮肤菌群共生微生物也可能是机会性病原体，并且对以治疗水平生产和分泌化合物施加工程化制约。
发明概述
本发明提供了对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)进行工程化以生产有益的局部试剂，如化妆品、营养药物(neutraceuticals)、防晒霜和对皮肤表面的治疗。本发明提供了基因工程化的谷氨酸棒杆菌作为生产对皮肤表面有益的化合物的宿主的用途。营养缺陷型谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)(营养缺陷型提供了防止不必要的传播的保障)作为也能够提供润肤霜的发酵培养基的一部分施用于皮肤表面。制剂包括糖和工程化的谷氨酸棒杆菌用作营养源的其他培养基组分。谷氨酸棒杆菌转化营养源以生产有益化合物，诸如氨基酸、寡肽、抗菌肽和蛋白。
谷氨酸棒杆菌已经被工程化超过40年，已经开发出了多样化的基因工具箱。此外，谷氨酸棒杆菌是非共生的，并且不会被工程化成在皮肤的脂质和蛋白上生长；相反，我们的培养基制剂提供了生长(多种)营养物。
一方面，本发明提供了局部皮肤益生菌制剂，其包含经基因工程化以生产皮肤生物活性剂的谷氨酸棒杆菌细菌的活菌群和用于所述细菌的营养源。
一方面，本发明提供了谷氨酸棒杆菌的工程化菌株的用途，所述工程化菌株通过适应性实验室进化而被特别工程化，用于在皮肤酸性和脂质环境中更好的生长和生物生产。
在实施方案中：
将制剂置于人的皮肤上；
细菌正在生产所述活性剂；
制剂进一步包含皮肤润肤霜；
制剂进一步包含保湿剂，诸如甘油、透明质酸和丙二醇，或者润滑剂，诸如乳木果油、可可脂和辛基十二醇，或者闭塞剂，诸如凡士林、十六醇(十六烷-1-醇)和羊毛脂；
营养源包含一种或多种糖；
生物活性剂选自化妆品、抗衰老剂、抗氧化剂、防晒霜、抗炎剂、镇痛剂和治疗性化合物；
生物活性剂选自信号肽、载体肽、神经递质抑制剂肽和酶抑制剂肽；
生物活性剂选自赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、组氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、GHK-Cu、GSH-Cu、锰三肽、六胜肽(Peptamide-6)、肌肽、N-乙酰肌肽、三肽-10-瓜氨酸、棕榈酰三肽、棕榈酰四肽、棕榈酰五肽、乙酰基四肽、六肽-11、四肽PKEK、六肽-14、丝蛋白、水通道蛋白、α干扰素、Hsp70、转化生长因子、大米肽和大豆肽；
生物活性剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂，诸如用于治疗内瑟顿综合征(NethertonSyndrome)的LEKTI-D5、LEKTI-D6；和/或
生物活性剂是抗炎化合物，诸如IL-10。
生物活性剂是抗菌肽，诸如片球菌素和乳酸链球菌素。
生物活性剂是抗体片段，诸如单链可变片段抗肿瘤坏死因子α。
一方面，本发明提供了使用主题制剂的方法，其包括在细菌在预定时间范围内在皮肤上生产有效量活性剂的条件下将制剂施用于有其需要的人的皮肤。
在实施方案中：
时间范围是1至30、60或90天，或者大约4、8、12、24或48小时；和/或
所述方法进一步包括调整营养源的浓度以调整生物生产和定殖时间，诸如其中葡萄糖和甘油的浓度从润肤霜的2％变化至20％，用于使定殖时间越来越长。
本发明包括本文所记载的特定实施方案的所有组合，如同每个组合都已被着力引述，诸如其中
附图简述
图1.安全性和可行性数据：3D体外培养显示谷氨酸棒杆菌未造成细胞死亡增加；谷氨酸棒杆菌能够保持稳定的定殖状况；谷氨酸棒杆菌能够在培养物中生产赖氨酸。
图2.润肤霜中谷氨酸棒杆菌的存活时间。以每毫升107CFU添加到乳化的润肤霜中并置于室温，并且定期测量活性谷氨酸棒杆菌。
图3.将包含产谷氨酸的土壤细菌谷氨酸棒杆菌的益生菌润肤霜施用于皮肤的安全性和有效性。
图4.(左)将谷氨酸棒杆菌进行发酵并且采用镍色谱法纯化上清以分离分泌的LEKTI-D6蛋白和LEKTI-D5，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。(右)KLK5蛋白针对不同浓度的纯化LEKTI-D6蛋白的生物活性抑制试验。
具体实施方案的描述和本发明的递送方法
除非禁忌或另有注明，否则在这些描述和整个说明书中，术语“一(a)”和“一(an)”是指一或多，术语“或”是指和/或。本文描述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且根据其的各种修改或改变将提示给本领域技术人员并且将包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请，包括其引文，在此出于所有目的通过引用以其整体并入。
我们公开了对无害的细菌谷氨酸棒杆菌的基因工程化，以暂时地繁殖皮肤微生物组并且递送治疗疾病以及改善容貌的分子和蛋白。虽然棒状杆菌(Corynebacterium)是人皮肤上三种最大量的细菌属之一，但是一般认为安全(GRAS)的生物谷氨酸棒杆菌不是皮肤微生物组固有的。谷氨酸棒杆菌是用于蛋白生产的经过充分研究的生物，其暂时定殖提供了另外的安全控制特征。该用于向皮肤表面连续生产酶和小分子的平台是皮肤治疗中的变革性进步。
虽然在学术界和工业界(MatriSys、Azitra、Xycrobe)两者中都已经想到了通过调节天然细菌来操控皮肤微生物组，但是我们对皮肤治疗采取了完全不同的方法。9虽然皮肤微生物组中棒状杆菌的丰度预示了谷氨酸棒杆菌的相容性，但是我们的方法是基于对非天然微生物进行工程化以暂时定殖在皮肤。这是通过制剂工程化来操控在皮肤上的停留时间实现的，类似于传统发酵中的培养基优化。该方法提供了提高的安全性，因为谷氨酸棒杆菌不能长期定殖在皮肤环境，并且与表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和痤疮棒状杆菌(C.acnes)不同，谷氨酸棒杆菌与任何皮肤病无关。该方法的好处包括在皮肤靶细胞的水平上缓慢、稳定、持续且有效的释放治疗剂。采用适应性实验室进化(ALE)，我们还使用了尤其适于在皮肤酸性和脂质环境中生长和生产生物产物的谷氨酸棒杆菌的工程化菌株。
实施例1.安全性和可行性：将包含产赖氨酸的土壤细菌谷氨酸棒杆菌的益生菌润肤霜施用于模型皮肤
虽然谷氨酸棒杆菌是GRAS(一般认为安全)，但我们在人体等同组织(EpiDerm)中测试了它的安全性。EpiDerm是由人来源的表皮角质形成细胞组成的高度分化的3D组织模型。以润肤霜的常见组分(甘油、葡萄糖、LB和生物素)的混合物，我们在EpiDerm的顶面给予了谷氨酸棒杆菌(～107CFU/cm2)和单独的培养基。组织细胞活力试验显示与肥皂造成的细胞死亡相比相似的组织活力(图1)。
作为概念证明，我们给予了EpiDerm系统过度生产赖氨酸，即常见润肤霜组分的谷氨酸棒杆菌。我们显示了赖氨酸产量大约增加20mM，从而说明我们的通过连续微生物生产来延长有效肽浓度的总体目标(图1)。
我们也已经显示谷氨酸棒杆菌在与常见润肤霜成分(水、甘油、硬脂酸、司盘60、黄原胶、二甲硅油)混合于乳剂中超过28天时是有活性的(图2)。
下面另外的实施例尤其证明，通过在润肤霜中提供营养物、在皮肤表面上谷氨酸的连续生产以及生物活性LEKTI的异源生产而在人皮肤的稳定暂时定殖来治疗皮肤病，诸如内瑟顿综合征、特应性皮炎、银屑病和红斑痤疮。
实施例2.将包含产谷氨酸的土壤细菌谷氨酸棒杆菌的益生菌润肤霜施用于皮肤的安全性和效力
谷氨酸棒杆菌是常见土壤细菌并且不能在皮肤表面上生存。因为谷氨酸棒杆菌消耗糖和脂肪酸，所以它不能利用皮肤表面上的脂质和蛋白来生产生物产物。我们已经显示，通过将用于生长的组分添加到常见润肤霜成分中，我们能够调整皮肤环境，在所述皮肤环境中谷氨酸棒杆菌不仅能够在皮肤稳定定殖而且生产生物产物。
我们使用了常见润肤霜成分(石蜡油、水、司盘60、二甲硅油和硬脂酸)与谷氨酸棒杆菌生长所需的组分(葡萄糖、甘油、酵母提取物和生物素)，使得谷氨酸棒杆菌能够在皮肤表面上产生营养物。润肤霜与以1010CFU/mL的浓度重悬的谷氨酸棒杆菌组合成1∶1的混合物。进行人体实验以测定土壤细菌的皮肤定殖和谷氨酸(谷氨酸棒杆菌分泌和生产的氨基酸)的产生。我们单独使用润肤霜对照以测定局部微生物组条件。在0、2、4、8和24小时之后，我们使用了皮肤拭子并且测定在皮肤上16cm2部分中的菌落形成单位。我们测得在24小时后回落至对照条件之前，谷氨酸棒杆菌稳定定殖在皮肤表面8小时。我们还发现在24小时后回落至对照条件之前，谷氨酸棒杆菌不断增加且连续生产超过8小时。突显谷氨酸棒杆菌连续生产的能力，将0.1％谷氨酸的局部谷氨酸制剂添加到皮肤并且在15分钟之后检测不到，很可能是因为皮肤表面上的吸收和降解，证明了细菌生产的化合物在表面上连续地利用。我们的来自人体实验的安全数据还证明，在人皮肤上施用该生物体是无刺激的且不致敏的，证实了安全性和效力，参见例如图3。
该实施例使用谷氨酸，即常见润肤霜成分，作为生产其他治疗和美容蛋白的概念证明。值得注意地，润肤霜中的营养物使细菌能够定殖在皮肤，并且调整营养源的浓度调整生物生产和定殖时间。我们可以将葡萄糖和甘油的浓度从用于最长水平定殖的润肤霜的20％改变至完全缺乏，这样细菌会非常快速地相继死亡。
实施例3.谷氨酸棒杆菌生产和分泌生物活性治疗蛋白
内瑟顿综合征是由编码淋巴上皮Kazal型相关蛋白酶抑制剂(LEKTI)丝氨酸蛋白酶抑制剂的SPINK5基因的突变引起的疾病。这些突变造成皮肤表面上的激肽释放酶，特别是KLK5的抑制不足。激肽释放酶是分解表皮结构蛋白的蛋白酶，抑制不足引起导致皮肤屏障功能丧失的失控的蛋白酶活性。其他疾病，诸如特应性皮炎、银屑病和红斑痤疮也已经表明具有LEKTI引起的激肽释放肽的抑制不足。
我们对谷氨酸棒杆菌工程化以连续生产LEKTI蛋白，并且将它们局部施用于NS患者的病变皮肤表面，从而抑制KLK5并修复皮肤表面。活性药物是已知抑制KLK5的修饰型LEKTI蛋白。已经采用N-末端分泌氨基酸信号对其修饰使得谷氨酸棒杆菌将蛋白分泌出细胞。
我们将LEKTI-D6和LEKTI-D5蛋白基因插入到谷氨酸棒杆菌的基因组。编码序列由pH36启动子驱动并且包括N-末端分泌标签(porB)。分泌标签改善蛋白向谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的细胞外环境中的分泌并且分泌标签切割氨基酸序列，导致成熟蛋白被分泌到细胞外环境。然后，对菌株进行发酵并且纯化蛋白。纯化的蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示在编码蛋白的分子量处的清晰条带(图4)。
LEKTI-D6：
LEKTI-D5：
*加粗字体是分泌标签，**加下划线字体是活性部分
我们使用KLK5生物试验，通过谷氨酸棒杆菌的LEKTI微生物分泌，显示了正确折叠且有生物活性的蛋白。KLK5抑制试验是测定KLK5抑制的首要方法。在试验中，采用底物乙酰基-YASR-对硝基苯胺孵育KLK5。不受抑制的KLK5在精氨酸位置(P4)切割底物乙酰基-YASR，释放对硝基苯胺，即一种具有405nm吸光度的发色团，导致在该波长处的吸收增加。当被抑制时，底物乙酰基-YASR-对硝基苯胺保持完整，并且在405nm处的吸收没有增加。作为阳性对照，我们采用无任何抑制剂并且添加纯化的红色荧光蛋白(RFP)。作为阴性对照，我们采用只添加底物(不添加KLK5)以及添加100uM纯化的亮抑酶肽，已知亮抑酶肽在高浓度下抑制KLK5。我们的结果显示RFP和无抑制剂导致超过30分钟的稳步增加的吸收。另一方面，仅底物或添加亮抑酶肽在该时段导致非常小的吸收增加。LEKTI-D6的浓度增加显示KLK5的剂量依赖性猝灭，IC50是89nM。
实施例4.DNA盒和采用代表性治疗蛋白：抗菌肽的验证
抗菌肽的连续产生能够治疗皮肤感染并改善细菌菌群失调。目前的局部方法经常引起有害细菌的顽固性重现。通过局部施用谷氨酸棒杆菌，我们使用竞争抑制和抗菌剂的连续产生来永久消除有害细菌，诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。片球菌素是窄范围抗生素，并且我们显示了连续的现场生产能够用来治疗和预防金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染和定殖。在一种实施方案中，使用天然序列和转运体，我们将片球菌素表达为三基因成员家族，其中pedC是转运体，pedA是前体并且pedD切割pedA以在上清中提供活性片球菌素。
片球菌素(通过3个蛋白表达的)
>pedA
>pedC
>pedD
在另一种实施方案中，我们使用谷氨酸棒杆菌分泌标签来直接分泌活性化合物。
片球菌素(通过单一蛋白表达的)
我们使用相同的方案来递送供选择的抗菌肽，包括乳酸链球菌素，其是由细菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)产生的多环抗菌肽。
实施例5.采用代表性治疗蛋白：抗体验证
我们构建了用于现场生产抗炎抗体、抗体片段和纳米抗体的盒以治疗免疫障碍，诸如内瑟顿综合征、特应性皮炎、银屑病和红斑痤疮；方案可容易地扩展至靶向IgG、CD20和其他免疫靶标的其他抗体。
单链可变片段抗肿瘤坏死因子α
实施例6.采用代表性治疗蛋白：抗炎剂验证
我们构建了用于现场生产包括IL-10的白细胞介素的盒以治疗皮肤上的免疫超敏反应。
IL-10
除了LEKTI之外，其他的蛋白酶抑制剂，包括分泌性白细胞蛋白酶抑制剂和弹性蛋白酶抑制剂，通过谷氨酸棒杆菌的连续生产能够用来抑制皮肤病。
分泌性白细胞蛋白酶抑制剂
弹性蛋白酶抑制剂
实施例7.采用代表性美容蛋白验证
我们还采用代表性短肽序列验证了发明，所述代表性短肽序列通过上调胶原的产生或者放松面部肌肉以减少皱纹而有益于美容。通过细菌的连续生产极大地增加了它们的停留时间，正常情况下它们被皮肤吸收和分解。实例包括(编码的美容肽序列加了下划线)：
1.GHK-Cu(与微量铜络合)
2.GEKG
3.PKEK
4.GPRPA
5.YAGFL

Claims (17)

1.一种局部皮肤益生菌制剂，其包含经基因工程改造以生产皮肤生物活性剂的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)细菌的活菌群和用于所述细菌的营养源。
2.权利要求1所述的制剂，所述制剂被置于人的皮肤上。
3.权利要求1或2所述的制剂，其中所述细菌正在生产所述活性剂。
4.权利要求1、2或3所述的制剂，其还包含皮肤润肤霜。
5.权利要求1、2、3或4所述的制剂，其还包含保湿剂，诸如甘油、透明质酸和丙二醇，或者润滑剂，诸如乳木果油、可可脂和辛基十二醇，或者闭塞剂，诸如凡士林、十六醇(十六烷-1-醇)和羊毛脂。
6.权利要求1、2、3、4或5所述的制剂，其中所述营养源包含一种或多种糖。
7.权利要求1、2、3、4、5或6所述的制剂，其中所述生物活性剂选自化妆品、抗衰老剂、抗氧化剂、防晒霜、抗炎剂、抗菌剂、镇痛剂和治疗性化合物。
8.权利要求1、2、3、4、5或6所述的制剂，其中所述生物活性剂选自信号肽、载体肽、神经递质抑制剂肽和酶抑制剂肽。
9.权利要求1、2、3、4、5或6所述的制剂，其中所述生物活性剂选自赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、组氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、GHK-Cu、GSH-Cu、锰三肽、六胜肽(Peptamide-6)、肌肽、N-乙酰肌肽、三肽-10-瓜氨酸、棕榈酰三肽、棕榈酰四肽、棕榈酰五肽、乙酰基四肽、六肽-11、四肽PKEK、六肽-14、丝蛋白、水通道蛋白、α干扰素、Hsp70、转化生长因子、大米肽和大豆肽。
10.权利要求1、2、3、4、5或6所述的制剂，其中所述生物活性剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂，诸如用于治疗内瑟顿综合征(Netherton Syndrome)、特应性皮炎、银屑病和红斑痤疮的LEKTI-D6、LEKTI-D5、弹性蛋白酶抑制剂(elafin)和分泌性白细胞蛋白酶抑制剂。
11.权利要求1、2、3、4、5或6所述的制剂，其中所述生物活性剂是抗炎化合物，诸如治疗疾病，诸如内瑟顿综合征、特应性皮炎、银屑病、红斑痤疮和慢性伤口感染的IL-10。
12.权利要求1、2、3、4、5或6所述的制剂，其中所述生物活性剂是抗菌肽，诸如治疗疾病，诸如内瑟顿综合征、特应性皮炎、银屑病、红斑痤疮和慢性伤口感染的片球菌素和乳酸链球菌素。
13.权利要求1、2、3、4、5或6所述的制剂，其中所述生物活性剂是抗体、抗体片段或纳米抗体，诸如治疗疾病，诸如内瑟顿综合征、特应性皮炎、银屑病、红斑痤疮和慢性伤口感染的单链可变片段抗肿瘤坏死因子α。
14.一种使用权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11所述的制剂的方法，其包括在所述细菌在预定时间范围内在皮肤上产生有效量的活性剂的条件下将所述制剂施用于有其需要的人的皮肤。
15.权利要求12所述的方法，其中所述时间范围是4、8、12、24和48小时。
16.权利要求12或13所述的方法，其还包括调整所述营养源的浓度以调整生物生产和定殖时间。
17.权利要求12或13所述的方法，其还包括调整所述营养源的浓度以调整生物生产和定殖时间，其中葡萄糖和甘油的浓度从所述润肤霜的2％变化至20％，用于使定殖时间越来越长。
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