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CN116948901B - 食窦魏斯氏菌d-2胞外多糖在抑制结肠癌细胞中的应用 - Google Patents

食窦魏斯氏菌d-2胞外多糖在抑制结肠癌细胞中的应用 Download PDF

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CN116948901B
CN116948901B CN202310908858.7A CN202310908858A CN116948901B CN 116948901 B CN116948901 B CN 116948901B CN 202310908858 A CN202310908858 A CN 202310908858A CN 116948901 B CN116948901 B CN 116948901B
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了食窦魏斯氏菌D‑2胞外多糖在抑制结肠癌细胞中的应用。本发明首先提供了一种分离自婴儿粪便的的食窦魏斯氏菌D‑2（保藏号：CCTCC NO:M 20221190），然后采用改良后的mMRS培养基对食窦魏斯氏菌D‑2进行扩大培养，并从其培养物中分离纯化得到食窦魏斯氏菌D‑2胞外多糖D‑2‑EPS。本发明首次提出食窦魏斯氏菌D‑2胞外多糖在抑制结肠癌细胞中的应用，并发挥抗结肠癌作用，而且本发明食窦魏斯氏菌D‑2来自健康人的肠道，其代谢产物胞外多糖为天然产物，成分绿色、安全。

Description

食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖在抑制结肠癌细胞中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及结肠癌治疗技术领域，具体涉及食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖在抑制结肠癌细胞中的应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是世界上第三常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因。大部分CRC患者发现病情时已是中晚期，严重威胁着中国及全球人类的生命健康。同时化疗、靶向治疗也伴随着因人而异的毒副作用，有时甚至危及生命。因此，寻找更新更有效的CRC治疗方法具有重要意义。大量研究表明肠道微生物与结直肠癌的发生发展密切相关。已有研究报导一些乳酸杆菌，肠球菌和链球菌及其代谢产物在癌症预防和治疗中的起到了重要作用。
食窦魏斯氏菌（Weissellacibaria）是乳酸菌的一种，同时也作为一种肠道菌群，参与肠道微生态的组成。肠道微生物测序结果表明，食窦魏斯氏菌在结直肠癌患者体内减少。此外，也有研究表明食窦魏斯氏菌具有调节免疫的作用。但食窦魏斯氏菌是否可直接抑制结直肠癌及相关机制尚不清楚。此外，由于活体益生菌的存放环境要求较高，某些特定菌种存在机会性感染的可能，导致活体细菌在临床应用具有一定的限制和风险。正是由于当前临床用药中存在的上述问题，因此，探究益生菌的发挥抗癌作用的有效产物及其抗结肠癌的机制，并基于此开发新的干预方式和药物迫在眉睫。
乳酸菌产生的胞外多糖具有调节免疫，抗炎抗肿瘤等作用。食窦魏斯氏菌胞外多糖产量高，但目前研究主要集中在食品发酵方面，其抗肿瘤的效果及相关机制报道目前尚未见到。因此，寻找具有抗结直肠癌作用的食窦魏斯氏菌，及发掘其有效代谢产物，并基于此开发新的活体生物药物具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的在于提供食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖在抑制结肠癌细胞中的应用。
基于上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明第一方面提供了一种食窦魏斯氏菌（Weissellacibaria）。
优选地，所述食窦魏斯氏菌由婴儿粪便中分离鉴定而来；所述食窦魏斯氏菌含有序列1（SEQ IDNO：1）的核酸序列。
更加优选地，所述食窦魏斯氏菌为保藏号CCTCC NO: M 20221190的食窦魏斯氏菌D-2。
优选地，所述食窦魏斯氏菌的培养物包含所述食窦魏斯氏菌。
本发明第二方面提供了一种食窦魏斯氏菌胞外多糖，所述食窦魏斯氏菌胞外多糖由上述第一方面任一所述的食窦魏斯氏菌合成。
优选地，所述食窦魏斯氏菌胞外多糖由所述食窦魏斯氏菌经改良MRS（mMRS）培养基或MRS培养基发酵后分离纯化而来。
更加优选地，所述mMRS培养基配方包括：按比例每升培养基中含10g蛋白胨（Peptone）、10g牛肉膏（Beef extract）、5g酵母提取物（Yeastextract）、1mL吐温80（Tween80）、2g磷酸氢二钾、5g柠檬酸二铵、5g无水乙酸钠、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、100g蔗糖，余量为水。
更加优选地，所述发酵过程具体为：将含有所述食窦魏斯氏菌的菌液以2%（v/v）接种量接种于所述mMRS培养基中，在30℃的条件下静置培养48h，得到所述食窦魏斯氏菌的发酵液。
更加优选地，所述分离纯化过程具体为：将所述食窦魏斯氏菌的发酵液进行灭菌、灭酶处理，得到灭活后的发酵液；将灭活后的发酵液离心处理后取上清液加入三氯乙酸，4℃下静置处理后离心除蛋白，再次收集上清液；将除蛋白后的上清液浓缩后醇沉得到沉淀物；将沉淀物复溶后，用截留分子量为8000-14000Da的透析袋进行透析处理，收集分子量大于14000Da的产物，得到透析后的溶液；将透析后的溶液进行冻干处理，得到所述食窦魏斯氏菌粗胞外多糖。
本发明第三方面提供了上述第一方面所述的食窦魏斯氏菌或上述第一方面所述食窦魏斯氏菌的培养物或上述第二方面所述的食窦魏斯氏菌胞外多糖在制备预防、缓解或/和治疗结肠癌产品中的应用。
优选地，上述第一方面所述的食窦魏斯氏菌或上述第一方面所述食窦魏斯氏菌的培养物或上述第二方面所述的食窦魏斯氏菌胞外多糖在制备抑制结肠癌细胞生长产品中的应用。
优选地，所述预防、缓解或/和治疗包括调节细胞凋亡相关信号通路；所述细胞凋亡相关信号通路包括Fas/FasL信号通路。更加优选地，所述调节包括上调Fas/FasL信号通路。
优选地，所述产品为药物。
本发明第四方面提供了一种用于预防、缓解或/和治疗结肠癌的药物，包括有效成分和药学可接受的辅料，所述有效成分为上述第一方面所述的食窦魏斯氏菌或上述第一方面所述食窦魏斯氏菌的培养物或上述第二方面所述的食窦魏斯氏菌胞外多糖。
优选地，所述药物组合物的给药方式为口服给药或胃肠外给药。
优选地，所述胃肠外给药的方法为静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、局部给药、瘤内给药或直肠内给药。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
（1）本发明首先提供了一种分离自婴儿粪便、保藏号为CCTCC NO: M 20221190的食窦魏斯氏菌D-2，然后采用改良后的mMRS培养基对食窦魏斯氏菌D-2进行扩大培养，并从其培养物中分离纯化得到食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖D-2-EPS。本发明首次提出食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖在抑制结肠癌细胞中的应用，如该食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖可在体内或体外通过诱导细胞凋亡的方式有效抑制人结肠癌细胞生长并发挥抗结肠癌作用，尤其是通过诱导细胞凋亡Fas/FasL信号通路。
（2）本发明食窦魏斯氏菌D-2筛选自健康人的肠道，其代谢产物胞外多糖也是乳酸菌代谢过程中产生的天然成分，从临床应用的角度来看，与其他抗肿瘤药物相比，食窦魏斯氏菌D-2的胞外多糖更为安全。
附图说明
图1为本发明食窦魏斯氏菌D-2在MRS和mMRS培养基平板上培养相同时间后结果对比；其中，A为MRS平板，B为mMRS平板；
图2本发明食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖的鉴定结果图；其中，A和B为胞外多糖的SEM图，C为胞外多糖溶液不同浓度下的紫外光谱检测结果，D为胞外多糖的红外光谱检测结果，E为胞外多糖的液相色谱检测结果；
图3为本发明食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖体外抑制人结肠癌细胞增殖结果；其中，A-C分别为不同浓度的食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖分别处理48h和72h后对人结肠癌细胞HT29、SW480和人正常肠上皮细胞NCM460的细胞存活率结果统计图，D和E分别为不处理（NC组）和食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖处理（D-2-EPS组）人结肠癌细胞SW480、HT29后的细胞克隆形成结果实验图及其相应的数据统计图；
图4为本发明食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖体外诱导人结肠癌细胞周期阻滞结果；其中，A为不处理（NC组）和食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖处理（D-2-EPS组）人结肠癌细胞SW480细胞周期中各阶段细胞占比图及其结果统计柱图，B为不处理（NC组）和食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖处理（D-2-EPS组）人结肠癌细胞HT29后细胞周期中各阶段细胞占比图及其结果统计柱图；
图5为本发明划痕实验结果；其中，A为不处理（NC组）和食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖处理（D-2-EPS组）人结肠癌细胞SW480后细胞迁移图及其迁移面积结果统计图，B为不处理（NC组）和食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖处理（D-2-EPS组）人结肠癌细胞HT29后细胞迁移面积图及其迁移面积结果统计图；
图6为本发明细胞迁移和侵袭实验结果；A和B分别为不处理（NC组）和食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖处理（D-2-EPS组）人结肠癌细胞SW480、HT29后细胞迁移图及其细胞迁移数结果统计图，C和D分别为不处理（NC组）和食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖处理（D-2-EPS组）人结肠癌细胞SW480、HT29后细胞侵袭图及其细胞侵袭数结果统计图；
图7为本发明不处理（NC组）和食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖处理（D-2-EPS组）人结肠癌细胞SW480、HT29后细胞凋亡的流式结果图；其中，A和B分别为人结肠癌细胞SW480的流式结果图及其数据统计图，C和D分别为人结肠癌细胞HT29的流式结果图及其数据统计图；
图8为本发明采用Western blot检测人结肠癌细胞HT29中信号通路蛋白表达水平变化；图中，NC为对照组；D-2-EPS为食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖处理的实验组；
图9为本发明不处理和不同浓度的食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖处理HT-29荷瘤裸鼠后小鼠体内肿瘤、小鼠体重、主要组织器官和凋亡相关蛋白表达结果变化；其中，A和B分别为肿瘤大小实物图和肿瘤体积数据统计图，C为小鼠体重变化图，D为小鼠心肝脾肺肾组织病理图，E-G为采用Western blot检测人结肠癌细胞HT29中信号通路蛋白表达水平变化。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例结合附图，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
实施例1：食窦魏斯氏菌D-2的获得
1.食窦魏斯氏菌D-2的筛选和鉴定
1.1食窦魏斯氏菌D-2的筛选
将健康婴幼儿粪便加入无菌PBS并震荡重悬，取上清液，并梯度稀释至10-5，得到稀释液；将该稀释液加入到乳酸菌生长培养基MRS液体培养基中，于37℃静置培养48h，得到菌液；吸取菌液并梯度稀释至10-5，然后吸取稀释液涂布到MRS固体培养基中，于37℃静置培养至生长出明显单菌落。
1.2食窦魏斯氏菌D-2的鉴定
将单菌落挑取至MRS液体培养基中，37℃静置培养24h后，取0.5mL的菌液，4℃、5000g离心5min，去上清后，加入无菌PBS重悬细菌沉淀。通过使用引物（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）对细菌进行菌液16SDNA序列扩增，并将扩增序列送擎科生物科技有限公司进行测序。将16S DNA的测序结果（SEQ IDNO：1）输入NCBI的BLAST数据库进行鉴定，最终根据同源序列分析证实分离菌株为Weissellacibaria，命名为Weissella cibaria D-2，并将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年7月27日，菌种保藏号为CCTCC NO: M 20221190。
实施例2：食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖的获取和鉴定
2.1食窦魏斯氏菌D-2发酵培养基的优化
将W. cibariaD-2于MRS平板上划线，置于37℃恒温培养箱中静置培养24-48h进行活化，得到活化的单菌落；挑取活化的单菌落分别于MRS和mMRS平板上划线，其中，mMRS培养基配方为蛋白胨（Peptone）10g/L，牛肉膏（Beef extract）10g/L，酵母提取物（Yeastextract）5g/L，吐温80（Tween 80）1ml/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸二铵5g/L，无水乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，蔗糖100g/L。结果如图1所示。
由图1可以看出，与生长于MRS培养基上的食窦魏斯氏菌D-2相比，生长于mMRS培养基上的食窦魏斯氏菌D-2更黏稠，推测食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖产量增多，因此，优选mMRS对食窦魏斯氏菌D-2进行发酵处理。
2.2食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖的获取
将W. cibariaD-2于MRS平板上划线，置于37℃恒温培养箱中静置培养24-48h，进行活化，得到活化的单菌落；挑取活化的单菌落至10mL MRS液体培养基中，并于37℃静置培养24-48h，至培养基浑浊，得到菌液；将菌液以2%（v/v）接种量，接种到改良MRS（mMRS）液体培养基的锥形瓶中，在30℃静置培养48h，直至培养基黏稠，得到菌种发酵液。将菌种发酵液的锥形瓶于100℃水浴15min来灭活菌和酶，冷却恢复至室温，菌液非常黏稠时，可取灭菌后的去离子水将菌种发酵液稀释2-3倍；转移菌种发酵液至离心管，4℃、12000g离心30min，弃沉淀，取上清；向离心后的上清中加入80%（m/v）的三氯乙酸至最终浓度4%（m/v），4℃静置12h后，4℃、12000g离心30min以去除蛋白，此步骤重复2-3次直至蛋白清除干净；收集上清液，旋蒸浓缩至原来一半体积后，加入三倍体积95%（v/v）的冷乙醇，在4℃下静置12h，然后在4℃、12000g离心30min得到沉淀；向沉淀中加入50-100mL灭菌后的去离子水复溶（加入水的体积视沉淀溶解情况而定），转移至透析袋（截留分子量为8000-14000Da）中，在4℃下透析48h，每隔8h更换透析液；将透析后的溶液转移至50mL离心管，-80℃过夜冷冻后，放入冻干机中进行冷冻干燥得粗胞外多糖D-2-EPS。
2.3食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖的鉴定
2.3.1表面微观形貌及元素分析
实验方法：将冻干后的D-2-EPS样品用乙醇溶解，经超声波清洗、取样、红外干燥、喷金(10nm)、上胶等步骤，固定在扫描电镜下观察。在3.0kV的加速电压下，在1000、2000、5000、10000倍放大倍数下观察了D-2-EPS样品的表面微观形貌。结果如图2中A和B所示。
结果分析：由图2中A和B可以看出，食窦魏斯氏菌D-2的胞外多糖成粗糙的片状结构且有分支，同时一小部分多糖成球状且分散于片状结构周围。
2.3.2紫外光谱扫描
实验方法：将冻干后的D-2-EPS溶于纯水分别配制浓度为100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的胞外多糖溶液，在190-400nm波长范围内扫描。用紫外可见分光光度计对D-2-EPS的纯度进行鉴定。结果如图2中C所示。
结果分析：由图2中C可以看出，不同浓度的食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖的紫外吸收光谱曲线光滑平整，在280nm左右处未见蛋白质特征性吸收峰，说明提取的粗D-2-EPS样品中基本不含有蛋白质。
2.3.3红外光谱扫描
实验方法：用傅里叶变换红外光谱仪测定D-2-EPS的红外光谱，具体采用溴化钾压片法，将充分冻干后的D-2-EPS(1mg)与干燥KBr粉末按1∶100左右的比例混合，压成颗粒，在400-4000cm-1的频率范围内进行红外光谱扫描。结果如图2中D所示。
结果分析：由图2中D可以看出，食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖红外吸收光谱表现出糖类独特的吸收峰特征：3414.61cm-1处吸收带/峰归属于多糖类分子的-OH伸缩振动峰；2922.97cm-1处尖锐的峰是糖类分子中甲基或亚甲基的C-H伸缩振动；1354.42cm-1处是甲基或亚甲基的C-H单键的变角振动；1646.87cm-1处是C=O双键伸缩振动，证明样品中含有醛酸。1154.12cm-1处是吡喃糖环中C=O的弯曲振动峰；1022.29cm-1处是糖环中C-O-C的拉伸振动峰；917.34cm-1处是由糖分子中的β-吡喃糖环结构引起的。
2.3.4单糖和糖醛酸组成分析
实验方法：采用高效液相色谱法分析D-2-EPS样品的单糖和糖醛酸成分，色谱条件为：仪器：岛津LC-20AD；色谱柱：Xtimate C18 4.6*200mm 5µm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：250nm；进样量：20uL；流动相：0.05M磷酸二氢钾溶液（用氢氧化钠溶液调PH为6.70）-乙腈。结果如图2中E所示。
结果分析：由图2中E可以看出，高效液相色谱分析结果表明食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖成分主要为葡萄糖（98.426%）。因此，食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖为同聚多糖。
实施例3：食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖体外抑制人结肠癌细胞
3.1实验分组
选取人正常肠上皮细胞NCM460和人结肠癌细胞HT29、SW480，并对选取的细胞划分成对照组和添加食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖的实验组两组，培养环境温度均为37℃，培养环境气体成分均为5%的二氧化碳和95%的空气。其中，对照组不加食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖；实验组根据不同的功能试验，将食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖设置为0.2-1.0mg/mL范围内不同的浓度梯度。
3.2细胞增殖抑制检测
3.2.1 细胞增殖-毒性检测（CCK8）试验
实验方法：按照上述3.1实验分组步骤，将铺在96孔板内的人正常肠上皮细胞NCM460、人结肠癌细胞HT29、SW480培养48h或72h，其中，实验组中食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖的浓度梯度分别设置为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL；然后在96孔板的每一个孔内加入10μL CCK8溶液，随后将孔板放入到培养箱内进行孵育，在培养箱孵育2-4h后测定在450nm处吸光度。结果如图3中A-C所示，其中，细胞存活率=某浓度胞外多糖实验组细胞吸光值/对照组细胞吸光值*100%。
结果分析：由图3中A-C所示，与人正常肠上皮细胞NCM460相比，人结肠癌细胞HT29、SW480的细胞存活率被食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖显著抑制，且呈现一定的浓度依赖性和时间依赖性。
3.2.2 克隆形成实验
实验方法：按照上述3.1实验分组步骤（其中，实验组中食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖的浓度为0.7mg/mL），将铺在6孔板内培养72h的人结肠癌细胞HT29、SW480细胞消化后重新接种到12孔板中，使每个孔细胞量为500个，完全培养基培养10-14天，中间每隔4-5天换液；10-14天后弃培养基，PBS清洗2遍，每孔加入500μL 4%多聚甲醛固定30min，弃去多聚甲醛，PBS清洗2遍；每孔加入500μL0.1%结晶紫染色液，染色30min后将结晶紫染色液回收于离心管，PBS清洗2遍，待自然晾干。12孔板倒扣于白色背景板，拍照，结果如图3中D和E所示。
结果分析：由图3中D和E所示，食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖对细胞SW480和HT29作用72h后，均体现初抑制克隆形成的能力，以上结果说明食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖可以抑制结肠癌细胞的增殖。
3.3 细胞周期实验
实验方法：按照上述3.1实验分组步骤（其中，实验组中食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖的浓度为0.7mg/mL），将铺在6孔板内培养72h的人结肠癌细胞HT29、SW480消化后，收集1-5×106个细胞，1500rpm离心5min，去除上清，加入1mL预冷的PBS重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中用PBS清洗2-3遍；向离心管中加入300μL PBS重悬细胞，然后逐滴缓慢加入700 μL预冷的无水乙醇，将离心管上下颠倒混匀，放于4℃静置过夜。1500rpm离心5min，去除上清，PBS清洗2-3遍；向每管细胞中加入535μLPI染色液，轻轻吹打混匀，37℃避光孵育30min，然后用200目滤网过滤至流式管，冰上存放，24h内用流式细胞仪检测细胞周期，结果如图4所示。
结果分析：由图4可知，与对照组（NC组）相比，食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖诱导结肠癌细胞周期阻滞，作用72h后诱导SW480和HT29细胞G1期停留。
3.4划痕实验
实验方法：按照上述3.1实验分组步骤（其中，实验组中食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖的浓度为0.7mg/mL），将铺在6孔板内培养72h的人结肠癌细胞HT29、SW480细胞消化下来，重新接种在12孔板中，使每个孔细胞量为5×105个，加入完全培养基置于培养箱中培养12-24h，使细胞贴壁；待每个孔中细胞长满后，用小枪头比着直尺，沿垂直水平方向各划一条线呈十字状；然后去除培养基，PBS洗涤细胞1次清除飘落细胞；40倍显微镜下，十字交叉点的上下左右各取1个视野拍照，记为0h，拍照后加入无血清培养基，将12孔板放入培养箱继续培养，24、48、72h按上述方法拍照取样，至划痕愈合。结果如图5所示。
结果分析：由图5可知，与对照组相比，食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖处理的SW480和HT29在48h后迁移覆盖的面积比例均更小，说明添加食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖的实验组的结直肠癌细胞迁移能力更弱。
3.5 细胞迁移和侵袭实验
3.5.1 细胞迁移实验
实验方法：按照上述3.1实验分组步骤（其中，实验组中食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖的浓度为0.7mg/mL），将铺在6孔板内培养72h的人结肠癌细胞HT29、SW480细胞消化下来，用无血清培养基重悬，调整细胞浓度为1×106个/mL，向transwell板上室（孔径8μm）加入100-150μL细胞悬液（大约1×105个/孔），下室加入600μL含15%-20%FBS的完全培养基，培养箱中培养12-48h；取出transwell板，上室和下室中的培养基均弃去，向下室中加入800μL 4%多聚甲醛，室温固定30min。吸出上室和下室多聚甲醛固定液，向下室中加入800μL0.1%结晶紫染色液，室温染色20min；回收结晶紫，用镊子夹取上室，清水浸泡缓慢冲洗2-3次，将棉签戳平，用棉签平面轻轻擦掉上室未迁移的细胞，自然风干；100倍显微镜下随机选取五个视野拍照，计数迁移细胞数目。结果如图6中A和B所示。
结果分析：由图6中A和B可知，与对照组相比，食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖组的SW480和HT29穿到下室的细胞量明显均明显减少，胞外多糖组迁移能力被抑制，以上结果说明食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖可以抑制结肠癌细胞的迁移。
3.5.2 细胞侵袭实验
实验方法：基质胶置于4℃融化，在冰上用4℃预冷的无血清培养基与基质胶按8∶1比例稀释（稀释比例根据细胞活力决定），在transwell上室底部中央垂直悬空加入50μL稀释后的基质胶，放入培养箱37℃温育0.5-1h，至基质胶变为凝胶状；后续步骤同3.5.1中细胞迁移所述。结果如图6中C和D所示。
结果分析：由图6中C和D可知，与对照组相比，食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖处理的SW480和HT29穿到下室的细胞量明显均明显减少，胞外多糖组侵袭能力被抑制，以上结果说明食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖可以抑制结肠癌细胞的侵袭。
3.6细胞凋亡检测
实验方法：按照上述3.1实验分组步骤（其中，实验组中食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖的浓度为0.7mg/mL），将铺在6孔板内培养72h的人结肠癌细胞HT29、SW480细胞消化后收集；分别依次加入5μL Annexin V染料和5μL PI染料，加入5μL Annexin V染料后光孵育15min，加入5μL PI染料后避光孵育5min；孵育完成后记录染色情况并进行数据统计，同时将孵育后的细胞分别转移至流式管中，在1h内使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果如图7所示。
结果分析：由图7所示，与空白对照组相比，食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖均能增加人结肠癌细胞SW480和HT29凋亡细胞占比，说明食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖可以促进结肠癌细胞凋亡。
3.7 Western blot检测信号通路蛋白表达
实验方法：按照上述3.1实验分组步骤，在6孔板内培养72h的人结肠癌细胞HT29，用RIPA裂解细胞，提取蛋白，并经Western Blot(WB)分别检测细胞凋亡相关蛋白Fas、FasL、Caspase8/Cleaved-caspase-8和Caspase3/Cleaved-caspase3的表达。结果如图8所示。
结果分析：由图8可知，与空白对照组相比，食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖处理的HT29细胞中凋亡相关蛋白Fas、FasL、Cleaved-Caspase-8以及Cleaved-Caspase-3蛋白水平均增高，说明食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖通过Fas/FasL信号通路抑制结肠癌细胞生长。
实施例4：食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖抑制HT-29荷瘤裸鼠内人结肠癌肿瘤的生长
4.1构建HT-29荷瘤裸鼠模型
实验方法：在无菌操作环境下，将人结肠癌细胞HT-29传代后，稳定培养24h，在对数生长期内将细胞浓度调整至5×106个/mL，以100μL/只的细胞悬液浓度注射接种于裸鼠右腋皮下，操作在1h内完成，得到HT-29荷瘤裸鼠模型。
实验分组：根据小鼠种类、给药种类和剂量的不同，设空白对照组、食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖胞外多糖低剂量组、食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖中剂量组和食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖高剂量组。其中，待肿瘤体积生长至大约150mm3，开始给予胞外多糖进行干预。每3天给药1次，共计4次，每次瘤内注射量均为0.1mL/20g体质量。给药剂量和途径如下：
空白对照组：健康裸鼠，每次瘤内注射PBS(0.1mL/20g体质量/天)，自由进食和饮水；
食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖低剂量组：接种结肠癌细胞HT-29裸鼠，每次瘤内注射食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖(50mg/kg体质量/天)，自由进食和饮水；
食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖中剂量组：接种结肠癌细胞HT-29裸鼠，每次瘤内注射食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖(100mg/kg体质量/天)，自由进食和饮水；
食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖高剂量组：接种结肠癌细胞HT-29裸鼠，每次瘤内注射食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖(150mg/kg体质量/天)，自由进食和饮水。
4.2肿瘤体积测量
实验方法：按照上述4.1实验方法喂养小鼠14天，在喂养期间每天进行肿瘤体积测量，并在实验结束最后一天将小鼠肿瘤取出拍照；其中，肿瘤体积计算公式如下：肿瘤体积(mm3)＝(L×S2)/2；式中，L为肿瘤块长径；S为肿瘤块短径。结果如图9中A和B所示。
结果分析：由图9中A和B所示，与空白对照组相比，食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖低剂量、中剂量和高剂量组荷瘤裸鼠肿瘤体积均显著减少，说明食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖在体内具有较好的抑制肿瘤作用。
4.3体重及脏器情况检测
实验方法：按照上述4.1实验方法喂养小鼠14天，在喂养期间每天进行裸鼠体重称重，结果如图9中C所示。并于第15天，以颈椎脱臼法处死小鼠，取出移植瘤及心肝脾肺肾，并对心肝脾肺肾行HE染色，观察组织损伤情况，结果如图9中D所示。
结果分析：由图9中C和D可以看出，食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖低剂量、中剂量和高剂量组荷瘤裸鼠的体重以及脏器组织与空白对照组相比，均无明显差异，说明食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖对裸鼠的体重和重要组织均没有明显毒副作用。
4.4 Western blot检测信号通路蛋白表达
实验方法：按照上述4.3实验方法得到各组剥离出的移植瘤，然后用WB方法验证不同浓度的食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖对细胞凋亡相关蛋白Fas、FasL、Caspase8/Cleaved-caspase-8和Caspase3/Cleaved-caspase3表达的影响。结果如图9中E-G所示。
结果分析：由图9中E-G可以看出，与空白对照组相比，食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖低剂量、中剂量和高剂量处理的肿瘤细胞中凋亡相关蛋白Fas、FasL、Cleaved-Caspase-8以及Cleaved-Caspase-3表达水平均增高，说明体内移植瘤模型中，食窦魏斯氏菌D-2胞外多糖可以通过Fas/FasL信号通路抑制肿瘤的生长。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的不足，且具高度产业利用价值。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (7)

1.一株食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria），其含有序列1的核酸序列，所述食窦魏斯氏菌是保藏号为CCTCC NO: M 20221190的食窦魏斯氏菌D-2。
2.一种食窦魏斯氏菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，采用mMRS培养基培养权利要求1所述的食窦魏斯氏菌D-2，获得发酵液，将所述食窦魏斯氏菌的发酵液进行灭菌、灭酶处理，得到灭活后的发酵液；将灭活后的发酵液离心处理后取上清液加入三氯乙酸，4℃下静置处理后离心除蛋白，再次收集上清液；将除蛋白后的上清液浓缩后醇沉得到沉淀物；将沉淀物复溶后用截留分子量为8000-14000Da的透析袋收集产物，得到食窦魏斯氏菌胞外多糖。
3.根据权利要求2所述的食窦魏斯氏菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述mMRS培养基的配方包括：按比例每升培养基中含10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母提取物、1mL吐温80、2g磷酸氢二钾、5g柠檬酸二铵、5g无水乙酸钠、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、100g蔗糖，余量为水。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法制备的食窦魏斯氏菌胞外多糖在制备缓解或/和治疗结肠癌的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品为药物。
6.一种用于缓解或/和治疗结肠癌的药物，包括有效成分和药学可接受的辅料，其特征在于，所述有效成分为根据权利要求2或3的制备方法制备的食窦魏斯氏菌胞外多糖。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物的给药方式为口服给药或胃肠外给药。
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