CN116926233A - 小麦TaHAL3-7B基因的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了小麦TaHAL3‑7B基因的分子标记及其应用，属于作物选种培育技术领域。本发明基于小麦自然群体中TaHAL3‑7B基因的遗传变异分析，开发了两个可用于鉴定小麦穗长和粒长的分子标记，此两个分子标记均位于TaHAL3‑7B基因的基因区，一个是InDel标记，另一个是SNP标记，二者均包含TaHAL3‑7B‑Hapl I、TaHAL3‑ 7B‑Hapl II、TaHAL3‑7B‑Hapl III和TaHAL3‑7B‑ Hapl IV 4种单倍型，本发明为小麦产量相关性状的遗传改良提供了有效的基因资源和分子标记，可加速育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及小麦基因的分子标记及其应用，具体涉及小麦TaHAL3-7B基因的分子标记及其在辅助育种中的应用，属于作物选种培育技术领域。
背景技术
小麦（Triticum aestivum L.）是世界三大主要粮食作物之一，随着世界人均耕地面积的不断减少，提高小麦产量和产量相关性状已成为目前育种的关键目标。抗盐蛋白HAL3是一种广泛存在于植物、动物和真菌中的高度保守的黄素蛋白，具有调节磷酸酶活性、调控植物生长发育等多种功能，可显著提高拟南芥、烟草、水稻、苹果等植物的耐盐性，其编码基因为HAL3基因。小麦中编码抗盐蛋白HAL3的基因（TaHAL3-7B基因）的相关分子标记及其应用目前尚未报道。随着生物技术不断发展，SNP标记和单倍型得以广泛应用，极大提高了目标性状的选择效率。因此，TaHAL3-7B基因的分子标记开发将为小麦遗传改良及分子标记辅助选择提供有效的基因资源。
发明内容
本发明的目的在于：提供小麦TaHAL3-7B基因的分子标记及其在鉴定小麦单倍型中的应用，旨在为作物遗传改良及分子标记辅助选择提供有效的基因资源。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
小麦TaHAL3-7B基因的分子标记，所述分子标记位于TaHAL3-7B基因的基因区，一个是InDel标记，一个是SNP标记，二者均包含TaHAL3-7B-Hapl I、TaHAL3-7B-Hapl II、 TaHAL3-7B-Hapl III和TaHAL3-7B-Hapl IV 4种单倍型，其中：
所述InDel标记由SEQ ID NO:8所示的上游引物HAB-ID12-F和SEQ ID NO:9所示的下游引物HAB-ID12-R扩增得到，该InDel标记的TaHAL3-7B-Hapl I和TaHAL3-7B-Hapl III2种单倍型的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，序列长度275bp，TaHAL3-7B-Hapl II和TaHAL3-7B-Hapl IV 2种单倍型的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，序列长度263bp；
所述SNP标记由SEQ ID NO:10所示的上游引物HB4-KPNI-F和SEQ ID NO:11所示的下游引物HB4-KPNI-R扩增得到，该SNP标记的TaHAL3-7B-Hapl I和TaHAL3-7B-Hapl IV 2种单倍型的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，序列长度339bp，TaHAL3-7B-Hapl II和TaHAL3- 7B-Hapl III 2种单倍型的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，序列长度320bp。
前述的小麦TaHAL3-7B基因的分子标记在选育小麦TaHAL3-7B-Hapl II和TaHAL3- 7B-Hapl IV 2种单倍型中的应用，所述TaHAL3-7B-Hapl II和TaHAL3-7B-Hapl IV 2种单倍型相比于TaHAL3-7B-Hapl I和TaHAL3-7B-Hapl III 2种单倍型具有缩短小麦穗长和增加小麦粒长的等位基因。
利用前述的小麦TaHAL3-7B基因的分子标记选育TaHAL3-7B-Hapl II和TaHAL3- 7B-Hapl IV 2种单倍型小麦的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：提取待测小麦品种或品系的基因组DNA；
步骤2：以待测小麦品种或品系的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:8所示的上游引物HAB-ID12-F和SEQ ID NO:9所示的下游引物HAB-ID12-R进行PCR扩增，得到PCR产物C1；用SEQ ID NO:10所示的上游引物HB4-KPNI-F和SEQ ID NO:11所示的下游引物HB4-KPNI-R进行PCR扩增，得到PCR产物A1；
步骤3：用限制性内切酶Kpn I对PCR产物A1进行酶切，得到酶切产物B1；
步骤4：用6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物C1进行稳压电泳分离，用3%琼脂糖凝胶对酶切产物B1进行稳压电泳分离，根据电泳结果确定待测小麦的单倍型，具体的：
（1）如果PCR产物C1出现了分子量大小为275bp的扩增片段、酶切产物B1出现了分子量大小为339bp的扩增片段，则该小麦品种或品系为TaHAL3-7B-Hapl I类型，其不含有缩短小麦穗长和增加小麦粒长的等位基因；
（2）如果PCR产物C1出现了分子量大小为263bp的扩增片段、酶切产物B1出现了分子量大小为320bp的扩增片段，则该小麦品种或品系为TaHAL3-7B-Hapl II类型，其含有缩短小麦穗长和增加小麦粒长的等位基因；
（3）如果PCR产物C1出现了分子量大小为275bp的扩增片段、酶切产物B1出现了分子量大小为320bp的扩增片段，则该小麦品种或品系为TaHAL3-7B-Hapl III类型，其不含有缩短小麦穗长和增加小麦粒长的等位基因；
（4）如果PCR产物C1出现了分子量大小为263bp的扩增片段、酶切产物B1出现了分子量大小为339bp的扩增片段，则该小麦品种或品系为TaHAL3-7B-Hapl IV类型，其含有缩短小麦穗长和增加小麦粒长的等位基因。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明基于小麦自然群体中TaHAL3-7B基因的遗传变异分析，开发了两个可用于鉴定小麦穗长和粒长的分子标记，此两个分子标记均位于TaHAL3-7B基因的基因区，一个是InDel标记，另一个是SNP标记（SNP 17），二者均包含TaHAL3-7B-Hapl I、TaHAL3-7B-Hapl II、TaHAL3-7B-Hapl III和TaHAL3-7B-Hapl IV 4种单倍型，其中，所述InDel标记由引物HAB-ID12-F/R扩增得到，所述SNP标记（SNP 17）由引物HB4-KPNI-F/R扩增得到，本发明开发的这两个分子标记为小麦产量相关性状（穗长、粒长）的遗传改良提供了有效的基因资源和分子标记，可加速育种进程；
（2）本发明开发的上述两个分子标记为小麦分子标记辅助选择育种提供了新方法，对培育高产小麦品种具有重要意义；
（3）通过应用本发明开发的TaHAL3-7B基因的上述两个分子标记，可判断待测小麦品种中是否含有TaHAL3-7B基因的优异等位基因（TaHAL3-7B-Hapl II和TaHAL3-7B-Hapl III），从而预测小麦的穗长和粒长，不仅节约了成本，还大大提高了选择效率，为高效筛选TaHAL3-7B基因的优异等位基因、构建高产新品种提供了辅助育种方法。
附图说明
图1是小麦TaHAL3-7B基因的SNP变异位点及单倍型分析图；
图2是小麦TaHAL3-7B基因的InDel标记检测结果图；
图3是小麦TaHAL3-7B基因的SNP 17位点标记检测结果图；
图4是小麦TaHAL3-7B基因单倍型与穗长关联分析结果图，a和b表示邓肯多重比较的显著性差异（P<0.05）；
图5是小麦TaHAL3-7B基因单倍型与粒长关联分析结果图，a、b和c表示邓肯多重比较的显著性差异（P<0.05）。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、小麦TaHAL3-7B基因多态位点及单倍型的获得
1、小麦TaHAL3-7B基因多态位点的获得
（1）设计特异引物
根据小麦TaHAL3-7B基因的基因组序列（2K 启动子区和基因区的序列见SEQ IDNO:1）设计特异引物，所述特异引物为SeqHAL3-7B-1F和SeqHAL3-7B-1R、SeqHAL3-7B-2F和SeqHAL3-7B-2R以及SeqHAL3-7B-3F和SeqHAL3-7B-3R。上述特异引物的核苷酸序列具体如下：
SeqHAL3-7B-1F：GGCGCCACATTATTTCTTC（SEQ ID NO:2）
SeqHAL3-7B-1R：AGACTCGGACTGGACTGGT（SEQ ID NO:3）
SeqHAL3-7B-2F：ACATATGATCGACCCAGACCTGA（SEQ ID NO:4）
SeqHAL3-7B-2R：ACTGGGTTACTTTTCACACACGG（SEQ ID NO:5）
SeqHAL3-7B-3F：GGAGCCCAAATGTCAATGTC（SEQ ID NO:6）
SeqHAL3-7B-3R：CCATCACAGTAAAAATCAGAACG（SEQ ID NO:7）
（2）进行PCR扩增
利用上述特异引物对表1中的42份普通六倍体小麦品种（均来自于国家种质资源库）的DNA进行PCR扩增，扩增体系为50μL，具体有：5μL DNA模板、2.5μL上游引物、2.5μL下游引物、25μL Phanta Max超保真 DNA 聚合酶、15μL ddH2O；采用普通扩增程序扩增，步骤如下：
1）95℃预变性5min；
2）34个循环：95℃变性30s，58℃复性30s（SeqHAL3-7B-1F/1R和SeqHAL3-7B-2F/2R）或55℃复性30s （SeqHAL3-7B-3F/3R），72℃延伸2min；
3）72℃延伸10min；结束扩增，12℃保存。
表1 42份普通六倍体小麦品种
2、小麦TaHAL3-7B基因单倍型的获得
通过回收目标片段得到纯化后产物，利用特异引物SeqHAL3-7B-1F/1R、SeqHAL3-7B-2F/2R、SeqHAL3-7B-3F/3R对纯化后产物进行双向一代测序。
多序列比对分析结果显示，小麦TaHAL3-7B基因存在19处SNP变异和1处InDel变异，其中，启动子区存在13处SNP变异，基因区存在6处SNP变异和一处12bp的InDel变异，这19处SNP变异位点与InDel位点完全共分离。小麦TaHAL3-7B基因共检测到了4种单倍型：TaHAL3-7B-Hapl I、TaHAL3-7B-Hapl II、TaHAL3-7B-Hapl III和TaHAL3-7B-Hapl IV。
小麦TaHAL3-7B基因的SNP变异位点及单倍型分析如图1所示。
二、小麦TaHAL3-7B基因分子标记的开发及单倍型的鉴定
1、小麦TaHAL3-7B基因分子标记的开发
基于InDel和SNP 17位点变异，利用小麦联盟的Primer Server （BETA）和dCAPS引物设计工具分别设计引物，其中，InDel位点引物记为HAB-ID12-F和HAB-ID12-R，SNP 17位点dCAPS标记记为HB4-KPNI-F和HB4-KPNI-R。上述引物的核苷酸序列具体如下：
HAB-ID12-F：CGAAGTACCACGACCGCAG（SEQ ID NO:8）
HAB-ID12-R：CGAGAAAGTGACCAGTCGAAGT（SEQ ID NO:9）
HB4-KPNI-F：TGTGTTCCCTCATGCTGTCA（SEQ ID NO:10）
HB4-KPNI-R：GCTCCCAGCTTTCCGGTA（SEQ ID NO:11）
2、小麦TaHAL3-7B基因单倍型的鉴定
利用引物HAB-ID12-F/R和HB4-KpnI-F/R分别对294份自然群体材料InDel位点和SNP 17位点进行鉴定。
（1）InDel位点鉴定
利用引物HAB-ID12-F/R对294份自然群体材料InDel位点进行鉴定，具体包括以下步骤：
①PCR扩增
用引物HAB-ID12-F/R对待测小麦品种的DNA进行PCR扩增得到PCR产物C1，PCR扩增体系为10μL，具体有：1μL DNA模板、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、5μL 2×Taq PCR 预混试剂、3μL ddH2O；采用普通扩增程序扩增，步骤如下：
（i）95℃变性5min；
（ii）34个循环：95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min；
（iii）72℃延伸10min；结束扩增，4℃保存。
②凝胶电泳检测
利用质量浓度为6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（每100ml凝胶溶液中含有5.85g丙烯酰胺和0.15g甲叉丙烯酰胺）对PCR产物C1进行稳压电泳分离，根据电泳结果确定待测小麦在InDel位点的基因型以及待测小麦可能的单倍型：
（i）若PCR产物C1的大小为275bp（SEQ ID NO:12），则待测小麦在InDel位点存在12bp片段插入，InDel位点的基因型为GAGGCGGCGGCGGC，待测小麦可能的单倍型为TaHAL3- 7B-Hapl I或TaHAL3-7B-Hapl III；
（ii）若PCR产物C1的大小为263bp（SEQ ID NO:13），则待测小麦在InDel位点存在12bp片段缺失，InDel位点的基因型为G，待测小麦可能的单倍型为TaHAL3-7B-Hapl II或TaHAL3-7B-Hapl IV。
294份自然群体材料中的部分自然群体材料的InDel标记的检测结果见图2。
（2）SNP 17位点鉴定
利用引物HB4-KPNI-F/R对294份自然群体材料SNP 17位点进行鉴定，具体包括以下步骤：
①PCR扩增
用引物HB4-KPNI-F/R对待测小麦品种的DNA进行PCR扩增得到PCR产物A1，PCR扩增体系为10μL，具体有：1μL DNA模板、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、5μL 2×Taq PCR 预混试剂、3μL ddH2O；采用普通扩增程序扩增，步骤如下：
（i）95℃变性5min；
（ii）34个循环：95℃变性30s，55.7℃复性30s，72℃延伸1min；
（iii）72℃延伸10min；结束扩增，4℃保存。
②酶切
用限制性内切酶Kpn I对PCR产物A1进行酶切，得到酶切产物B1，酶切体系为10μL，具体有：3μL PCR产物A1、0.2μL限制性内切酶Kpn I、1μL 10×CutSmart缓冲液、5.8μLddH2O；反应条件为37℃孵育4h。
③凝胶电泳检测
利用3%琼脂糖凝胶（3.6g琼脂糖，120mL 0.5×TBE，10000×GelRed核酸染料）对酶切产物B1进行稳压电泳检测，鉴定PCR产物A1是否被切为两个片段，根据电泳结果确定待测小麦在SNP 17位点的基因型以及待测小麦可能的单倍型：
（i）若酶切产物B1为一个片段，且片段大小为339bp（SEQ ID NO:14），则待测小麦在SNP 17位点发生了单碱基变异，SNP 17位点的基因型为A，待测小麦可能的单倍型为TaHAL3-7B-Hapl I或TaHAL3-7B-Hapl IV；
（ii）若酶切产物B1为两个片段，且片段大小分别为320bp（SEQ ID NO:15）和19bp（SEQ ID NO:16），则待测小麦在SNP 17位点未发生单碱基变异，SNP 17位点的基因型为C，待测小麦可能的单倍型为TaHAL3-7B-Hapl II或TaHAL3-7B-Hapl III。
294份自然群体材料中的部分自然群体材料的SNP 17位点标记的检测结果见图3。
根据图1所示的单倍型分型情况，以及294份自然群体材料的InDel标记和SNP 17位点标记的检测结果，对这294份自然群体材料的单倍型进行分型，分型结果见表2。
表2 小麦自然群体中TaHAL3-7B基因的分型结果
三、小麦TaHAL3-7B基因单倍型与产量性状的关联分析
利用R语言的GAPIT包的一般线性模型（generalized linear model，GLM），结合294份自然群体材料的TaHAL3-7B基因单倍型数据（小麦55K芯片和小麦TaHAL3-7B基因）以及2年4个环境（E1：2021年烟台莱山瀑拉谷试验基地；E2：2021年石家庄栾城试验站；E3：2022年烟台沐浴村试验基地；E4：2022年烟台莱山瀑拉谷试验基地）下穗长和粒长的表型数据进行全基因组关联分析。利用R语言lme4包计算4个环境下各性状最佳线性无偏估计值（best linear unbiased estimator，BLUE）。
小麦TaHAL3-7B基因单倍型与产量性状关联分析结果见表3。
表3 小麦TaHAL3-7B基因单倍型与产量性状关联分析结果
将表3所列数据做图，分别得到TaHAL3-7B基因单倍型与穗长关联分析结果图（图4）和TaHAL3-7B基因单倍型与粒长关联分析结果图（图5）。
小麦TaHAL3-7B基因单倍型与穗长、粒长关联分析结果显示：
（1）相比于TaHAL3-7B-Hapl I类型，TaHAL3-7B-Hapl II和TaHAL3-7B-Hapl IV类型穗长平均显著降低13.75%和12.71%；相比于TaHAL3-7B-Hapl III类型，TaHAL3-7B-Hapl II和TaHAL3-7B-Hapl IV类型穗长平均显著降低8.82%和7.74%；
（2）相比于TaHAL3-7B-Hapl I类型，TaHAL3-7B-Hapl II、TaHAL3-7B-Hapl III和TaHAL3-7B-Hapl IV类型粒长平均显著增加7.86%、7.56%和9.29%。
可见，TaHAL3-7B-Hapl II和TaHAL3-7B-Hapl IV类型是小麦TaHAL3-7B基因的优异单倍型。
综上，本发明所鉴定的小麦TaHAL3-7B基因的4种单倍型与小麦穗长和粒长显著相关，可用于鉴定小麦穗长和粒长性状，具有重要的育种应用价值。
需要说明的是，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引申出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (6)
1.小麦TaHAL3-7B基因的分子标记，其特征在于，所述分子标记位于TaHAL3-7B基因的基因区，一个是InDel标记，一个是SNP标记，二者均包含TaHAL3-7B-Hapl I、TaHAL3-7B- Hapl II、TaHAL3-7B-Hapl III和TaHAL3-7B-Hapl IV 4种单倍型，其中：
所述InDel标记由SEQ ID NO:8所示的上游引物HAB-ID12-F和SEQ ID NO:9所示的下游引物HAB-ID12-R扩增得到，该InDel标记的TaHAL3-7B-Hapl I和TaHAL3-7B-Hapl III 2种单倍型的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，序列长度275bp，TaHAL3-7B-Hapl II和TaHAL3- 7B-Hapl IV 2种单倍型的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，序列长度263bp；
所述SNP标记由SEQ ID NO:10所示的上游引物HB4-KPNI-F和SEQ ID NO:11所示的下游引物HB4-KPNI-R扩增得到，该SNP标记的TaHAL3-7B-Hapl I和TaHAL3-7B-Hapl IV 2种单倍型的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，序列长度339bp，TaHAL3-7B-Hapl II和TaHAL3-7B- Hapl III 2种单倍型的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，序列长度320bp。
2.权利要求1所述的小麦TaHAL3-7B基因的分子标记在选育小麦TaHAL3-7B-Hapl II和TaHAL3-7B-Hapl IV 2种单倍型中的应用，所述TaHAL3-7B-Hapl II和TaHAL3-7B-Hapl IV2种单倍型相比于TaHAL3-7B-Hapl I和TaHAL3-7B-Hapl III 2种单倍型具有缩短小麦穗长和增加小麦粒长的等位基因。
3.利用权利要求1所述的小麦TaHAL3-7B基因的分子标记选育TaHAL3-7B-Hapl II和TaHAL3-7B-Hapl IV 2种单倍型小麦的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：提取待测小麦品种或品系的基因组DNA；
步骤2：以待测小麦品种或品系的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:8所示的上游引物HAB-ID12-F和SEQ ID NO:9所示的下游引物HAB-ID12-R进行PCR扩增，得到PCR产物C1；用SEQ ID NO:10所示的上游引物HB4-KPNI-F和SEQ ID NO:11所示的下游引物HB4-KPNI-R进行PCR扩增，得到PCR产物A1；
步骤3：用限制性内切酶Kpn I对PCR产物A1进行酶切，得到酶切产物B1；
步骤4：用6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物C1进行稳压电泳分离，用3%琼脂糖凝胶对酶切产物B1进行稳压电泳分离，根据电泳结果确定待测小麦的单倍型，具体的：
（1）如果PCR产物C1出现了分子量大小为275bp的扩增片段、酶切产物B1出现了分子量大小为339bp的扩增片段，则该小麦品种或品系为TaHAL3-7B-Hapl I类型，其不含有缩短小麦穗长和增加小麦粒长的等位基因；
（2）如果PCR产物C1出现了分子量大小为263bp的扩增片段、酶切产物B1出现了分子量大小为320bp的扩增片段，则该小麦品种或品系为TaHAL3-7B-Hapl II类型，其含有缩短小麦穗长和增加小麦粒长的等位基因；
（3）如果PCR产物C1出现了分子量大小为275bp的扩增片段、酶切产物B1出现了分子量大小为320bp的扩增片段，则该小麦品种或品系为TaHAL3-7B-Hapl III类型，其不含有缩短小麦穗长和增加小麦粒长的等位基因；
（4）如果PCR产物C1出现了分子量大小为263bp的扩增片段、酶切产物B1出现了分子量大小为339bp的扩增片段，则该小麦品种或品系为TaHAL3-7B-Hapl IV类型，其含有缩短小麦穗长和增加小麦粒长的等位基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤2中，用SEQ ID NO:8所示的上游引物HAB-ID12-F和SEQ ID NO:9所示的下游引物HAB-ID12-R进行PCR扩增时：
PCR扩增体系为10μL，具体有：1μL DNA模板、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、5μL 2×Taq PCR 预混试剂、3μL ddH2O；
扩增步骤如下：
（1）95℃变性5min；
（2）34个循环：95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min；
（3）72℃延伸10min；结束扩增，4℃保存。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤2中，用SEQ ID NO:10所示的上游引物HB4-KPNI-F和SEQ ID NO:11所示的下游引物HB4-KPNI-R进行PCR扩增时：
PCR扩增体系为10μL，具体有：1μL DNA模板、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、5μL 2×Taq PCR 预混试剂、3μL ddH2O；
扩增步骤如下：
（1）95℃变性5min；
（2）34个循环：95℃变性30s，55.7℃复性30s，72℃延伸1min；
（3）72℃延伸10min；结束扩增，4℃保存。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤3中，用限制性内切酶Kpn I对PCR产物A1进行酶切时：
酶切体系为10μL，具体有：3μL PCR产物A1、0.2μL限制性内切酶Kpn I、1μL 10×CutSmart缓冲液、5.8μL ddH2O；
反应条件为：37℃孵育4h。
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