CN116926112A - 一种小立碗藓中dna大片段的转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小立碗藓中DNA大片段的转化方法。本发明提供了一种小立碗藓中DNA大片段的转化方法，包括如下步骤：采用聚乙二醇介导小立碗藓原生质体转化，依靠同源重组将外源目的DNA大片段整合入小立碗藓基因组预定位点；所述外源目的DNA大片段为50‑100kb。本发明采用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)介导的小立碗藓原生质体转化方法，将多基因的大片段DNA转入小立碗藓，并通过同源重组插入指定位点，并替换内源基因组序列。本发明在医药、能源、环境、农业、工业等领域具有重要应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小立碗藓中DNA大片段的转化和替换内源序列方法。
背景技术
小立碗藓(Physcomitrium patens)生长所需营养简单，容易培养；其配子体在生活史中占优势，对其突变体的表型可以进行直接研究；其核基因组易于与有同源片段的外源DNA发生高频率的同源重组，从而使得精确的基因破坏和基因敲除成为可能，为基因功能的研究提供了良好的材料。小立碗藓与高等陆生植物有很多相似特点，而小立碗藓的一些特性使得它比其他植物更易于进行分子生物学的研究。小立碗藓在国外已经成为植物分子生物学研究的模式生物。
同时，小立碗藓是合成生物学的底盘物种，可以作为重组治疗蛋白药物和具有商业价值的天然产物的异源表达底盘宿主。利用小立碗藓表达复杂产物需要转化大片段，但目前尚未有转化多基因大片段DNA的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种小立碗藓中DNA大片段的转化方法。
第一方面，本发明要求保护一种小立碗藓中DNA大片段的转化方法。
本发明要求保护的小立碗藓中DNA大片段的转化方法，可包括如下步骤：采用聚乙二醇介导小立碗藓原生质体转化，依靠同源重组将外源目的DNA大片段整合入小立碗藓基因组预定位点；所述外源目的DNA大片段为50-100kb。
进一步地，所述外源目的DNA大片段和所述小立碗藓基因组上预定位点之间均具有1kb的同源臂。
进一步地，根据所述外源目的DNA大片段的序列以及位于所述小立碗藓基因组上重组预定位点上下游各1kb序列，得到小立碗藓同源重组DNA大片段的序列；所述小立碗藓同源重组DNA大片段的序列自上游到下游依次为所述小立碗藓基因组上重组预定位点上游1kb序列、所述外源目的DNA大片段的序列、所述小立碗藓基因组上重组预定位点下游1kb序列；然后制备得到所述小立碗藓同源重组DNA大片段。
更进一步地，所述小立碗藓同源重组DNA大片段是按照如下步骤制备得到的：
(A1)根据所述外源目的DNA大片段的序列以及位于所述小立碗藓基因组上重组预定位点上下游各1kb序列，得到小立碗藓同源重组DNA大片段的序列；所述小立碗藓同源重组DNA大片段的序列自上游到下游依次为所述小立碗藓基因组上重组预定位点上游1kb序列、所述外源目的DNA大片段的序列、所述小立碗藓基因组上重组预定位点下游1kb序列；将所述小立碗藓同源重组DNA大片段的序列分成两段或两段以上20-30kb的序列，并且每相邻的两段序列在相邻处具有1kb重叠；然后针对每段20-30kb的序列，将其分成若干个2800-3100bp的序列，并且每相邻的两个段在相邻处有40-150bp重叠，然后针对每个片段进行化学合成，得到若干个目的DNA小片段；
(A2)针对每段20-30kb的序列，分别将若干个所述目的DNA小片段通过在酵母中利用同源重组组装成对应的20-30kb的外源目的DNA中片段；从而获得两个或两个以上20-30kb的外源目的DNA中片段；
(A3)将所述两个或两个以上20-30kb的外源目的DNA中片段通过在酵母中利用同源重组组装成所述小立碗藓同源重组DNA大片段。
更进一步地，步骤(A1)中，位于首尾的两个2800-3100bp的片段的非重叠端均连接有40-150bp的用于与酵母表达载体(如pRS413质粒)重组的同源臂序列。针对每段20-30kb的序列，是将合成的若干个所述目的DNA小片段分别构建到细菌表达质粒(如引入NotI酶切位点的pUC57质粒)中，得到若干个含有所述目的DNA小片段的重组质粒(记为pUC57-M质粒)。
更进一步地，步骤(A2)中，针对每段20-30kb的序列，是将对应的若干个所述目的DNA小片段从相应的所述重组质粒中切下(如用Not I酶切pUC57-M质粒)后与线性化的所述酵母表达载体(如通过PCR扩增得到的两端带有能够与所述目的DNA小片段发生同源重组的同源臂的线性化的pRS413质粒)一同导入酵母细胞，通过同源重组获得含有对应的20-30kb的外源目的DNA中片段的重组质粒；从而获得两个或两个以上含有20-30kb的外源目的DNA中片段的重组质粒(记为pRS413-M质粒)。
更进一步地，步骤(A3)中，是将对应的两个或两个以上所述20-30kb的外源目的DNA中片段从相应的所述重组质粒中切下(如用Not I酶切pRS413-M质粒)后与线性化的所述酵母表达载体(如通过PCR扩增得到的能够与所述20-30kb的外源目的DNA中片段发生同源重组的同源臂的线性化的pJS356质粒)一同导入酵母细胞，通过同源重组获得含有所述外源目的DNA大片段的重组质粒。
进一步地，在所述方法中，在步骤(A3)之后还可包括如下步骤：
(A4)将(A3)获得的含有所述外源目的DNA大片段的重组质粒酶切为线性DNA，纯化回收(如利用醋酸铵法纯化回收)后利用聚乙二醇介导的小立碗藓原生质体转化法转入小立碗藓原生质体。
在本发明的具体实施方式中，转化时，待转化的所述线性DNA取80μg。
进一步地，在所述方法中，在步骤(A4)之后还可包括如下步骤：
(A5)待(A4)转化后的小立碗藓原生质体再生后，先利用抗生素初步筛选出阳性株系，然后再进行基因型鉴定，从而获得将所述外源目的DNA大片段整合入小立碗藓基因组预定位点的重组小立碗藓。
其中，所述基因型鉴定的设计原则如下：将基因型鉴定检测位点设计在合成序列(即前文所述目的DNA大片段)与野生型序列(即前文所述小立碗藓基因组序列)存在差异的每个区域，即野生型序列的缺失区和合成序列的连接区。本发明在合成序列和野生型序列共有的序列上设计了引物，并在与合成序列和野生型序列不同的序列上分别设计了另一个引物，分别对合成序列和野生型序列进行扩增。如果只能扩增野生型序列而不能扩增合成序列，则该位点没有发生同源重组替换。如果野生型序列和合成序列都能扩增，则该位点没有发生同源重组，但合成序列可能在其他位点有同源重组，或者合成的线性片段在体内自环化不稳定存在，也可能是嵌合体。如果无法扩增野生型序列，只能扩增合成序列，则合成序列与野生型序列在该位点发生同源重组。如果一个株系只能用合成序列扩增出所有位点，而不能扩增出对应的所有野生型序列，则该株系为真阳性人工合成株系。
在所述方法中，所述外源目的DNA大片段整合入所述小立碗藓基因组上重组预定位点可为如下任一：
(B1)所述外源目的DNA大片段插入到所述小立碗藓基因组上重组预定位点；
(B2)所述外源目的DNA大片段替换掉所述小立碗藓基因组上重组预定位点之间的天然序列。
在本发明的具体实施方式中，所述外源目的DNA大片段的核苷酸序列为将SEQIDNo.1的第1001-15000位、SEQ ID No.2的第1-10421位、SEQ ID No.3的第1001-15000位、SEQ ID No.4的第1-846位、SEQ ID No.5的第1001-15000位、SEQ ID No.6的第1-13265位顺次首尾相连所得序列。
在本发明的具体实施方式中，所述整合入小立碗藓基因组预定位点为将所述外源目的DNA大片段替换小立碗藓天然基因组18号染色体的第460,488至615,668位之间共155,180bp序列。相应的，所述位于小立碗藓基因组上重组预定位点上游1kb序列如SEQ ID No.1第1-1000bp所示，所述位于小立碗藓基因组上重组预定位点下游1kb序列如SEQ ID No.6的第13266-14265位所示。
进一步地，所述20-30kb的外源目的DNA中片段为三个，分别记为外源目的DNA中片段1、外源目的DNA中片段2和外源目的DNA中片段3；所述外源目的DNA中片段1的核苷酸序列为将SEQ ID No.1和SEQ ID No.2顺次首尾相连后所得；所述外源目的DNA中片段2的核苷酸序列为将SEQ ID No.3和SEQ ID No.4顺次首尾相连后所得；所述外源目的DNA中片段3的核苷酸序列为将SEQ ID No.5和SEQ ID No.6顺次首尾相连后所得。
更进一步地，所述外源目的DNA中片段1是通过将10个3kb的目的DNA小片段通过在酵母中利用同源重组所得；所述10个3kb的目的DNA小片段分别记为目的DNA小片段1、目的DNA小片段2、目的DNA小片段3、目的DNA小片段4、目的DNA小片段5、目的DNA小片段6、目的DNA小片段7、目的DNA小片段8、目的DNA小片段9和目的DNA小片段10；所述目的DNA小片段1的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第1-2982位所示；所述目的DNA小片段2的核苷酸序列如SEQID No.1的第2833-5812位所示；所述目的DNA小片段3的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第5663-8642位所示；所述目的DNA小片段4的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第8493-11472位所示；所述目的DNA小片段5的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第11324-14301位所示；所述目的DNA小片段6的核苷酸序列为将SEQ ID No.1的第14153-15000位和SEQ ID No.2的第1-2131位顺次首尾相连后所得；所述目的DNA小片段7的核苷酸序列如SEQ ID No.2的第1983-4961位所示；所述目的DNA小片段8的核苷酸序列如SEQ ID No.2的第4812-7791位所示；所述目的DNA小片段9的核苷酸序列如SEQ ID No.2的第7642-10621位所示；所述目的DNA小片段10的核苷酸序列如SEQ ID No.2的第10472-13358位所示。
更进一步地，所述外源目的DNA中片段2是通过将另外7个3kb的目的DNA小片段通过在酵母中利用同源重组所得；所述另外7个3kb的目的DNA小片段分别记为目的DNA小片段1’、目的DNA小片段2’、目的DNA小片段3’、目的DNA小片段4’、目的DNA小片段5’、目的DNA小片段6’、目的DNA小片段7’；所述目的DNA小片段1＇的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第1-2982位所示；所述目的DNA小片段2＇的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第2833-4710位所示；所述目的DNA小片段3＇的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第4561-7540位所示；所述目的DNA小片段4＇的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第7391-10370位所示；所述目的DNA小片段5＇的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第10221-13200位所示；所述目的DNA小片段6＇的核苷酸序列为将SEQ IDNo.3的第13052-15000位和SEQ ID No.4的第1-1031位顺次首尾相连后所得序列；所述目的DNA小片段7＇的核苷酸序列如SEQ ID No.4的第882-3940位所示。
更进一步地，所述外源目的DNA中片段3是通过将再有10个3kb的目的DNA小片段通过在酵母中利用同源重组所得；所述再有10个3kb的目的DNA小片段分别记为目的DNA小片段1＇＇、目的DNA小片段2＇＇、目的DNA小片段3＇＇、目的DNA小片段4＇＇、目的DNA小片段5＇＇、目的DNA小片段6＇＇、目的DNA小片段7＇＇、目的DNA小片段8＇＇、目的DNA小片段9＇＇和目的DNA小片段10＇＇；所述目的DNA小片段1＇＇的核苷酸序列如SEQ ID No.5的第1-2982位所示；所述目的DNA小片段2＇＇的核苷酸序列如SEQ ID No.5的第2833-5812位所示；所述目的DNA小片段3＇＇的核苷酸序列如SEQ ID No.5的第5663-8642位所示；所述目的DNA小片段4＇＇的核苷酸序列如SEQ ID No.5的第8493-11472位所示；所述目的DNA小片段5＇＇的核苷酸序列如SEQID No.5的第11324-14302位所示；所述目的DNA小片段6＇＇的核苷酸序列为将SEQ ID No.5的第14153-15000位和SEQ ID No.6的第1-2132位顺次首尾相连后所得序列；所述目的DNA小片段7＇＇的核苷酸序列如SEQ ID No.6的第1983-3962位所示；所述目的DNA小片段8＇＇的核苷酸序列如SEQ ID No.6的第4814-7792位所示；所述目的DNA小片段9＇＇的核苷酸序列如SEQ ID No.6的第7643-10622位所示；所述目的DNA小片段10＇＇的核苷酸序列如SEQ IDNo.6的第10473-14265位所示。
第二方面，本发明要求保护前文第一方面中所述组装方法在如下任一中的应用：
(C1)以小立碗藓为底盘宿主进行大片段DNA组装从而生产重组蛋白药物
(C2)以小立碗藓为底盘宿主进行大片段DNA组装从而生产具有经济价值的天然代谢产物。
本发明采用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)介导的小立碗藓原生质体转化方法，将多基因的大片段DNA转入小立碗藓，并通过同源重组插入指定位点，并替换内源基因组序列。本发明在医药、能源、环境、农业、工业等领域具有重要应用潜力。
附图说明
图1为本发明组装替换流程图。
图2为基因型鉴定结果图。图中泳道1-10与表1中的PCR标记位点相对应。
图3为semi-syn18L全基因组测序分析。没有读取到被删除区域的序列，并且读到了所有删减后新连接的序列。图中，Semi-syn18L表示外源目的DNA大片段替换掉对应小立碗藓天然基因组序列的阳性株系。
图4为小立碗藓各个生长时期表型图。图中，Semi-syn18L表示外源目的DNA大片段替换掉对应小立碗藓天然基因组序列的阳性株系，WT表示野生型株系。
图5为胁迫处理的叶绿素含量统计图。A为NaCl处理。B为山梨醇处理。图中，semi-syn18L表示外源目的DNA大片段替换掉对应小立碗藓天然基因组序列的阳性株系，WT表示野生型株系。
具体实施方式
本发明采用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)介导的小立碗藓原生质体转化方法，将多基因的大片段DNA转入小立碗藓，并通过同源重组插入指定位点，并替换内源基因组序列。具体设计思路如下：
由于大片段DNA体外操纵较困难，本发明首先将人工合成DNA序列化学合成成多个3-kb小片段DNA，然后将10个左右的3-kb小片段DNA在酵母中利用同源重组组装成20-30-kb左右的大片段(Jiang,S.,Tang,Y.,Xiang,L.,Zhu,X.,Cai,Z.,Li,L.,Chen,Y.,Chen,P.,Feng,Y.,Lin,X.,et al.(2021).Efficient de novo assembly and modification oflarge DNA fragments.Science China Life Sciences 65,1445-1455.)，再将三个20-30kb人工合成DNA片段在酵母中进行第二轮组装，最终组装成一个68.5kb的人工合成DNA大片段。最后在小立碗藓中利用PEG介导的原生质体转化法，将68.5kb的人工合成DNA大片段转入原生质体中重组替换对应的155kb的天然基因组序列，方案流程如图1所示。
由于大片段DNA体外操纵较困难，本发明首先根据待整合入小立碗藓基因组中外源目的DNA大片段的序列，将其分成两段或两段以上20-30kb的序列，并且每相邻的两段序列在相邻处具有1kb的重叠(如图2所示)；然后针对每段20-30kb的序列，分别合成10个左右约3kb的目的DNA小片段，并且每相邻的两个所述目的DNA小片段在相邻处有150bp重叠；然后将每10个左右的约3kb小片段DNA在酵母中利用同源重组组装成一个20-30kb左右的大片段。然后，再将两个或两个以上20-30kb的DNA片段在酵母中进行第二轮组装，最终组装成一个更大的人工合成DNA大片段。最后在小立碗藓中利用PEG介导的原生质体转化法，将这个更大的人工合成DNA大片段转入小立碗藓原生质体中重组替换对应的天然基因组序列，方案流程如图1所示。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、小立碗藓中DNA大片段的转化
本实施例将以如下为例，详细说明小立碗藓中DNA大片段的转化方法：将所述人工合成的外源目的DNA大片段替换小立碗藓天然基因组18号染色体的第460,488和615,668位之间共155,180bp序列。
待转化的外源目的DNA大片段序列为将SEQ ID No.1的第1001-15000位、SEQIDNo.2的第1-10421位、SEQ ID No.3的第1001-15000位、SEQ ID No.4的第1-846位、SEQ IDNo.5的第1001--15000位、SEQ ID No.6的第1-13265位顺次首尾相连所得序列，位于所述小立碗藓基因组上重组预定位点上游1kb序列如SEQ ID No.1第1-1000位所示，位于所述小立碗藓基因组上重组预定位点下游1kb序列如SEQ ID No.6的第13266-14265位所示。
据此得到小立碗藓同源重组DNA大片段，其自上游到下游其序列为“SEQ ID No.1的第1-15000位+SEQ ID No.2的第1-10421位+SEQ ID No.3的第1001-15000位+SEQ IDNo.4的第1-846位+SEQ ID No.5的第1001-15000位+SEQ ID No.6的第1-14265位”。将所述小立碗藓同源重组DNA大片段分成三段20-30kb的序列，并且每相邻的两段序列在相邻处具有1kb重叠(两处重叠具体为SEQ ID No.2的第9422-10421位和SEQ ID No.3的第1-1000位，以及“SEQ ID No.3的第14847-15000位和SEQ IDNo.4的第1-846位顺次首尾连接所得序列”和SEQ ID No.5的第1-1000位)，分别记为外源目的DNA中片段1、外源目的DNA中片段2和外源目的DNA中片段3，所述外源目的DNA中片段1的核苷酸序列为将SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2顺次首尾相连后所得；所述外源目的DNA中片段2的核苷酸序列为将SEQ ID No.3和SEQID No.4顺次首尾相连后所得；所述外源目的DNA中片段3的核苷酸序列为将SEQ ID No.5和SEQ ID No.6顺次首尾相连后所得。
将所述酵母同源重组片段1分为10个3kb左右的目的DNA小片段并进行化学合成，并且每相邻的两个所述目的DNA小片段在相邻处有149-151bp重叠。这里10个3kb左右的目的DNA小片段分别记为目的DNA小片段1、目的DNA小片段2、目的DNA小片段3、目的DNA小片段4、目的DNA小片段5、目的DNA小片段6、目的DNA小片段7、目的DNA小片段8、目的DNA小片段9和目的DNA小片段10；所述目的DNA小片段1的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第1-2982位所示；所述目的DNA小片段2的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第2833-5812位所示；所述目的DNA小片段3的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第5663-8642位所示；所述目的DNA小片段4的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第8493-11472位所示；所述目的DNA小片段5的核苷酸序列如SEQIDNo.1的第11324-14301位所示；所述目的DNA小片段6的核苷酸序列为将SEQ ID No.1的第14153-15000位和SEQ ID No.2的第1-2131位顺次首尾相连后所得；所述目的DNA小片段7的核苷酸序列如SEQ ID No.2的第1983-4961位所示；所述目的DNA小片段8的核苷酸序列如SEQ ID No.2的第4812-7791位所示；所述目的DNA小片段9的核苷酸序列如SEQ ID No.2的第7642-10621位所示；所述目的DNA小片段10的核苷酸序列如SEQ ID No.2的第10472-13358位所示。将这里的10个3kb左右的目的DNA小片段分别克隆到经过改造的pUC57细菌表达质粒(上下游引物分别加上2个NotI酶切位点序列，然后将PCR产物用无缝克隆试剂盒连接成环状质粒，所得改造后质粒的全序列如SEQ ID No.7所示)的两个NotI酶切位点之间，经测序验证正确后得到10个含有上述不同目的DNA小片段的重组质粒。然后将10个NotI酶切后的DNA大片段和pRS413细菌酵母双元表达载体质粒(Jiang,S.,Tang,Y.,Xiang,L.,Zhu,X.,Cai,Z.,Li,L.,Chen,Y.,Chen,P.,Feng,Y.,Lin,X.,et al.(2021).Efficient denovo assembly and modification of large DNA fragments.Science China LifeSciences 65,1445-1455.)的线性DNA(经PCR扩增得到的线性DNA，并且引入同源臂，引物序列如下：F：5’-gggcgaattgGCGGCCGCTTAATAATGGCATAAAAAATCTACTTACTTTTTATAT TCT-3’；R：5’-acaaaagctgGCGGcCGCACAAAGGATGTTGGATCGATTTTGTATTGGAAGATAAG CA-3’)一同导入BY4741酵母细胞中，通过同源重组将10个目的DNA片段和载体质粒片段组装成环状的目的表达质粒，从阳性重组酵母细胞中获得含有“SEQ ID No.1+SEQ ID No.2”所示外源目的DNA中片段的重组质粒，并将其转入细菌中进行扩繁，以便富集更多的重组质粒用于后续的第二轮组装。
将所述酵母同源重组片段2分成7个3kb左右的目的DNA小片段并进行化学合成，并且每相邻的两个所述目的DNA小片段在相邻处有149-151bp重叠。这里8个3kb左右的目的DNA小片段分别记为目的DNA小片段1＇、目的DNA小片段2＇、目的DNA小片段3＇、目的DNA小片段4＇、目的DNA小片段5＇、目的DNA小片段6＇、目的DNA小片段7＇；所述目的DNA小片段1＇的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第1-2982位所示；所述目的DNA小片段2＇的核苷酸序列如SEQ IDNo.3的第2833-4710位所示；所述目的DNA小片段3＇的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第4561-7540位所示；所述目的DNA小片段4＇的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第7391-10370位所示；所述目的DNA小片段5＇的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第10221-13200位所示；所述目的DNA小片段6＇的核苷酸序列为将SEQ ID No.3的第13052-15000位和SEQ ID No.4的第1-1031位顺次首尾相连后所得序列；所述目的DNA小片段7＇的核苷酸序列如SEQ ID No.4的第882-3940位所示。将这里的7个3kb左右的目的DNA小片段分别克隆到经过改造的pUC57细菌表达质粒(上下游引物分别加上2个NotI酶切位点序列，然后将PCR产物用无缝克隆试剂盒连接成环状质粒，所得改造后质粒的全序列如SEQ ID No.7所示)的两个NotI酶切位点之间，经测序验证正确后得到7个含有上述不同目的DNA小片段的重组质粒。然后将7个NotI酶切后的DNA大片段和pRS413细菌酵母双元表达载体质粒(Jiang,S.,Tang,Y.,Xiang,L.,Zhu,X.,Cai,Z.,Li,L.,Chen,Y.,Chen,P.,Feng,Y.,Lin,X.,et al.(2021).Efficient de novoassembly and modification of large DNA fragments.Science China Life Sciences65,1445-1455.)的线性DNA(经PCR扩增得到的线性DNA，并且引入同源臂，引物序列如下：F：5’-gggcgaattgGCGGCCGCTTAAGAATTAACAAAATTAGAAGATTACAAACAATAAAAG-3’；R：5’-acaaaagctgGCGGcCGCTAGGTAAATATAGAATAAATTCATAAAGTTTTCTAGAGAA-3’)一同导入BY4741酵母细胞中，通过同源重组将7个目的DNA片段和载体质粒片段组装成环状的目的表达质粒，从阳性重组酵母细胞中获得含有“SEQ ID No.3+SEQ ID No.4”所示外源目的DNA片段的重组质粒，并将其转入细菌中进行扩繁，以便富集更多的重组质粒用于后续的第二轮组装。
将所述酵母同源重组片段3分成10个3kb左右的目的DNA小片段并进行化学合成，并且每相邻的两个所述目的DNA小片段在相邻处有149-151bp重叠。这里10个3kb左右的目的DNA小片段分别记为目的DNA小片段1＇＇、目的DNA小片段2＇＇、目的DNA小片段3＇＇、目的DNA小片段4＇＇、目的DNA小片段5＇＇、目的DNA小片段6＇＇、目的DNA小片段7＇＇、目的DNA小片段8＇＇、目的DNA小片段9＇＇和目的DNA小片段10＇＇；所述目的DNA小片段1＇＇的核苷酸序列如SEQID No.5的第1-2982位所示；所述目的DNA小片段2＇＇的核苷酸序列如SEQ ID No.5的第2833-5812位所示；所述目的DNA小片段3＇＇的核苷酸序列如SEQ ID No.5的第5663-8642位所示；所述目的DNA小片段4＇＇的核苷酸序列如SEQ ID No.5的第8493-11472位所示；所述目的DNA小片段5＇＇的核苷酸序列如SEQ ID No.5的第11324-14302位所示；所述目的DNA小片段6＇＇的核苷酸序列为将SEQ ID No.5的第14153-15000位和SEQ ID No.6的第1-2132位顺次首尾相连后所得序列；所述目的DNA小片段7＇＇的核苷酸序列如SEQ ID No.6的第1983-3962位所示；所述目的DNA小片段8＇＇的核苷酸序列如SEQ ID No.6的第4814-7792位所示；所述目的DNA小片段9＇＇的核苷酸序列如SEQ ID No.6的第7643-10622位所示；所述目的DNA小片段10＇＇的核苷酸序列如SEQ ID No.6的第10473-14265位所示。将这里的10个3kb左右的目的DNA小片段分别克隆到经过改造的pUC57细菌表达质粒(上下游引物分别加上2个NotI酶切位点序列，然后将PCR产物用无缝克隆试剂盒连接成环状质粒，所得改造后质粒的全序列如SEQ IDNo.7所示)的两个NotI酶切位点之间，经测序验证正确后得到10个含有上述不同目的DNA小片段的重组质粒。然后将10个NotI酶切后的大DNA片段和pRS413细菌酵母双元表达载体质粒(Jiang,S.,Tang,Y.,Xiang,L.,Zhu,X.,Cai,Z.,Li,L.,Chen,Y.,Chen,P.,Feng,Y.,Lin,X.,et al.(2021).Efficient de novo assembly and modification oflarge DNA fragments.Science China Life Sciences65,1445-1455.)的线性DNA(经PCR扩增得到的线性DNA，并且引入同源臂，引物序列如下：F：5’-gggcgaattgGCGGCCGCTGATAATAGTACCAAAATGATGTTTTATATTAAATTCTTC-3’；R：5’-acaaaagctgGCGGcCGCACATCAAATATAGATAGATTTTTCATATATGAAGCTCTAG-3’)一同导入BY4741酵母细胞中，通过同源重组将10个目的DNA片段和载体质粒片段组装成环状的目的表达质粒，从阳性重组酵母细胞中获得含有“SEQ ID No.5+SEQ ID No.6”所示外源目的DNA片段的重组质粒，并将其转入细菌中进行扩繁，以便富集更多的重组质粒用于后续的第二轮组装。
接着，将上述获得的三个含有20-30kb的外源目的DNA片段的重组质粒分别NotI酶切成线性片段后与细菌酵母双元表达载体pJS356(Jiang,S.,Tang,Y.,Xiang,L.,Zhu,X.,Cai,Z.,Li,L.,Chen,Y.,Chen,P.,Feng,Y.,Lin,X.,et al.(2021).Efficient de novoassembly and modification of large DNA fragments.Science China Life Sciences65,1445-1455.)的线性DNA片段(经PCR扩增得到的线性DNA，并且引入同源臂，与目的DNA片段之间有40bp的重叠，引物序列如下：F：5’-AGTGTACTAGgcggccgcttaataatggcataaaaaatctacttactttttatattct-3’；R：5’-GAGAATCTTTgcggccgcacatcaaatatagatagatttttcatatatgaagctctag-3’)一同导入BY4741酵母细胞，在酵母细胞中通过同源重组组装成一个含有约70kb的目的DNA的重组质粒，从阳性重组酵母细胞中获得含有外源目的DNA大片段(核苷酸序列从5’端到3’端为“SEQ ID No.1的第1-15000位+SEQ ID No.2的第1-10421位+SEQIDNo.3的第1001-15000位+SEQ ID No.4的第1-846位+SEQ ID No.5的第1001-15000位+SEQID No.6的第1-14265位”)的重组质粒，并将其转入细菌中进行扩繁，以便富集更多的重组质粒用于后续小立碗藓原生质体转化。
然后，将含有外源目的DNA大片段(核苷酸序列从5’端到3’端为“SEQ ID No.1的第1-15000位+SEQ ID No.2的第1-10421位+SEQ ID No.3的第1001-15000位+SEQ ID No.4的第1-846位+SEQ ID No.5的第1001-15000位+SEQ ID No.6的第1-14265位”)的重组质粒用NotI酶切为线性DNA，然后将其利用醋酸铵法纯化回收备用。最后将80μg外源DNA大片段的线性DNA片段利用PEG介导的小立碗藓原生质体转化法，将线性外源目的DNA转入原生质体中。原生质体再生后，先利用G418(SEQ ID No.6的11328-13265位编码G418抗性基因)初步筛选出阳性株系，然后再进行基因型鉴定。
人工合成外源目的DNA(核苷酸序列为将SEQ ID No.1的第1001-15000位、SEQ IDNo.2的第1-10421位、SEQ ID No.3的第1001-15000位、SEQ ID No.4的第1-846位、SEQ IDNo.5的第1001-15000位、SEQ ID No.6的第1-13265位顺次首尾相连所得序列)与野生型序列(小立碗藓天然基因组18号染色体的第460,488-615,668位之间共155,180bp序列)总共有11处差异之处，本发明在这11个位点分别设计了针对合成序列和天然序列的基因型鉴定引物(表1)，用基因型鉴定的方法筛选阳性株系。所述基因型鉴定的设计原则如下：将基因型鉴定检测位点设计在合成序列(即前文所述目的DNA大片段)与野生型序列(即前文所述小立碗藓基因组序列)存在差异的每个区域，即野生型序列的缺失区和合成序列的连接区。本发明在合成序列和野生型序列共有的序列上设计了引物，并在与合成序列和野生型序列不同的序列上分别设计了另一个引物，分别对合成序列和野生型序列进行扩增。如果只能扩增野生型序列而不能扩增合成序列，则该位点没有发生同源重组替换。如果野生型序列和合成序列都能扩增，则该位点没有发生同源重组，但合成序列可能在其他位点有同源重组，或者合成的线性片段在体内自环化不稳定存在，也可能是嵌合体。如果无法扩增野生型序列，只能扩增合成序列，则合成序列与野生型序列在该位点发生同源重组。如果一个株系只能用合成序列扩增出所有位点，而不能扩增出对应的所有野生型序列，则该株系为真阳性人工合成株系。
结果显示：原生质体再生和抗性筛选过后，对阳性株系进行基因型鉴定，最终鉴定出了转化、定点插入并替换天然序列的阳性株系(如图2所示)。本发明将阳性株系继续全基因组测序分析发现，该阳性株系中转入的DNA大片段确实在指定的位点插入并重组替换了天然序列(如图3所示)，并且未发现整合插入其他基因组位置。
表1、基因鉴定引物
之后，对人工合成株系的各个生长时期进行了详细的表型观察，与野生型相比，合成株系没有表现出明显的表型差异，与野生型几乎完全相似(如图4所示)。我们还对合成株系和野生型株系进行了盐和渗透胁迫处理，在不同浓度的胁迫条件下，二者的生命活力(叶绿素含量)也没有表现出明显的不同，二者的生命活力几乎完全相似(如图5所示)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.一种小立碗藓中DNA大片段的转化方法，包括如下步骤：采用聚乙二醇介导小立碗藓原生质体转化，依靠同源重组将外源目的DNA大片段整合入小立碗藓基因组上重组预定位点；所述外源目的DNA大片段为50-100kb。
2.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于：所述外源目的DNA大片段的两端与所述小立碗藓基因组上重组预定位点之间均具有1kb的上下游同源臂。
3.根据权利要求1或2所述的转化方法，其特征在于：根据所述外源目的DNA大片段的序列以及位于所述小立碗藓基因组上重组预定位点上下游各1kb序列，得到小立碗藓同源重组DNA大片段的序列；所述小立碗藓同源重组DNA大片段的序列自上游到下游依次为所述小立碗藓基因组上重组预定位点上游1kb序列、所述外源目的DNA大片段的序列、所述小立碗藓基因组上重组预定位点下游1kb序列；然后制备得到所述小立碗藓同源重组DNA大片段。
4.根据权利要求3所述的转化方法，其特征在于：在所述方法中，将所述小立碗藓同源重组DNA大片段转化小立碗藓原生质体，待转化后的小立碗藓原生质体再生后，先利用抗生素初步筛选出阳性株系，然后再进行基因型鉴定，最后进行全基因组测序分析，从而获得将所述外源目的DNA大片段整合入小立碗藓基因组上重组预定位点的重组小立碗藓。
5.根据权利要求1-4中任一所述的转化方法，其特征在于：所述方法中，所述外源目的DNA大片段整合入所述小立碗藓基因组上重组预定位点为如下任一：
(B1)所述外源目的DNA大片段插入到所述小立碗藓基因组上重组预定位点；
(B2)所述外源目的DNA大片段替换掉所述小立碗藓基因组上重组预定位点之间的天然序列。
6.根据权利要求1-5中任一所述的转化方法，其特征在于：所述外源目的DNA大片段的核苷酸序列为将SEQ ID No.1的第1001-15000位、SEQ ID No.2的第1-10421位、SEQ IDNo.3的第1001-15000位、SEQ ID No.4的第1-846位、SEQ ID No.5的第1001-15000位和SEQID No.6的第1-13265位顺次首尾相连所得。
7.根据权利要求1-6中任一所述的转化方法，其特征在于：所述整合入小立碗藓基因组上重组预定位点为将所述外源目的DNA大片段替换小立碗藓天然基因组18号染色体的第460,488-615,668位之间共155,180bp序列。
8.根据权利要求1-7中任一所述的转化方法，其特征在于：所述小立碗藓基因组上重组预定位点上游1kb序列如SEQ ID No.1第1-1000位所示。
9.根据权利要求1-8中任一所述的转化方法，其特征在于：所述小立碗藓基因组上重组预定位点下游1kb序列如SEQ ID No.6的第13266-14265位所示。
10.权利要求1-9中任一所述转化方法在如下任一中的应用：
(C1)以小立碗藓为底盘宿主生产重组蛋白药物；
(C2)以小立碗藓为底盘宿主生产具有经济价值的天然代谢产物。
Priority Applications (1)
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| CN202310937739.4A CN116926112A (zh) | 2023-07-28 | 2023-07-28 | 一种小立碗藓中dna大片段的转化方法 |
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