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CN116904400B - 可利霉素在体外car/tcr-t细胞产品制备过程优化中的应用 - Google Patents

可利霉素在体外car/tcr-t细胞产品制备过程优化中的应用 Download PDF

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CN116904400B
CN116904400B CN202311173465.2A CN202311173465A CN116904400B CN 116904400 B CN116904400 B CN 116904400B CN 202311173465 A CN202311173465 A CN 202311173465A CN 116904400 B CN116904400 B CN 116904400B
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car
tcr
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孙媛媛
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Chengdu Yibang Pharmaceutical Technology Co ltd
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Chengdu Yibang Pharmaceutical Technology Co ltd
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Abstract

本发明涉及遗传改造T细胞药物技术领域，具体涉及可利霉素在体外CAR/TCR‑T细胞产品制备过程优化中的应用：包括CAR‑T细胞和TCR‑T细胞在内的遗传改造T细胞，在回输之前对其进行一定时间的体外培养，并在培养体系中添加一定浓度的可利霉素，可以有效减缓遗传改造T细胞的耗竭进程、提升细胞因子的表达水平、抑制免疫抑制性受体的表达水平、提升CD4+和CD8+的比例以及中央记忆性T细胞群比例，进而提升遗传改造T细胞的回输存活率以及肿瘤杀伤效果。本技术方案可以解决由于T细胞活性和T细胞耗竭等因素造成的CAR‑T/TCR‑T细胞疗法的治疗效果不理想的技术问题，具有理想的应用推广前景。

Description

可利霉素在体外CAR/TCR-T细胞产品制备过程优化中的应用
技术领域
本发明涉及遗传改造T细胞药物技术领域，具体涉及可利霉素作为体外T细胞增殖活化抑制剂、遗传改造T细胞制剂以及肿瘤治疗药物的应用，更具体地涉及可利霉素在体外CAR/TCR-T细胞产品制备过程优化中的应用。
背景技术
近年来，嵌合抗原受体修饰的T细胞（Chimeric antigen receptor modified Tcells, CAR-T）疗法或T细胞受体修饰的T细胞（T cell receptor modified T cells,TCR-T）疗法已成为一种热门的肿瘤免疫治疗手段。T细胞功能状态对CAR-T/TCR-T细胞治疗效果有重要影响，而大多数肿瘤病人由于长期处于肿瘤负荷状态或接受过放化疗，体内T细胞在功能处于抑制或免疫耐受等情况。
除了肿瘤患者T细胞活性问题之外，T细胞耗竭也是CAR-T/TCR-T细胞治疗中需要关注的问题。T细胞耗竭是指在机体长期处于肿瘤负荷或病毒感染状态或者不利的体外培养环境下，T细胞免疫功能进行性丧失，表现为增殖杀伤能力和细胞因子分泌水平均降低，而免疫抑制性受体分子表达升高。T细胞在体外刺激活化、病毒介导的CAR修饰及扩增过程中，持续受到胞内活化信号的刺激，其耗竭过程比正常T细胞快，而CAR-T/TCR-T细胞的快速耗竭将导致体内扩增维持时间变短，肿瘤细胞杀伤能力减弱，从而使病人对治疗反应不佳。
除此之外，常规的CAR-T/TCR-T细胞制备流程也会影响T细胞的CD4+/CD8+比例。T细胞需要在体外刺激，活化和扩增，由于CD8+T细胞的增殖速度明显快于CD4+T细胞，使得CD4/CD8比例降低，而CD4+/CD8+比例均衡性对T细胞发挥良好的抗肿瘤作用至关重要，有研究表明CD8+T细胞虽然具有直接的肿瘤杀伤作用，但如果缺少CD4+T细胞，会导致CD8+T细胞快速耗竭，功能减弱，影响CAR-T/TCR-T细胞在后续回输回体内后的扩增和抗肿瘤作用。
由于目前临床上使用的CAR-T/TCR-T细胞大部分来源于肿瘤病人自体T细胞修饰改造，其T细胞功能往往较差，导致CAR-T/TCR-T细胞疗法的效果不佳。因此，如何逆转T细胞耗竭状态、保证T细胞免疫疗法在临床治疗中发挥更长效稳定的抗肿瘤作用，研究T细胞的重新激活、克隆性增生、提高其肿瘤浸润能力及肿瘤细胞杀伤能力等成为领域热点。
发明内容
本发明意在提供可利霉素在制备遗传改造T细胞制剂中的应用，以解决由于T细胞活性和T细胞耗竭等因素造成的CAR-T/TCR-T细胞疗法的治疗效果不理想的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
可利霉素在制备遗传改造T细胞制剂中的应用。
进一步，所述遗传改造T细胞为CAR-T细胞或者TCR-T细胞。
进一步，可利霉素添加于遗传改造T细胞的体外培养体系中。
进一步，可利霉素在体外培养体系中的工作浓度为1.25μM-5μM。
进一步，体外培养体系为含有可利霉素、IL-7、IL-15、青链霉素双抗、FBS的淋巴细胞培养基。
本技术方案还提供了一种可利霉素在制备肿瘤治疗药物中的应用，所述肿瘤治疗药物包括经过体外培养的遗传改造T细胞，体外培养的环境中含有1.25μM-5μM可利霉素；所述肿瘤为血液瘤或者实体瘤。
进一步，所述可利霉素用于减缓遗传改造T细胞的耗竭，提升CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例，以及提升中央记忆性T细胞群比例。
遗传改造T细胞（例如，CAR-T细胞或者TCR-T细胞）在回输生物体之前的体外培养阶段，如果在培养过程中加入一定量的可利霉素，可以减缓遗传改造T细胞的耗竭进程。具体体现在遗传改造T细胞的增殖速度减缓、细胞因子分泌增加、免疫抑制性受体的表达水平受到抑制、体内以及体外肿瘤杀伤效果提升、细胞回输之后的存活率提升等。除此之外，体外培养阶段的可利霉素处理，还可以提升CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例，使其更接近于体内正常生理水平，降低了由于制备遗传改造T细胞的过程所带来的不同亚型细胞比例失调的负面影响。并且，体外培养阶段的可利霉素处理还可以提升中央记忆性T细胞群比例，进一步提高遗传改造T细胞的治疗效果。其中，遗传改造T细胞为现有技术的成熟技术，已经广泛应用于临床治疗，在此不再进行赘述。
本技术方案还提供了一种可利霉素在制备遗传改造T细胞的耗竭抑制剂的应用。
进一步，所述可利霉素为遗传改造T细胞的增殖抑制剂、遗传改造T细胞的细胞因子分泌促进剂、遗传改造T细胞的免疫抑制性受体的抑制剂、遗传改造T细胞的肿瘤杀伤效果促进剂。
本技术方案还提供了一种可利霉素在制备体外T细胞增殖活化抑制剂中的应用。
可利霉素不但用于制备医药用途的制剂的中间过程，还可以用于基础研究中，作为一种工具试剂，避免T细胞耗竭、减缓T细胞增殖活化，进而研究相关的作用机制以及疾病的发生发展进程。
本技术方案的原理如下：
在CAR-T/TCR-T细胞治疗的实践操作中，需要取生物体体内的T细胞（例如，来源于人体外周血，分离收集所有的CD3+T淋巴细胞，即全T淋巴细胞）。然后，对T细胞进行体外培养和遗传改造，获得CAR-T/TCR-T细胞。获得的CAR-T/TCR-T细胞再经过体外培养，形成状态相对稳定的细胞，再回输到生物体中，实现抗肿瘤作用（血液瘤、实体瘤等）。T细胞在体外刺激活化、病毒介导的CAR和TCR修饰及扩增过程中，持续受到胞内活化信号的刺激，其耗竭过程比未经修饰的T细胞快，CAR-T/TCR-T细胞相对于普通T细胞的CD4+/CD8+比例均衡性受到破坏，这都影响了CAR-T/TCR-T细胞的作用效果，将CAR-T/TCR-T细胞回输到生物体中，其存活率和抗肿瘤效果大打折扣。上述技术问题都是由于CAR-T/TCR-T细胞的本身的特殊性造成的，呈现出了和未经遗传改造的T细胞不一样的性质（例如：耗竭速度加快，CD4+细胞/CD8+细胞比例显著下降）。发明人针对如何降低CAR-T/TCR-T细胞耗竭速度、如何防止CD4+和CD8+T细胞出现比例失调的出现等方面，进行了大量深入研究，发现在对CAR-T/TCR-T细胞回输前的体外培养条件进行调整，可以有效改善CAR-T/TCR-T细胞情况。更具体地，在上述体外培养阶段施加一定浓度的可利霉素，可以抑制CAR-T/TCR-T细胞增殖速度、降低CAR-T/TCR-T细胞耗竭速度、一定程度上恢复CD4+和CD8+T细胞比例等，进而保证CAR-T/TCR-T细胞回输到体内的存活率以及抗肿瘤活性。
现有技术（CN113577086A）曾报道在小鼠体内施加可利霉素，会增加T细胞的增殖活性，进而提升体内的T细胞比例（CD3+T淋巴细胞），并同时提升CD4+T细胞和CD8+T细胞各自的含量（但是对两种细胞的比例没有影响）。从现有技术可以推测：可利霉素是一种T细胞增殖促进物质。CAR-T/TCR-T细胞是遗传改造后的T细胞，有可能可利霉素也会促进CAR-T/TCR-T细胞的增殖。CAR-T/TCR-T细胞在遗传改造的过程中，受到大量的体外刺激活化，增殖速度快且不同类型表面抗原的CAR-T/TCR-T细胞增殖速度不等，进而带来了耗竭快、CD4+和CD8+T细胞比例失调的不良后果，因此，需要抑制CAR-T/TCR-T细胞的增殖速度，防止细胞耗竭。出于这样的考虑，本领域技术人员并不倾向于将可利霉素应用于CAR-T/TCR-T细胞回输前的体外培养阶段。发明人在对大量CAR-T/TCR-T细胞体外培养添加物进行筛选之后，意外发现：一定浓度的可利霉素不但不会促进CAR-T/TCR-T细胞在体外的大量增殖，还会一定程度上抑制CAR-T/TCR-T细胞的增殖速度（实施例4），这与发明人从现有技术中推测出的效果完全相反。进而确定了可利霉素具有一定作为CAR-T/TCR-T细胞体外培养添加物的潜能，可以作为减缓CAR-T/TCR-T细胞耗竭的物质。
T细胞耗竭也是目前CAR-T/TCR-T细胞疗法中有待解决的问题之一，T细胞耗竭是指T细胞免疫功能进行性丧失，表现为对目标物质的杀伤能力和细胞因子分泌水平均降低，而免疫抑制性受体分子表达升高。T细胞的过度增殖和活化（例如，制备CAR-T/TCR-T细胞的过程会造成这种情况），都会造成T细胞耗竭进程的加快。发明人进而对可利霉素对T细胞耗竭的作用进行了深入研究，以确定其可用性。研究发现，在CAR-T/TCR-T细胞体外培养阶段施加1.25μM-5μM的可利霉素可以有效抑制CAR-T/TCR-T细胞的增殖速度（实施例4）；体外培养施加1.25μM-2.5μM（优选2.5μM）的可利霉素，进而获得的CAR-T/TCR-T细胞有更强的体外肿瘤杀伤效果（实施例7）；体外培养施加1.25μM-2.5μM（优选2.5μM）的可利霉素，可以有效提升CAR-T/TCR-T细胞的细胞因子分泌水平（实施例8）；体外培养施加1.25μM-5μM（优选2.5μM）的可利霉素，可以有效降低CAR-T/TCR-T细胞的免疫抑制性受体分子的表达水平（实施例9）；体外培养施加2.5μM的可利霉素，进而获得的CAR-T/TCR-T细胞回输到动物体内，可以获得更强的血液瘤和实体瘤的治疗效果（实施例10-12）；体外培养施加2.5μM的可利霉素，进而获得的CAR-T/TCR-T细胞回输到动物体内，可以保证更高的CAR-T/TCR-T细胞的存活率（实施例13、14）。上述实验说明了，在CAR-T/TCR-T细胞的体外培养阶段施加1.25μM-2.5μM（优选2.5μM）的可利霉素，可以有效抑制增殖进而避免T细胞的过早耗竭，保证了后续回输至体内的CAR-T/TCR-T细胞处于活性较强的状态。而5μM的可利霉素的施加，虽然可以有效抑制CAR-T/TCR-T细胞的过快增殖，但对细胞因子分泌水平并不存在正向影响。上述实验数据说明了，可利霉素可以作为遗传改造T细胞的体外增殖抑制剂、活性维持试剂、CAR-T/TCR-T细胞衰竭抑制剂，进而应用于CAR-T/TCR-T细胞的制备中，提升CAR-T/TCR-T细胞疗法的治疗效果。
除了可利霉素对于CAR-T/TCR-T细胞衰竭的抑制效果之外，发明人还发现了可利霉素具有提升CAR-T/TCR-T细胞中CD4+和CD8+比例的效果（实施例5），进而维持CD4+和CD8+比例均衡性，减少由于CAR-T/TCR-T细胞的制备过程带来的CD4+和CD8+比例过低的情形，使该比例尽可能地接近正常生理状态下的CD4+和CD8+比例。除此之外，可利霉素还具有提高CAR-T/TCR-T细胞中央记忆性T细胞群比例的效果（实施例6）。T细胞根据其表面表达分子的不同，可分为初始T细胞、中央记忆性T细胞、效应记忆性T细胞和效应性T细胞，在以往的CAR-T/TCR-T细胞疗法中，发现中央记忆性T细胞群在体内具有良好的增殖效果和长效的抗肿瘤作用，并且有研究发现与健康人相比，肿瘤病人T细胞中中央记忆性T细胞比例较低，而效应记忆性T细胞比例较高。通过可利霉素的添加，可以在体外CAR-T/TCR-T细胞制备过程中提高中央记忆性T细胞比例，有效提高CAR-T/TCR-T细胞的体内肿瘤治疗效果。上述CD4+和CD8+比例提升效果和中央记忆性T细胞比例的提升效果，是发明人在研究可减缓T细胞耗竭的药物的过程中的意外发现，可利霉素相对于其他单纯抑制T细胞耗竭的药物，还具有更多的作用效果，进一步提升CAR-T/TCR-T细胞疗法的效果。
综上所述，本技术方案的有益效果在于：
（1）经可利霉素处理的CAR-T/TCR-T细胞体外扩增速度减慢，可延缓在CAR-T/TCR-T细胞制备过程中的过度活化、增殖和耗竭进程。
（2）经可利霉素处理的CAR-T/TCR-T细胞可以很好地维持CD4+/CD8+比例均衡性，可在原有基础上提高CD4+/CD8+比例，对体外制备的CAR-T/TCR-T细胞在体内发挥更有效的抗肿瘤作用具有明显帮助。
（3）经可利霉素处理的CAR-T/TCR-T细胞中央记忆性T细胞比例上升，现有研究发现中央记忆性T细胞群在体内具有良好的增殖效果和长效的抗肿瘤作用，因此可利霉素处理后的CAR-T/TCR-T细胞在体内的增殖能力增强。
（4）经可利霉素处理的CAR-T/TCR-T细胞体内外肿瘤杀伤能力增强，细胞因子分泌水平增加，免疫抑制性受体分子表达下降，模型小鼠体内CAR-T/TCR-T细胞数量增加，表明可利霉素可增强CAR-T/TCR-T细胞的抗肿瘤作用，延缓CAR-T/TCR-T细胞的耗竭进程，提高CAR-T/TCR-T细胞在体内的长效扩增能力。
（5）确定了可利霉素体外处理CAR-T/TCR-T细胞的最优工作浓度为1.25-2.5μM（优选2.5μM），在此浓度下，可利霉素的作用效果呈现出非常显著的优势。
附图说明
图1为实施例3的可利霉素处理体外CAR-T/TCR-T细胞产品流程示意图。
图2为实施例4的不同浓度可利霉素处理CAR-T/TCR-T细胞后的体外增殖曲线（CM：可利霉素；A为CAR-T细胞；B为TCR-T细胞）。
图3为实施例5的不同浓度可利霉素处理CAR-T/TCR-T细胞后第7天的CD4+/CD8+比例（CM：可利霉素；A为针对不同处理的CAR-T的流式细胞术分析结果图；B为不同处理的CAR-T的CD4+/CD8+比例的统计图；C为针对不同处理的TCR-T的流式细胞术分析结果图；D为不同处理的TCR-T的CD4+/CD8+比例的统计图）。
图4为实施例6的不同浓度可利霉素处理CAR-T细胞后第7天的CCR7和CD45RA表达情况（CM：可利霉素；A为针对不同处理的CD4+CAR-T的流式细胞术分析结果图；B为根据A结果的针对四种类型的T细胞的统计图；C为针对不同处理的CD8+CAR-T的流式细胞术分析结果图；D为根据C结果的针对四种类型的T细胞的统计图）。
图5为实施例6的不同浓度可利霉素处理TCR-T细胞后第7天的CCR7和CD45RA表达情况（CM：可利霉素；A为针对不同处理的CD4+TCR-T的流式细胞术分析结果图；B为根据A结果的针对四种类型的T细胞的统计图；C为针对不同处理的CD8+TCR-T的流式细胞术分析结果图；D为根据C结果的针对四种类型的T细胞的统计图）。
图6为实施例7的不同浓度可利霉素处理CAR-T/TCR-T细胞后第7天的肿瘤细胞裂解率（CM：可利霉素；A为CAR-T细胞；B为TCR-T细胞）。
图7为实施例8的不同浓度可利霉素处理CAR-T细胞的细胞因子分泌水平（CM：可利霉素；A为CD4+CAR-T细胞；B为CD8+CAR-T细胞）。
图8为实施例8的不同浓度可利霉素处理TCR-T细胞的细胞因子分泌水平（CM：可利霉素；A为CD4+TCR-T细胞；B为CD8+TCR-T细胞）。
图9为实施例9的不同浓度可利霉素处理CAR-T/TCR-T细胞的免疫抑制性受体分子的表达水平（CM：可利霉素；A为CAR-T细胞；B为TCR-T细胞）。
图10为实施例10的经可利霉素处理CAR-T治疗的小鼠血液瘤模型活体成像图。
图11为实施例11的经可利霉素处理CAR-T治疗的小鼠皮下瘤模型活体成像图。
图12为实施例12的经可利霉素处理TCR-T治疗的小鼠皮下瘤模型活体成像图。
图13为实施例13的经可利霉素处理CAR-T治疗第21天小鼠体内T细胞比例（A为空白对照T细胞；B为CAR-T细胞；C为可利霉素处理后的CAR-T细胞）。
图14为实施例14的经可利霉素处理TCR-T治疗第21天小鼠体内T细胞比例（A为空白对照T细胞；B为TCR-T细胞；C为可利霉素处理后的TCR-T细胞）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
实施例1：药物来源与配制
可利霉素属于16元大环内酯类抗生素，具有活性基团羧基、烷氧基、环氧基、酮基和醛基以及一对共轭的C＝C，分子量约为884-982。后续实验研究具体使用到的可利霉素购自同联药业股份有限公司（上海，中国），规格200mg/片，每片可利霉素含量为112.28 mg，后续配制药品溶液时以功效成分可利霉素计算。配置时，称取适量的可利霉素药物粉末（药片研磨粉碎后使用）于1.5 mL离心管中，加入DMSO溶液溶解为10 mM母液备用。
实施例2：CAR-T/TCR-T细胞的制备
CAR-T/TCR-T细胞均为现有技术常规的通过遗传改造的T细胞，主要是通过转基因的技术将含有CAR或者TCR基因的表达质粒转入T细胞中，使得T细胞表达CAR或者TCR蛋白，提升T细胞的免疫治疗效果。本技术方案关注的重点是如何进一步提升CAR-T/TCR-T细胞的治疗效果，下面以具体的表达CD19 CAR和NY-ESO1 TCR基因为例，进行CAR-T/TCR-T细胞构建方式的具体说明。需要指出的是表达其他类型的CAR或者TCR基因（遗传修饰有CAR或者TCR基因）的T细胞，在体外培养的条件下，均可响应于特定浓度的可利霉素，实现细胞体外增殖的抑制、提升CD4+/CD8+比例、提升中央记忆性T细胞群的比例。这些遗传改造后的T细胞，在撤药后回输体内，细胞活性显著增加，肿瘤治疗效果增加。在具体的实施方式中，CAR-T细胞为表达CD19 CAR蛋白的T细胞，TCR-T细胞为表达NY-ESO1 TCR蛋白的T细胞。
（1）构建CD19 CAR和NY-ESO1 TCR表达慢病毒载体质粒
使用的原始慢病毒表达载体（空载体）为pLVX-IRES-mCherry（宝日医生物技术有限公司，产品编号：631237）。委托合成融合蛋白CD19 CAR和NY-ESO1 TCR的基因序列，利用EcoR1和BamH1两个酶切位点分别将这两个序列插入表达载体中，得到pLVX-CD19 CAR-TSPAN32-IRES-mCherry和pLVX-NY-ESO1 TCR-TSPAN32-IRES-mCherry表达载体。用EcoR1和BanH1两个酶切位点酶切鉴定CD19 CAR和NY-ESO1 TCR序列是否连上，分别切出1600bp和2600bp左右大小的条带，说明已构建好以上两个质粒。
嵌合抗原受体CAR（CD19 CAR）是基于FMC63抗体序列为基础构建，为现有技术常规的嵌合抗原受体，包括以下几个部分，依照从胞外到胞内的顺序，依次为：信号肽（signalpeptide，SEQ ID NO.1）、轻链可变区（mIglv，SEQ ID NO.2）、铰链区（Hinge chain，SEQ IDNO.3）、重链可变区（mIghv，SEQ ID NO.4）、CD28胞外区（CD28 Extra，SEQ ID NO.5）、CD28跨膜区（CD28 TM，SEQ ID NO.6）、CD28胞内区（CD28 cyto，SEQ ID NO.7）、CD3zeta胞内区（CD3zeta cyto，CD3ζ，SEQ ID NO.8）。
T细胞受体TCR（NY-ESO1 TCR）是基于NY-ESO1抗体序列为基础构建，为现有技术常规的嵌合抗原受体受体，包括以下几个部分，依照从胞外到胞内的顺序，依次为：TCRα可变区（TCRVα，SEQ ID NO.9）、CD28跨膜区（CD28 TM，SEQ ID NO.10）、CD28胞内区（CD28 cyto，SEQ ID NO.11）、CD3zeta胞内区（CD3zeta cyto，CD3ζ，SEQ ID NO.12）、融合蛋白接头liner（SEQ ID NO.13）、TCRβ可变区（TCRVβ，SEQ ID NO.14）、CD28跨膜区（CD28 TM，SEQ IDNO.15）、41BB胞内区（41BB cyto，SEQ ID NO.16）、CD3zeta胞内区（CD3zeta cyto，CD3ζ，SEQID NO.17）。
（2）病毒包装
病毒包装采用现有技术的常规方式，具体如下：
293T细胞培养：培养基为DMEM培养基，加10% FBS。当细胞生长至融合率达到80-90%时，需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。在37℃、5%CO2和90%相对湿度的细胞培养箱中培养。
铺板：包病毒前一晚在10 cm皿中铺293T细胞，使包病毒时细胞密度达到80-90%。包病毒前1 h，将细胞培养基换成DMEM培养基（1:4000加入氯喹），放入细胞孵箱中。
质粒加入：配制目的质粒和包装质粒（psPAX2和pMD2G两种包装质粒）混合物，组成以及配比如表1所示。将表1中的混合物与500μL 2×HBS混匀，滴加到293T细胞的培养皿中。
表1：病毒质粒和包装质粒混合物
换液：12h后换成正常培养基，24h后继续换液。
收集病毒：分别于36h、48h和60h时收集三次病毒上清，混匀。
过滤：用0.45μm的滤膜过滤上清液，以除去细胞杂质等。
病毒冻存：将分装好的病毒液于-80℃冰箱中冻存。
（3）原代人T细胞分离培养
本技术方案使用T细胞进行CAR-T/TCR-T的制备，T细胞可以收集于外周血。在本实施例中，以从外周血中分离的T细胞来进行说明。本技术方案不涉及采血过程，仅仅使用从外周血中分离的T细胞进行细胞制剂的制备，不涉及外科手术过程。
分离外周血T细胞：将获得的外周血用PBS进行1:1稀释，将15ml离心管中加入等量淋巴细胞分离液，使得分离液：血液：PBS = 1:1:1，将稀释后血液小心加入到分离液的上层，室温条件下800g离心20min，将离心机升速和降速均调低至2档。离心结束后，小心吸取PBMC（人外周血单核细胞）细胞层，转移到新的15ml离心管中，加入3-5倍体积的PBS稀释，1500rpm离心细胞5min，再用PBS洗涤细胞一次，孵育anti-CD3磁珠 20min，利用磁力分选柱分出CD3+T细胞，细胞计数，PBS洗涤细胞1-2次。其中，CD3+T淋巴细胞代表全T淋巴细胞，包括辅助/诱导T淋巴细胞（CD3+CD4+）、抑制/细胞毒T淋巴细胞（CD3+CD8+）等所有类型的T淋巴细胞。
T细胞体外刺激培养：配制T淋巴细胞刺激液，成分以及配比见表2。将细胞用配好的刺激液重悬，在12孔板中培养，2mL/孔。镜下观察细胞密度，每天更换刺激液，连续刺激三天，第三天后将培养基换成只含IL-2的培养基。
表2：T淋巴细胞刺激液
（4）T细胞病毒感染
第3天将刺激好的T细胞铺于六孔板中，细胞密度为2×106个/孔，配置病毒感染液，试剂如表3所示。六孔板离心（1000g，37℃，90min），然后在细胞孵箱中放置8-10h后，换成正常培养基（培养基中含IL-2）。感染T细胞48h后对细胞进行荧光检测，检测是否转染成功。至此，完成CAR-T/TCR-T细胞的构建。
表3：病毒感染液成分
实施例3：可利霉素体外处理CAR-T/TCR-T细胞
将制备好的CAR-T/TCR-T细胞以1.0×106个/孔接种于24孔板中（即第5天），以DMSO为阴性对照，可利霉素浓度梯度设置为1.25μM、2.5μM和5μM，同时加入重组人IL-7（10ng/ml）和IL-15（5ng/ml），将上述物质加入培养基中，对CAR-T/TCR-T细胞进行体外培养。培养基为淋巴细胞培养基，含10% FBS和1%青链霉素双抗（参见表2，不加IL2、Anti-CD3、Anti-CD28），每组做三个复孔，体外扩增培养CAR-T/TCR-T细胞至第12天，即可利霉素体外处理CAR-T/TCR-T细胞第7天，之后在进行体外实验检测CAR-T/TCR-T细胞表型和功能。按照上述方式继续培养至第14天，即可利霉素体外处理CAR-T/TCR-T细胞第9天，去除可利霉素、IL-7和IL-15，取CAR-T/TCR-T细胞，将CAR-T/TCR-T细胞尾静脉回输肿瘤模型小鼠，观察CAR-T/TCR-T细胞对小鼠体内肿瘤细胞的杀伤作用及体内作用维持情况（示意图参见图1）。
实施例4：可利霉素抑制CAR-T/TCR-T细胞体外增殖
为证明可利霉素对CAR-T/TCR-T细胞体外增殖的抑制作用，本实施例检测了CAR-T/TCR-T细胞给予不同可利霉素药物浓度后的体外增殖情况。第0天将健康志愿者外周血中的CD3+T细胞分离纯化后以1.0×106个/孔接种于24孔板中，同时加入CD3抗体（600ng/ml）、CD28抗体（300ng/ml）以及重组人IL-2（10ng/ml）体外刺激培养3天后，感染慢病毒，分别制备CAR-T和TCR-T细胞（具体过程参见实施例2）。将CD3抗体（600ng/ml）、CD28抗体（300ng/ml）以及重组人IL-2（10ng/ml）替换为重组人IL-7（10ng/ml）和IL-15（5ng/ml），以DMSO为阴性对照，可利霉素浓度梯度设置为1.25μM、2.5μM和5μM，每组做三个复孔，体外扩增CAR-T/TCR-T细胞，在体外培养的第3、7、11和15天进行细胞计数，分别绘制CAR-T/TCR-T细胞增殖曲线。
实验结果参见图2，由实验结果可知可利霉素对CAR-T/TCR-T细胞体外增殖有抑制作用，其中5 μM组的抑制作用最为明显（****P ＜0.0001）。
现有技术CN113577086A（异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗免疫失调的药物中的应用）中提到，将可利霉素给药至小鼠，可利霉素在小鼠体内能够显著促进总T细胞(CD3阳性细胞)增加，其中，CD4和CD8阳性细胞都增加（参见专利CN113577086A的实施例4和附图11：外周血中CD3+细胞比例的柱状图）。可见，体内施加可利霉素对于未经过遗传改造的T细胞的作用效果是促进增殖。该作用趋势和本技术方案存在较大差异，按照该现有技术的报道，可利霉素的作用趋势在于对T细胞产生促进增殖的作用，而作为T细胞的遗传改造的CAR-T/TCR-T细胞，理论上也会受到来自可利霉素的促增殖作用。但是，发明人意外地发现，在体外对遗传改造后的CAR-T/TCR-T细胞施加不同浓度的可利霉素，均对CAR-T/TCR-T细胞的增殖产生了抑制作用，获得了预料不到的技术效果。
实际上，CAR-T/TCR-T细胞治疗方法需要对来自生物体的T细胞进行遗传改造和体外培养，在遗传改造和体外培养过程中，我们并不希望T细胞的增殖活性过强，否则，T细胞在体外刺激活化、病毒介导的CAR修饰及扩增过程中，持续受到胞内活化信号的刺激，其耗竭过程比正常T细胞快，而CAR-T/TCR-T细胞的快速耗竭将导致体内扩增维持时间变短，也就是回输到患者体内的CAR-T/TCR-T细胞活性变差，肿瘤细胞杀伤能力减弱，从而使病人对治疗反应不佳。所以，适当地抑制CAR-T/TCR-T细胞的体外增殖能力，对提升CAR-T/TCR-T疗法的效果非常有帮助。
发现可利霉素对于CAR-T/TCR-T细胞的抑制效果，可将可利霉素作为体外T细胞抑制剂，特别是体外CAR-T/TCR-T细胞抑制剂，应用于CAR-T/TCR-T细胞疗法中，在前期T细胞遗传改造和CAR-T/TCR-T细胞体外培养阶段使用，抑制CAR-T/TCR-T细胞过早活化以及过早耗竭，在将CAR-T/TCR-T细胞回输患者或者其他生物体时，将可利霉素撤去，CAR-T/TCR-T细胞的增殖抑制状态消除，CAR-T/TCR-T细胞可以在体内充分发挥肿瘤治疗效果。
实施例5：可利霉素提高CAR-T/TCR-T细胞体外培养中的CD4+/CD8+比例
为证明可利霉素对CAR-T/TCR-T细胞体外培养中CD4+/CD8+比例的维持作用，本实施例利用流式细胞仪检测CAR-T/TCR-T细胞给予不同可利霉素药物浓度后第7天的CD4+和CD8+T细胞比例。第0天将制备好的CAR-T/TCR-T细胞以1.0×106个/孔接种于24孔板中，以DMSO为阴性对照，可利霉素浓度梯度设置为1.25μM、2.5μM和5μM，同时加入重组人IL-7（10ng/ml）和IL-15（5ng/ml），每组做三个复孔。在体外培养的第7天利用流式细胞仪检测CAR-T/TCR-T细胞中CD4+和CD8+比例，进行统计学分析做图。
实验结果发现可利霉素1.25μM和2.5μM组可提高CAR-T/TCR-T细胞体外培养中CD4＋/CD8＋比例，其中2.5 μM组比例提高最明显（****P ＜ 0.001），而5 μM组与对照组相比未见明显差异（参见图3）。因此，适当可利霉素在CAR-T/TCR-T细胞体外培养过程中添加，除了可以减缓细胞增殖趋势防止细胞衰变之外，还可以适当提升CD4＋/CD8＋比例，这是现有技术未曾报道过的。在目前常规的CAR-T/TCR-T细胞制备流程中，T细胞需要在体外刺激，活化和扩增，由于CD8+T细胞的增殖速度明显快于CD4+T细胞，使得CD4+/CD8+比例降低，而CD4+/CD8+比例均衡性对T细胞发挥良好的抗肿瘤作用至关重要，有研究表明CD8+T细胞虽然具有直接的肿瘤杀伤作用，但如果缺少CD4+T细胞，会导致CD8+T细胞快速耗竭，功能减弱，影响CAR-T/TCR-T细胞在体内的扩增和抗肿瘤作用。在本技术方案中，我们可以看到，在体外培养CAR-T/TCR-T细胞时，如果不加入可利霉素（使用DMSO代替），CD4+/CD8+比例低至0.2-0.3左右，而加入1.25μM的可利霉素，可以使得CD4+/CD8+比例升高至0.4左右，加入2.5μM的可利霉素，可以使得CD4+/CD8+比例升高至0.6左右，适量的可利霉素加入，可以使得上述比例提升2倍左右，提升幅度非常大，通过维持CD4+/CD8+比例来实现CAR-T/TCR-T细胞治疗效果的提升，这也是发明人在实验研究之前未曾预料到的。并且，如果可利霉素的用量继续提升至5μM，则上述的提升效应消失。
现有技术CN113577086A（异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗免疫失调的药物中的应用）中提到，将可利霉素给药至小鼠，可利霉素在小鼠体内能够显著促进CD4和CD8阳性细胞都增加（参见专利CN113577086A的实施例4和附图8：外周血中CD4+/CD3+和CD8+/CD3+细胞比例的柱状图）。分析该图中空白组和可利霉素施加组的实验数据，空白组的CD4+/CD8+比例约为45%/30%；可利霉素施加组的CD4+/CD8+比例约为50%/35%；上述两组数据并不存在非常显著的差别。由此可见施加体内可利霉素对于普通未经过遗传改造的T细胞CD4+/CD8+比例并没有显著影响。并且，在体内CD4+/CD8+比例较高，是有利于T细胞发挥功效的。本领域技术人员由此可以推断，可利霉素对于调整T细胞的组成并没有显著影响，对遗传改造后的CAR-T/TCR-T细胞的CD4+/CD8+比例也很有可能没有影响。但是实际情况并非如我们推断的那样，如果在体外针对CAR-T/TCR-T细胞施加适当浓度的可利霉素，可以成倍数地促进CD4+/CD8+比例增加，获得预料不到的技术效果。在体外培养和遗传改造的过程中，由于CD8+细胞增殖速度快导致CD4+/CD8+比例下调严重（根据CN113577086A的实验数据，在体内普通T细胞的CD4+/CD8+比例维持在1.5左右，和图3的DMSO实验组存在显著差别），影响细胞的活性和治疗效果。而在体外培养CAR-T/TCR-T细胞过程中，适量施加可利霉素可以抑制比例下降趋势，一定程度上回复CD4+/CD8+比例，获得了预料不到的技术效果。
实施例6：可利霉素提高CAR-T/TCR-T细胞体外培养过程中TCM（中央记忆性T细胞群）比例
为证明可利霉素提高CAR-T/TCR-T细胞体外培养过程中TCM（中央记忆性T细胞群）比例，本实施例利用流式细胞仪分别检测CAR-T/TCR-T细胞给予不同可利霉素药物浓度后第7天CD4+和CD8+T细胞中TN（初始T细胞，CCR7+CD45RA+）、TCM（中央记忆性T细胞，CCR7-CD45RA+）、TEM（效应记忆性T细胞，CCR7-CD45RA-）和TE（效应性T细胞，CCR7-CD45RA+）。第0天将制备好的CAR-T/TCR-T以1.0×106个/孔接种于24孔板中，以DMSO为阴性对照，可利霉素浓度梯度设置为1.25μM、2.5μM和5μM，同时加入重组人IL-7（10ng/ml）和IL-15（5ng/ml），每组做三个复孔。在体外培养的第7天利用流式细胞仪检测CD4+和CD8+CAR-T/TCR-T细胞中CCR7和CD45RA的表达情况，其中TN为CCR7+CD45RA+、TCM为CCR7+CD45RA-、TEM为CCR7-CD45RA-、TE为CCR7-CD45RA+，将得到的流式数据进行统计学分析做图。
实验结果发现可利霉素1.25μM和2.5μM可提高CD4+和CD8+CAR-T/TCR-T细胞体外培养中TCM比例，其中2.5μM组TCM比例提高最明显（****P ＜ 0.0001），而5μM组与对照组相比未见明显差异（图4和图5）。T细胞根据其表面表达分子的不同，可分为初始T细胞、中央记忆性T细胞、效应记忆性T细胞和效应性T细胞，在以往的CAR-T/TCR-T细胞疗法中，发现中央记忆性T细胞群在体内具有良好的增殖效果和长效的抗肿瘤作用，并且有研究发现与健康人相比，肿瘤病人T细胞中中央记忆性T细胞比例较低，而效应记忆性T细胞比例较高如果在体外CAR-T/TCR-T细胞制备过程中提高中央记忆性T细胞比例，将会提高CAR-T/TCR-T细胞的体内肿瘤治疗效果。
可利霉素在CAR-T/TCR-T细胞体外培养的过程中施加，可以有效提升中央记忆性T细胞比例，这是现有技术未曾报道的，可利霉素通过多种方式提升CAR-T/TCR-T细胞的治疗效果。
实施例7：可利霉素增强CAR-T/TCR-T细胞体外肿瘤杀伤能力
为证明可利霉素增强CAR-T/TCR-T细胞体外肿瘤杀伤能力，本实施例利用体外肿瘤细胞和CAR-T/TCR-T细胞共培养实验检测CAR-T/TCR-T细胞给予不同可利霉素药物浓度后第7天对肿瘤细胞的体外杀伤能力。第0天将制备好的CAR-T/TCR-T以1.0×106个/孔接种于24孔板中，以DMSO为阴性对照，可利霉素浓度梯度设置为1.25μM、2.5μM和5μM，同时加入重组人IL-7（10ng/ml）和IL-15（5ng/ml）体外扩增培养CAR-T细胞至第七天，将表达CD19抗原的Raji肿瘤细胞系分别与不同可利霉素药物浓度处理后的CAR-T细胞（可利霉素撤药后）按效靶比1:1进行共培养，即在48孔板中分别铺Raji细胞和CAR-T细胞2.0×105个，48h后检测Raji细胞数量；将表达NY-ESO1抗原的A375肿瘤细胞系分别与不同可利霉素药物浓度处理后的TCR-T细胞按效靶比1:1进行共培养，即在48孔板中分别铺A375细胞和TCR-T细胞2.0×105个，48h后检测A375细胞数量，计算出不同组TCR-T细胞的肿瘤裂解率。
实验结果发现可利霉素可增强CAR-T/TCR-T细胞体外肿瘤杀伤能力，其中2.5μM组效果最明显（**P＜0.01）（图6）。
实施例8：可利霉素增强CAR-T/TCR-T细胞的细胞因子分泌水平
为证明可利霉素在CAR-T/TCR-T细胞体外肿瘤杀伤过程中对细胞因子分泌的影响，本实施例利用流式细胞仪检测CAR-T/TCR-T细胞和肿瘤细胞共培养实验48h后，CAR-T/TCR-T细胞干扰素γ（IFNG）、肿瘤坏死因子α（TNFA）、颗粒酶B（GZMB）和穿孔素1（PRF1）的胞内表达水平。将Raji肿瘤细胞系分别与不同可利霉素药物浓度处理后的CAR-T细胞按效靶比1:1进行共培养，即在48孔板中分别铺Raji细胞和CAR-T细胞2.0×105个；将A375肿瘤细胞系分别与不同可利霉素药物浓度处理后的TCR-T细胞按效靶比1:1进行共培养，即在48孔板中分别铺A375细胞和TCR-T细胞2.0×105个，48 h流式细胞仪检测CD4+和CD8+CAR-T/TCR-T细胞中INFG、TNFA、GZMB和PRF1的表达水平。
实验结果发现可利霉素1.25μM和2.5μM可提高CAR-T/TCR-T细胞的细胞因子分泌水平，其中，2.5μM组提高最明显，而5μM组与对照组相比未见明显差异（图7和图8）。
实施例9：可利霉素下调CAR-T/TCR-T细胞免疫抑制性受体分子的表达水平
为证明可利霉素在CAR-T/TCR-T细胞体外肿瘤杀伤过程中对免疫抑制性受体分子表达水平的影响，本实施例利用流式细胞仪检测CAR-T/TCR-T细胞和肿瘤细胞共培养实验48h后，CAR-T/TCR-T细胞PD1、LAG3、TIM3的表达水平。将Raji肿瘤细胞系分别与不同可利霉素药物浓度处理后的CAR-T细胞按效靶比1:1进行共培养，即在48孔板中分别铺Raji细胞和CAR-T细胞2.0×105个；将A375肿瘤细胞系分别与不同可利霉素药物浓度处理后的TCR-T细胞按效靶比1:1进行共培养，即在48孔板中分别铺Raji细胞和TCR-T细胞2.0×105个，48 h流式细胞仪检测CAR-T/TCR-T细胞中PD1、LAG3、TIM3的表达水平。
实验结果发现可利霉素1.25μM、2.5μM和5μM可不同程度下调CAR-T/TCR-T细胞的免疫抑制性受体分子的表达水平，其中2.5μM组效果最明显（图9）。
实施例10：可利霉素增强CAR-T细胞对血液瘤的体内治疗作用
为证明可利霉素增强CAR-T细胞对血液瘤的体内治疗作用，本实施例利用NSG小鼠血液肿瘤模型检测CAR-T/TCR-T细胞给予不同可利霉素药物浓度后第7天对血液肿瘤细胞的体内杀伤能力。第0天将健康志愿者外周血中的CD3+T细胞分离纯化后以1.0×106个/孔接种于24孔板中，同时加入CD3抗体（600 ng/ml）、CD28抗体（300 ng/ml）以及重组人IL-2（10ng/ml）体外刺激培养3天后，感染靶向CD19的CAR慢病毒，第5天将CAR-T细胞给予可利霉素处理（工作浓度为2.5μM，参见图1），体外扩增培养CAR-T细胞至第14天（可利霉素处理时间共9天），取处理过的CAR-T细胞进行体内实验（CM treated CAR-T组）。以不加可利霉素的CAR-T细胞为阴性对照（使用DMSO替代可利霉素，CAR-T组），以未修饰T细胞作为空白对照（NC-T组）。其中，作为阴性对照的未加可利霉素处理的CAR-T细胞处理流程同图1，只是使用DMSO替代可利霉素；未修饰T细胞体外培养流程同图1，只是未经病毒感染处理。将Raji-luc细胞（表达荧光素酶）以1.0×106个/只经尾静脉接种于NSG小鼠体内，接种后第7天利用活体成像仪检测肿瘤细胞的体内分布情况，将小鼠分为3组，每组5只，在Raji-luc细胞注射后第7天以5.0×106个/只分别经尾静脉回输未修饰T细胞、CAR-T细胞和可利霉素处理的CAR-T细胞，在第14天和第21天利用活体成像仪检测肿瘤细胞的体内生长情况。
实验结果发现未修饰T细胞组小鼠体内肿瘤细胞增殖速度很快，第21天只剩一只小鼠存活，其余均死亡，CAR-T细胞组可抑制肿瘤生长但清除不完全，可利霉素处理的CAR-T细胞组小鼠体内肿瘤细胞抑制作用明显优于CAR-T细胞组，第14天和第21天未检测到肿瘤细胞荧光信号，表明可利霉素可增强CAR-T细胞对血液瘤的体内杀伤作用，提高CAR-T的体内治疗效果（图10）。
实施例11：可利霉素增强CAR-T细胞对实体肿瘤的体内治疗作用
为证明可利霉素增强CAR-T细胞对实体肿瘤的体内治疗作用，本实施例利用NSG小鼠皮下瘤模型检测CAR-T细胞给予不同可利霉素药物浓度后第7天对实体瘤细胞的体内杀伤能力。第0天将健康志愿者外周血中的CD3+T细胞分离纯化后以1.0×106个/孔接种于24孔板中，同时加入CD3抗体（600 ng/ml）、CD28抗体（300 ng/ml）以及重组人IL-2（10 ng/ml）体外刺激培养3天后，感染靶向CD19的CAR慢病毒，第5天将CAR-T细胞给予可利霉素处理（工作浓度为2.5μM），体外扩增培养CAR-T细胞至第14天（可利霉素处理时间共9天），取处理过的CAR-T细胞进行体内实验（CM treated CAR-T组）。CAR-T组和NC-T组的情况同实施例10。将A375-CD19-luc稳转株（同时表达CD19抗原和荧光素酶）以1.0×106个/只皮下接种于NSG小鼠右上背部，接种后第7天利用活体成像仪检测肿瘤细胞的体内分布情况，将小鼠分为3组，每组5只，在A375-CD19-luc细胞注射后第7天以5.0×106个/只分别经尾静脉回输未修饰T细胞、CAR-T细胞和可利霉素处理的CAR-T细胞，在第14天和第21天利用活体成像仪检测肿瘤细胞的体内生长情况。
实验结果发现未修饰T细胞组小鼠体内肿瘤细胞增殖速度很快，CAR-T细胞组可抑制肿瘤生长但第21天瘤块体积和第14天相比有增大的趋势，可利霉素处理的CAR-T细胞组小鼠体内肿瘤细胞抑制作用明显优于CAR-T细胞组，第21天肿瘤细胞体积显著缩小，表明可利霉素可增强CAR-T细胞对实体瘤的体内杀伤作用，提高CAR-T 的体内治疗效果（图11）。
实施例12：可利霉素增强TCR-T细胞对实体肿瘤的体内治疗作用
为证明可利霉素增强TCR-T细胞对实体肿瘤的体内治疗作用，本实施例利用NSG小鼠皮下瘤模型检测TCR-T细胞给予不同可利霉素药物浓度后第7天对实体瘤细胞的体内杀伤能力。第0天将健康志愿者外周血中的CD3+T细胞分离纯化后以1.0×106个/孔接种于24孔板中，同时加入CD3抗体（600 ng/ml）、CD28抗体（300 ng/ml）以及重组人IL-2（10 ng/ml）体外刺激培养3天后，感染靶向NY-ESO1的TCR慢病毒，第5天将TCR-T细胞给予可利霉素处理（工作浓度为2.5μM），体外扩增培养TCR-T细胞至第14天（可利霉素处理时间共9天），取处理过的TCR-T细胞进行体内实验（CM treated CAR-T组）。以不加可利霉素的TCR-T细胞为阴性对照（使用DMSO替代），以未修饰T细胞作为空白对照。其中，作为阴性对照的未加可利霉素处理的TCR-T细胞处理流程同图1，只是使用DMSO替代可利霉素；未修饰T细胞体外培养流程同图1，只是未经病毒感染处理。将A375-luc稳转株（表达NY-ESO1抗原和荧光素酶）以1.0×106个/只皮下接种于NSG小鼠右上背部，接种后第7天利用活体成像仪检测肿瘤细胞的体内分布情况，将小鼠分为3组，每组5只，在A375-luc细胞注射后第7天以5.0×106个/只分别经尾静脉回输未修饰T细胞、TCR-T细胞和可利霉素处理的TCR-T细胞，在第14天和第21天利用活体成像仪检测肿瘤细胞的体内生长情况。
实验结果发现未修饰T细胞组小鼠体内肿瘤细胞增殖速度很快，TCR-T细胞组可抑制肿瘤生长但第21天瘤块体积和第14天相比有增大的趋势，可利霉素处理的TCR-T细胞组小鼠体内肿瘤细胞抑制作用明显优于TCR-T细胞组，第21天肿瘤细胞体积显著缩小，表明可利霉素可增强TCR-T细胞对实体瘤的体内杀伤作用，提高TCR-T 的体内治疗效果（图12）。
实施例13：可利霉素提高CAR-T细胞回输体内的存活率
为证明可利霉素提高CAR-T细胞回输体内的存活率，本实施例利用NSG小鼠皮下瘤模型检测可利霉素对CAR-T细胞体内存活率的影响。将A375-CD19-luc稳转株（同时表达CD19抗原和荧光素酶）以1.0×106个/只皮下接种于NSG小鼠右上背部，接种后第7天利用活体成像仪检测肿瘤细胞的体内分布情况，将小鼠分为3组，每组5只，以5.0×106个/只分别经尾静脉回输未修饰T细胞、CAR-T细胞和可利霉素处理的CAR-T细胞，在第21天利用流式细胞仪检测3组小鼠肿瘤内、脾脏和骨髓中人源CD3+T细胞比例。
实验结果发现与未修饰T细胞组和普通CAR-T细胞组相比，可利霉素处理的CAR-T细胞组小肿瘤内、脾脏和骨髓中T细胞比例明显增高，表明可利霉素可增强CAR-T细胞回输后在体内的存活率（图13）。
实施例14：可利霉素提高TCR-T细胞回输体内的存活率
为证明可利霉素提高TCR-T细胞回输体内的存活率，本实施例利用NSG小鼠皮下瘤模型检测可利霉素对TCR-T细胞体内存活率的影响。将A375-luc稳转株（同时表达NY-ESO1抗原和荧光素酶）以1.0×106个/只皮下接种于NSG小鼠右上背部，接种后第7天利用活体成像仪检测肿瘤细胞的体内分布情况，将小鼠分为3组，每组5只，以5.0×106个/只分别经尾静脉回输未修饰T细胞、TCR-T细胞和可利霉素处理的TCR-T细胞，在第21天利用流式细胞仪检测3组小鼠肿瘤内、脾脏和骨髓中人源CD3+T细胞比例。
实验结果发现与未修饰T细胞组和普通TCR-T细胞组相比，可利霉素处理的TCR-T细胞组小肿瘤内、脾脏和骨髓中T细胞比例明显增高，表明可利霉素可增强TCR-T细胞回输后在体内的存活率（图14）。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (4)

1.可利霉素在制备遗传改造T细胞的耗竭抑制剂的应用，其特征在于，所述遗传改造T细胞为CAR-T细胞或者TCR-T细胞；
可利霉素添加于遗传改造T细胞的体外培养体系中；所述体外培养体系为含有可利霉素、IL-7、IL-15、青链霉素双抗、FBS的淋巴细胞培养基；可利霉素在体外培养体系中的工作浓度为1.25μM-5μM。
2.可利霉素在制备肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤治疗药物包括经过体外培养的遗传改造T细胞，所述遗传改造T细胞为CAR-T细胞或者TCR-T细胞；体外培养的环境中含有可利霉素、IL-7、IL-15、青链霉素双抗、FBS的淋巴细胞培养基；可利霉素的工作浓度为1.25μM-5μM；所述肿瘤为血液瘤或者实体瘤。
3. 根据权利要求2所述的可利霉素在制备肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述可利霉素用于减缓遗传改造T细胞的耗竭，提升CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的比例，以及提升中央记忆性T细胞群比例。
4.可利霉素在制备体外T细胞增殖活化抑制剂中的应用，其特征在于，可利霉素添加于遗传改造T细胞的体外培养体系中；所述体外培养体系为含有可利霉素、IL-7、IL-15、青链霉素双抗、FBS的淋巴细胞培养基；可利霉素在体外培养体系中的工作浓度为1.25μM-5μM；所述遗传改造T细胞为CAR-T细胞或者TCR-T细胞。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017127755A1 (en) * 2016-01-20 2017-07-27 Fate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immune cell modulation in adoptive immunotherapies
WO2021068910A1 (zh) * 2019-10-11 2021-04-15 沈阳福洋医药科技有限公司 一种抗肿瘤药物的筛选靶点、应用及筛选方法
CN113491699A (zh) * 2020-04-01 2021-10-12 中国科学院上海药物研究所 霉酚酸或含霉酚酸的组合制剂在抗冠状病毒中的应用
CN113577086A (zh) * 2020-04-30 2021-11-02 沈阳福洋医药科技有限公司 异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗免疫失调的药物中的应用
CN115322968A (zh) * 2022-09-21 2022-11-11 东莞市东南部中心医院 一种car-t细胞的培养体系及应用和培养方法
CN116790505A (zh) * 2023-05-16 2023-09-22 浙江大学医学院附属第一医院 一种用于car-t细胞培养的培养基及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017127755A1 (en) * 2016-01-20 2017-07-27 Fate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immune cell modulation in adoptive immunotherapies
WO2021068910A1 (zh) * 2019-10-11 2021-04-15 沈阳福洋医药科技有限公司 一种抗肿瘤药物的筛选靶点、应用及筛选方法
CN113491699A (zh) * 2020-04-01 2021-10-12 中国科学院上海药物研究所 霉酚酸或含霉酚酸的组合制剂在抗冠状病毒中的应用
CN113577086A (zh) * 2020-04-30 2021-11-02 沈阳福洋医药科技有限公司 异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗免疫失调的药物中的应用
WO2021219113A1 (zh) * 2020-04-30 2021-11-04 沈阳福洋医药科技有限公司 异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗免疫失调的药物中的应用
CN115322968A (zh) * 2022-09-21 2022-11-11 东莞市东南部中心医院 一种car-t细胞的培养体系及应用和培养方法
CN116790505A (zh) * 2023-05-16 2023-09-22 浙江大学医学院附属第一医院 一种用于car-t细胞培养的培养基及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Anti-Tumor Effects of Carrimycin and Monomeric Isovalerylspiramycin I on Hepatocellular Carcinoma in Vitro and in Vivo;Yong Jin;Frontiers in Pharmacology;全文 *
Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15;Yang Xu;Blood;全文 *
Pancreatic tumor eradication via selective Pin1 inhibition in cancer-associated fibroblasts and T lymphocytes engagement;Jiaye Liu;Nat Commun;全文 *
可利霉素药理活性研究进展;夏明钰;中国抗生素杂志;全文 *

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