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CN116887868A - 达农病的治疗 - Google Patents

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CN116887868A
CN116887868A CN202180092975.XA CN202180092975A CN116887868A CN 116887868 A CN116887868 A CN 116887868A CN 202180092975 A CN202180092975 A CN 202180092975A CN 116887868 A CN116887868 A CN 116887868A
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fold
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J·M·特雷韦霍
G·萨
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Spaceship Seven LLC
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Abstract

本发明提供了用于治疗受试者中的达农病的方法，所述受试者被鉴定为患有达农病或处于达农病的风险中并且/或者具有在LAMP‑2基因的一种或多种同种型中的失活突变。该方法可以包括向受试者施用治疗有效量的包含衣壳和载体基因组的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，其中所述载体基因组包含编码LAMP‑2蛋白、优选LAMP‑2B蛋白的多核苷酸序列。

Description

达农病的治疗
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年12月7日提交且名称为“达农病的治疗(Treatment of DanonDisease)”的美国临时专利申请号63/122,249的优先权，所述美国临时专利申请以引用的方式整体并入本文。
序列表
该申请经由EFS-Web以电子方式提交，并且包括以电子方式提交的以.txt格式的序列表。.txt文件含有名称为“ROPA_023_01WO_SeqList_ST25.txt”的序列表，其于2021年12月7日创建且具有～62千字节的大小。该.txt文件中包含的序列表是说明书的部分，并且以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明一般涉及腺相关病毒(AAV)基因疗法在达农病(Danon disease)中的临床用途。
背景技术
溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2，也称为CD107b)是一种编码溶酶体相关膜糖蛋白的基因。该基因的可变剪接产生三种同种型：LAMP-2A、LAMP-2B和LAMP-2C。LAMP-2的功能缺失突变与人疾病包括达农病相关，所述达农病是与自噬受损相关的家族性心肌病。
国际专利申请公开号WO2017127565A1公开了如Hashem等人，Stem Cells.2015年7月；33(7):2343-50中所述，在源自具有LAMP-2突变的患者的人诱导多能干细胞(hiPSC)中LAMP-2的过表达，导致减少的氧化性应激水平和细胞凋亡性细胞死亡，确认了LAMP-2B在疾病病理生理学中的重要性。
本领域仍然需要与治疗人受试者中的达农病有关的方法和组合物。本公开内容提供了此类组合物方法。
发明内容
在一个方面，本公开内容提供了用于治疗受试者中的达农病的方法，所述受试者被鉴定为患有达农病或处于达农病的风险中并且/或者具有在LAMP-2基因的一种或多种同种型中的失活突变，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含衣壳和载体基因组的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，其中所述载体基因组包含编码LAMP-2蛋白、优选LAMP-2B蛋白的多核苷酸序列。
在一些实施例中，治疗有效量为小于约2×1014个载体基因组(vg)/千克(kg)受试者的体重。
在一些实施例中，治疗有效量为小于约1.5×1014vg/kg受试者的体重。
在一些实施例中，治疗有效量为小于约1×1014vg/kg受试者的体重。
在一些实施例中，治疗有效量为至少约1×1012vg/kg受试者的体重。
在一些实施例中，治疗有效量为至少约1×1013vg/kg受试者的体重。
在一些实施例中，治疗有效量为约6.7×1013vg/kg受试者的体重。
在一些实施例中，治疗有效量为约1.1×1014vg/kg受试者的体重。
在一些实施例中，治疗有效量为约2.0×1014vg/kg受试者的体重。
在一些实施例中，该方法还包括向受试者施用有效量的他克莫司。
在一些实施例中，该方法还包括向受试者施用有效量的利妥昔单抗。
在一些实施例中，该方法包括向受试者施用有效量的他克莫司，并且向受试者施用有效量的利妥昔单抗。
在一些实施例中，该方法包括向受试者施用有效量的依库珠单抗。
在一些实施例中，该方法还包括向受试者施用有效量的利妥昔单抗；向受试者施用有效量的他克莫司；和/或向受试者施用有效量的依库珠单抗。
在一些实施例中，受试者处于补体激活的后遗症的风险中，所述后遗症例如非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、任选地导致可逆性血小板减少症和/或急性肾损伤(AKI)的aHUS。
在一些实施例中，该方法还包括向受试者施用有效量的皮质类固醇。
在一些实施例中，该方法还包括在施用有效量的他克莫司之前，向受试者施用有效量的皮质类固醇。
在一些实施例中，受试者是未成年受试者，任选地具有8-14岁和/或15-17岁的年龄。
在一些实施例中，受试者是儿童受试者，任选地具有0-8岁的年龄。
在一些实施例中，受试者是成人受试者，任选地具有18岁或以上的年龄。
在一些实施例中，治疗有效量的AAV是静脉内施用的。
在一些实施例中，治疗有效量的AAV通过直接心脏注射，任选地通过颈静脉内或Swan-Ganz导管进行施用。
在一些实施例中，治疗有效量的AAV通过腹膜内注射进行施用。
在一些实施例中，该方法导致以下中的一种或多种：a)通过AAV的心肌细胞和/或骨骼肌转导；b)任选地在心肌细胞和/或骨骼肌中，编码LAMP-2B的外源核糖核酸多核苷酸的表达和/或外源LAMP-2B蛋白的表达；c)任选地通过取样的心内膜心肌活检的组织学确定的，一种或多种达农病相关的组织学异常，任选地自噬泡或肌原纤维紊乱的校正或改善；d)心肌细胞分子标记物表达的校正或改善；和/或e)心肌细胞组织学的校正或改善。
在一些实施例中，AAV包含表达盒，所述表达盒包含与启动子可操作地连接的编码LAMP-2B蛋白的多核苷酸序列，并且其中所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:2共享至少95％的同一性，并且/或者所述LAMP-2B蛋白质与SEQ ID NO:1共享至少95％的同一性。
在一些实施例中，多核苷酸序列包含SEQ ID NO:2或由其组成，并且/或者LAMP-2B蛋白包含SEQ ID NO:1或由其组成。
在一些实施例中，启动子是CAG启动子。
在一些实施例中，启动子包含与SEQ ID NO:22共享至少95％的同一性的增强子/启动子区。
在一些实施例中，增强子/启动子区包含SEQ ID NO:22或由其组成。
在一些实施例中，表达盒按5'至3'次序包含：
(a)包含SEQ ID NO:22的增强子/启动子区；
(b)编码LAMP-2B蛋白的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:3；
(c)包含SEQ ID NO:27的3'UTR序列；和/或
(d)包含SEQ ID NO:7的聚腺苷酸化序列。
在一些实施例中，表达盒由以下侧接：(i)包含SEQ ID NO:11的5'ITR；以及(ii)包含SEQ ID NO:12的3'ITR。
在一些实施例中，表达盒包含SEQ ID NO:8。
在一些实施例中，衣壳是AAV9衣壳。
在一些实施例中，AAV9衣壳包含一种或多种衣壳蛋白，所述一种或多种衣壳蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸1至736、SEQ ID NO:28的氨基酸138至736、或SEQ ID NO:28的氨基酸203至736。
在其它方面，本公开内容提供了用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物。用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物包含治疗有效量的包含衣壳和载体基因组的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，其中所述载体基因组包含编码LAMP-2蛋白、优选LAMP-2B蛋白的多核苷酸序列。
在一些实施例中，治疗有效量为小于约2×1014个载体基因组(vg)/千克(kg)受试者的体重。
在一些实施例中，治疗有效量为小于约1.5×1014vg/kg。
在另一个方面，本公开内容提供了试剂盒，其包含本公开的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物；以及治疗达农病的使用说明书。
该试剂盒还可以包括包含以下中的一种或多种的一种或多种单位剂量、药物组合物或组合物：利妥昔单抗；他克莫司；依库珠单抗；和皮质类固醇。
本发明的进一步方面和实施例在下述详细描述中公开。
附图说明
图1描绘了用于生成本公开内容中的腺相关病毒(AAV)颗粒的pAAV-LAMP2B转移质粒的图解。AAV颗粒含有由以下侧接的表达盒：源自AAV2的反向末端重复(ITR)元件，由巨细胞病毒立即早期(CMV IE)增强子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、鸡β-肌动蛋白和兔珠蛋白内含子(CBA/RbG内含子)组成的CAG启动子，LAMP2B转基因，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)和兔珠蛋白聚腺苷酸化信号(RGpA)。
图2A-2B描绘了用PBS或不同剂量的AAV9.LAMP2B(1×1013、5×1013和1×1014vg/kg)注射的WT或LAMP2 KO小鼠中的心脏组织分析图。图2A显示了使用qPCR确定的载体拷贝数/核(VCN/核)。图2B显示了LAMP2B mRNA水平的定量RT-PCR(通过GAPDH标准化的相对于PBS的倍数变化)。引物检测人和小鼠LAMP2B mRNA两者。值为平均值±SEM。相对于用PBS注射的KO小鼠，##p<0.01，###p<0.0001。
图3A-3C描绘了心脏组织中的人LAMP2和LC3-II蛋白质表达的图。图3A显示了对于小鼠(mLAMP2)和人LAMP2(hLAMP2)、LC3-II(关于自噬的标记物)，通过蛋白质印迹评估的来自用PBS或增加剂量的AAV9.LAMP2B(1×1013、5×1013和1×1014vg/kg)注射的Lamp2 KO小鼠和首次用于实验的对照WT小鼠的心脏的蛋白质裂解物，GAPDH用作上样对照。图3B显示了针对GAPDH标准化的hLAMP2蛋白的定量(使用ImageJ的密度测定法)。图3C显示了针对GAPDH标准化的LC3-II的定量(使用ImageJ的密度测定法)。值为平均值±SEM。相对于WT，**p<0.01；相对于用PBS注射的KO小鼠，#p<0.05，##p<0.01。
图4描绘了心脏组织的透射电子显微镜检查图像，其显示了液泡(如通过黄色箭头表示的自噬结构)。来自用PBS或者以5×1013或1×1014vg/kg的AAV9.LAMP2B注射的WT型或Lamp2 KO小鼠的代表性图像。比例尺在上图中为2μm，且在下图中为0.54μm。
图5描绘了用6.7×1013GC/kg AAV9.LAMP2B治疗的患者中，每个二倍体基因组的载体DNA拷贝的图。在基线时、在治疗之后的第8周、第6个月和第12个月，对患者1001、1002和1005进行分析。
图6描绘了来自患者1002的心脏组织的免疫组织化学图像，其显示了心脏LAMP2B表达。来自剂量前，阳性对照，或者用6.7×1013GC/kg AAV9.LAMP2B治疗的患者在治疗之后的第8周、第6个月和第12个月的代表性图像。比例尺为100μm。
图7A-7C描绘了关于患者1001(图7A)、患者1002(图7B)和患者1005(图7C)，脑利钠肽(BNP)相对于基线的倍数变化图。患者用6.7×1013GC/kg AAV9.LAMP2B进行治疗。在治疗之后的第8周、第6个月和第12个月，分析BNP倍数变化。
图8描绘了在其中并未鉴定DLT的情形下，研究群组中的入选顺序的图解。
图9描绘了在给定群组内的单个DLT的背景下，任何群组中的入选顺序的图解。如果第二个患者经历DLT，则将停止群组内的入选。三角形/感叹号指示关于患者2的DLT发生。
图10A-10D是描绘AAV9.LAMP2B研究评价和治疗事件表的图表。缩写：AAV9：腺相关病毒血清型9；ADA：抗药物抗体；aPTT：活化部分凝血活酶时间；BNP：脑利钠肽；C3：补体3；C4：补体4；CBC：全血细胞计数；CK-MB：肌酐激酶-MB；D：天；d/c：停药；ECG：心电图；HBV：乙型肝炎病毒；HCV：丙型肝炎病毒；HIV：人免疫缺陷病毒；IgG：免疫球蛋白G；IgM：免疫球蛋白M；IP：研究产品；IV：静脉内输注；LFT：肝功能测试；M：月；MRI：磁共振成像；PMBC：外周血单核细胞；PRO：患者报告结局；PT：凝血酶原时间；QOL：生活质量；sC5b-9：血清膜攻击复合物；TAT：凝血酶-抗凝血酶复合物；VO2：最大耗氧量；W：周。
图11A-11B描绘了在用PBS或增加剂量的AAV9.LAMP2B(1×1013、5×1013和1×1014vg/kg)注射的Lamp2 KO小鼠或首次用于实验的对照WT小鼠中，通过侵入性左心室内压(分别为dP/dt最大和dP/dt最小)分析的心脏收缩力(图11A)和心脏舒张(图11B)的图。
图12描绘了心脏组织的透射电子显微镜检查图像，其显示了液泡(如通过黄色箭头表示的自噬结构)。来自用PBS或者以5×1013、1×1014vg/kg或2×1014vg/kg的AAV9.LAMP2B注射的WT型或Lamp2 KO小鼠的代表性图像。比例尺在上图中为2μm，且在下图中为0.6μm。
图13A-13B描绘了在用PBS或增加剂量的AAV9.LAMP2B(1×1013、5×1013、1×1014和2×1014vg/kg)注射的Lamp2 KO小鼠或首次用于实验的对照WT小鼠中，通过有创左血流动力学(分别为dP/dt最大和dP/dt最小)分析的心脏收缩力(图13A)和心脏舒张(图13B)的图。
图14A-14B描绘了在用以低剂量的RP-A501处理后，通过免疫组织化学的LAMP2蛋白质表达(图14A)以及通过电子显微镜检查的细胞形态学(图14B)。显示了来自患者1005的来自室间隔活检的代表性图像。
图15A描绘了在低剂量和高剂量患者两者中，在超声心动图上的心室肥大的重塑，伴随壁厚度的减少或稳定。所有超声心动图参数都来自通过单个阅读者进行的当地实验室评价。
图15B描绘了在低剂量和高剂量患者两者中，左心室(LV)射血分数(EF)和壁厚度的稳定或改善。所有超声心动图参数都来自通过单个阅读者进行的当地实验室评价。
图15C描绘了有创血流动力学，其证实了在低剂量和高剂量患者中，如通过肺毛细血管楔压测量的舒张功能障碍(LV充盈压)的长期稳定或改善。
图15D显示了在高剂量和低剂量患者两者中的血流动力学稳定或收缩功能的改善。
具体实施方式
本公开内容提供了涉及治疗人受试者中的达农病的方法和组合物。本发明人已证实了用设计为表达LAMP-2的LAMP-2B同种型的腺相关病毒(AAV)成功治疗人受试者中的达农病。AAV可以与用皮质类固醇、他克莫司、利妥昔单抗和/或依库珠单抗的治疗结合进行施用；并且AAV可以以不同剂量进行施用。如本文所公开的，在大约6.7×1013vg/kg或更低至大约2.0×1014vg/kg或更高范围内的剂量在达农病受试者中可能是安全和有效的。
载体序列
人LAMP-2B的野生型多肽序列(SEQ ID NO:1)和编码人LAMP-2B的野生型多核苷酸序列(SEQ ID NO:2)分别为：
本文公开的是修饰的多核苷酸序列，其编码溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)的同种型或其功能变体。在某些实施例中，与编码LAMP-2的同种型的野生型多核苷酸相比，修饰的多核苷酸序列包含下述修饰中的一种或多种：密码子优化、CpG耗竭、隐蔽剪接位点的去除或替代开放读码框(ORF)的数目减少。在一些实施例中，修饰的多核苷酸编码LAMP-2A、LAMP-2B、LAMP-2C或这些同种型中任一种的功能变体。在实施例中，本公开内容提供了编码LAMP-2B或其功能变体的多核苷酸序列或转基因，其包含与SEQ ID NO:2相比的一个或多个核苷酸取代。在实施例中，转基因与选自SEQ ID NO:3-5的序列共享至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或完全同一性。本公开内容提供了编码LAMP-2B的至少三个说明性变体转基因序列(SEQ ID NO:3-5)：
在一个实施例中，转基因与选自SEQ ID NO:2-5的序列共享至少95％的同一性。在一个实施例中，转基因与选自SEQ ID NO:2-5的序列共享至少99％的同一性。在一个实施例中，转基因包含选自SEQ ID NO:2-5的序列。在一个实施例中，转基因与SEQ ID NO:3共享至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或完全同一性。在一个实施例中，转基因与SEQ ID NO:4共享至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或完全同一性。在一个实施例中，转基因与SEQ ID NO:5共享至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或完全同一性。
在一些实施例中，转基因与SEQ ID NO:2-5中任何一个的子序列相似或等同。在一些实施例中，转基因包含SEQ ID NO:2-5中任何一个的子序列。在各个实施例中，子序列可以包含完整序列中的任何一组连续核苷酸(nt)，其长度为至少约50nt、至少约100nt、至少约150nt、至少约250nt、至少约200nt、至少约350nt、至少约450nt、至少约400nt、至少约450nt、至少约550nt、至少约600nt、至少约650nt、至少约600nt、至少约650nt、至少约700nt、至少约750nt、至少约800nt、至少约850nt、至少约900nt、至少约950nt、或至少约1000nt。
在一些实施例中，转基因与包含SEQ ID NO:3-5中任何一个的核苷酸1-500、250-750、500-1000或750-1240的子序列共享至少95％的同一性。在一个实施例中，转基因与包含SEQ ID NO:3-5中任何一个的核苷酸1-500、250-750、500-1000或750-1240的子序列共享至少99％的同一性。在一个实施例中，转基因包括包含SEQ ID NO:2-5中任何一个的核苷酸1-500、250-750、500-1000或750-1240的序列。在实施例中，转基因与包含SEQ ID NO:2-5中任何一个的核苷酸1-500、250-750、500-1000或750-1240的子序列共享至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或完全同一性。在实施例中，转基因与包含SEQ ID NO:3的核苷酸1-500、250-750、500-1000或750-1240的子序列共享至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或完全同一性。在实施例中，转基因与包含SEQ ID NO:3的核苷酸1-500、250-750、500-1000或750-1240的子序列共享至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或完全同一性。
在某些实施例中，转基因编码LAMP-2的各种同种型中的任一种，包括LAMP-2A、LAMP-2B或LAMP-2C中的任一种，或者这些同种型中的任一种的功能片段或变体。因此，在特定实施例中，表达盒是编码LAMP-2A、LAMP-2B或LAMP-2C中的任一种或者其功能片段或变体的优化的多核苷酸序列，其包含与相应的野生型多核苷酸序列相比的一种或多种修饰，包括选自以下的一种或多种修饰：编码LAMP-2A、LAMP-2B或LAMP-2C的转基因序列的密码子优化；表达盒或转基因序列含有比其相应的野生型序列更少的CpG位点；表达盒或转基因序列含有比其相应的野生型序列更少的CpG位点；表达盒或转基因序列含有比其相应的野生型序列更少的隐蔽剪接位点；和/或表达盒或转基因序列含有比其相应的野生型序列更少的开放读码框。在特定实施例中，优化的序列对于人细胞中的增加表达进行优化。编码LAMP-2A和LAMP-2C同种型的野生型人多核苷酸序列分别在SEQ ID NO:29和30中阐述。人LAMP-2A和LAMP-2C蛋白的野生型序列分别在SEQ ID NO:34和35中阐述。野生型LAMP-2同种型的序列和编码序列也是可公开获得的。虽然说明书描述了关于LAMP-2B的具体实施例，但应理解，LAMP-2A或LAMP-2C可以可替代地用于每个实施例中。
野生型LAMP-2A(SEQ ID NO:29)和野生型LAMP-2C(SEQ ID NO:30)的编码序列跨越至少核苷酸1–1080与野生型LAMP-2B(SEQ ID NO:2)的编码序列是100％等同的。相应地，本领域技术人员很容易认识到，通过将LAMP-2A(SEQ ID NO:29)或野生型LAMP-2C(SEQ IDNO:30)的3'端(核苷酸1081-端部)取代LAMP-2B(例如，SEQ ID NO:3-5中任一个的优化的LAMP-2B)的核苷酸1081–1233，本文公开的转基因、表达盒和载体可以适于表达LAMP-2的这些同种型。例如，本发明的实施例利用优化的LAMP-2B基因序列SEQ ID NO:3-5的核苷酸1-1080，其分别为SEQ ID NO:31-33。
在一个实施例中，转基因与选自SEQ ID NO:31-33的序列共享至少95％的同一性。在一个实施例中，转基因与选自SEQ ID NO:31-33的序列共享至少99％的同一性。在一个实施例中，转基因包含选自SEQ ID NO:31-33的序列。在一个实施例中，转基因与SEQ ID NO:31共享至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或完全同一性。在一个实施例中，转基因与SEQ ID NO:32共享至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或完全同一性。在一个实施例中，转基因与SEQ ID NO:33共享至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或完全同一性。在一些情况下，转基因具有的多核苷酸序列不同于参考序列的多核苷酸序列，所述参考序列例如“天然”或“野生型”LAMP-2B序列。在一些实施例中，转基因与参考序列共享至多70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的同一性。在一些实施例中，参考序列是SEQ IDNO:2。例如，SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:2共享78.5％的同一性。
在一些情况下，转基因具有的多核苷酸序列不同于参考序列的多核苷酸序列，所述参考序列例如“天然”或“野生型”LAMP-2A序列。在一些实施例中，转基因与参考序列共享至多70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的同一性。在一些实施例中，参考序列是SEQ ID NO:29中所示的野生型人LAMP-2A序列。
在一些情况下，转基因具有的多核苷酸序列不同于参考序列的多核苷酸序列，所述参考序列例如“天然”或“野生型”LAMP-2C序列。在一些实施例中，转基因与参考序列共享至多70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的同一性。在一些实施例中，参考序列是SEQ ID NO:30中所示的野生型人LAMP-2C序列。
在一个实施例中，转基因对于在人宿主细胞中的表达进行密码子优化。在一个实施例中，转基因编码序列通过用更频繁出现的密码子替换更不频繁出现的密码子进行修饰或“密码子优化”，以增强表达。编码序列是mRNA序列的一部分，其编码用于翻译的氨基酸。在翻译过程中，61个三核苷酸密码子各自翻译成20种氨基酸之一，导致遗传密码的简并或冗余。然而，不同的细胞类型和不同的动物物种利用以不同的频率编码相同的氨基酸的tRNA(各自携带反密码子)。当基因序列含有较不频繁地由相应tRNA表示的密码子时，核糖体翻译机制可能缓慢，阻碍有效翻译。表达可以经由关于特定物种的“密码子优化”得到改善，其中编码序列被改变为编码相同的蛋白质序列，但利用高度出现和/或被高度表达的人蛋白质利用的密码子(Cid-Arregui等人，2003；J.Virol.77:4928)。
在一些实施例中，转基因的编码序列进行修饰，以用在灵长类动物中频繁表达的密码子替换在哺乳动物或灵长类动物中较不频繁表达的密码子。例如，在一些实施例中，转基因编码与参考多肽(例如野生型LAMP-2B；SEQ ID NO:3)具有至少85％序列同一性的多肽—例如，与参考多肽至少90％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少98％的同一性或至少99％的同一性—其中编码序列的至少一个密码子在人中具有的tRNA频率高于上文或本文公开的序列中的相应密码子。
在一个实施例中，转基因包含比SEQ ID:2更少的替代开放读码框。在一个实施例中，转基因通过终止或去除不编码所需转基因的开放读码框(ORF)进行修饰，以增强表达。开放读码框(ORF)是在起始密码子之后且不含终止密码子的核酸序列。ORF可能处于正向或反向取向，并且与目的基因相比，可能“在框内”或“在框外”。此类开放读码框具有在表达盒中连同目的基因一起表达的潜力，并且可以导致不希望有的不利效应。在一些实施例中，转基因已通过进一步改变密码子使用进行修饰，以去除开放读码框。这可以通过以下完成：消除一个或多个起始密码子(ATG)和/或将在反向取向上或在框外的一个或多个终止密码子(TAG、TAA或TGA)引入所需的ORF，同时保存编码的氨基酸序列，并且任选地维持在目的基因中高度利用的密码子(即，避免频率<20％的密码子)。
在一些实施例中，表达盒包含对于转基因的起始密码子5'的至多一个、至多两个、至多三个、至多四个或至多五个起始密码子。在一些实施例中，表达盒不含对于转基因的起始密码子5'的起始密码子。在一些实施例中，5'UTR、启动子、增强子、启动子/增强子元件中的一个或多个ATG密码子、或对于转基因的起始密码子5'的其它序列在一个或多个隐蔽起始位点被去除后保留。在一些实施例中，表达盒不包含转基因上游的隐蔽起始位点，以生成错误的mRNA。
在本公开内容的变型中，转基因编码序列可以通过密码子优化或非转基因ORF的去除或使用这两种技术进行优化。在一些情况下，在密码子优化后去除非转基因ORF或使其降到最低，以便去除在密码子优化期间引入的ORF。
在一个实施例中，转基因含有比SEQ ID:2更少的CpG位点。不受理论的束缚，认为多核苷酸序列中CpG位点的存在与宿主针对包含多核苷酸序列的病毒载体的不期望的免疫应答相关。在一些实施例中，转基因被设计为减少CpG位点的数目。示例性方法在美国专利申请公开号US20020065236A1中提供。
在一个实施例中，转基因含有比SEQ ID:2更少的隐蔽剪接位点。为了优化，可以使用软件，例如，以增加GC含量和/或去除隐蔽剪接位点，以便避免转录沉默，并且，因此，增加转基因表达。可替代地，可以使用本领域已知的任何优化方法。例如，在国际专利申请公开号WO2004015106A1中描述了隐蔽剪接位点的去除。
本文还公开的是编码LAMP-2B的表达盒和基因治疗载体。在某些实施例中，表达盒和基因治疗载体包含密码子优化的或变体LAMP-2B多核苷酸序列或本文公开的转基因序列。
在特定实施例中，编码LAMP-2B的表达盒或基因治疗载体包含：共有最佳Kozak序列、全长聚腺苷酸化(聚A)序列(或全长聚A由截短的聚A的取代)、以及最低限度或无上游(即5')或隐蔽起始密码子(即ATG位点)。在一些实施例中，表达盒不包含能够生成替代mRNA的对于转基因5'的起始位点。在某些实施例中，表达盒或基因治疗载体包含编码LMAP-2B的序列，例如密码子优化的或变体LAMP-2B多核苷酸序列或本文公开的转基因序列。
在一些情况下，表达盒含有以下中的两种或更多种：第一反向末端重复、增强子/启动子区、共有最佳Kozak序列、转基因(例如，编码本文公开的LAMP-2B的转基因)、包括全长聚A序列的3'非翻译区、以及第二反向末端重复。在一些实施例中，反向末端重复(ITR)之一或两者是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV9 ITR、或本领域已知的任何一种ITR。在一些实施例中，表达盒包含恰好两个ITR。在一些实施例中，两个ITR均为AAV2、AAV5或AAV9 ITR。在一些实施例中，两个ITR均为AAV2 ITR。
在一个实施例中，表达盒包含可操作地连接到转基因的Kozak序列。在一个实施例中，Kozak序列是包含SEQ ID NO:6或由其组成的共有最佳Kozak序列：
GCCGCCACCATGG(SEQ ID NO:6)。
在各个实施例中，表达盒包含可操作地连接到转基因的替代Kozak序列。在一个实施例中，Kozak序列是包含SEQ ID NO.14-18中的任何一个或由其组成的替代Kozak序列：
(gcc)gccRccAUGG(SEQ ID NO:14)；
AGNNAUGN(SEQ ID NO:15)；
ANNAUGG(SEQ ID NO:16)；
ACCAUGG(SEQ ID NO:17)；
GACACCAUGG(SEQ ID NO:18)。
在一些实施例中，表达盒不包含Kozak序列。
在SEQ ID NO:14中，小写字母表示在其中碱基仍然可以变化的位置处的最常见碱基；大写字母指示高度保守的碱基；R指示腺嘌呤或鸟嘌呤。在SEQ ID NO:14中，括号中的序列(GCC)是任选的。在SEQ ID NO:15-17中，‘N’表示任何碱基。
可以使用各种序列代替该共有最佳Kozak序列作为翻译起始位点，并且鉴定且测试其它序列在本领域技术人员的技能范围内。参见Kozak M.An analysis of vertebratemRNA sequences:intimations of translational control.J.Cell Biol.115(4):887–903(1991)。
在一个实施例中，表达盒包含可操作地连接到转基因的全长聚A序列。在一个实施例中，全长聚A序列包含SEQ ID NO:7：
各种可替代的聚A序列可以用于本公开内容的表达盒中，包括但不限于牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGHpA)(SEQ ID NO:19)、SV40早期/晚期聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:20)、以及人生长激素(HGH)聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:21)：
在一些实施例中，表达盒包含聚A序列的活性片段。在特定实施例中，聚A序列的活性片段包含例如本文公开的任何聚A序列的少于20个碱基对(bp)、少于50bp、少于100bp或少于150bp或者由其组成。
在一些情况下，通过确保表达盒不含竞争性ORF来增加转基因的表达。在一个实施例中，表达盒不包含在转基因的起始密码子5'的20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500个碱基对内的起始密码子。在一些实施例中，表达盒不包含转基因的起始密码子5'的起始密码子。在一些实施例中，表达盒不包含能够生成替代mRNA的对于转基因5'的起始位点。
在一个实施例中，表达盒在5'到3'方向上包含可操作地连接的第一反向末端重复、增强子/启动子区、内含子、共有最佳Kozak序列、转基因、包括全长聚A序列的3'非翻译区、以及第二反向末端重复，其中所述表达盒不包含能够生成替代mRNA的对于转基因5'的起始位点。
在一些实施例中，增强子/启动子区在5'到3'方向上包含：CMV IE增强子和鸡β-肌动蛋白启动子。在一个实施例中，增强子/启动子区包含CAG启动子(SEQ ID NO:22)。如本文使用的，“CAG启动子”指包含CMV早期增强子元件、鸡β-肌动蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白基因的第一个外显子和第一个内含子、以及来自兔β-珠蛋白基因的剪接受体的多核苷酸序列。
在一些实施例中，增强子/启动子区包含遍在启动子。在一些实施例中，增强子/启动子区包含CMV启动子(SEQ ID NO:23)、SV40启动子(SEQ ID NO:24)、PGK启动子(SEQ IDNO:25)和/或人β-肌动蛋白启动子(SEQ ID NO:26)。在一些实施例中，增强子/启动子区包含与SEQ ID NOs:23-26中任何一个共享至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸：
进一步的示例性启动子包括但不限于人延伸因子1α启动子(EFS)，SV40早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复(LTR)启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子，对于目的基因异源的内源性细胞启动子，巨细胞病毒(CMV)启动子例如CMV立即早期启动子区(CMVIE)，劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子，合成启动子，杂合启动子等等。
在一些实施例中，3'UTR包含与SEQ ID NO:27共享至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸(WPRE元件)：
在一些实施例中，表达盒与选自SEQ ID NO:8-10的序列共享至少95％的同一性。在一个实施例中，表达盒与选自SEQ ID NO:8-10的序列共享完全同一性，或者与选自SEQID NO:8-10的序列共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％的同一性：
在某些实施例中，表达盒包含与选自SEQ ID NO:8-10的序列相比的一种或多种修饰，包括但不限于本文公开的任何修饰。在特定实施例中，一种或多种修饰包括以下中的一种或多种：去除一个或多个(例如，所有)上游ATG序列，用优化的共有Kozak序列或另一种Kozak序列包括但不限于本文公开的那些中的任一种替换Kozak序列，和/或用全长聚腺苷酸化序列或另一种聚腺苷酸化序列包括但不限于本文公开的那些中的任一种替换聚腺苷酸化序列。在这些示例性表达盒内的遗传元件的说明性配置在图1中进行描绘。
在一个实施例中，载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一个实施例中，表达盒包含选自SEQ ID NO:11和12的反向末端重复(ITR)序列：
在相关实施例中，本公开内容提供了包含本文公开的表达盒的基因治疗载体。一般地，本文所述的基因治疗载体包括包含编码溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)的一种或多种同种型的多核苷酸的表达盒，并且允许LAMP-2的表达，以部分或完全纠正有此需要的受试者(例如，患有达农病或特征在于至少部分由于缺陷型LAMP-2表达的缺陷型自噬潮的另一种病症的受试者)中的缺陷型LAMP-2蛋白质表达水平和/或自噬潮。在特定实施例中，表达盒包含编码本文公开的LAMP-2的多核苷酸序列，例如SEQ ID NO:2-5，或其功能变体。在一些实施例中，变体序列与SEQ ID NO:2-5中的任一个具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施例中，变体是SEQ ID NO:2-5中任一个的片段，例如，与SEQID NO:2-5中任一个的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的片段。
基因治疗载体
基因治疗载体可以是病毒或非病毒载体。说明性的非病毒载体包括例如裸露DNA、阳离子脂质体复合物、阳离子聚合物复合物、阳离子脂质体-聚合物复合物和外来体。病毒载体的例子包括但不限于腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒和腺相关病毒(AAV)载体。
在根据本公开内容的组合物和方法中，病毒载体一般是AAV载体。AAV是一种4.7kb的单链DNA病毒。基于AAV的重组载体与极佳的临床安全性相关，因为野生型AAV是非致病性的且与任何已知疾病没有病因学相关。另外，AAV提供了在众多组织中的高效基因递送和持续转基因表达的能力。“AAV载体”意指源自腺相关病毒血清型的载体，所述血清型包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh.10、AAVrh.74等。AAV载体可以具有全部或部分缺失的一种或多种AAV野生型基因，例如rep和/或cap基因，但保留功能性侧翼反向末端重复(ITR)序列。功能性ITR序列对于AAV病毒粒子的拯救、复制和包装是必需的。因此，AAV载体在本文中定义为至少包括病毒复制和包装所需的顺式序列(例如，功能性ITR)。ITR无需是野生型核苷酸序列，并且可以例如通过核苷酸的插入、缺失或取代进行改变，只要序列提供功能性拯救、复制和包装。AAV载体可以包含其它修饰，包括但不限于一种或多种修饰的衣壳蛋白(例如，VP1、VP2和/或VP3)。例如，衣壳蛋白可以进行修饰，以改变嗜性和/或减少免疫原性。
预料了针对AAV的免疫原性。在AAV疗法的施用之后，针对病毒衣壳和/或转基因的抗体的发展已在文献中得到报道(Mendell等人New Engl.J.Med.377:1713-1722(2017)；Rangarajan等人New Engl.J.Med.377:2519-2530(2017)。与发表的文献一致，本公开内容中进行的研究类似地显示了在给药后的第30天和第91天，针对AAV9的血清中和抗体的增加。载体递送导致针对AAV9衣壳的特征性结合抗体应答，但并未注意到针对LAMP2B的显著的抗药物抗体(ADA)应答，其中关于靶组织中的转导介导的LAMP2B功能没有可检测的结果。
基于AAV的重组载体与极佳的临床安全性相关，因为野生型AAV是非致病性的且与任何已知疾病没有病因学相关。另外，AAV提供了在众多组织中的高效基因递送和持续转基因表达的能力。各种AAV血清型是已知的，包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh.10、AAVrh.74等。AAV载体可以具有全部或部分缺失的一种或多种AAV野生型基因，例如rep和/或cap基因，但保留功能性侧翼反向末端重复(ITR)序列。重组AAV载体的血清型由其衣壳决定。国际专利公开号WO2003042397A2公开了各种衣壳序列，包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV8、AAV9和rh10的那些衣壳序列。国际专利公开号WO2013078316A1公开了来自AAVrh74的VP1的多肽序列。众多不同的天然存在的或遗传修饰的AAV衣壳序列是本领域已知的。
说明性的非限制性衣壳是具有SEQ ID NO:28的序列的AAV9衣壳(或其VP1、VP2或VP3片段)。在一些实施例中，本公开内容的AAV载体包含衣壳蛋白，其与SEQ ID NO:28的整个序列、或在SEQ ID NO:28的氨基酸138至736上、或在SEQ ID NO:28的氨基酸203至736上，共享至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的同一性。
AAV表达载体使用已知技术进行构建，以至少提供在转录方向上作为可操作连接的组分的控制元件，包括转录起始区、目的DNA(即LAMP-2基因)和转录终止区。
在一些实施例中，病毒载体是AAV9载体。在一些实施例中，病毒载体的表达盒由AAV2反向末端重复(ITR)侧接。在所公开的载体的可替代实施例中使用的ITR包括但不限于AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。在一些实施例中，病毒载体是AAV2/9载体。符号AAV2/9指具有AAV2的ITR和AAV9的衣壳的AAV载体。本公开内容的其它实施例包括但不限于AAV2/9、AAV5/9、AAVrh74、AAV2/rh74、AAV5/9和AAV5/rh74载体。可以使用本领域已知的其它ITR。可用于本公开内容的载体中的示例性ITR(和其它AAV组分)包括但不限于US6936466B2、US9169494B2、US20050220766A1、US20190022249A1和US7282199B2中描述的那些，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
可以利用分子生物学领域众所周知的方法来构建可用于本发明的实践中的基因递送病毒载体。通常，携带转基因的病毒载体由编码转基因的多核苷酸、合适的调控元件和对于病毒蛋白生产所必需的元件进行组装，所述病毒蛋白介导细胞转导。此类重组病毒可以通过本领域已知的技术产生，例如，通过转染包装细胞或者通过用辅助质粒或病毒瞬时转染。病毒包装细胞的通常例子包括但不限于HeLa细胞、SF9细胞(任选地具有杆状病毒辅助载体)、293细胞等。基于疱疹病毒的系统可以用于生产AAV载体，如US20170218395A1中所述。用于产生此类复制缺陷型重组病毒的详细方案可以例如在W095/14785、W096/22378、美国专利号5,882,877、美国专利号6,013,516、美国专利号4,861,719、美国专利号5,278,056和W094/19478中找到，所述专利的全部内容在此以引用的方式并入。
本公开内容还提供了药物组合物，其包含本文公开的表达盒或载体(例如，基因治疗载体)以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在特定实施例中，药物组合物包括包含本文公开的表达盒的AAV载体，例如，其中所述表达盒包含编码LAMP-2B的密码子优化的转基因，例如SEQ ID NO:3-5中的任一个及其变体。提供了例如用于预防或治疗特征在于缺陷型自噬潮的病症(例如，达农病)的药物组合物，其包含治疗有效量的本文公开的表达盒或载体，其包含编码LAMP-2的一种或多种同种型的多核苷酸的核酸序列。
可用于本发明的实践中的AAV载体可以使用各种系统包括基于腺病毒的系统和无辅助病毒系统包装到AAV病毒粒子(病毒颗粒)内。AAV生物学中的标准方法包括以下中描述的那些方法：Kwon和Schaffer.Pharm Res.(2008)25(3):489-99；Wu等人Mol.Ther.(2006)14(3):316-27.Burger等人Mol.Ther.(2004)10(2):302-17；Grimm等人Curr Gene Ther.(2003)3(4):281-304；Deyle DR，Russell DW.Curr Opin Mol Ther.(2009)11(4):442-447；McCarty等人Gene Ther.(2001)8(16):1248-54；以及Duan等人Mol Ther.(2001)4(4):383-91。无辅助病毒系统包括US 6,004,797；US 7,588,772；和US 7,094,604中描述的那些系统；
含有表达盒或载体的药物组合物可以是适合于所选择的施用模式的任何形式，例如，用于心室内、心肌内、冠状动脉内、静脉内、动脉内、肾内、尿道内、硬膜外或肌内施用。包含编码一种或多种LAMP-2同种型的多核苷酸的基因治疗载体可以作为单独的活性剂，或与其它活性剂组合，以单位施用形式，作为与常规药物支持物的混合物，施用于动物和人类。在一些实施例中，药物组合物包含用本公开内容的任何基因治疗载体离体转导的细胞。
达农病的治疗
治疗溶酶体病症和/或达农病的示例性方法在整体并入本文的WO 2018/170239A1中提供。
在一个方面，本公开内容提供了预防、缓和、改善、减少、抑制、消除和/或逆转有此需要的受试者中的达农病或另一种自噬病症的一种或多种症状的方法，其中所述方法包括向受试者施用本公开内容的基因治疗载体。术语“达农病”指具有多系统临床表现的X连锁显性遗传骨骼和心肌病症。达农病突变导致溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)蛋白质表达的缺失。主要临床特征包括骨骼和心肌病、心脏传导异常、认知困难和视网膜疾病。男性通常比女性更早且更严重地受影响。
心脏注射可以通过中央静脉通路，例如颈内静脉来执行。Swan-Ganz肺动脉导管(PAC)或其它PAC可以用于将AAV递送至心脏。
在一个实施例中，载体经由选自肠胃外、静脉内、动脉内、心内、冠状动脉内、心肌内、肾内、尿道内、硬膜外和肌内的途径进行施用。在一个实施例中，载体进行多次施用。在一个实施例中，载体通过载体的肌内注射进行施用。在一个实施例中，载体通过将载体注射到骨骼肌内进行施用。在一个实施例中，表达盒包含肌肉特异性启动子，任选地肌肉肌酸激酶(MCK)启动子或MCK/SV40杂合启动子，如Takeshita等人Muscle creatine kinase/SV40hybrid promoter for muscle-targeted long-term transgene expression.Int J MolMed.2007年2月；19(2):309-15中所述。在一个实施例中，载体通过心内注射进行施用。
在一个实施例中，载体例如AAV载体是全身施用的，并且更特别地，是静脉内施用的。有利地，载体以比当使用原始或野生型LAMP-2B序列时观察到相同应答所需的剂量更小的剂量(以vg/mL、vg/kg体重或vg/分钟/kg计)进行施用。在特定实施例中，载体是包含表达盒的AAV2/9载体，所述表达盒包含本文公开的编码LAMP-2B的多核苷酸。
在一些实施例中，本公开内容提供了在受试者中表达LAMP-2B的方法，其包括向受试者全身施用腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体包含表达盒，所述表达盒包含与SEQID NO:2共享至少95％的同一性或与SEQ ID NO:2等同的转基因，该转基因可操作地连接到增强子/启动子区，其中与在AAV载体施用之前的LAMP-2B表达或未治疗的对照受试者中的LAMP-2B表达相比，所述AAV载体对受试者的全身施用导致LAMP-2B表达的增加。在一些实施例中，AAV病毒粒子是AAV2/9载体，其是在载体基因组中具有AAV9衣壳和AAV2 ITR的载体。在特定实施例中，表达盒包含本文公开的任何元件。在一些实施例中，全身施用包含静脉内施用。在一些实施例中，受试者显示出达农病的症状。在一些实施例中，受试者患有达农病或处于达农病的风险中。
在一些实施例中，全身(或更特别地静脉内)施用导致在受试者的一个或多个组织(例如心脏、肌肉和/或肝脏)中，以由转基因表达的mRNA的形式，作为mRNA的LAMP-2B多核苷酸表达。在一些实施例中，与未治疗的受试者或用对照载体治疗的受试者中的表达相比，作为mRNA的LAMP-2B多核苷酸的表达在心脏中增加到至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2.0倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5倍、至少约3倍或至少约4倍。在一些实施例中，与未治疗的受试者或用对照载体治疗的受试者中的表达相比，作为mRNA的LAMP-2B多核苷酸的表达在心脏中增加到至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少3倍或至少4倍。在一些实施例中，与未治疗的受试者或用对照载体治疗的受试者中的表达相比，作为mRNA的LAMP-2B多核苷酸的表达在心脏中增加到1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、3倍或4倍。
在一些实施例中，与未治疗的受试者或用对照载体治疗的受试者中的表达相比，作为mRNA的LAMP-2B多核苷酸的表达在肌肉中增加到至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2.0倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5倍、至少约3倍或至少约4倍。在一些实施例中，与未治疗的受试者或用对照载体治疗的受试者中的表达相比，作为mRNA的LAMP-2B多核苷酸的表达在肌肉中增加到至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少3倍或至少4倍。在一些实施例中，与未治疗的受试者或用对照载体治疗的受试者中的表达相比，作为mRNA的LAMP-2B多核苷酸的表达在肌肉中增加到1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、3倍或4倍。
在一些实施例中，LAMP-2B转基因在受试者的心脏中表达而在肝脏中不表达。在一些实施例中，观察到与肝脏相比，LAMP-2B多核苷酸作为mRNA的表达在心脏中为至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2.0倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5倍、至少约3倍或至少约4倍。在一些实施例中，观察到与肝脏相比，LAMP-2B多核苷酸作为mRNA的表达在心脏中为至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少3倍或至少4倍。在一些实施例中，观察到与肝脏相比，LAMP-2B多核苷酸作为mRNA的表达在心脏中为1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、3倍或4倍。
在一些实施例中，与未治疗的受试者或用对照载体治疗的受试者中的表达相比，野生型或功能性LAMP-2B蛋白的表达在心脏中增加到至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2.0倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5倍、至少约3倍或至少约4倍。在一些实施例中，与未治疗的受试者或用对照载体治疗的受试者中的表达相比，野生型或功能性LAMP-2B蛋白的表达在心脏中增加到至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少3倍或至少4倍。在一些实施例中，与未治疗的受试者或用对照载体治疗的受试者中的表达相比，野生型或功能性LAMP-2B蛋白的表达在心脏中增加到1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、3倍或4倍。
在一些实施例中，观察到与肝脏相比，野生型或功能性LAMP-2B蛋白的表达在心脏中为至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2.0倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍或至少约5倍。在一些实施例中，观察到与肝脏相比，野生型或功能性LAMP-2B蛋白的表达在心脏中为至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少3倍或至少4倍。在一些实施例中，观察到与肝脏相比，野生型或功能性LAMP-2B蛋白的表达在心脏中为1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、3倍或4倍。
在一些实施例中，与未治疗的受试者的肝脏中的表达相比，基因治疗载体的施用导致在肝脏中至多约1.1倍、至多约1.2倍、至多约1.3倍、至多约1.4倍、至多约1.5倍、至多约1.6倍、至多约1.7倍、至多约1.8倍、至多约1.9倍、或至多约2倍增加的野生型或功能性LAMP-2B蛋白的表达。在一些实施例中，与未治疗的受试者的肝脏中的表达相比，基因治疗载体的施用导致在肝脏中至多1.1倍、至多1.2倍、至多1.3倍、至多1.4倍、至多1.5倍、至多1.6倍、至多1.7倍、至多1.8倍、至多1.9倍、或至多2倍增加的野生型或功能性LAMP-2B蛋白的表达。在一些实施例中，与未治疗的受试者的肝脏中的表达相比，基因治疗载体的施用导致在肝脏中1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或2倍增加的野生型或功能性LAMP-2B蛋白的表达。
在一个实施例中，本公开内容提供了治疗有此需要的受试者中的疾病或病症，任选地达农病的方法，其包括使细胞与根据本公开内容的基因治疗载体接触，并且将细胞施用于受试者。在一个实施例中，细胞是干细胞，任选地多能干细胞。在一个实施例中，干细胞能够分化成心脏组织。在一个实施例中，干细胞能够分化成肌肉组织，例如心肌组织和/或骨骼肌组织。在一个实施例中，干细胞是自体的。在一个实施例中，干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。
在一个实施例中，疾病或病症是自噬病症。在一些实施例中，自噬病症选自但不限于终末期心力衰竭、心肌梗塞、药物毒性、糖尿病、终末期肾衰竭和衰老。在一个实施例中，受试者是哺乳动物，例如人。在一个实施例中，受试者显示出达农病或另一种自噬病症的症状。在一个实施例中，受试者已被鉴定为具有减少的或无法检测的LAMP-2表达。在一个实施例中，受试者已被鉴定为具有突变的LAMP-2基因。
顺应使用本文所述方法的治疗的受试者/患者包括但不限于处于特征在于自噬潮不足的疾病或病症(例如达农病以及其它已知的自噬病症，包括但不限于收缩性和舒张性心力衰竭、心肌梗塞、药物毒性(例如蒽环类药物氯喹及其衍生物)、糖尿病、终末期肾病和衰老)的风险中，但并未显示症状的个体，以及目前显示症状的受试者。此类受试者可能已被鉴定为具有突变的LAMP-2基因或者具有减少的或无法检测的LAMP-2表达水平。
在一些实施例中，患者是人。在一些实施例中，患者是儿童、青少年或成年人。在一些实施例中，患者是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20岁，或者超过20岁。在一些实施例中，患者是20至50岁。在一些实施例中，患者是50至65岁。在一些实施例中，患者是1至5、2至6、3至7、4至8、5至9、6至10、7至11、8至12、9至13、10至14、11至15、12至16、13至17、14至18、15至19、或16至20岁。在一些实施例中，患者是5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16、
16至17、17至18、18至19、19至20、或20至21岁。在特定实施例中，患者是15至16岁。
在一些实施例中，患者是人类男性。在一些实施例中，患者是儿童、青少年或成年人类男性。在一些实施例中，患者是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20岁的男性，或者超过20岁的男性。在一些实施例中，患者是20至50岁的男性。在一些实施例中，患者是50至65岁的男性。在一些实施例中，患者是1至5、2至6、3至7、4至8、5至9、6至10、7至11、8至12、9至13、10至14、11至15、12至16、13至17、14至18、15至19、或16至20岁的男性。在一些实施例中，患者是5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16、16至17、17至18、18至19、19至20、或20至21岁的男性。在特定实施例中，患者是15至16岁。
在一些实施例中，患者是人类女性。在一些实施例中，患者是儿童、青少年或成年人类女性。在一些实施例中，患者是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20岁的女性，或者超过20岁的女性。在一些实施例中，患者是20至50岁的女性。在一些实施例中，患者是50至65岁的女性。
在一些实施例中，受试者显示出特征在于自噬潮不足的疾病或病症(例如达农病以及其它已知的自噬病症，包括但不限于收缩性和舒张性心力衰竭、心肌梗塞、药物毒性、糖尿病、终末期肾病和衰老)的症状。症状可能正在积极表现，或者可能被压制或控制(例如，通过用药)或处于缓解期。受试者可能已经或可能尚未被例如合格的医生诊断为患有该病症。
在一些实施例中，在全身施用时，病毒载体(例如AAV载体)或包含该载体的药物组合物是有效的。例如，在一些情况下，在静脉内施用于受试者(例如灵长类动物，例如非人灵长类动物或人)时，本公开内容的病毒载体证实了功效。在一些实施例中，在全身施用时，本公开内容的病毒载体能够在各种组织中(例如，在心脏、肌肉和/或肺中)诱导LAMP-2B的表达。在特定实施例中，包含与SEQ ID NO:2基本上等同或等同的转基因的AAV9载体静脉内施用于受试者导致心脏组织中可检测的LAMP-2B表达。在一些实施例中，LAMP-2B的表达在受试者心脏的左心室、右心室、左心房和右心房中的一个或多个或全部中是可检测的。在一些实施例中，LAMP-2B的表达在受试者心脏的左心室的亚区1和/或亚区2中是可检测的。
“可检测的表达”通常指与未用病毒载体治疗的对照受试者或组织相比，至少5％、10％、15％、20％或更多的转基因表达。在一些实施例中，可检测的表达意指无载体对照至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、或至少100倍大的表达。转基因表达可以确定为超过细胞中的野生型或内源基因的表达的增加(考虑到转基因的表达可能影响内源基因表达的可能性)。转基因表达也可以通过序列的RT-PCR检测进行确定，所述序列存在于转基因mRNA转录物上，但不存在于内源基因的mRNA转录物上。例如，转录物的3'UTR可以用于确定转基因的表达，而不依赖于内源基因(其可能具有不同的3'UTR)的表达。由转基因编码的多肽的表达可以通过如下述实例中所述的蛋白质印迹或酶联免疫吸附测定(ELISA)，或者本领域已知的其它方法进行评价。可以使用与蛋白质的野生型和外源拷贝交叉反应的抗体。在一些情况下，可以鉴定对于外源蛋白特异性抗体并且用于确定转基因表达。考虑到靶细胞或组织，本领域技术人员可以设计适当的检测方法。在一些情况下，使用标准曲线来定量测量表达。可以使用纯化的LAMP-2蛋白通过实例中描述的或本领域已知的方法生成标准曲线。可替代地，转基因的表达可以通过相应mRNA的定量进行评价。
如本文使用的，术语“载体基因组”和“基因组拷贝”可互换地指样品中的单链AAV基因组多核苷酸的数目。可以使用定量聚合酶链反应(qPCR)或数字液滴聚合酶链反应(ddPCR)，使用对于重组AAV基因组特异性的引物，例如侧接基因组的WPRE序列的引物，来测量载体基因组拷贝。可以关于用参考样品生成的标准曲线进行定量，所述参考样品例如含有携带用于所用引物的靶扩增子的质粒DNA的样品。ddPCR和qPCR的方法是本领域众所周知的。用于临床前研究的剂量单位以载体基因组(vg)/kg体重来表示。临床剂量表示为载体基因组拷贝数(GC)/kg。两个单位术语(GC/kg和vg/kg)预期描述相同的实体，并且在本公开内容中可互换使用。
在一些实施例中，在以5x1014vg/kg或更少、3×1014vg/kg或更少、2×1014vg/kg或更少、1×1014vg/kg或更少、9×1013vg/kg或更少、8×1013vg/kg或更少、7×1013vg/kg或更少、6×1013vg/kg或更少、5×1013vg/kg或更少、4×1013vg/kg或更少、3×1013vg/kg或更少、2×1013vg/kg或更少、或者1×1013vg/kg或更少的载体基因组(vg)/千克受试者的重量(kg)的剂量下，发生心脏组织中LAMP-2B的可检测表达。
在一些实施例中，在以1×1013vg/kg至2×1013vg/kg、2×1013vg/kg至3×1013vg/kg、3×1013vg/kg至4×1013vg/kg、4×1013vg/kg至5×1013vg/kg、5×1013vg/kg至6×1013vg/kg、6×1013vg/kg至7×1013vg/kg、7×1013vg/kg至8×1013vg/kg、8×1013vg/kg至9×1013vg/kg、9×1013vg/kg至1×1014vg/kg、1×1014vg/kg至2×1014vg/kg、2×1014vg/kg至3×1014vg/kg、或3×1014vg/kg至5x1014vg/kg的载体基因组(vg)/千克受试者的重量(kg)的剂量下，发生心脏组织中LAMP-2B的可检测表达。
在一些实施例中，在以1×1013vg/kg至3×1013vg/kg、3×1013vg/kg至5×1013vg/kg、5×1013vg/kg至7×1013vg/kg、7×1013vg/kg至9×1013vg/kg、9×1013vg/kg至2×1014vg/kg、或2×1014vg/kg至5×1014vg/kg的载体基因组(vg)/千克受试者的重量(kg)的剂量下，发生心脏组织中LAMP-2B的可检测表达。在一些实施例中，在以1×1013vg/kg至5×1013vg/kg、5×1013vg/kg至9×1013vg/kg、9×1013vg/kg或至5x1014vg/kg的载体基因组(vg)/千克受试者的重量(kg)的剂量下，发生心脏组织中LAMP-2B的可检测表达。在一些实施例中，在以1×1013vg/kg至9×1013vg/kg、或9×1013vg/kg或至5x1014vg/kg的载体基因组(vg)/千克受试者的重量(kg)的剂量下，发生心脏组织中LAMP-2B的可检测表达。
在一些实施例中，在以1×1013vg/kg至5×1013vg/kg、5×1013vg/kg至1×1014vg/kg、或1×1014vg/kg至5x1014vg/kg的载体基因组(vg)/千克受试者的重量(kg)的剂量下，发生心脏组织中LAMP-2B的可检测表达。
在一些实施例中，在以1×1013vg/kg至5x1014vg/kg的载体基因组(vg)/千克受试者的重量(kg)的剂量下，发生心脏组织中LAMP-2B的可检测表达。在一些实施例中，在以1×1013vg/kg至1×1014的载体基因组(vg)/千克受试者的重量(kg)的剂量下，发生心脏组织中LAMP-2B的可检测表达。
共施用
在一些情况下，可以通过一种或多种次要药剂包括但不限于免疫调节剂的共施用来增加安全性和/或功效。
在一些实施例中，该方法包括向受试者施用有效量的皮质类固醇，包括但不限于地塞米松、甲泼尼龙或泼尼松。用于施用AAV疗法的皮质类固醇的适当剂量和剂量方案是本领域已知的。参见Diehl等人Cell.&Mol.Immunol.14，146–179(2017)。
在一些实施例中，该方法包括向受试者施用有效量的他克莫司、环孢菌素、雷帕霉素、西罗莫司或其衍生物。在一些实施例中，该方法还包括在施用有效量的他克莫司之前，向受试者施用有效量的皮质类固醇。如本文所公开的，在一些情况下，他克莫司可以允许在向受试者施用AAV后皮质类固醇水平的更快速减量。他克莫司可以在AAV之前7-21天，例如在AAV前21天、14天、10天、7天、5天、2天或1天，优选前1天进行施用。他克莫司施用可以在AAV施用后继续。他克莫司可以在AAV之后施用120天，例如在AAV后1天、5天、10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、110天或120天，优选后90天的持续时间。参见Tardieu等人Hum.Gen.Ther.25(6):506-516(2014)。
他克莫司可以以0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg.kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg或0.6mg/kg的剂量进行施用。他克莫司可以与700mg/m2、800mg/m2、900mg/m2、1000mg/m2、1100mg/m2、1200mg/m2、1300mg/m2、1400mg/m2、1500mg/m2、1600mg/m2或1700mg/m2霉酚酸酯同时进行施用。
在一些实施例中，该方法包括向受试者施用与1200mg/m2霉酚酸酯同时的0.2mg/kg他克莫司。
他克莫司可以以2个分份剂量每天进行口服施用。他克莫司可以以有效量进行施用，以维持2ng/mL、2.5ng/mL、3ng/mL、3.5ng/ml、4ng/mL、4.5ng/mL或5ng/mL的谷血清水平。他克莫司的替代品包括但不限于麦考酚酯、环孢菌素、改良的环孢菌素、西罗莫司、依维莫司或贝拉西普。
在一些实施例中，该方法包括向受试者施用有效量的利妥昔单抗。如本文所公开的，在一些情况下，利妥昔单抗可以减少和/或预防针对AAV的免疫应答。利妥昔单抗可以在AAV之前7-21天，例如在AAV前21天、14天、10天、7天、5天、2天或1天，优选前1天进行施用。利妥昔单抗可以在AAV后7-21天，例如在AAV后21天、14天、10天、7天、5天、2天或1天，优选后1天进行施用。利妥昔单抗可以施用于受试者1、2、3次或更多次。参见Corti等人Hum.GeneTher.Clin.Dev.28(4):208-218(2017)以及Corti等人Mol.Ther.Meth.Clin.Dev.1，14033(2014)。
利妥昔单抗可以300mg/m2、400mg/m2、500mg/m2、600mg/m2、700mg/m2、750mg/m2、800mg/m2、900mg/m2、1000mg/m2、1100mg/m2或1200mg/m2，优选750mg/m2的剂量进行施用。利妥昔单抗的替代品包括但不限于奥妥珠单抗、Tuxima(rituximab-abbs)或来那度胺。
他克莫司可以在利妥昔单抗前进行施用。他克莫司可以与利妥昔单抗同时进行施用。他克莫司可以在利妥昔单抗后进行施用。可以停止利妥昔单抗施用，同时继续他克莫司施用。
在一些实施例中，利妥昔单抗在AAV施用之前的第-14天和-7天时进行施用，并且他克莫司在AVV施用之前的第-7天开始施用直到AAV施用之后的3个月。
在一些实施例中，该方法包括向受试者施用有效量的依库珠单抗、雷夫利珠单抗或另一种补体抑制剂。用补体抑制剂的治疗方法是本领域已知的。参见Zipfel等人Front.Immunol.(2019)。依库珠单抗被批准用于治疗非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)。
在一些实施例中，受试者处于补体激活的后遗症的风险中，所述后遗症例如非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、任选地导致可逆性血小板减少症和/或急性肾损伤(AKI)的aHUS。
在一些实施例中，该方法还包括向受试者施用有效量的利妥昔单抗；向受试者施用有效量的他克莫司；和/或向受试者施用有效量的依库珠单抗。
可以使用本领域已知的各种皮质类固醇。在一些实施例中，该方法包括向受试者施用有效量的地塞米松、甲泼尼龙、倍他米松、泼尼松、泼尼松龙、去炎松、氢化可的松、可的松、氟氢可的松或其组合。
药物组合物和剂量
在另一个方面，本公开内容提供了药物组合物。在各个实施例中，药物组合物含有对于能够被注射的制剂是药学上可接受的媒介物(例如，载体、稀释剂和赋形剂)。示例性赋形剂包括泊洛沙姆。用于病毒载体(包括AAV)的配制缓冲液一般含有防止聚集的盐，以及减少载体的粘性的其它赋形剂(例如泊洛沙姆)。这些可以特别是等渗的、无菌的、盐水溶液(磷酸一钠或磷酸二钠，氯化钠、钾、钙或镁等等，或此类盐的混合物)，或干燥的、尤其是冷冻干燥的组合物，取决于情况，所述组合物在无菌水或生理盐水的添加后允许构建可注射溶液。有利地，制剂在冷冻时(例如在低于0℃、约-60℃或约-72℃下)对于贮存和使用是稳定的。
在一些实施例中，药物组合物包含以用于施用于受试者的合适浓度(例如，200mM)和pH(例如，pH 7.2±0.1)的缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。药物组合物可以包括以合适浓度(例如，0.01％)的泊洛沙姆。药物组合物可以作为冷冻产品在治疗场所提供。AAV的单位剂量的最终体积可以全部或部分地基于例如以千克(kg)计的患者重量，以及计算或实验确定的AAV载体基因组(vg)拷贝数水平/体积例如毫升(mL)药物组合物进行确定。必要时，药物组合物可以进行稀释，以获得用于注射的所需浓度或体积。
在一些实施例中，药物组合物包含200mM NaCl、10mM NaH2PO4、1％(w/v)蔗糖、0.01％泊洛沙姆188，pH 7.2±0.1。
在一些实施例中，AAV载体以约1×1012至约5×1014个AAV载体的载体基因组(vg)/千克(vg)受试者的总体重(vg/kg)的剂量进行施用。在一些实施例中，AAV载体以约1×1013至约5×1014vg/kg的剂量进行施用。在一些实施例中，AAV载体以约5×1013至约3×1014vg/kg的剂量进行施用。在一些实施例中，AAV载体以约5×1013至约1×1014vg/kg的剂量进行施用。在一些实施例中，AAV载体以小于约1×1012vg/kg、小于约3×1012vg/kg、小于约5×1012vg/kg、小于约7×1012vg/kg、小于约1×1013vg/kg、小于约3×1013vg/kg、小于约5×1013vg/kg、小于约7×1013vg/kg、小于约1×1014vg/kg、小于约3×1014vg/kg、或小于约5×1014vg/kg的剂量进行施用。
在一些实施例中，AAV载体以约6.7×1013至2×1014vg/kg的剂量进行施用。在一些实施例中，AAV载体以约6.7×1013至约1.1×1014vg/kg的剂量进行施用。
在一些实施例中，AAV载体以约1×1013vg/kg、约3×1013vg/kg、约5×1013vg/kg、约7×1013vg/kg、约1×1014vg/kg、约3×1014vg/kg、或约5×1014vg/kg的剂量进行施用。在一些实施例中，AAV载体以约6.7×1013vg/kg、约1.1×1013vg/kg、或约2.0×1013vg/kg的剂量进行施用。
在一些实施例中，AAV载体以1×1012vg/kg、3×1012vg/kg、5×1012vg/kg、7×1012vg/kg、1×1013vg/kg、3×1013vg/kg、5×1013vg/kg、7×1013vg/kg、1×1014vg/kg、3×1014vg/kg、5×1014vg/kg、7×1014vg/kg、1×1015vg/kg、3×1015vg/kg、5×1015vg/kg、或7×1015vg/kg的剂量进行施用。在一些实施例中，AAV载体以6.7×1013vg/kg、1.1×1013vg/kg、或2.0×1013vg/kg的剂量进行施用。
在一些实施例中，AAV载体以约1×1013至5×1014个AAV载体的载体基因组(vg)/千克(vg)受试者的总体重(vg/kg)的剂量进行全身施用。在一些实施例中，AAV载体以约1×1013至5×1014vg/kg的剂量进行全身施用。在一些实施例中，AAV载体以约5×1013至3×1014vg/kg的剂量进行全身施用。在一些实施例中，AAV载体以约5×1013至1×1014vg/kg的剂量进行全身施用。在一些实施例中，AAV载体以小于约1×1013vg/kg、小于约3×1013vg/kg、小于约5×1013vg/kg、小于约7×1013vg/kg、小于约1×1014vg/kg、小于约3×1014vg/kg、或小于约5×1014vg/kg的剂量进行全身施用。
在一些实施例中，AAV载体以约6.7×1013至2×1014vg/kg的剂量进行全身施用。在一些实施例中，AAV载体以约6.7×1013至约1.1×1014vg/kg的剂量进行施用。
在一些实施例中，AAV载体以约1×1013vg/kg、约3×1013vg/kg、约5×1013vg/kg、约7×1013vg/kg、约1×1014vg/kg、约3×1014vg/kg、或约5×1014vg/kg的剂量进行全身施用。在一些实施例中，AAV载体以约6.7×1013vg/kg、约1.1×1013vg/kg、或约2.0×1013vg/kg的剂量进行全身施用。
在一些实施例中，AAV载体以1×1013vg/kg、3×1013vg/kg、5×1013vg/kg、7×1013vg/kg、1×1014vg/kg、3×1014vg/kg、或5×1014vg/kg的剂量进行全身施用。在一些实施例中，AAV载体以6.7×1013vg/kg、1.1×1013vg/kg、或2.0×1013vg/kg的剂量进行全身施用。
在一些实施例中，AAV载体以约1×1013至5×1014个AAV载体的载体基因组(vg)/千克(vg)受试者的总体重(vg/kg)的剂量进行静脉内施用。在一些实施例中，AAV载体以约1×1013至5×1014vg/kg的剂量进行静脉内施用。在一些实施例中，AAV载体以约5×1013至3×1014vg/kg的剂量进行静脉内施用。在一些实施例中，AAV载体以约1×1013至1×1014vg/kg的剂量进行静脉内施用。在一些实施例中，AAV载体以小于约1×1013vg/kg、小于约3×1013vg/kg、小于约5×1013vg/kg、小于约7×1013vg/kg、小于约1×1014vg/kg、小于约3×1014vg/kg、或小于约5×1014vg/kg的剂量进行静脉内施用。
在一些实施例中，AAV载体以约6.7×1013至2×1014vg/kg的剂量进行静脉内施用。在一些实施例中，AAV载体以约6.7×1013至约1.1×1014vg/kg的剂量进行施用。
在一些实施例中，AAV载体以约1×1013vg/kg、约3×1013vg/kg、约5×1013vg/kg、约7×1013vg/kg、约1×1014vg/kg、约3×1014vg/kg、或约5×1014vg/kg的剂量进行静脉内施用。在一些实施例中，AAV载体以约6.7×1013vg/kg、约1.1×1013vg/kg、或约2.0×1013vg/kg的剂量进行静脉内施用。
在一些实施例中，AAV载体以1×1013vg/kg、3×1013vg/kg、5×1013vg/kg、7×1013vg/kg、1×1014vg/kg、3×1014vg/kg、或5×1014vg/kg的剂量进行静脉内施用。在一些实施例中，AAV载体以6.7×1013vg/kg、1.1×1013vg/kg、或2.0×1013vg/kg的剂量进行静脉内施用。
在一些实施例中，AAV病毒粒子的治疗有效量为约1×1012至约5×1014个AAV病毒粒子的载体基因组(vg)/千克(vg)受试者的总体重(vg/kg)。在一些实施例中，治疗有效量为约1×1013至约5×1014vg/kg。在一些实施例中，治疗有效量为约5×1013至约3×1014vg/kg。在一些实施例中，治疗有效量为约5×1013至约1×1014vg/kg。在一些实施例中，治疗有效量为小于约1×1012vg/kg、小于约3×1012vg/kg、小于约5×1012vg/kg、小于约7×1012vg/kg、小于约1×1013vg/kg、小于约3×1013vg/kg、小于约5×1013vg/kg、小于约7×1013vg/kg、小于约1×1014vg/kg、小于约3×1014vg/kg、或小于约5×1014vg/kg。
在一些实施例中，AAV病毒粒子的治疗有效量为约6.7×1013至2×1014vg/kg。在一些实施例中，AAV病毒粒子以约6.7×1013至约1.1×1014vg/kg的剂量进行施用。
在一些实施例中，AAV病毒粒子的治疗有效量为1×1013vg/kg、约3×1013vg/kg、约5×1013vg/kg、约7×1013vg/kg、约1×1014vg/kg、约3×1014vg/kg、或约5×1014vg/kg。在一些实施例中，治疗有效量为约6.7×1013vg/kg、约1.1×1013vg/kg、或约2.0×1013vg/kg。
在一些实施例中，AAV病毒粒子的治疗有效量为1×1012vg/kg、3×1012vg/kg、5×1012vg/kg、7×1012vg/kg、1×1013vg/kg、3×1013vg/kg、5×1013vg/kg、7×1013vg/kg、1×1014vg/kg、3×1014vg/kg、5×1014vg/kg、7×1014vg/kg、1×1015vg/kg、3×1015vg/kg、5×1015vg/kg、或7×1015vg/kg。在一些实施例中，治疗有效量为6.7×1013vg/kg、1.1×1013vg/kg、或2.0×1013vg/kg。
定义
术语“溶酶体相关膜蛋白2”和“LAMP-2”可互换地指核酸和多肽多态性变体、等位基因、突变体和种间同源物，其：(1)具有的氨基酸序列与由LAMP-2核酸(参见例如，GenBank登录号NM_002294.2(同种型A)、NM_013995.2(同种型B)、NM_001122606.1(同种型C))编码的氨基酸序列，或者LAMP-2多肽(参见例如，GenBank登录号NP_002285.1(同种型A)、NP_054701.1(同种型B)、NP_001116078.1(同种型C))的氨基酸序列具有大于约90％的氨基酸序列同一性，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列同一性，优选在至少约25、50、100、200、300、400个或更多个氨基酸的区域上，或在全长上；(2)结合针对免疫原产生的抗体，例如多克隆抗体，所述免疫原包含LAMP-2多肽(例如，本文所述的LAMP-2多肽)的氨基酸序列；或由LAMP-2核酸(例如，本文所述的LAMP-2多核苷酸)编码的氨基酸序列，及其保守修饰的变体；(3)在严格杂交条件下，与对应于编码LAMP-2蛋白的核酸序列及其保守修饰变体的反义链特异性杂交；(4)具有的核酸序列与LAMP-2核酸(例如，如本文所述的LAMP-2多核苷酸、以及如本文所述的编码LAMP-2多肽的LAMP-2多核苷酸)具有大于约90％，优选大于约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的核苷酸序列同一性，优选在至少约25、50、100、200、500、1000、2000个或更多个核苷酸的区域上，或在全长上。
术语“溶酶体相关膜蛋白2B”和“LAMP-2B”可互换地指核酸和多肽多态性变体、等位基因、突变体和种间同源物，其：(1)具有的氨基酸序列与由LAMP-2B核酸(参见例如NM_013995.2)编码的氨基酸序列，或者LAMP-2B多肽(参见例如NP_054701.1)的氨基酸序列具有大于约90％的氨基酸序列同一性，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列同一性，优选在至少约25、50、100、200、300、400个或更多个氨基酸的区域上，或在全长上；(2)结合针对免疫原产生的抗体，例如多克隆抗体，所述免疫原包含LAMP-2B多肽(例如，本文所述的LAMP-2B多肽)的氨基酸序列；或由LAMP-2B核酸(例如，本文所述的LAMP-2B多核苷酸)编码的氨基酸序列，及其保守修饰的变体；(3)在严格杂交条件下，与对应于编码LAMP-2B蛋白的核酸序列及其保守修饰变体的反义链特异性杂交；(4)具有的核酸序列与LAMP-2B核酸(例如，如本文所述的LAMP-2B多核苷酸、以及如本文所述的编码LAMP-2B多肽的LAMP-2B多核苷酸)具有大于约90％，优选大于约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的核苷酸序列同一性，优选在至少约25、50、100、200、500、1000、2000个或更多个核苷酸的区域上，或在全长上。
关于蛋白质(例如LAMP-2B)的术语“功能变体”指多肽序列，或者具有至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、或至少约80个氨基酸残基的多肽序列片段，其保留蛋白质的一种或多种功能属性。例如，LAMP-2B的功能变体是保留一种或多种功能的LAMP-2B(如本文所定义的)，所述功能例如：(1)调节人心肌细胞功能(Chi等人(2019)PNAS USA116(2)556-565)；(2)改善达农病的代谢功能和生理功能(Adler等人(2019)J.Am.CollegeCardiology S0735-1097(19)31295-1)；和/或(3)自噬(Rowland等人(2016)J.Cell Sci.(2016)129，2135-2143)。
LAMP-2B具有腔结构域(残基29-375)、跨膜结构域(残基376-399)和细胞质结构域(残基400-410)，参见UniProt登录号P13473。LAMP-2B的功能包括分子伴侣介导的自噬，这是响应各种应激且作为具有较长生物半衰期的蛋白质的正常周转的部分，介导蛋白质的溶酶体降解的过程(Cuervo等人Science 273:501-503(1996)，Cuervo等人J.Cell Sci.113:4441-4450(2000)，Bandyopadhyay等人Mol.Cell.Biol.28:5747-5763(2008)，Li等人Exp.Cell Res.327:48-56(2014)，Hubert等人Biol.Open 5:1516-1529(2016))。LAMP-2B可能靶向GAPDH和MLLT11用于溶酶体降解。LAMP-2B可能是在自噬过程中自噬体与溶酶体的融合所需的。已提出，缺乏LAMP2的细胞表达正常水平的VAMP8，但未能在自噬体上累积STX17，这是自噬体和溶酶体之间的融合缺乏的最可能解释。LAMP-2B可能是自噬体的内容物的正常降解所需的。LAMP-2B可能是经由其在溶酶体蛋白降解中的功能，有效的MHCII介导的外源性抗原呈递所需的；通过内体/溶酶体区室中的蛋白酶生成的抗原肽被新生的MHCII亚基捕获(Crotzer等人Immunology 131:318-330(2010))。
因此，LAMP-2B的功能变体包括能够介导前述功能中的任一种的LAMP-2B片段。在一些实施例中，LAMP-2B的功能片段包括腔结构域、跨膜结构域和细胞质结构域中的一种或多种。在一些实施例中，LAMP-2B的功能变体包含关于天然LAMP-2B的一个或多个C末端或N末端缺失。在一些实施例中，LAMP-2B的功能变体包含关于天然LAMP-2B的一个或多个内部缺失。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“等同”或百分比“同一性”指如使用下述序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查所测量的，当在比较窗口或指定区域上就最大对应性进行比较且比对时，两个或更多个序列或子序列是等同的，或者具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域上与参考序列共享至少约80％的同一性，例如至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，所述参考序列例如如本文所述的LAMP-2多核苷酸或多肽序列。此类序列随后被说成是“基本上等同的”。该定义还指测试序列的互补体。优选地，同一性存在于长度至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，例如，在长度为50、100、200、300、400个氨基酸或核苷酸的区域上，或在参考序列的全长上。
对于序列比较，通常地一个序列充当测试序列与其进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机内，必要时，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数，计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。对于核酸和蛋白质与LAMP-2核酸和蛋白质的序列比较，使用BLAST和BLAST 2.0算法和默认参数。
如本文使用的，“比较窗口”包括对选自20至600、通常为约50至约200、更通常为约100至约150的邻接位置数目中的任何一个的区段的提及，其中在两个序列进行最佳比对后，序列可以与具有相同数目的邻接位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的最佳序列比对可以例如通过以下进行：Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，Pearson&Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法，这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wl中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或手动比对和目视检查(参见例如，Ausubel等人，编辑，Current Protocols inMolecular Biology(1995年增刊))。适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的例子是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别在Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)以及Altschul等人，Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1977)中进行描述。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)(在万维网上ncbi.nlm.nih.gov/处)公开获得。
两个核酸序列或多肽基本上等同的指示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体是免疫交叉反应的，如下文所述。因此，多肽通常与第二多肽基本上等同，例如，其中两种肽仅因保守取代而不同。两个核酸序列基本上等同的另一个指示是两个分子或其互补体在严格条件下彼此杂交。两个核酸序列基本上等同的又一个指示是可以使用相同的引物来扩增序列。
如本文使用的，“施用”指局部和全身施用，例如，包括肠内、肠胃外、肺部和局部/经皮施用。可用于本文所述方法的用于化合物(例如，编码一种或多种LAMP-2同种型的多核苷酸)的施用途径包括例如经口(口服(P.O.))施用、鼻或吸入施用、作为栓剂施用、局部接触、经皮递送(例如，经由经皮贴剂)、鞘内(IT)施用、静脉内(“iv”)施用、腹膜内(“ip”)施用、肌内(“im”)施用、病灶内施用或皮下(“sc”)施用，或向受试者植入缓释装置，例如微型渗透泵、储库制剂等。施用可以通过任何途径，包括肠胃外和经粘膜(例如，经口、鼻、阴道、直肠或经皮)。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、动脉内、肾内、尿道内、心内、冠状动脉内、心肌内、皮内、硬膜外、皮下、腹膜内、心室内、离子电渗和颅内。其它递送模式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注、经皮贴剂等。
术语“校正”指临床参数相对于受试者中的基线水平的改变，其导致参数正常化到等于或大致等于在没有达农病的个人中观察到的该参数水平的水平。
术语“改善”指临床参数相对于受试者中的基线水平的改变，其导致参数增加(或降低)到显著大于(或小于)在治疗施用之前在受试者中观察到的该参数水平的水平。例如，改善可以包括受试者的心脏中的自噬泡的大小或数目的减少。
术语“全身施用(systemic administration)”和“全身施用(systemicallyadministered)”指将化合物或组合物施用于哺乳动物的方法，使得化合物或组合物经由循环系统递送至体内部位，包括药物作用的靶向部位。全身施用包括但不限于经口、鼻内、直肠和肠胃外(例如，除通过消化道外，例如肌内、静脉内、动脉内、经皮和皮下)施用。
当例如关于化合物(例如，LAMP-2多核苷酸)和/或其类似物和另一种活性剂使用时，术语“共施用”或“同时施用”指这样施用化合物和/或类似物和活性剂，使得两者可以同时达到生理效应。然而，这两种药剂无需一起施用。在某些实施例中，一种药剂的施用可以先于另一种的施用。同时的生理效应不一定要求两种药剂同时存在于循环中。然而，在某些实施例中，共施用通常导致两种药剂以关于任何给定剂量的其最大血清浓度的显著分数(例如20％或更大，例如30％或40％或更大，例如50％或60％或更大，例如70％或80％或90％或更大)同时存在于体内(例如血浆中)。
术语“治疗有效量”指实现所需结果所必要的基因治疗载体的量和/或剂量和/或剂量方案，例如，一种或多种LAMP-2同种型的表达增加，其量足以减少特征在于自噬受损或缺陷的疾病(例如达农病)的最终严重程度。
术语“有效量”指实现所需结果(例如免疫抑制药物的免疫抑制效应)所必要的基因治疗载体的量和/或剂量和/或剂量方案。
短语“施用的原因”指由医学专业人员(例如，医生)或控制受试者的医疗护理的个人采取的动作，其控制和/或允许所讨论的药剂/化合物对受试者的施用。施用的原因可以涉及诊断和/或确定适当的治疗或预防方案，和/或对于受试者开出特定药剂/化合物的处方。此类开处方可以包括例如起草处方表格、注释病历等等。
如本文使用的，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指延迟该术语应用于其的疾病或状况、或者此类疾病或状况的一种或多种症状的发作、延缓或逆转其进展、减少其严重程度、或者减轻或预防其。术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”还包括预防、缓和、改善、减少、抑制、消除和/或逆转疾病或状况的一种或多种症状。
术语“缓和”指该病理状况或疾病的一种或多种症状的减少或消除，和/或该病理状况或疾病的一种或多种症状的发作速度或严重程度的减少或延迟，和/或该病理状况或疾病的预防。在某些实施例中，病理状况或疾病的一种或多种症状的减少或消除可以包括，例如，LAMP-2的一种或多种同种型的表达水平的可测量和持续增加。
如本文使用的，短语“基本上由……组成”指方法或组合物中叙述的活性药物试剂的属或种，并且还可以包括其自身不具有用于所叙述的适应症或目的的基本活性的其它药剂。
术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换地指人受试者。
术语“基因转移”或“基因递送”指用于将外来DNA可靠地插入宿主细胞内的方法或系统。此类方法可以导致非整合的转移DNA的瞬时表达，转移复制子(例如附加体)的染色体外复制和表达，或转移的遗传材料整合到宿主细胞的基因组DNA内。
术语“载体”在本文中用于(当单独出现时)指能够转移或转运另一种核酸分子的核酸分子。转移的核酸一般与载体核酸分子连接，例如插入其内。载体可以包括在细胞中指导自主复制或逆转录的序列，或者可以包括足以允许整合到宿主细胞DNA内的序列。“载体”包括基因治疗载体。如本文使用的，术语“基因治疗载体”指能够用于执行基因治疗，例如将编码治疗性多肽的多核苷酸序列递送至受试者的载体(例如AAV病毒粒子)。基因治疗载体可以包含在引入受试者内之时，编码治疗活性多肽例如LAMP-2B的核酸分子(“转基因”)，或可用于替换基因治疗的其它基因。有用的载体包括但不限于病毒载体。术语“AAV载体”和“AAV病毒粒子”在本文中可互换使用，以指包装到AAV衣壳内的载体基因组。
如本文使用的，术语“表达盒”指在适当的背景下能够驱动编码治疗活性多肽(例如，LAMP-2B)的多核苷酸(“转基因”)表达的DNA区段，所述治疗活性多肽掺入所述表达盒中。当引入宿主细胞内之时，表达盒尤其能够指导细胞的机器将转基因转录成RNA，其然后通常进行进一步处理并最终翻译成治疗活性多肽。表达盒可以包含在基因治疗载体中。一般地，术语表达盒排除对于5'ITR 5'以及对于3'ITR 3'的多核苷酸序列。
本说明书中提及且鉴定的所有专利、专利出版物和其它出版物个别地并明确地以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
实例
实例1：表达LAMP2B的重组AAV9载体
通过3质粒、无辅助病毒系统生成表达LAMP2B的重组AAV9载体。pAAV-LAMP2B转移质粒、pAAV-2/9包装质粒和pAd-Helper腺病毒辅助质粒瞬时转染到HEK293T生产细胞内，生成含有血清型9衣壳蛋白和侧接人LAMP2B表达盒的AAV2 ITR的重组AAV颗粒(AAV9.LAMP2B)。
AAV顺式转移质粒(pAAV-LAMP2B)的结构含有由源自AAV2的病毒ITR区侧接的转基因表达盒，如图1中描绘的。表达盒含有由嵌合启动子驱动的人LAMP2B编码序列，所述嵌合启动子含有CMV IE增强子(CMV IEE)、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、嵌合鸡β-肌动蛋白和兔珠蛋白内含子。表达盒还包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，并且由兔珠蛋白聚A信号(RGpA)终止。
实例2：临床前体外和体内功效研究
在来自达农病(DD)患者的iPSC衍生的心肌细胞中进行的体外研究指示了LAMP2B表达的剂量依赖性增加，以及对线粒体膜电位(DD中的心肌细胞的关键细胞特征)的有益作用。在体外表型校正的证实后，在临床相关的热量限制的LAMP2敲除(KO)小鼠模型中执行了LAMP-2B基因治疗的体内研究。
Lamp2 KO小鼠在2月龄时用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或以1×1013、5×1013和1×1014vg/kg剂量的AAV9.LAMP2B进行静脉内注射，并且在其在治疗后3个月的评估之前经受6周交替禁食。如图2和3中所示，在DD中特别受影响的器官(包括AAV9治疗的KO小鼠的心脏、肝脏和骨骼肌)中观察到人LAMP2B的剂量依赖性增加和LC3-II(自噬潮的标记物)的减少。
如图4中所示，AAV9.LAMP2B施用导致心脏超微结构的改善，包括在治疗后3个月以5×1013和1×1014vg/kg的剂量治疗的Lamp2 KO小鼠中可见的自噬泡更少。来自以1×1014vg/kg给药的Lamp2 KO小鼠群组的心脏超微结构得到显著改善，并且类似于对照WT动物。相反地，仅接受PBS的KO小鼠显示了在其心脏组织中的液泡数目增加。为了检查心脏功能，在研究终止之前执行有创血流动力学。如图11中所示，收缩力通过侵入性左心室内压(dP/dt最大值和dP/dt最小值)进行评估，并且发现与WT对照相比，在未治疗的PBS对照Lamp2 KO小鼠中是显著降低的。WT小鼠中的平均dP/dt最大值和dP/dt最小值分别为7050和-5550mmHg/s。在LAMP2KO小鼠中，平均dP/dt最大值和dP/dt最小值：对于PBS(n＝7)为3656和-3265mmHg/s，并且对于1×1013vg/kg(n＝7)为4197和-3542mmHg/s，对于5×1013vg/kg(n＝12)为5073和-3905mmHg/s，且对于1×1014vg/kg(n＝11)AAV9.LAMP2B治疗的组为4729和-3765mmHg/s。
如图12中所示，AAV9.LAMP2B显著改善了成年Lamp2 KO小鼠的心脏中的超微结构。如图13中所示，在3个月的时间点，通过有创血流动力学证实了心脏功能的显著改善，并且通过2×1014vg/kg的最高测试剂量，改善是剂量依赖性的。在该最高剂量下，心脏血流动力学与野生型表型是可比较的，从而提示了最大可能的功效和可能的最佳有效剂量。肝酶的显著减少提示了在AAV9给药动物中也观察到肝脏异常的改善。来自该研究的结果指示了，在2×1014vg/kg的有效剂量下，AAV9.LAMP2B介导的基因治疗是安全的，并且通过改善老年小鼠中的心脏生理学、自噬潮和肝脏异常，成功逆转了已建立的疾病表型。
实例3：临床前药理学
在Lamp2 KO小鼠中执行了安全性测量，包括临床病理学、组织病理学以及针对LAMP-2B基因治疗的免疫应答。血清化学实验对象组并未显示在PBS对照或用AAV9.LAMP2B载体给药的小鼠中的不良后果。相对于WT动物，在未治疗的PBS对照KO小鼠中注意到血清钾(K+)水平的显著增加。与注射PBS的Lamp2 KO对照小鼠相比，在用5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和2×1014vg/kg的AAV9.LAMP2B治疗的小鼠中，这些K+水平显著减少，恢复到预计的范围。在正常血清肌酸和血尿素氮水平的背景下升高的血清钾可能来源于过度的肌肉分解(Lehnhardt 2011)。因此，通过AAV9.LAMP2B施用观察到的血清钾的减少显示了LAMP-2B基因疗法治疗的小鼠中的肌病减少，这是DD的一个重要特征。心脏、肝脏和骨骼肌组织的组织病理学并未显示AAV9.LAMP2B治疗的样品的显著改变。通过qPCR检查了载体的生物分布，其揭示了在全身器官中的显著分布，其中在肝脏中注意到最高水平的载体基因组(vg)，与肝脏相比，在心脏和骨骼肌中具有1/10的vg且在脑中具有1/100的vg。脾脏和性腺显示出最低量的载体基因组分布。在用1×1014vg/kg和2×1014vg/kg的AAV9.LAMP2B给药的小鼠中，使用RT-qPCR在组织子集中检查了通过mRNA估计对转基因表达的定量。平均而言，心脏具有最高水平的人LAMP2B mRNA，紧随其后的是肝脏和骨骼肌。脑、肺、肾脏和性腺也显示了中等水平的人LAMP2B mRNA，并且在给药后6个月的时间点，在脾脏中检测到非常低的水平。
根据良好实验室规范(GLP)执行的本文所述的临床前研究并未显示与最多3×1014vg/kg的剂量相关的意外死亡率，身体、行为、形态学、血液学或生物化学异常。来自该研究的结果显示了，AAV9.LAMP2B介导的基因疗法证实了在Lamp2 KO小鼠中的DD表型中的安全性和持久益处。该研究证实了关于LAMP-2B基因治疗的IV(静脉内)施用的安全有效概况，并且指示了AAV9.LAMP2B的最小有效剂量在5×1013至1×1014vg/kg的范围内，证实了LAMP-2B基因疗法在人中用于治疗达农病的临床潜力。
实例4：临床前毒理学
另外，在2岁的非人灵长类动物(NHP)(食蟹猴)中执行102天的非GLP研究，所述动物用治疗载体以GLP鼠毒理学研究中测试的最高剂量水平(3×1014vg/kg)进行治疗。动物在装运前中预先筛查AAV9中和抗体。分配到治疗组和媒介物对照组的所有动物都证实了完全的血清阴性(在1:5、1:20、1:80稀释度下，没有病毒中和)。两只猴子被分配到治疗载体组(3×1014vg/kg)，而2只猴子被分配到媒介物对照组。在给药(静脉内注射到隐静脉内)之后，在基线时以及在第3、7、15、21、30、42、50、60、91和102天，对动物进行评估。不存在意外的死亡率或体重的显著改变。在多个时间点从两个群组中获得血液样品用于临床病理学。在AAV9.LAMP2B注射的组中，观察到在第7天的瞬时转氨酶增加以及在第7天伴随的血小板瞬时降低(在正常范围内)，没有任何病理后遗症。还注意到在研究第50天，肌酐激酶和乳酸脱氢酶的轻度升高(但在正常范围内)，没有伴随的临床毒性迹象。对于执行的任何其它血液学或生物化学评价，并未注意到其它显著的治疗相关效应。
实例5：LAMP-2B基因治疗临床研究
选择6.7×1013GC/kg的初始剂量用于临床研究。用于剂量递增的方法涉及在6.7×1013GC/kg和2.0×1014GC/kg之间的中间剂量的评估。
关于评估AAV9.LAMP2B的临床前研究的剂量单位以载体基因组(vg)/kg体重来表示。在本研究中施用的AAV9.LAMP2B的临床剂量表示为载体基因组拷贝数(GC)/kg，因为该命名法被视为如在制造过程中定量的研究材料的最佳描述。这两个单位术语(GC/kg和vg/kg)预期描述关于转基因数量的同一实体。
该研究将排除具有高预先存在的抗AAV9血清中和抗体滴度(抗AAV9中和抗体滴度>1:40)的受试者。具有合成或胆汁淤积性肝功能障碍(PT/INR>1.5×ULN；胆红素>1.5×ULN)证据的患者也被排除(最多10×ULN的转氨酶升高或最多2×ULN的GGT是允许的，因为这是DD的突出组分，并且被认为占优势地反映肌肉异常)。全身性皮质类固醇疗法将在AAV输注之前一天进行施用，在施用之后的几周过程中持续，并且在输注之后的8至12周之间减量至停药。
安全监测包括肝酶(包括转氨酶、胆红素、ALP和凝血参数)的频繁测试。还将评估血小板和综合凝血谱(包括PT/aPTT/纤维蛋白原/D-二聚体)，以及补体途径组分。还将获得血清和全血，用于评估针对病毒衣壳组分和LAMP-2B两者的潜在体液和细胞介导的免疫应答。
目标和终点
主要目标
·表征与含有人LAMP2B转基因(研究产品)的rAAV9衣壳的输注相关的安全性和毒性。
·关于安全性、毒性和初步功效，评估研究产品的一系列单一IV剂量。
·经由心内膜心肌活检，确定研究产品的输注是否导致心肌细胞(和骨骼肌)转导和基因表达(如通过心肌LAMP2B DNA、RNA和蛋白质的评价所确定的)，以确定是否存在疾病相关的组织学异常(自噬泡、肌原纤维紊乱)的校正，并且使得能够初步表征心肌细胞分子和组织学校正的程度。
·使得能够初步评价临床稳定性，如在研究产品输注之后的大约8–12周，通过医学、射线照相和心肺运动/生理参数确定的(在后续时间点进行类似评估以评估次要目标，如下文所述)。
次要目标
·确定关于其研究产品的输注导致心血管病理生理学的持续(在研究产品之后的6个月到3年)改善、稳定(或相对于历史对照的恶化率降低)的患者百分比，如通过医学评估、心脏结构和功能的射线照相评估、以及心肺运动/生理参数所确定的。
·确定其中心肌细胞含有校正的LAMP2B基因和/或蛋白质以及DD相关的组织学异常的改善的患者百分比，并且在可行时定量心肌中的遗传和组织学校正的程度。
·确定且表征对研究产品的免疫应答(免疫原性)，包括评估体液(抗体)和细胞(T淋巴细胞)抗AAV9和抗LAMP-2B蛋白活性。
·评估接受研究产品的患者的百分比，所述患者需要和/或接受后续心脏移植、LVAD、植入式心律转复除颤器或起搏器放置、用于心脏传导异常的电生理消融手术或用于心力衰竭的后续住院治疗。
·评估接受研究产品的患者的总体存活，包括所有患者且特别是接受以选择用于后续评估的剂量的研究产品的患者的1年和3年总体存活评价。
探索目标
·评估心肌细胞中的分子和组织学校正的证据与临床稳定或改善的参数之间的潜在关联性，并且评估心肌细胞分子/组织学校正与骨骼肌和血液中的LAMP2B基因/蛋白质证据之间的潜在关联性。
·评估肌肉损伤(包括CPK和转氨酶)和充血性心力衰竭(包括BNP、高敏肌钙蛋白)的血清学标记物，并且确定这些血液标记物的早期(即8–12周)改善是否可能是DD的临床、结构和组织学修饰的潜在替代物。
·评估接受研究产品的患者中的患者报告结局/生活质量(PRO/QOL)，如借助于堪萨斯城心肌病问卷(Kansas City Cardiomyopathy Questionnaire)(KCCQ-12)和PedsQL评估的。
·评估DD的非心血管方面的改善、稳定(或相对于历史对照的恶化率降低)的存在和程度，包括神经肌肉和眼科功能的评价。
终点
安全性终点
安全性和耐受性终点是：
·总体和按强度的治疗中出现的不良事件(TEAE)和SAE发生率。
·由研究者认为至少很可能与AAV9.LAMP2B有关的总体和按强度的TEAE和SAE发生率。
·需要心脏干预的患者比例，所述心脏干预包括心脏移植、植入式心律转复除颤器或起搏器放置、用于心脏传导异常的电生理消融手术或用于心力衰竭的后续住院治疗。
·针对AAV9.LAMP2B的免疫应答的表征，如通过针对AAV-9或LAMP-2B蛋白反应性的抗体或T淋巴细胞所证明的。
·肝毒性的证据，基于肝脏转氨酶(AST和ALT)、GGT、胆红素和ALP距离基线的改变。
·凝血病的证据，基于血小板计数、凝血酶原时间(PT或国际标准化比值(INR))、活化部分凝血活酶时间(aPTT)、纤维蛋白原、D-二聚体、凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)和补体组分(补体3(C3)、补体4(C4)和血清膜攻击复合物(sC5b-9))距离基线的改变。
·以下距离基线的改变：
-生命体征测量。
-安全性实验室测试结果。
-体格检查发现。
功效终点
功效终点包括心血管病理生理学的临床改善、稳定(或相对于历史对照的恶化率降低)的评价，如通过医学评估、心脏结构和功能的射线照相评估、以及心肺运动/生理参数所确定的。功效终点的初步评价将在最初的集中于安全性的随访过程中(在研究产品输注之后的最初8–12周)以及在更持久的(6个月到3年)随访期过程中发生。
研究设计
这是一项在DD患者中的非随机化、开放标签的1期研究。
在该1期研究期间，大约11–23个患者将接受研究产品(IP)的单次IV输注，其中患者的群组根据下文详述的指南接受以序贯地更高剂量水平的AAV9.LAMP2B。并不施用IP的研究场所可以参与试验。这些场所将执行初步筛查以及在IP给药之后的就诊。IP施用和紧随其后的研究就诊将在执行IP施用的研究场所执行。这预期减轻患者及其家人广泛旅行的负担。
计划在6个不同的群组中调查三个剂量水平。仅当确定在可比较剂量的成人群组内少于33％的患者已经历剂量限制性毒性(DLT)时，在儿童群体(8–14岁)中评估给定剂量的群组的给药才是可行的。仅当确定在先前的较低剂量群组内少于33％的患者已经历DLT时，其中成人或儿童患者接受更高剂量的群组的给药才是可行的。为了可对于DLT评价进行评估，患者必须已接受预期剂量的IP，并且在IP输注之后的8周期间保持可用于随访(除了在输注之后的最初8周期间具有被认为与研究产品有关的致命性AE的患者之外)。
以给定剂量水平的儿童患者(8–14岁)将仅在更年长的(成人和15–17岁)群组中的剂量水平的安全性确定之后开始。图8描绘了根据其中并未鉴定DLT的情形，群组中的计划入选的总体顺序。图9描绘了在任何给定群组内的入选顺序。基于先前群组中鉴定的安全性概况和直接益处的前景，将通过IDSMC做出关于群组扩展、后续群组开放(涉及增加或以其它方式修改研究产品剂量)、以及在后续临床开发中评估剂量的建议的决定。通过IDSMC的研究产品安全性的另外定期审查将在每个研究群组中关于患者的最初8周DLT评估期之后发生。
研究产品
研究产品(AAV9.LAMP2B)是一种基因治疗产品，其由含有具有ITR元件的人LAMP2B转基因的AAV9衣壳，包含CMV IEE、CBA启动子、CBA和兔珠蛋白内含子的CAG启动子，WPRE和RGpA组成，如在图1中显示且在实例1中描述的。
剂型
AAV9.LAMP2B的组合物由在适用于输注的缓冲液(200mM NaCl、10mM NaH2PO4、1％(w/v)蔗糖、0.01％泊洛沙姆188，pH 7.2±0.1)中配制的活性成分(以[3.0–6.0×1013vg/mL]的浓度且能够转导靶细胞以表达治疗蛋白LAMP2B的重组AAV9.LAMP2B病毒颗粒)组成。AAV9.LAMP2B作为冷冻产品提供给临床场所，并且AAV9.LAMP2B剂量的最终体积基于以千克(kg)计的患者重量和计算的AAV9载体基因组(vg)拷贝数/毫升(mL)进行预测。
待调查的剂量
在该1期研究期间，11–23个患者将接受研究产品的单次IV输注，其中最多3个特定的成人和儿童患者群组接受以根据下文指南的剂量水平的AAV9.LAMP2B。仅当确定在可比较剂量的成人群组内少于33％的患者已经历剂量限制性毒性(DLT)时，在儿童群体(8–14岁)中评估给定剂量的群组的启动才是可行的。三个AAV9.LAMP2B剂量水平将如下根据剂量递增设计进行调查：
·群组1：成人和15–17岁：6.7×1013GC/kg(n＝3)*
·群组2：成人和15–17岁：1.1×1014GC/kg(n＝2–4)
·群组3：成人和15–17岁：2.0×1014GC/kg(n＝2–4)
·群组1A：儿童8–14岁：6.7×1013GC/kg(n＝2–4)
·群组2A：儿童8–14岁：1.1×1014GC/kg(n＝2–4)
·群组3A：儿童8–14岁：2.0×1014GC/kg(n＝2–4)
·群组1按照先前的方案版本入选了3个患者
以给定剂量水平的AAV9.LAMP2B在儿童患者(8–14岁)中的评估将仅在更年长的(成人和15–17岁且一般能够提供同意的那些人)群体中的剂量水平的安全性确定之后开始。AAV9.LAMP2B将以基于总体重的剂量进行施用。如果患者是肥胖的(体重指数(BMI)>85％，按照疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)(CDC)生长图表，IP可以使用下文的休谟公式(Hume formula)以基于瘦体重(LBM)的剂量进行施用。LBM＝(0.32810×W)+(0.33929×H)-29.5336
该研究排除了具有预先存在的抗AAV9血清中和抗体滴度(>1:40)的患者。患者接受使用利妥昔单抗、他克莫司和皮质类固醇，用于抗AAV免疫原性应答的预防。利妥昔单抗在IP输注之前进行施用。他克莫司施用3个月并且在IP施用之前开始。皮质类固醇在治疗载体施用之前一天开始，然后每天一次直到治疗后的第8周，随后为在停药前的4周减量。他克莫司和利妥昔单抗作为免疫压制方案的部分的并入允许整体皮质类固醇施用的减少。
关于群组1的临床安全性概况
三个15岁及以上的患者的群组(群组1)接受以6.7×1013GC/kg剂量的LAMP-2B基因疗法，连同按照方案的伴随皮质类固醇。受试者特性显示于表1中。第二个患者和第三个患者也接受他克莫司。治疗方案和LAMP2B相对表达显示于表2中。并未注意到针对LAMP2B的显著的抗药物抗体(ADA)应答。
患者在接受IP后的几天内显示了一些全身症状(例如恶心、呕吐、腹痛和低烧)。如预计的，患者在IP施用之后发展了免疫应答。这种免疫应答与血细胞计数(血小板、白血细胞)减少、转氨酶升高、骨骼肌和心脏相关酶和肽水平升高相关。在治疗后大约1至2周发生的血小板计数减少与相应的D-二聚体增加以及C3和C4(补体部分)减少相关。在其它AAV基因治疗计划中已观察到血小板计数的减少，并且与针对AAV9衣壳的急性补体介导的免疫反应一致。迄今为止，用LAMP-2B基因疗法进行治疗的患者维持使用皮质类固醇，并未用依库珠单抗进行治疗。所观察到的血小板、D-二聚体和C3/C4水平的改变在几天后得到改善。
天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的增加已在其它AAV基因治疗计划中得到证实。所观察到的AST/ALT增加与胆红素高于正常范围的增加以及肝胆疾病的临床体征/症状无关。GGT(一种不受骨骼肌损伤影响的肝酶，与AST/ALT不同)的升高是较温和的，并且不超过大于5X基线的水平。对于群组1中的前三个患者，EliSpot测定对于AAV9衣壳和LAMP2B转基因两者均为阴性。因为距离基线的GGT增加已按比例低于距离基线的AST和ALT增加，所以这些AST和ALT增加在起源方面占优势地是骨骼肌。这也对于相关的CPK升高可见。群组1中的三个患者中的两个发展了与类固醇诱发的肌病一致的骨骼肌无力。随着皮质类固醇减量至停药，骨骼肌无力恢复。在治疗后的6个月、9个月和12个月，患者在家中是稳定的。
表1
表2
*与正常心脏组织相比，使用软件以盲法方式和表达来定量细胞染色的百分比面积。值代表3-14个切片的平均值。
**样品在第9个月获取
群组1的基因表达和功效终点
三个15岁及以上的患者的群组(群组1)接受以6.7×1013GC/kg剂量的LAMP-2B基因疗法，连同按照方案的伴随皮质类固醇。在LAMP-2B基因疗法治疗之后，分析了载体DNA拷贝数，如图5中所示。如表2中所示，所有三个患者都通过蛋白质印迹和免疫组织化学证实了心脏LAMP2B表达的证据，包括其对免疫压制方案的依从性有限的第一个患者。对免疫压制方案具有良好依从性的患者1002和1005证实了高水平的心脏LAMP2B表达连同临床生物标记物改善。在以6.7x1013 gc/kg的全身剂量治疗的患者的心脏活检中，LAMP2B基因表达被证实为相对于正常存在于68-92％的细胞中，如在9个月和12个月通过免疫组织化学(IHC)确定的，以及在一个患者中通过蛋白质印迹评价测量的正常LAMP2B蛋白表达的高达61％。如图6中所示，患者1002证实了在LAMP-2B基因疗法治疗之后稳固的LAMP2心脏表达。患者1002和1005显示了在以后的时间点IHC染色的百分比和水平的一致增加。
如图7中所示，三个患者中的两个证实了与心脏功能改善一致的关键临床生物标记物改善。心力衰竭的关键标记物脑利钠肽(BNP)在所有三个患者中都得到改善(即降低)，包括在具有确认的免疫压制方案依从性的患者1002和1005(图7B和7C)中的大于50％。肌酸激酶心肌带(CPK-MB)在患者1002和1005中或得到改善或稳定。值得注意的是，如通过电子显微镜检查评价的，存在达农病理学的标志自噬泡的明显改善。如表3中所示，具有确认的免疫压制方案依从性以及在9个月和12个月的随访的患者1002和1005证实了心输出量的改善，如通过有创血流动力学测量的。因为达农病患者无法独立地改善，所以在本研究中的所有三个患者中观察到的益处具有临床意义，并且对这种在其它方面破坏性的疾病提供了转化基因治疗方法。
表3
*第9个月
剂量限制性毒性的定义
剂量限制性毒性(DLT)定义为如下在研究产品施用后8周内发生的任何AE的出现：
·美国国家癌症研究所AE通用术语标准(National Cancer Institute CommonTerminology Criteria for AEs)(NCI CTCAE)，5.0版，3级或更高级别的输液相关反应。
·尽管支持疗法，但与肝损伤相关的4级转氨酶升高持续超过2周。
·使用支持性方案并未改善或消退的3级转氨酶升高。
·其它3级或更高级别的AE，除了3级恶心/呕吐、腹泻、便秘、发烧、疲劳或在72小时内消退为<3级的皮疹，或在2周内消退为<3级的与临床症状无关的3级实验室异常之外。
DLT将不考虑研究者归因的因果关系进行确定。在其中很可能存在与研究疗法无关的病因学的背景下(例如继发于机动车事故的3级疼痛)，可以做出事件并不代表DLT的确定，但需要通过IDSMC的评估。关于每个患者的基线值将基于在IP施用之前的6个月内的可用临床数据。
剂量递增程序
在群组内的入选将这样错开，使得在群组中的后续患者可以接受IP之前，必须跟踪初始患者至少8周。预料利妥昔单抗和他克莫司的添加减少在IP施用之后的免疫应答。在已证实免疫应答的压制后，伴随IDSMC同意，群组中的后续患者之间的8周持续时间可以缩短。每个群组将由至少2个患者组成。如果群组中的前2个患者中的1个经历了DLT，则另外2个患者将入选该群组。为了开始后续(更高剂量或儿童)群组的启动，先前群组中的所有患者必须在IP输注之后已跟踪至少8周，并且已存在DLT消退或稳定的证据。以给定剂量水平的儿童患者(8–14岁)将仅在群组1、2和3(成人和15–17岁)群组中的剂量水平的安全性确定之后开始。
如果确定6.7×1013GC/kg(低剂量)的施用导致在群组1中的最初2或3个患者中伴随可接受的安全性的亚治疗性LAMP-2B表达，则将启动以1.1×1014GC/kg的中间剂量的群组2。如果6.7×1013GC/kg被视为亚治疗性的，则并不执行以6.7×1013GC/kg剂量的群组1A(儿童8–14岁)。仅在以1.1×1014GC/kg的中间剂量的群组2(成人和15–17岁)完成后、以及通过IDSMC的安全性审查之后，才开始入选以1.1×1014GC/kg的中间剂量的群组2A(儿童8–14岁)。参考图8。
研究产品施用
患者将在第0天时接受经由IV输注的AAV9.LAMP2B基因治疗产品；预期IP将作为单剂量输注给患者。患者将在具有关于心血管病症的研究治疗剂的经验的设施中的住院患者(住院治疗)的背景下接受研究产品。患者将保持住院治疗48–72小时，并且可能在研究疗法输注之后保持住院治疗最多14天，并且其后可以由治疗研究调查员自行决定出院。每日一次的评价将持续到第7天，并且可以由研究调查员自行决定延长。
治疗前用药和伴随治疗
用于抗AAV免疫原性应答的预防将在研究产品的输注之前和之后进行施用。除皮质类固醇之外，还将施用利妥昔单抗和他克莫司来压制针对IP的免疫应答。
治疗前用药
在利妥昔单抗输注之前的预先用药：
·对乙酰氨基酚–15mg/kg PO(最多1g)
·苯海拉明–12.5至50mg PO，或按照产品插页
·利妥昔单抗：患者将在IP输注之前的第-14天和第-7天时接受剂量为750mg/m2的利妥昔单抗。
·皮质类固醇：患者将接受剂量为1mg/kg体重的泼尼松(经口或IV)，从研究产品输注前一天(第-1天)开始，然后每天一次直到治疗后的第8周，其后随后为在到第3个月的停药之前的4周减量；在其中增强的免疫压制疗法(即利妥昔单抗、他克莫司)作为预防进行施用的背景下，皮质类固醇减量可能在较早的时间点开始，包括在IP施用之后的最初4周内，由研究调查员与申办方的医学监测员一起自行决定。
-在其中泼尼松导致无法接受的AE或不可用的背景下，甲泼尼龙或地塞米松可以以等价剂量(0.8mg/kg甲泼尼龙；0.15mg/kg地塞米松)替代。
-在肝酶(胆红素或转氨酶)增加超过基线或可归因于研究产品的其它AE的背景下，皮质类固醇减量可能延长超过4周的时期。
-在不可耐受的皮质类固醇相关AE的背景下或在如上文指出的增强的预防性免疫压制的背景下，皮质类固醇减量可能早于第8周开始，由研究调查员与申办方的医学监测员共同决定。
-待共施用以预防皮质类固醇并发症的用药可以依照机构标准给予，并且应该包括关于耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jirovecii)肺炎(PCP)、胃肠道溃疡和便秘的预防。如果不存在机构指南，则这些可能包括且不限于每周3次的阿托伐醌或甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、H2拮抗剂(即雷尼替丁)或质子泵抑制剂(即奥美拉唑)、以及每天一次以年龄/重量适当的剂量进行施用的伴随或不伴随泻药的大便软化剂(即多库酯)。
·他克莫司：患者将接受以2个分份剂量每天的口服他克莫司。剂量将根据需要基于他克莫司的谷血清水平进行调整，以维持2–5ng/mL的水平，其中施用从第-7天时开始直到第3个月。他克莫司可以由研究调查员自行决定停药。
·在皮质类固醇疗程期间的支持性用药：按照机构实践，患者将接受关于耶氏肺孢子虫肺炎(PJP/PCP)预防、胃肠道溃疡和便秘的预防。
·另外的治疗前用药：在研究产品的输注之前不需要，但如果机构指南要求AAV研究药剂的输注，则可以考虑；此类药剂可能包括对乙酰氨基酚(扑热息痛)和/或组胺能H1-或H2-拮抗剂。
伴随(支持性护理)用药：
另外的支持疗法可以由研究调查员自行决定在IP施用之前或之后进行施用，以预防或治疗不利效应。这些可能包括但不限于：
·皮质类固醇
·在补体激活的背景下的依库珠单抗。在依库珠单抗施用之前，患者必须已接受如对于年龄和健康状况适当的，如通过疾病控制中心(Centers for Disease Control)推荐的脑膜炎球菌疫苗接种。脑膜炎球菌疫苗接种可以在接受研究产品之前通过研究场所进行施用；
·在凝血病的背景下，血小板或血浆制品的输液；
·止吐药(例如昂丹司琼)；
·在嗜中性粒细胞减少症的背景下的生长因子(例如G-CSF)；
·在输液相关反应的背景下的止痛药和消炎药
患者纳入标准
患者必须满足所有下述标准(并且不满足任何排除标准)，以对于研究参与是合格的：
1.具有确认的LAMP2突变的DD诊断。
2.如通过在ECG、超声心动图、钆增强心脏MRI或电生理学研究上的至少一项异常发现证明的心脏牵涉。
3.关于群组1、2和3，年龄≥15岁；对于群组1A、2A和3A，年龄8–14岁。
4.性别男性。
5.NYHA II或III级。如果在6MWT期间无法行走≥450米，则NYHA I级患者是合格的。
6.如通过以下定义的足够的血液学功能：
a.血红蛋白≥10g/dL(6.2mmol/L；1级贫血，按照NCICTCAE 5.0版)。
b.嗜中性粒细胞绝对计数≥1,500/mm3(1.5×109/L；≤1级嗜中性粒细胞减少症)。
c.血小板计数≥75,000/mm3(75×109/L；≤1级血小板减少症)。
7.如通过以下定义的肝功能：
a.AST和ALT≤10.0×ULN或GGT≤2×ULN(DD中的转氨酶升高被广泛视为来源于肌肉损伤；因此关于这些转氨酶的上限相对较高以及GGT水平的考虑，以及另外的肝脏合格性标记物胆红素和PT/INR的存在)。
b.血清胆红素≤1.5×ULN(即胆红素增加级别)。
c.PT/INR≤1.5×ULN(在不存在抗凝的情况下)
d.在肝脏超声时不存在肝硬化
8.如下的肾功能：肌酐≤1.5×ULN；(如果肌酐>1.5ULN，则要求肌酐清除率≥50mL/分钟/1.73m2，如通过肾脏病饮食改良(Modification of Diet in Renal Disease)(MDRD)方程式(Stevens 2006)，修订的Schwartz公式(用于18岁以下的患者)(Schwartz2009)计算的，或24小时尿收集)。
9.能够提供知情同意书(对于成年患者和儿童患者的父母/法定监护人)和同意(对于15–17岁的患者)。
10.能够遵守研究程序，包括研究疗法和随访评估。
11.在6MWT期间能够独立行走>150米。
12.患者已接受如对于年龄和健康状况适当的，通过疾病控制中心推荐的脑膜炎球菌疫苗接种。
患者排除标准
符合下述标准中的任一项的患者从研究参与中排除：
1.在入选之前的30天内使用正性肌力药、血管扩张剂或利尿剂的IV疗法(即，患者必须在经口药物疗法时是稳定的)。
2.先前的心脏移植或先前的其它器官(肺、肝脏、其它)移植。
3.在入选之前的30天内的心脏手术、经皮肤心脏介入或瓣膜成形术。
4.LVAD的存在或要求。
5.在入选之前的90天内的心肌梗塞、不稳定型心绞痛、中风或TIA。
6.在超声心动图上的显著(大于中度)瓣膜狭窄或反流。
7.需要机械通气。
8.抗AAV9中和抗体滴度>1:40。
9.涉及使用研究药剂用于治疗CHF或心肌病的任何其它临床调查中的同时入选。
10.活动性乙型或丙型肝炎感染(包括具有阳性HBsAg、HbeAg、或可检测的HBV或HCV病毒载量的患者)。具有先前的、充分消退的HBV或HCV的患者是合格的。
11.重大医疗状况，包括记录的HIV感染，活动性病毒性肝炎或其它肝炎，控制不佳的高血压或糖尿病，控制不佳的心律失常，或者不受控制的病毒、细菌或真菌感染。
12.研究者认为致使患者不适合研究参与或处于高于研究参与的可接受风险中的任何伴随的医学或精神病学状况。
13.活动性血液学或实体器官恶性肿瘤，不包括非黑色素瘤皮肤癌或其它原位癌。如果在过去3年内不存在活动性恶性肿瘤的证据，则具有先前切除的实体器官恶性肿瘤或确定治疗的血液恶性肿瘤的患者可能是合格的。
14.他克莫司使用的任何禁忌症，其包括对他克莫司或HC-60(聚氧乙烯60氢化蓖麻油)的超敏反应。
研究持续时间
在第0天时的研究产品施用前大约60天内，对患者进行筛查并且具有执行的筛查评价。所有患者都计划在该方案的主持下，在研究产品施用后跟踪36个月。将评价总体存活，并且选择停止随访的其它组分的患者(除非在健康状况的严重恶化的背景下，否则强烈建议不要这样做)；为此类患者提供与研究人员保持联系用于评估总体健康状况和存活的选项。在随访期结束后，患者将进入长期随访(LTFU)研究，允许在IP施用后另外2至5年的随访。
长期随访
在1期安全性终点(输注后的最初8–12周)和后续随访(输注后的最初3年)的评价之后；对于另外2–5年(总共5–8年，包括研究规定的3年随访在内)每隔一定时间进行关于安全性和毒性(即AE)、总体存活、总体健康状况(包括关于心脏移植的需要和其它不良健康结果)的持续随访。将计划5年的长期随访，但如果在前2年期间并未鉴定可归因于研究疗法的严重AE，则将重新评估。
如果确定在研究期间并未鉴定严重的药物不良反应，则将计划另外2年的长期随访，具有取决于与研究产品有关的AE的程度、严重程度和消退的更长随访(最多5年)。
事件时间表和研究程序
事件时间表
研究产品将在第0天时经由IV输注进行施用。在研究产品输注后，患者将在专门的研究设施中保持住院治疗或住院至少48–72小时，以及输注后最多14天，由研究调查员的临床判断自行决定。IP输注后，患者应该以图10A-10D中概述的频率参加研究就诊。对于研究产品之后的7天，每天执行一次评价。每日评估可能在第7天后继续。
随访就诊将涉及在研究产品的输注之后的几天、几周、几个月和几年内发生的一系列临床、临床实验室、细胞和遗传、心脏成像和心脏生理学评估。在研究产品输注之前和之后的选定时间点，还需要心内膜心肌活检(经由右心室的中央静脉通路导管插入术执行)和骨骼肌活检。
关于心肌细胞中的LAMP2B基因和蛋白质的证据(以及DD组织学的组织学评估，包括自噬泡的定量)的跟踪观察，将在输注后的第8周以及第6、12和36个月经由心内膜心肌活检1发生。如随后详述的，将同时评价另外的侵入性较小的评价，包括骨骼肌活检、LAMP2B血液水平(血浆(LAMP-2B蛋白)和单核细胞(LAMP2B DNA)以及心肌病和CHF的其它血清学和射线照相参数的评估，具有鉴定心肌中的分子和组织学改善的潜在替代标记物的探索性意图。详细的事件时间表呈现于图10A-10D中，其脚注如下：
1.筛查就诊评价将在60天时期内执行。在入选之前作为护理标准的部分执行的评价可以作为筛查评价用于研究，并不需要重复(基于研究调查员与申办方协商后的判断)。
2.基线就诊评价可以在患者已完成筛查就诊并已满足所有纳入标准和排除标准后执行。所有评价必须到第-1天和研究产品的施用之前完成。基线就诊评价无需在利妥昔单抗和他克莫司治疗已开始前完成。
3.在筛查就诊期间，全面的医疗史将包括任何有关的心血管和其它潜在的疾病相关的既往事件，包括住院治疗和心脏介入；还将记录家族病史。
4.在筛查就诊和第-1天期间的伴随用药和手术应该包括在先前30天期间的任何用药和手术。在随访就诊期间，这应该包括在最近的先前评估之后的任何用药和手术。
5.身高将在筛查就诊时以及其后每年收集一次。
6.生活质量/患者报告结局(Patient Reported Outcomes)问卷将包括KCCQ-12和PedsQL。
7.第1天到第7.8天的每日实验室评价。实验室评价每周最多执行3次。
9.血清膜攻击复合物(sC5b-9)在研究产品施用后的方案指定时间点是必需的。取决于患者的临床状况，以及由研究者自行决定，可以在另外的时间点或更频繁地执行测试。
10.在筛查就诊期间的病毒血清学应该包括HIV、HBV和HCV病毒载量，以及包括HBsAg、HBeAg和HBsAb的全面HBV抗原/抗体实验对象组。
11.心脏血清学将包括CHF的潜在标记物，包括BNP、CK-MB和肌钙蛋白-I水平。
12.针对研究产品(AAV9和LAMP-2B)的免疫应答将包括血清(抗药物抗体(ADA)；IgG、IgM)和外周血T淋巴细胞(ELISpot)的评估。
13.将收集全血，对于血清、血浆和PBMC(仅用于筛查评价)进行处理，并贮存用于潜在的探索性测定，包括血清和血细胞中的LAMP2水平评估。研究ICF为患者提供了提供或拒绝贮存样品可以用于方案中未指定的潜在另外的未来研究的同意书的机会。
14.将在研究产品输注之后收集筛查唾液、尿、粪便和血液(血浆)样品，用于载体颗粒脱落的评估。每种体液/物质的评估将如指示的继续，直到对于给定的流体/物质存在两次阴性评估(或当载体水平已在低水平或可忽略不计的水平下达到平台时)，在此时不需要后续评估。
15.将经由唾液或血液(单核细胞)借助于心律失常和心肌病实验对象组进行基因测序，以确认且定义LAMP2突变。如果LAMP2基因型未被定义为致病性的，则将执行来自分离的外周血单核细胞或活检组织的LAMP2的蛋白质评价，以确认LAMP2缺陷。
16.当不因植入起搏器、除颤器、其它留置装置或医学状况(即，按照机构指南，肾功能障碍排除钆造影剂的使用)的存在禁忌时，将执行含钆MRI。在肾功能障碍的背景下，可以由会诊放射科医生自行决定或依照机构指南利用非钆造影剂。在其中MRI禁忌的背景下，可以使用CT扫描。
17.在可行时，对于初始和后续评估，应该在一天中的相似时间执行6分钟步行。在随访评价期间，应该尽可能不要在同一天时执行6分钟步行测试和心肺运动测试。
18.利妥昔单抗前驱用药、对乙酰氨基酚和苯海拉明将在利妥昔单抗输注之前30–60分钟给予。关于细节，参考药剂手册(Pharmacy Manual)。
19.皮质类固醇将从第-1天时开始，以泼尼松(IV或PO)1mg/kg(或甲泼尼龙或地塞米松等价物)的剂量每天进行施用，直到W8。皮质类固醇减量将在研究产品之后的W8(第56天)时开始，具有到研究产品之后的3个月的计划停药(d/c)。更延长的减量或者在第56天之前或之后的时间点开始减量由治疗研究者与研究医学监测员共同决定。可以按照机构标准提供用于皮质类固醇施用的支持性用药。
血清中的中和抗AAV9抗体滴度
按照事件时间表(图10A-10D)，用于确定血清中的中和抗AAV9抗体滴度的血液样品将在筛查时；第-1天、第2周、第4周、第8周、第3个月、第6个月、第12个月、第24个月、第36个月进行收集。抗AAV9中和抗体滴度>1:40的患者对于研究参与是不合格的。
肝脏超声
除胆红素、PT/INR和转氨酶水平的实验室评价之外，还将在筛查时执行肝脏的超声，以评估与肝硬化或其它肝脏损害一致的发现。如果临床上指示，则可以执行后续(输注后)超声。
安全性评价
生命体征
待测量的生命体征包括收缩压/舒张压、脉搏、呼吸率、脉搏血氧饱和度和体温，并且将依照机构标准执行。按照事件时间表(图10A-10D)，生命体征将在每一次研究就诊时进行测量。
身高和重量
身高(cm)将在筛查时以及其后每年测量一次。按照事件时间表(图10A-10D)，重量(kg)将在筛查时；第-1天；从第1周到第8周每周一次；每3个月一次(第3个月–第12个月)；以及每6个月一次(第12个月–第36个月)进行测量。在第-1天时获取的重量测量将用于计算患者的剂量。
临床和体格检查
按照事件时间表(图10A-10D)，全面体格检查(包括体力状态、一般外观；头、眼、耳、鼻和喉；心血管；皮肤病、腹部；泌尿生殖系统；淋巴结；肝；肌肉骨骼；呼吸系统；和神经系统)将在筛查时；第-14天和第-7天；第-1天；第0天；从第1天到第7天每天一次；从第2周到第8周每周一次；每3个月一次(第3个月–第12个月)；以及每6个月一次(第12个月–第36个月)进行。
血液学、凝血研究和化学
用于临床实验室测试，包括CBC和分类、凝血研究和化学的血液样品，将如下文和事件时间表(图10A-10D)中指定的执行。临床实验室测试将由研究者或合格的指定人员(例如，医生的助理、执业护士)执行且审查。将确定下述临床实验室参数：
·血液学：血红蛋白、血细胞比容、红细胞(RBC)计数、平均细胞体积(MCV)、平均细胞血红蛋白浓度(MVHC)、血小板、白血细胞(WBC)计数和分类，包括嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
-化学：钠、钾、氯化物、二氧化碳(或碳酸氢盐)、血尿素氮(BUN)、肌酐、葡萄糖、ALP、ALT、AST、胆红素、GGT、钙、镁和磷。
血液学和化学评估将在筛查时；第-1天；从第1天到第7天每天一次；从第2周到第4周(血液学)，到第8周(化学)每周最多3×；每3个月一次(第3个月–第12个月)；以及每6个月一次(第12个月–第36个月)执行。在筛查就诊期间，如果血清肌酐>1.5×ULN，则可以计算肌酐清除率(CrCl)，并且如果如通过MDRD方程式计算的，CrCl>50mL/分钟/1.73m2，则患者将被视为合格的。
-凝血研究：PT(和/或INR)、aPTT、D-二聚体、凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)和纤维蛋白原。评估将在筛查时；第-1天、第2天、第4天、第7天；从第2周到第8周每周一次；每3个月一次(第3个月–第12个月)；以及每6个月一次(第12个月–第36个月)执行。
-补体：C3、C4和sC5b-9膜攻击复合物。
C3和C4评估将在筛查时；第-1天、第1天、第3天、第5天、第7天；从第2周到第8周每周最多3×；每3个月一次(第3个月–第12个月)；以及每6个月一次(第12个月–第36个月)执行。sC5b-9评估将在筛查时；第-1天；从第1天到第7天每天一次；在第2周期间每周最多3×；从第3周到第8周每天一次；第3个月和第6个月执行。另外的临床实验室测试可以由研究调查员自行决定执行。
心脏血清学
用于心脏血清学的血液样品将按照事件时间表(图10A-10D)进行收集。待测量的参数包括：
·在筛查时；第-1天，在第2周、第4周、第6周、第8周期间一次；每3个月一次(第3个月–第12个月)；以及每6个月一次(第12个月–第36个月)收集的BNP
·在筛查时；第-1天，第7天，从第2周到第8周每周一次；每3个月一次(第3个月–第12个月)；以及每6个月一次(第12个月–第36个月)收集的CK-MB
·在筛查时；第-1天、第2天、第4天、第7天；从第2周到第8周每周一次；每3个月一次(第3个月–第12个月)；以及每6个月一次(第12个月–第36个月)收集的高敏肌钙蛋白水平
尿分析
按照事件时间表(图10A-10D)，用于比重、pH、蛋白质、葡萄糖、酮、血液、尿白细胞酯酶的尿样品将在筛查时；第7天、第4周、第8周；在第12个月、第24个月和第36个月期间收集一次。
免疫原性
按照事件时间表(图10A-10D)，还将收集用于免疫原性的血液样品，用于确定全血和血清中的体液(抗体)和细胞(T淋巴细胞)抗AAV9和抗LAMP-2B蛋白活性；还将收集IgG和IgM。用于抗体评估的血液样品将在筛查时；第7天；在第2周、第4周、第8周、第3个月、第6个月、第12个月、第24个月和第36个月期间收集一次。用于细胞评估的血液样品将在筛查时；在第4周、第8周、第3个月、第6个月、第12个月、第24个月和第36个月期间收集一次。用于IgG和IgM评估的血液样品将在筛查时；第-1天、第2天、第4天、第7天；在第4周、第8周、第3个月和第6个月期间收集一次。
载体脱落
按照事件时间表(图10A-10D)，血液(血浆)、唾液、尿和粪便样品将在筛查时；第3天，在第2周、第4周、第8周、第3个月、第6个月和第9个月期间收集一次，用于载体颗粒脱落的评估。每种体液/物质的评估将如指示的继续，直到对于给定的流体/物质存在两次阴性评估(或当载体水平已在低水平或可忽略不计的水平下达到平台时)，在此时不需要后续评估。
不良事件
将记录从知情同意书和同意(如果适用的话)的提供起发生的所有AE。这包括患者自发报告的AE，通过研究者观察到的那些AE，以及在计划的研究中心就诊期间，通过研究者回答开放式问题而引发的那些AE。待系统地记录的信息包括AE的类型、发作和消退的日期、严重程度以及所察觉到的与实验治疗的关系。每种AE的严重程度将基于NCI CTCAE 5.0版进行评定。
功效评价
心电图
按照事件时间表(图10A-10D)，十二导联ECG将在筛查时；第-1天；第1天；从第2周到第8周每周一次；每3个月一次(第3个月–第12个月)；以及每6个月一次(第12个月–第36个月)执行。
超声心动图
按照事件时间表(图10A-10D)，超声心动图将在筛查时；第4周、第8周；每3个月一次(第3个月-第12个月)；以及每6个月一次(第12个月–第36个月)执行。超声心动图的组分包括左心室射血分数(LVEF)的评价，左心室和右心室尺寸(例如，LV收缩末期和舒张末期尺寸、体积和指数，间隔壁和后壁厚度以及LV流出道尺寸)，向心性肥大和舒张模式的评价，瓣膜狭窄和反流的评价，壁运动异常的评价，肺动脉压，IVC大小和随着呼吸的改变，心包，LV质量，左心房(LA)直径和体积，等容舒张时间，多普勒测速，整体纵向应变和左心室流出道(LVOT)分级。
纽约心脏协会(New York Heart Association)(NYHA)分类
NYHA分类提供了根据症状的严重程度对心力衰竭程度进行分类的简单方法，如表4中所示。它基于患者在体力活动期间受限的程度将他们置于四个类别之一。按照事件时间表(图10A-10D)，NYHA评估将在每一次研究就诊时执行，除了基线就诊之外。
表4
心脏磁共振成像
当不因植入起搏器、除颤器、其它留置装置或医学状况(即，按照机构指南，肾功能障碍排除钆造影剂的使用)的存在禁忌时，将执行含钆MRI。在肾功能障碍的背景下，可以由会诊放射科医生自行决定或依照机构指南利用非钆造影剂(即，ferumoxytol)。按照事件时间表(图10A-10D)，评估将在筛查；第8周、第6个月、第12个月、第18个月、第24个月、第30个月和第36个月期间执行。
心脏MRI将涉及IV钆的注射以及在估计的30–40分钟总扫描时间内的多个序列采集。评价将包括LVEF，关于体表面积(BSA)的LV质量指数，最大LV壁厚度，关于最大壁厚度的z评分，LV舒张末期和收缩末期体积，LA直径、体积和体积指数，后期钆增强(LGE)的评价和LGE模式(Raja2018)。另外的评价将包括静息灌注心肌血流量(MBF)、细胞外体积(钆前后的T1图)和右心室射血分数(RVEF)。在其中MRI是禁忌的背景下，可以使用具有静脉内造影剂的心脏CT扫描代替MRI。
六分钟步行测试
6MWT是一项实用且简单的测试，其需要100英尺的走廊，但不需要运动器材或关于技术人员的高级培训。该测试测量患者在6分钟的时期内可以在平坦、坚硬的表面上快速行走的距离，并且从而是DD患者中逐渐受损的重要每日活动的定量评价。在筛查就诊期间，患者必须能够在6MWT期间独立行走>150米，以对于研究参与是合格的。另外，如果Ross I级患者在6MWT期间无法独立行走至少450米，则他们将被视为合格的。
按照事件时间表(图10A-10D)，6MWT将在筛查时；第8周、第3个月、第6个月、第12个月、第18个月、第24个月、第30个月和第36个月完成。在研究随访期间评估的每个时间点，应该尽可能在一天的同一时间执行。在进行评估的每个时间点，向每个患者给予在6MWT期间的指定间隔的相同说明。在规定两种评估的时间点，6MWT应该在与CPET不同的天时执行。该评价将在每次研究就诊时执行两次，间隔大约24小时。
心肺运动测试
按照事件时间表(图10A-10D)，心肺运动测试(CPET)，包括耗氧量(VO2)的评价，将在基线；第8周；第6个月、第12个月、第18个月、第24个月、第30个月和第36个月时执行。CPET涉及在自行车测力计或跑步机上的评估，包括休息、卸载运动和递增坡道运动，其设计为产生8–12分钟的总运动持续时间，伴随呼出气体的测量用于确定耗氧量和二氧化碳产生量。测量包括生命体征，肺指数(包括最大自主通气量)，通气阈值测量(包括呼吸交换率和每分钟通气量/二氧化碳产生量的比率)，最大运动测量(包括峰值生命体征和峰值VO2)，无氧阈值测量(包括VO2)和恢复评价。在规定两种评估的每个时间点，CPET应该在与6MWT不同的天时执行。
肺功能测试
按照事件时间表(图10A-10D)，肺功能测试(PFT)将在基线；第12个月、第24个月、第36个月时进行评估，以允许评价肺容量和膈肌容量两者。PFT评估将包括流量(包括FVC、FEV1)、肺活量和扩散容量(包括DLCO2)的测量。还将评估最大吸气压和呼气压。
右心导管插入术和心内膜心肌活检
按照事件时间表(图10A-10D)，右心导管插入术和心内膜心肌活检将在基线；第8周、第6个月、第12个月和第36个月时执行。导管插入术和活检将由具有该程序的专业知识的介入性心脏学团队执行。在右心导管插入术和心内膜心肌活检程序期间麻醉的使用将基于机构指南和研究调查员的临床判断。与麻醉相关的风险在产品包装插页中进行描述。
伴随血流动力学评价的右心导管插入术
将执行右心导管插入术以允许评价心肺血流动力学参数。评价的血流动力学参数将包括右心房和肺动脉压，肺动脉楔压，混合静脉血氧饱和度，以及心输出量和心脏指数(Fick公式)、肺毛细血管楔压、肺血管阻力和肺动脉高压的评价。
心内膜心肌活检
心内膜心肌活检将经由右心室的中央静脉通路导管插入术和导管介导的室间隔活检来执行，涉及大约3–5个样品/程序。
活检将允许评估LAMP2B基因/蛋白质表达的任何治疗相关改变，以及DD相关心肌组织学(即，自噬泡、肌原纤维紊乱)的改变。在后续调查期间关于右心导管插入术和心内膜心肌活检的建议将基于在1期过程中观察到的组织学改变和LAMP-2B表达的程度进行评估，并且包括心肌分子和组织学改变与来自侵入性较小的评价的参数改善的潜在关联性，所述参数包括来自骨骼肌活检的LAMP-2B表达、血液中的LAMP-2B水平、以及心肌病和CHF的其它血清学和射线照相参数。
骨骼肌活检
将执行骨骼肌活检，以评估骨骼肌中的LAMP2B基因/蛋白质表达，以便确定研究产品预防或逆转DD的肌肉骨骼组分的潜力，并且允许关于LAMP2骨骼肌是否是LAMP2心肌遗传校正和蛋白质表达的潜在可行替代物的评价。股外侧肌的切开活检将在基线；第8周、第6个月、第12个月和第36个月时执行，以允许评价上文详述的参数。在序贯评价时(即基线和治疗后8周)的活检将在对侧肌肉之间交替(即，在基线时右腿，在治疗后评价时左腿)，以便使潜在的程序相关的副作用降到最低。在后续(2期)研究中，将基于在1期研究期间观察到的组织学改变和LAMP-2B表达的程度、以及在心内膜心肌和骨骼肌基因/蛋白质表达之间的关联性，来评估关于肌肉活检的需要。在后续研究期间，还将考虑针吸活检的利用。在骨骼肌活检程序期间麻醉的使用将基于机构指南和研究调查员的临床判断。与麻醉相关的风险在产品包装插页中进行描述。需要时，骨骼肌活检可以与心内膜心肌活检结合执行，以限制麻醉或镇静。
神经认知评估
对于年龄≥16岁且被认为具有正常或接近正常的(轻度受限的)认知功能的患者，神经认知评估将包括下述组分：
·韦氏成人智力量表(Wechsler Adult Intelligence Scale)(WAIS-IV)。
·文兰适应行为量表(Vineland Adaptive Behavior Scale)，第三版(Vineland-3)。
具有更受限的认知功能的年龄≥16岁的患者将不借助于WAIS-IV进行评估。这些患者将通过下述组分进行评估：
·文兰适应行为量表，第三版(Vineland-3)。
·鉴别能力量表(Differential Ability Scales)(DAS-II)。
最适当评估的决定将由评估心理学家/神经认知评价专家与研究调查员共同做出。
对于年龄<18岁的患者，神经认知评估将包括下述组分：
·WAIS-IV(如果16或17岁并且被认为具有正常或接近正常的认知功能)。
·Vineland-3父母/看护人评价。
·鉴别能力量表(DAS-II)。
按照事件时间表(图10A-10D)，神经认知评价在基线；第12个月、第24个月和第36个月时进行评估。这些应该尽可能在每次评价时以相同的顺序进行。下文提供了每种仪器的简要描述。
韦氏成人智力量表(WAIS-IV)
WAIS-IV提供了简短、可靠的认知能力测量。含有用于评价个体有目的和有用行为的潜力的标准化问题和任务集。设计为测量主要心智能力。该测试产生一般认知能力、语言理解和非语言能力的总体估计的标准化评分。
文兰适应行为量表，第三版(Vineland-3)
Vineland-3是适应行为–人们在其日常生活中所做的事情的标准化测量。鉴于能力测量集中于应试者在测试情形下可以做的事情，Vineland-3集中于他或她在每日生活中实际做的事情。因为它是一种基于常模的工具，所以将应试者的适应性功能与同龄人的适应性功能进行比较。这是支持智力和发育障碍的诊断的主要工具。Vineland-3父母/看护人访谈表(Parent/Caregiver Interview Form)测量了跨越4个领域的适应行为功能：个体(从出生到90岁)中的沟通、日常生活、社交和运动功能。
鉴别能力量表(DAS-II)
DAS-II是一种全面的、个别施用的临床工具，用于评价对于学习很重要的认知能力。该测试可以施用于跨越广泛范围的发育水平，2岁6个月(2:6)到17岁11个月(17:11)的儿童。该测试产生关于总体一般概念能力、语言能力(语言概念和知识)、非语言能力(复杂、非语言、需要心理加工的归纳推理)和空间能力(复杂的视觉加工)的标准化评分。
神经肌肉评估
神经肌肉评估将在基线；第8周、第6个月、第12个月、第24个月和第36个月时执行。它将包括基本神经肌肉活动的定时测试，所述基本神经肌肉活动包括下述：
·从地板上站起来，
·4级楼梯的爬上和爬下，
·10米步行/跑步，
·计时起立行走(TUG)，和
·北极星移动评价测试(North-Star Ambulatory Assessment Test)。
眼科检查
按照事件时间表(图10A-10D)，眼科检查将在基线；第12个月、第24个月和第36个月时进行评估。它将包括通过直接检眼镜检查/眼底镜检查、眼底照相术、光学相干、断层扫描、自发荧光测试和视网膜电描记术的视网膜评估。
患者报告结局/生活质量(PRO/QOL)
本研究中待采用的PRO/QOL测量包括KCCQ-12和PedsQL。按照事件时间表(图10A-10D)，评估将在基线时；第8周，每3个月一次(第3个月–第12个月)；以及每6个月一次(第12个月–第36个月)进行收集。
功效评价
用于临床功效终点的评价将包括在研究产品施用之后的最初几个月和一年期间，按照事件时间表(图10A-10D)执行的下述评价：
·CPET，包括VO2的评价。
·6MWT(距离)评价。
·心内膜心肌活检(经由右心室的中央静脉通路导管插入术执行)，用于评估心肌细胞中的DD相关的组织学异常和LAMP2B基因/RNA/蛋白质的存在。
·钆增强的心脏MRI(当不因植入起搏器、除颤器、其它留置装置或医学状况的存在禁忌时)。
·超声心动图。
·将评价总体存活，并且选择停止随访的其它组分的患者(除非在健康状况的严重恶化的背景下，否则强烈建议不要这样做)；为此类患者提供与研究人员保持联系用于评估总体健康状况和存活的选项。
·关于后续心脏移植、LVAD、植入式心律转复除颤器或起搏器放置、用于心脏传导异常的电生理消融手术或用于CHF的住院治疗的需要的评估。
统计方法
对于给药群组最多3个患者的样品量，伴随最多6个患者的扩展(在3个患者中的1个中的DLT的情况下)被视为关于新型研究治疗剂的剂量评估的标准和安全方法。假定真正的DLT率为5％或更低，基于给定的群组(即，2个或更多个患者具有DLT的观察)，存在停止剂量递增的3％机会。如果假定真正的DLT率为50％，则基于给定的群组，存在停止剂量递增的83％机会。
计划入选的患者数目
11–23个(群组1按照先前的方案版本入选了3个患者)
研究群体
评估的研究群体将包括总体研究群体，该研究群体将接受一系列研究产品。另外的评估群体将是成年患者(18岁及以上，且包括15-17岁的患者)和儿童群体，包括8–14岁的群体。
实例6：1期研究结果
1期研究结果已证实了许多关键临床生物标记物和终点中的强烈趋势。
DD是一种遗传性继承的心肌病，其疾病特点和进展不同于典型的成人心肌病。大多数患者在功能缺损方面得到良好补偿，直至病程晚期；测量例如LVEF以及甚至6MWT可能是正常或仅轻度异常的，直至心肌病已进展。在该患者群体中，疾病相关异常的轻微改善或稳定是期望的，并且很能代表新出现的自然史的改善；这些可能伴随着临床生物标记物的稳定和/或改善，所述临床标记物已显示与自然史研究的进展相关联。
年龄>15岁的低剂量和高剂量成人和青少年群组(6.7x1013 GC/kg和1.1x1014 GC/kg)中的临床数据已证实了治疗的功效。数据包括：
1.LAMP2在主要靶器官中的持久蛋白质表达的确认。
2.形态学DD标志在细胞水平上的改善的证实。
3.关键心脏参数包括BNP的改善和/或稳定(在具有长期随访的4个患者各自中的降低，包括对于其存在关于免疫压制方案的确认依从性的2个低剂量患者中，距离基线的75％-79％降低)。
4.在低剂量和高剂量群组中具有确认的免疫压制的4个成人中的3个中的NYHA级别改善、以及在另一个低剂量患者中的稳定，以及4个患者各自中的6MWT的稳定至轻度改善
5.所有低剂量治疗的受试者中的生活质量和功能的自我报告的改善。
稳定的LAMP2B表达数据(图14)已伴随着心肌体系结构的可证实和有利的改变、以及病理DD标志的消退，如经由来自治疗前和治疗后时间点的心内膜心肌活检样品的电子显微镜检查所评价的。这些在图14中示出，其描绘了来自受试者1005的心肌组织。与小鼠基因敲除模型中的发现相似，治疗前活检指示了众多且广泛存在的自噬泡和心肌原纤维的严重混乱，使得不同的肌肉元素是最低限度可辨别的。在治疗后8周时的类似心内膜心肌活检证实了自噬泡的显著缩减，以及肌原纤维体系结构的恢复，伴随广泛存在的明显条纹。这些发现在稍后9个月的时间点得到确认，提示了分子和组织学消退得到持续。
关于低剂量群组中的有关心脏临床标记物的更多数据也证实了心脏功能的重要标记物的改善或稳定，所述标记物包括B型钠尿肽(BNP)(表5)、肌酸激酶-心肌带(MB)和心输出量，如通过有创血流动力学测量的。重要的是，所观察到的BNP距离基线的改善(分别为在18个月和15个月时的1002、79％和1005、75％)被该领域的专家视为高度相关和有希望的，因为利钠肽与心力衰竭的预后强烈相关联(Januzzi等人J Investig Med.2013年8月；61(6):950–955)。
临床益处的最有意义的参数之一是患者的功能水平，且特别是在心力衰竭的背景下，耐受作为日常生活一部分的体力活动的能力。因此，终点例如纽约心脏协会(NYHA)分类被视为与整体患者功能状态相联系的临床改善的有力测量(Russel等人Am Heart J.2009年10月；158(4Suppl):S24–S30.)。与DD的自然史显著且高度不一致的是，在低剂量和高剂量群组中具有长期随访的4个受试者中的3个已证实了NYHA分类从II到I的改善(表5)，而第四个受试者仍然保持在II的稳定水平下。
截至2021年11月的最近长期评价，所有三个患者都已证实了在其6MWT结果中的稳定和/或轻微改善(表5)。另外，如根据在最近就诊的PI访谈所报告的，所有受试者都报告了总体感觉良好，并未报告在其活动方面具有限制。受试者1002和1005还已报告了，自从接受RP-A501之后，他们的植入式心脏除颤器没有发生过任何放电。
表5.低剂量和高剂量群组中的1期临床终点
男性中的达农心肌病的标志尤其是来源于肥大以及伴随的舒张功能障碍的壁厚度增加。如图15A-15B中所示，高剂量和低剂量中的5个可评估患者中的4个证实了壁厚度的稳定或减少，如通过连续超声心动图所测量的。在一些受试者中，壁厚度的减少伴随着其射血分数的轻度改善或稳定，这是达农病的晚期表现(图15B)。除基于回声的参数之外，有创血流动力学还允许测量肺毛细血管楔压，其为舒张功能障碍和左侧充盈压的测量。与其它心脏参数一致，治疗患者中的连续楔压和心输出量/每搏输出量证实了改善或稳定(图15C-15D)。鉴于疾病的自然史，这与这些患者的正常进展形成对比。
表6显示了RP-A501证实稳定的心脏载体拷贝数(VCN)。
表6
*患者1001仅在当地就依从性监测了两周；在100后开始更长的依从性监测。VCN＝载体拷贝数/二倍体核。1第9个月的数据。2在第5个月的移植心脏样品。
表7显示了通过免疫组织化学(IHC)的心内膜心肌LAMP2B蛋白表达。
表7
*患者1001仅在当地就依从性监测了两周；在1001后开始更长的依从性监测。
**与正常对照样品相比，针对LAMP2染色的心内膜心肌活检。使用软件以盲法方式由2至14个切片定量细胞染色的百分比面积。对于具有高变动的样品报告了定性评价。
1由于高变动，先前公开为范围，现已澄清。2第9个月的数据。3在第5个月的外植体样品
表8显示心内膜心肌LAMP2B蛋白质印迹蛋白质表达。
表8
1第6个月的数据；在第12个月的样品不足。2第18个月的数据；在第12个月的样品不足。3第9个月的数据。4外植的心脏；第5个月的数据。
如上文对于来自1期研究的低剂量和高剂量群组所详述的，有关的心脏评价，包括血清心力衰竭标记物、有创血流动力学输出测量、超声心动图评价和总体功能评价，都证实了疾病的改善，其中即使稳定也代表了与中值死亡率为19年的进行性和致命性心肌病的自然史相比的积极结果。这些临床评估伴随着在心肌中的LAMP2表达，以及其为DD标志的液泡病理学和肌原纤维紊乱的组织学改善的证据。由于这些原因，所有证据-包括非临床数据且尤其是临床数据两者-压倒性地证实了RP-A501的直接益处的前景。
RP-A501在低剂量和高剂量水平下一般是良好耐受的。所有观察到的不利效应都是可逆的，没有持久的后遗症。早期转氨酶和肌酐激酶升高以及血小板和血红蛋白降低恢复到基线或最终改善。RP-A501 r-AAV剂量依赖性毒性在以高剂量水平治疗的两个患者之一中可见。接受最大总剂量的受影响的患者，发展了血栓性微血管病(TMA)，其使用支持性治疗包括短暂性血液透析完全消退。跨越两个剂量水平，不良事件是可逆的，并且在使用定制的免疫压制方案治疗之后的3个月，在很大程度上消退。
* * *
本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请都以引用的方式整体并入用于所有目的。然而，本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请的提及不是，也不应被视为以下的承认或任何形式的暗示：它们构成有效的现有技术或构成全世界的任何国家的公知常识的部分。
序列表
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<160> 35
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<210> 1
<211> 409
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Val Cys Phe Arg Leu Phe Pro Val Pro Gly Ser Gly Leu Val Leu
1 5 10 15
Val Cys Leu Val Leu Gly Ala Val Arg Ser Tyr Ala Leu Glu Leu Asn
20 25 30
Leu Thr Asp Ser Glu Asn Ala Thr Cys Leu Tyr Ala Lys Trp Gln Met
35 40 45
Asn Phe Thr Val Arg Tyr Glu Thr Thr Asn Lys Thr Tyr Lys Thr Val
50 55 60
Thr Ile Ser Asp His Gly Thr Val Thr Tyr Asn Gly Ser Ile Cys Gly
65 70 75 80
Asp Asp Gln Asn Gly Pro Lys Ile Ala Val Gln Phe Gly Pro Gly Phe
85 90 95
Ser Trp Ile Ala Asn Phe Thr Lys Ala Ala Ser Thr Tyr Ser Ile Asp
100 105 110
Ser Val Ser Phe Ser Tyr Asn Thr Gly Asp Asn Thr Thr Phe Pro Asp
115 120 125
Ala Glu Asp Lys Gly Ile Leu Thr Val Asp Glu Leu Leu Ala Ile Arg
130 135 140
Ile Pro Leu Asn Asp Leu Phe Arg Cys Asn Ser Leu Ser Thr Leu Glu
145 150 155 160
Lys Asn Asp Val Val Gln His Tyr Trp Asp Val Leu Val Gln Ala Phe
165 170 175
Val Gln Asn Gly Thr Val Ser Thr Asn Glu Phe Leu Cys Asp Lys Asp
180 185 190
Lys Thr Ser Thr Val Ala Pro Thr Ile His Thr Thr Val Pro Ser Pro
195 200 205
Thr Thr Thr Pro Thr Pro Lys Glu Lys Pro Glu Ala Gly Thr Tyr Ser
210 215 220
Val Asn Asn Gly Asn Asp Thr Cys Leu Leu Ala Thr Met Gly Leu Gln
225 230 235 240
Leu Asn Ile Thr Gln Asp Lys Val Ala Ser Val Ile Asn Ile Asn Pro
245 250 255
Asn Thr Thr His Ser Thr Gly Ser Cys Arg Ser His Thr Ala Leu Leu
260 265 270
Arg Leu Asn Ser Ser Thr Ile Lys Tyr Leu Asp Phe Val Phe Ala Val
275 280 285
Lys Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Leu Lys Glu Val Asn Ile Ser Met Tyr
290 295 300
Leu Val Asn Gly Ser Val Phe Ser Ile Ala Asn Asn Asn Leu Ser Tyr
305 310 315 320
Trp Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Thr
325 330 335
Val Ser Val Ser Gly Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asp Leu Arg Val
340 345 350
Gln Pro Phe Asn Val Thr Gln Gly Lys Tyr Ser Thr Ala Gln Glu Cys
355 360 365
Ser Leu Asp Asp Asp Thr Ile Leu Ile Pro Ile Ile Val Gly Ala Gly
370 375 380
Leu Ser Gly Leu Ile Ile Val Ile Val Ile Ala Tyr Val Ile Gly Arg
385 390 395 400
Arg Lys Ser Tyr Ala Gly Tyr Gln Thr
405
<210> 2
<211> 1233
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
atggtgtgct tccgcctctt cccggttccg ggctcagggc tcgttctggt ctgcctagtc 60
ctgggagctg tgcggtctta tgcattggaa cttaatttga cagattcaga aaatgccact 120
tgcctttatg caaaatggca gatgaatttc acagttcgct atgaaactac aaataaaact 180
tataaaactg taaccatttc agaccatggc actgtgacat ataatggaag catttgtggg 240
gatgatcaga atggtcccaa aatagcagtg cagttcggac ctggcttttc ctggattgcg 300
aattttacca aggcagcatc tacttattca attgacagcg tctcattttc ctacaacact 360
ggtgataaca caacatttcc tgatgctgaa gataaaggaa ttcttactgt tgatgaactt 420
ttggccatca gaattccatt gaatgacctt tttagatgca atagtttatc aactttggaa 480
aagaatgatg ttgtccaaca ctactgggat gttcttgtac aagcttttgt ccaaaatggc 540
acagtgagca caaatgagtt cctgtgtgat aaagacaaaa cttcaacagt ggcacccacc 600
atacacacca ctgtgccatc tcctactaca acacctactc caaaggaaaa accagaagct 660
ggaacctatt cagttaataa tggcaatgat acttgtctgc tggctaccat ggggctgcag 720
ctgaacatca ctcaggataa ggttgcttca gttattaaca tcaaccccaa tacaactcac 780
tccacaggca gctgccgttc tcacactgct ctacttagac tcaatagcag caccattaag 840
tatctagact ttgtctttgc tgtgaaaaat gaaaaccgat tttatctgaa ggaagtgaac 900
atcagcatgt atttggttaa tggctccgtt ttcagcattg caaataacaa tctcagctac 960
tgggatgccc ccctgggaag ttcttatatg tgcaacaaag agcagactgt ttcagtgtct 1020
ggagcatttc agataaatac ctttgatcta agggttcagc ctttcaatgt gacacaagga 1080
aagtattcta cagcccaaga gtgttcgctg gatgatgaca ccattctaat cccaattata 1140
gttggtgctg gtctttcagg cttgattatc gttatagtga ttgcttacgt aattggcaga 1200
agaaaaagtt atgctggata tcagactctg taa 1233
<210> 3
<211> 1233
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LAMP-2的变体
<400> 3
atggtctgct tcagactgtt ccctgtccct ggatctggtc tggtgcttgt gtgcttggtg 60
ctgggtgctg tgagatccta tgcccttgag ctgaacctga ctgactcaga aaatgccact 120
tgcctgtatg ccaagtggca gatgaacttc actgtgagat atgagactac caacaagacc 180
tacaagactg tgaccatctc agaccatggc actgtcacct acaatggatc aatctgtggt 240
gatgatcaga atggcccaaa gatagcagtg cagtttgggc ccggtttttc ctggattgct 300
aacttcacca aggcagcctc cacctacagc attgactcag tcagcttcag ctacaacact 360
ggggataaca ccaccttccc tgacgcagag gacaagggaa tccttactgt ggacgaactc 420
ctggcaatca gaatccccct taacgacctg ttcagatgca actccctttc aacccttgaa 480
aagaatgatg tggtgcaaca ctattgggac gtcctggtgc aagcctttgt gcagaatggg 540
acagtgagta ccaacgagtt cctctgtgac aaggacaaga ccagcactgt ggcccccact 600
atccacacca ctgtgcccag ccctaccact acccccaccc ctaaagagaa gccagaagct 660
ggaacctact cagtcaacaa tggaaatgac acatgcctcc ttgccaccat gggactgcag 720
ctgaacatca ctcaggacaa ggtggcctca gtgattaaca tcaaccctaa caccactcat 780
agcactggga gctgcagatc acatacagct ctgctgaggc tcaactcctc caccatcaag 840
tacctggact ttgtgtttgc tgtgaagaat gagaacaggt tctacctcaa ggaagtgaac 900
atttccatgt acctggtcaa tggttcagtg ttctctattg ccaacaacaa tctgagctac 960
tgggatgcac ccctgggatc ctcctacatg tgcaacaagg agcagactgt gagtgtgtca 1020
ggtgcttttc agatcaacac ttttgacctg agggtgcagc ccttcaatgt gactcaggga 1080
aagtactcca ctgcacaaga gtgttccttg gatgatgaca ctatcctcat ccccattatt 1140
gtgggagctg gactgtcagg attgattata gtgattgtga ttgcttatgt gattggaagg 1200
agaaagagct atgctggcta ccagaccctg taa 1233
<210> 4
<211> 1233
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LAMP-2的变体
<400> 4
atggtgtgct ttagactgtt tcctgtgcct ggttcagggc tggtcctggt ctgtctggtg 60
ctgggggctg tcagaagcta tgccttggag ctgaacctca ctgatagtga aaatgccact 120
tgtctgtatg ctaagtggca gatgaacttc actgtgagat atgaaaccac caacaagact 180
tacaaaacag tgaccatctc agatcatgga actgtgacct acaacggcag catttgtgga 240
gacgaccaga acggaccaaa aatcgctgtc caatttgggc ctggattctc ctggattgcc 300
aatttcacta aagctgcctc cacatattca attgactcag tgtccttctc ctacaacact 360
ggggacaaca ctactttccc tgatgctgaa gataagggaa tcttgacagt ggatgagctg 420
ctggctatca ggatcccttt gaatgacctg tttaggtgta attcactgag cactctggag 480
aagaacgacg tggtgcagca ctactgggac gtgctggtgc aggcctttgt gcagaacggc 540
actgtgtcca ccaacgaatt cctgtgtgat aaggacaaaa cttccactgt ggcacctaca 600
attcacacta ctgtgccttc acctaccacc actccaactc caaaggaaaa gcctgaagca 660
ggaacctact ctgtgaacaa tggcaatgat acctgtctgt tggccaccat gggcctccaa 720
ctgaacatta ctcaggacaa ggtggcctca gtgattaaca ttaaccccaa cactacccac 780
tccactggca gctgtagatc acacacagcc ttgctcagac tgaatagcag caccatcaag 840
tatttggatt ttgtgtttgc agtgaagaat gaaaacaggt tctacctgaa ggaagtcaac 900
atctcaatgt acctggtgaa cggctcagtg ttcagcattg ccaacaacaa cctctcctat 960
tgggacgctc cactggggag cagctacatg tgtaacaagg aacagactgt gtcagtgtca 1020
ggagccttcc agattaacac ctttgatctg agggtccaac cctttaatgt cactcaagga 1080
aagtatagca ctgcccagga gtgctccctg gatgatgaca ccattctgat tccaatcatt 1140
gtgggtgcag gactttctgg gcttattatt gtgattgtga ttgcctatgt gattggcaga 1200
aggaaatcct atgcagggta ccaaactctg taa 1233
<210> 5
<211> 1233
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LAMP-2的变体
<400> 5
atggtctgtt ttaggctgtt ccctgtccct ggttcaggac tggtcttagt gtgtctggtg 60
cttggagctg tcagaagcta tgccctggag ctgaacctga ctgactcaga aaatgccact 120
tgcctgtatg ccaagtggca gatgaacttc actgtcagat atgaaaccac caacaagacc 180
tataagactg tgaccatctc agaccatggc actgtgactt acaatgggtc aatttgtgga 240
gatgaccaga atggccctaa gatagctgtc cagtttggtc caggattcag ctggattgcc 300
aacttcacca aggcagccag cacctacagc attgactctg tgtccttctc ctacaacaca 360
ggagacaaca ccactttccc tgatgcagag gacaaaggta tcctgactgt ggatgagttg 420
ctggcaatca ggatcccact gaacgatctg ttcaggtgca actcactgtc cactctggaa 480
aagaatgatg tggtgcagca ctattgggat gtgctagtcc aggcctttgt ccagaatggg 540
actgtgtcaa ctaatgagtt cctgtgtgac aaggacaaga caagcactgt agcccccact 600
atccatacca cagtacctag ccccaccact actccaaccc ccaaggagaa gcctgaggct 660
ggcacctact cagtgaacaa tgggaatgac acctgtttgc tggccactat gggactccaa 720
ctgaacatca cccaggacaa agtggcctct gtgatcaata tcaatcccaa caccacccac 780
agcactgggt cctgcagaag ccacactgcc ctcctgaggc tcaactcatc aactatcaag 840
tacttggatt ttgtgtttgc agtgaagaat gagaacagat tctacctcaa agaggtcaac 900
atttcaatgt acctggtgaa tgggagtgtg ttctccattg ctaacaacaa cctgagctac 960
tgggatgccc ctctgggctc ctcatacatg tgcaacaagg aacagactgt gagtgtgtca 1020
ggggccttcc agatcaacac ttttgacctg agagtgcagc cctttaatgt gacacaggga 1080
aagtacagca ctgctcagga gtgcagcctg gatgatgaca ctatcctgat ccctatcatt 1140
gtgggggcag gcctgtctgg actcattatt gtgattgtga ttgcctatgt gatagggaga 1200
aggaagtctt atgctggata ccagaccctg taa 1233
<210> 6
<211> 13
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> Kozak序列
<400> 6
gccgccacca tgg 13
<210> 7
<211> 387
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 全长多聚A序列
<400> 7
tggctaataa aggaaattta ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc 60
actcggaagg acatatggga gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta 120
gagtttggca acatatgccc atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg 180
tcatcagtat atgaaacagc cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac 240
ttgaggttag atttttttta tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa 300
attttcctta catgttttac tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat 360
agctgtccct cttctcttat ggagatc 387
<210> 8
<211> 4549
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达盒
<400> 8
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg 180
atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240
tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300
tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360
tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 420
aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480
caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540
tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac 600
gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat 660
tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 720
ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 780
gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 840
aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc 900
cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag 960
cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt 1020
ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg 1080
gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc 1140
gctgcccggc ggctgtgagc gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt 1200
gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa 1260
caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt 1320
cgggctgcaa ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg 1380
tgcggggctc cgtacggggc gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca 1440
ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg 1500
cggcggcccc cggagcgccg gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt 1560
atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa 1620
atctgggagg cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg 1680
caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc 1740
tctccagcct cggggctgtc cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc 1800
ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc 1860
cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt 1920
tggcaaagaa ttcgagcggc cgccagccgc caccatggtc tgcttcagac tgttccctgt 1980
ccctggatct ggtctggtgc ttgtgtgctt ggtgctgggt gctgtgagat cctatgccct 2040
tgagctgaac ctgactgact cagaaaatgc cacttgcctg tatgccaagt ggcagatgaa 2100
cttcactgtg agatatgaga ctaccaacaa gacctacaag actgtgacca tctcagacca 2160
tggcactgtc acctacaatg gatcaatctg tggtgatgat cagaatggcc caaagatagc 2220
agtgcagttt gggcccggtt tttcctggat tgctaacttc accaaggcag cctccaccta 2280
cagcattgac tcagtcagct tcagctacaa cactggggat aacaccacct tccctgacgc 2340
agaggacaag ggaatcctta ctgtggacga actcctggca atcagaatcc cccttaacga 2400
cctgttcaga tgcaactccc tttcaaccct tgaaaagaat gatgtggtgc aacactattg 2460
ggacgtcctg gtgcaagcct ttgtgcagaa tgggacagtg agtaccaacg agttcctctg 2520
tgacaaggac aagaccagca ctgtggcccc cactatccac accactgtgc ccagccctac 2580
cactaccccc acccctaaag agaagccaga agctggaacc tactcagtca acaatggaaa 2640
tgacacatgc ctccttgcca ccatgggact gcagctgaac atcactcagg acaaggtggc 2700
ctcagtgatt aacatcaacc ctaacaccac tcatagcact gggagctgca gatcacatac 2760
agctctgctg aggctcaact cctccaccat caagtacctg gactttgtgt ttgctgtgaa 2820
gaatgagaac aggttctacc tcaaggaagt gaacatttcc atgtacctgg tcaatggttc 2880
agtgttctct attgccaaca acaatctgag ctactgggat gcacccctgg gatcctccta 2940
catgtgcaac aaggagcaga ctgtgagtgt gtcaggtgct tttcagatca acacttttga 3000
cctgagggtg cagcccttca atgtgactca gggaaagtac tccactgcac aagagtgttc 3060
cttggatgat gacactatcc tcatccccat tattgtggga gctggactgt caggattgat 3120
tatagtgatt gtgattgctt atgtgattgg aaggagaaag agctatgctg gctaccagac 3180
cctgtaaaag ggcgaattcc agcacacgcg tcctaggagc tcgagtacta ctggcggccg 3240
ttactagtgg atccgcggta caagtaagca tgcaagcttc gaggacgggg tgaactacgc 3300
ctgaatcaag cttatcgata aattcgagca tcttaccgcc atttattccc atatttgttc 3360
tgtttttctt gatttgggta tacatttaaa tgttaataaa acaaaatggt ggggcaatca 3420
tttacatttt tagggatatg taattactag ttcaggtgta ttgccacaag acaaacatgt 3480
taagaaactt tcccgttatt tacgctctgt tcctgttaat caacctctgg attacaaaat 3540
ttgtgaaaga ttgactgata ttcttaacta tgttgctcct tttacgctgt gtggatatgc 3600
tgctttaatg cctctgtatc atgctattgc ttcccgtacg gctttcgttt tctcctcctt 3660
gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtcc gtcaacgtgg 3720
cgtggtgtgc tctgtgtttg ctgacgcaac ccccactggc tggggcattg ccaccacctg 3780
tcaactcctt tctgggactt tcgctttccc cctcccgatc gccacggcag aactcatcgc 3840
cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc taggttgctg ggcactgata attccgtggt 3900
gttgtcgggg aagggcctcg ataccgtcga tatcgatcct ggctaataaa ggaaatttat 3960
tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt gtgtctctca ctcggaagga catatgggag 4020
ggcaaatcat ttaaaacatc agaatgagta tttggtttag agtttggcaa catatgccca 4080
tatgctggct gccatgaaca aaggttggct ataaagaggt catcagtata tgaaacagcc 4140
ccctgctgtc cattccttat tccatagaaa agccttgact tgaggttaga ttttttttat 4200
attttgtttt gtgttatttt tttctttaac atccctaaaa ttttccttac atgttttact 4260
agccagattt ttcctcctct cctgactact cccagtcata gctgtccctc ttctcttatg 4320
gagatcgaag caattcgttg atctgaattt cgaccaccca taatagatct cccattaccc 4380
tggtagataa gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta gtgatggagt 4440
tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc 4500
gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcag 4549
<210> 9
<211> 4549
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达盒
<400> 9
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg 180
atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240
tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300
tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360
tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 420
aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480
caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540
tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac 600
gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat 660
tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 720
ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 780
gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 840
aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc 900
cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag 960
cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt 1020
ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg 1080
gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc 1140
gctgcccggc ggctgtgagc gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt 1200
gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa 1260
caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt 1320
cgggctgcaa ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg 1380
tgcggggctc cgtacggggc gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca 1440
ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg 1500
cggcggcccc cggagcgccg gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt 1560
atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa 1620
atctgggagg cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg 1680
caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc 1740
tctccagcct cggggctgtc cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc 1800
ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc 1860
cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt 1920
tggcaaagaa ttcgagcggc cgccagccgc caccatggtg tgctttagac tgtttcctgt 1980
gcctggttca gggctggtcc tggtctgtct ggtgctgggg gctgtcagaa gctatgcctt 2040
ggagctgaac ctcactgata gtgaaaatgc cacttgtctg tatgctaagt ggcagatgaa 2100
cttcactgtg agatatgaaa ccaccaacaa gacttacaaa acagtgacca tctcagatca 2160
tggaactgtg acctacaacg gcagcatttg tggagacgac cagaacggac caaaaatcgc 2220
tgtccaattt gggcctggat tctcctggat tgccaatttc actaaagctg cctccacata 2280
ttcaattgac tcagtgtcct tctcctacaa cactggggac aacactactt tccctgatgc 2340
tgaagataag ggaatcttga cagtggatga gctgctggct atcaggatcc ctttgaatga 2400
cctgtttagg tgtaattcac tgagcactct ggagaagaac gacgtggtgc agcactactg 2460
ggacgtgctg gtgcaggcct ttgtgcagaa cggcactgtg tccaccaacg aattcctgtg 2520
tgataaggac aaaacttcca ctgtggcacc tacaattcac actactgtgc cttcacctac 2580
caccactcca actccaaagg aaaagcctga agcaggaacc tactctgtga acaatggcaa 2640
tgatacctgt ctgttggcca ccatgggcct ccaactgaac attactcagg acaaggtggc 2700
ctcagtgatt aacattaacc ccaacactac ccactccact ggcagctgta gatcacacac 2760
agccttgctc agactgaata gcagcaccat caagtatttg gattttgtgt ttgcagtgaa 2820
gaatgaaaac aggttctacc tgaaggaagt caacatctca atgtacctgg tgaacggctc 2880
agtgttcagc attgccaaca acaacctctc ctattgggac gctccactgg ggagcagcta 2940
catgtgtaac aaggaacaga ctgtgtcagt gtcaggagcc ttccagatta acacctttga 3000
tctgagggtc caacccttta atgtcactca aggaaagtat agcactgccc aggagtgctc 3060
cctggatgat gacaccattc tgattccaat cattgtgggt gcaggacttt ctgggcttat 3120
tattgtgatt gtgattgcct atgtgattgg cagaaggaaa tcctatgcag ggtaccaaac 3180
tctgtaaaag ggcgaattcc agcacacgcg tcctaggagc tcgagtacta ctggcggccg 3240
ttactagtgg atccgcggta caagtaagca tgcaagcttc gaggacgggg tgaactacgc 3300
ctgaatcaag cttatcgata aattcgagca tcttaccgcc atttattccc atatttgttc 3360
tgtttttctt gatttgggta tacatttaaa tgttaataaa acaaaatggt ggggcaatca 3420
tttacatttt tagggatatg taattactag ttcaggtgta ttgccacaag acaaacatgt 3480
taagaaactt tcccgttatt tacgctctgt tcctgttaat caacctctgg attacaaaat 3540
ttgtgaaaga ttgactgata ttcttaacta tgttgctcct tttacgctgt gtggatatgc 3600
tgctttaatg cctctgtatc atgctattgc ttcccgtacg gctttcgttt tctcctcctt 3660
gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtcc gtcaacgtgg 3720
cgtggtgtgc tctgtgtttg ctgacgcaac ccccactggc tggggcattg ccaccacctg 3780
tcaactcctt tctgggactt tcgctttccc cctcccgatc gccacggcag aactcatcgc 3840
cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc taggttgctg ggcactgata attccgtggt 3900
gttgtcgggg aagggcctcg ataccgtcga tatcgatcct ggctaataaa ggaaatttat 3960
tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt gtgtctctca ctcggaagga catatgggag 4020
ggcaaatcat ttaaaacatc agaatgagta tttggtttag agtttggcaa catatgccca 4080
tatgctggct gccatgaaca aaggttggct ataaagaggt catcagtata tgaaacagcc 4140
ccctgctgtc cattccttat tccatagaaa agccttgact tgaggttaga ttttttttat 4200
attttgtttt gtgttatttt tttctttaac atccctaaaa ttttccttac atgttttact 4260
agccagattt ttcctcctct cctgactact cccagtcata gctgtccctc ttctcttatg 4320
gagatcgaag caattcgttg atctgaattt cgaccaccca taatagatct cccattaccc 4380
tggtagataa gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta gtgatggagt 4440
tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc 4500
gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcag 4549
<210> 10
<211> 4549
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达盒
<400> 10
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg 180
atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240
tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300
tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360
tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 420
aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480
caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540
tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac 600
gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat 660
tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 720
ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 780
gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 840
aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc 900
cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag 960
cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt 1020
ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg 1080
gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc 1140
gctgcccggc ggctgtgagc gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt 1200
gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa 1260
caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt 1320
cgggctgcaa ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg 1380
tgcggggctc cgtacggggc gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca 1440
ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg 1500
cggcggcccc cggagcgccg gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt 1560
atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa 1620
atctgggagg cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg 1680
caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc 1740
tctccagcct cggggctgtc cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc 1800
ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc 1860
cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt 1920
tggcaaagaa ttcgagcggc cgccagccgc caccatggtc tgttttaggc tgttccctgt 1980
ccctggttca ggactggtct tagtgtgtct ggtgcttgga gctgtcagaa gctatgccct 2040
ggagctgaac ctgactgact cagaaaatgc cacttgcctg tatgccaagt ggcagatgaa 2100
cttcactgtc agatatgaaa ccaccaacaa gacctataag actgtgacca tctcagacca 2160
tggcactgtg acttacaatg ggtcaatttg tggagatgac cagaatggcc ctaagatagc 2220
tgtccagttt ggtccaggat tcagctggat tgccaacttc accaaggcag ccagcaccta 2280
cagcattgac tctgtgtcct tctcctacaa cacaggagac aacaccactt tccctgatgc 2340
agaggacaaa ggtatcctga ctgtggatga gttgctggca atcaggatcc cactgaacga 2400
tctgttcagg tgcaactcac tgtccactct ggaaaagaat gatgtggtgc agcactattg 2460
ggatgtgcta gtccaggcct ttgtccagaa tgggactgtg tcaactaatg agttcctgtg 2520
tgacaaggac aagacaagca ctgtagcccc cactatccat accacagtac ctagccccac 2580
cactactcca acccccaagg agaagcctga ggctggcacc tactcagtga acaatgggaa 2640
tgacacctgt ttgctggcca ctatgggact ccaactgaac atcacccagg acaaagtggc 2700
ctctgtgatc aatatcaatc ccaacaccac ccacagcact gggtcctgca gaagccacac 2760
tgccctcctg aggctcaact catcaactat caagtacttg gattttgtgt ttgcagtgaa 2820
gaatgagaac agattctacc tcaaagaggt caacatttca atgtacctgg tgaatgggag 2880
tgtgttctcc attgctaaca acaacctgag ctactgggat gcccctctgg gctcctcata 2940
catgtgcaac aaggaacaga ctgtgagtgt gtcaggggcc ttccagatca acacttttga 3000
cctgagagtg cagcccttta atgtgacaca gggaaagtac agcactgctc aggagtgcag 3060
cctggatgat gacactatcc tgatccctat cattgtgggg gcaggcctgt ctggactcat 3120
tattgtgatt gtgattgcct atgtgatagg gagaaggaag tcttatgctg gataccagac 3180
cctgtaaaag ggcgaattcc agcacacgcg tcctaggagc tcgagtacta ctggcggccg 3240
ttactagtgg atccgcggta caagtaagca tgcaagcttc gaggacgggg tgaactacgc 3300
ctgaatcaag cttatcgata aattcgagca tcttaccgcc atttattccc atatttgttc 3360
tgtttttctt gatttgggta tacatttaaa tgttaataaa acaaaatggt ggggcaatca 3420
tttacatttt tagggatatg taattactag ttcaggtgta ttgccacaag acaaacatgt 3480
taagaaactt tcccgttatt tacgctctgt tcctgttaat caacctctgg attacaaaat 3540
ttgtgaaaga ttgactgata ttcttaacta tgttgctcct tttacgctgt gtggatatgc 3600
tgctttaatg cctctgtatc atgctattgc ttcccgtacg gctttcgttt tctcctcctt 3660
gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtcc gtcaacgtgg 3720
cgtggtgtgc tctgtgtttg ctgacgcaac ccccactggc tggggcattg ccaccacctg 3780
tcaactcctt tctgggactt tcgctttccc cctcccgatc gccacggcag aactcatcgc 3840
cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc taggttgctg ggcactgata attccgtggt 3900
gttgtcgggg aagggcctcg ataccgtcga tatcgatcct ggctaataaa ggaaatttat 3960
tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt gtgtctctca ctcggaagga catatgggag 4020
ggcaaatcat ttaaaacatc agaatgagta tttggtttag agtttggcaa catatgccca 4080
tatgctggct gccatgaaca aaggttggct ataaagaggt catcagtata tgaaacagcc 4140
ccctgctgtc cattccttat tccatagaaa agccttgact tgaggttaga ttttttttat 4200
attttgtttt gtgttatttt tttctttaac atccctaaaa ttttccttac atgttttact 4260
agccagattt ttcctcctct cctgactact cccagtcata gctgtccctc ttctcttatg 4320
gagatcgaag caattcgttg atctgaattt cgaccaccca taatagatct cccattaccc 4380
tggtagataa gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta gtgatggagt 4440
tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc 4500
gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcag 4549
<210> 11
<211> 130
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 反向末端重复（ITR）序列
<400> 11
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 12
<211> 130
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 反向末端重复（ITR）序列
<400> 12
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag 130
<210> 13
<400> 13
000
<210> 14
<211> 13
<212> RNA
<213> 未知的
<220>
<223> 替代Kozak序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> g是最常见的残基，但可以改变
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> c是最常见的残基，但可以改变
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> g是最常见的残基，但可以改变
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> c是最常见的残基，但可以改变
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> c是最常见的残基，但可以改变
<400> 14
nnnnnnrnna ugg 13
<210> 15
<211> 8
<212> RNA
<213> 未知的
<220>
<223> 替代Kozak序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> n是a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n是a、c、g或u
<400> 15
agnnaugn 8
<210> 16
<211> 7
<212> RNA
<213> 未知的
<220>
<223> 替代Kozak序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> n是a、c、g或u
<400> 16
annaugg 7
<210> 17
<211> 7
<212> RNA
<213> 未知的
<220>
<223> 替代Kozak序列
<400> 17
accaugg 7
<210> 18
<211> 10
<212> RNA
<213> 未知的
<220>
<223> 替代Kozak序列
<400> 18
gacaccaugg 10
<210> 19
<211> 235
<212> DNA
<213> 家牛
<400> 19
tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg 60
accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat 120
tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag 180
gattgggagg acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctg 235
<210> 20
<211> 222
<212> DNA
<213> 猿猴病毒40
<400> 20
cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 60
aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 120
ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggagatgt 180
gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg ta 222
<210> 21
<211> 202
<212> DNA
<213> 智人
<400> 21
ctgcccgggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc 60
actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag 120
gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcccaagttg 180
ggaagaaacc tgtagggcct gc 202
<210> 22
<211> 1730
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> CAG启动子
<400> 22
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc 420
ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg 480
cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg 540
ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa 600
agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc 660
gggcgggagt cgctgcgcgc tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc 720
gcccgccccg gctctgactg accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt 780
ctcctccggg ctgtaattag cgcttggttt aatgacggct tgtttctttt ctgtggctgc 840
gtgaaagcct tgaggggctc cgggagggcc ctttgtgcgg ggggagcggc tcggggggtg 900
cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggctc cgcgctgccc ggcggctgtg 960
agcgctgcgg gcgcggcgcg gggctttgtg cgctccgcag tgtgcgcgag gggagcgcgg 1020
ccgggggcgg tgccccgcgg tgcggggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg 1080
gtgtgtgcgt gggggggtga gcagggggtg tgggcgcgtc ggtcgggctg caaccccccc 1140
tgcacccccc tccccgagtt gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtacgg 1200
ggcgtggcgc ggggctcgcc gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg 1260
gggcggggcc gcctcgggcc ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc ccccggagcg 1320
ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa tcgtgcgaga 1380
gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct gtgcggagcc gaaatctggg aggcgccgcc 1440
gcaccccctc tagcgggcgc ggggcgaagc ggtgcggcgc cggcaggaag gaaatgggcg 1500
gggagggcct tcgtgcgtcg ccgcgccgcc gtccccttct ccctctccag cctcggggct 1560
gtccgcgggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc ggcttctggc 1620
gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgttca tgccttcttc tttttcctac 1680
agctcctggg caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca ttttggcaaa 1730
<210> 23
<211> 204
<212> DNA
<213> 人巨细胞病毒
<400> 23
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180
tgggaggtct atataagcag agct 204
<210> 24
<211> 317
<212> DNA
<213> 猿猴病毒40
<400> 24
ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60
agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 120
tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 180
ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 240
aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 300
gcctaggctt ttgcaaa 317
<210> 25
<211> 500
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> PGK启动子
<400> 25
gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg 60
gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc 120
gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca 180
ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac 240
gtctcactag tctcgtgcag atggacagca ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt 300
ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg 360
gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct 420
ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt 480
cctcatctcc gggcctttcg 500
<210> 26
<211> 2403
<212> DNA
<213> 智人
<400> 26
cctgcagggc ccactagttc catgtcctta tatggactca tctttgccta ttgcgacaca 60
cactcaatga acacctacta cgcgctgcaa agagccccgc aggcctgagg tgcccccacc 120
tcaccactct tcctattttt gtgtaaaaat ccagcttctt gtcaccacct ccaaggaggg 180
ggaggaggag gaaggcaggt tcctctaggc tgagccgaat gcccctctgt ggtcccacgc 240
cactgatcgc tgcatgccca ccacctgggt acacacagtc tgtgattccc ggagcagaac 300
ggaccctgcc cacccggtct tgtgtgctac tcagtggaca gacccaaggc aagaaagggt 360
gacaaggaca gggtcttccc aggctggctt tgagttccta gcaccgcccc gcccccaatc 420
ctctgtggca catggagtct tggtccccag agtcccccag cggcctccag atggtctggg 480
agggcagttc agctgtggct gcgcatagca gacatacaac ggacggtggg cccagaccca 540
ggctgtgtag acccagcccc cccgccccgc agtgcctagg tcacccacta acgccccagg 600
cctggtcttg gctgggcgtg actgttaccc tcaaaagcag gcagctccag ggtaaaaggt 660
gccctgccct gtagagccca ccttccttcc cagggctgcg gctgggtagg tttgtagcct 720
tcatcacggg ccacctccag ccactggacc gctggcccct gccctgtcct ggggagtgtg 780
gtcctgcgac ttctaagtgg ccgcaagcca cctgactccc ccaacaccac actctacctc 840
tcaagcccag gtctctccct agtgacccac ccagcacatt tagctagctg agccccacag 900
ccagaggtcc tcaggccctg ctttcagggc agttgctctg aagtcggcaa gggggagtga 960
ctgcctggcc actccatgcc ctccaagagc tccttctgca ggagcgtaca gaacccaggg 1020
ccctggcacc cgtgcagacc ctggcccacc ccacctgggc gctcagtgcc caagagatgt 1080
ccacacctag gatgtcccgc ggtgggtggg gggcccgaga gacgggcagg ccgggggcag 1140
gcctggccat gcggggccga accgggcact gcccagcgtg gggcgcgggg gccacggcgc 1200
gcgcccccag cccccgggcc cagcacccca aggcggccaa cgccaaaact ctccctcctc 1260
ctcttcctca atctcgctct cgctcttttt ttttttcgca aaaggagggg agagggggta 1320
aaaaaatgct gcactgtgcg gcgaagccgg tgagtgagcg gcgcggggcc aatcagcgtg 1380
cgccgttccg aaagttgcct tttatggctc gagcggccgc ggcggcgccc tataaaaccc 1440
agcggcgcga cgcgccacca ccgccgagac cgcgtccgcc ccgcgagcac agagcctcgc 1500
ctttgccgat ccgccgcccg tccacacccg ccgccaggta agcccggcca gccgaccggg 1560
gcaggcggct cacggcccgg ccgcaggcgg ccgcggcccc ttcgcccgtg cagagccgcc 1620
gtctgggccg cagcgggggg cgcatggggg gggaaccgga ccgccgtggg gggcgcggga 1680
gaagcccctg ggcctccgga gatgggggac accccacgcc agttcggagg cgcgaggccg 1740
cgctcgggag gcgcgctccg ggggtgccgc tctcggggcg ggggcaaccg gcggggtctt 1800
tgtctgagcc gggctcttgc caatggggat cgcagggtgg gcgcggcgga gcccccgcca 1860
ggcccggtgg gggctggggc gccattgcgc gtgcgcgctg gtcctttggg cgctaactgc 1920
gtgcgcgctg ggaattggcg ctaattgcgc gtgcgcgctg ggactcaagg cgctaactgc 1980
gcgtgcgttc tggggcccgg ggtgccgcgg cctgggctgg ggcgaaggcg ggctcggccg 2040
gaaggggtgg ggtcgccgcg gctcccgggc gcttgcgcgc acttcctgcc cgagccgctg 2100
gccgcccgag ggtgtggccg ctgcgtgcgc gcgcgccgac ccggcgctgt ttgaaccggg 2160
cggaggcggg gctggcgccc ggttgggagg gggttggggc ctggcttcct gccgcgcgcc 2220
gcggggacgc ctccgaccag tgtttgcctt ttatggtaat aacgcggccg gcccggcttc 2280
ctttgtcccc aatctgggcg cgcgccggcg ccccctggcg gcctaaggac tcggcgcgcc 2340
ggaagtggcc agggcggggg cgacctcggc tcacagcgcg cccggctatt ctcgcagctc 2400
acc 2403
<210> 27
<211> 596
<212> DNA
<213> 土拨鼠肝炎病毒
<400> 27
attcgagcat cttaccgcca tttattccca tatttgttct gtttttcttg atttgggtat 60
acatttaaat gttaataaaa caaaatggtg gggcaatcat ttacattttt agggatatgt 120
aattactagt tcaggtgtat tgccacaaga caaacatgtt aagaaacttt cccgttattt 180
acgctctgtt cctgttaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactgatat 240
tcttaactat gttgctcctt ttacgctgtg tggatatgct gctttaatgc ctctgtatca 300
tgctattgct tcccgtacgg ctttcgtttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc 360
tctttatgag gagttgtggc ccgttgtccg tcaacgtggc gtggtgtgct ctgtgtttgc 420
tgacgcaacc cccactggct ggggcattgc caccacctgt caactccttt ctgggacttt 480
cgctttcccc ctcccgatcg ccacggcaga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg 540
gacaggggct aggttgctgg gcactgataa ttccgtggtg ttgtcgggga agggcc 596
<210> 28
<211> 736
<212> PRT
<213> 腺伴随病毒9
<400> 28
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn
260 265 270
Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275 280 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290 295 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305 310 315 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn
325 330 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu
340 345 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355 360 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp
370 375 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385 390 395 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu
405 410 415
Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420 425 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser
435 440 445
Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser
450 455 460
Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro
465 470 475 480
Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser
565 570 575
Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln
580 585 590
Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met
625 630 635 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val
705 710 715 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 29
<211> 1233
<212> DNA
<213> 智人
<400> 29
atggtgtgct tccgcctctt cccggttccg ggctcagggc tcgttctggt ctgcctagtc 60
ctgggagctg tgcggtctta tgcattggaa cttaatttga cagattcaga aaatgccact 120
tgcctttatg caaaatggca gatgaatttc acagtacgct atgaaactac aaataaaact 180
tataaaactg taaccatttc agaccatggc actgtgacat ataatggaag catttgtggg 240
gatgatcaga atggtcccaa aatagcagtg cagttcggac ctggcttttc ctggattgcg 300
aattttacca aggcagcatc tacttattca attgacagcg tctcattttc ctacaacact 360
ggtgataaca caacatttcc tgatgctgaa gataaaggaa ttcttactgt tgatgaactt 420
ttggccatca gaattccatt gaatgacctt tttagatgca atagtttatc aactttggaa 480
aagaatgatg ttgtccaaca ctactgggat gttcttgtac aagcttttgt ccaaaatggc 540
acagtgagca caaatgagtt cctgtgtgat aaagacaaaa cttcaacagt ggcacccacc 600
atacacacca ctgtgccatc tcctactaca acacctactc caaaggaaaa accagaagct 660
ggaacctatt cagttaataa tggcaatgat acttgtctgc tggctaccat ggggctgcag 720
ctgaacatca ctcaggataa ggttgcttca gttattaaca tcaaccccaa tacaactcac 780
tccacaggca gctgccgttc tcacactgct ctacttagac tcaatagcag caccattaag 840
tatctagact ttgtctttgc tgtgaaaaat gaaaaccgat tttatctgaa ggaagtgaac 900
atcagcatgt atttggttaa tggctccgtt ttcagcattg caaataacaa tctcagctac 960
tgggatgccc ccctgggaag ttcttatatg tgcaacaaag agcagactgt ttcagtgtct 1020
ggagcatttc agataaatac ctttgatcta agggttcagc ctttcaatgt gacacaagga 1080
aagtattcta cagctcaaga ctgcagtgca gatgacgaca acttccttgt gcccatagcg 1140
gtgggagctg ccttggcagg agtacttatt ctagtgttgc tggcttattt tattggtctc 1200
aagcaccatc atgctggata tgagcaattt tag 1233
<210> 30
<211> 1236
<212> DNA
<213> 智人
<400> 30
atggtgtgct tccgcctctt cccggttccg ggctcagggc tcgttctggt ctgcctagtc 60
ctgggagctg tgcggtctta tgcattggaa cttaatttga cagattcaga aaatgccact 120
tgcctttatg caaaatggca gatgaatttc acagtacgct atgaaactac aaataaaact 180
tataaaactg taaccatttc agaccatggc actgtgacat ataatggaag catttgtggg 240
gatgatcaga atggtcccaa aatagcagtg cagttcggac ctggcttttc ctggattgcg 300
aattttacca aggcagcatc tacttattca attgacagcg tctcattttc ctacaacact 360
ggtgataaca caacatttcc tgatgctgaa gataaaggaa ttcttactgt tgatgaactt 420
ttggccatca gaattccatt gaatgacctt tttagatgca atagtttatc aactttggaa 480
aagaatgatg ttgtccaaca ctactgggat gttcttgtac aagcttttgt ccaaaatggc 540
acagtgagca caaatgagtt cctgtgtgat aaagacaaaa cttcaacagt ggcacccacc 600
atacacacca ctgtgccatc tcctactaca acacctactc caaaggaaaa accagaagct 660
ggaacctatt cagttaataa tggcaatgat acttgtctgc tggctaccat ggggctgcag 720
ctgaacatca ctcaggataa ggttgcttca gttattaaca tcaaccccaa tacaactcac 780
tccacaggca gctgccgttc tcacactgct ctacttagac tcaatagcag caccattaag 840
tatctagact ttgtctttgc tgtgaaaaat gaaaaccgat tttatctgaa ggaagtgaac 900
atcagcatgt atttggttaa tggctccgtt ttcagcattg caaataacaa tctcagctac 960
tgggatgccc ccctgggaag ttcttatatg tgcaacaaag agcagactgt ttcagtgtct 1020
ggagcatttc agataaatac ctttgatcta agggttcagc ctttcaatgt gacacaagga 1080
aagtattcta cagctgaaga atgttctgct gactctgacc tcaactttct tattcctgtt 1140
gcagtgggtg tggccttggg cttccttata attgttgtct ttatctctta tatgattgga 1200
agaaggaaaa gtcgtactgg ttatcagtct gtgtaa 1236
<210> 31
<211> 1080
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LAMP-2的变体
<400> 31
atggtctgct tcagactgtt ccctgtccct ggatctggtc tggtgcttgt gtgcttggtg 60
ctgggtgctg tgagatccta tgcccttgag ctgaacctga ctgactcaga aaatgccact 120
tgcctgtatg ccaagtggca gatgaacttc actgtgagat atgagactac caacaagacc 180
tacaagactg tgaccatctc agaccatggc actgtcacct acaatggatc aatctgtggt 240
gatgatcaga atggcccaaa gatagcagtg cagtttgggc ccggtttttc ctggattgct 300
aacttcacca aggcagcctc cacctacagc attgactcag tcagcttcag ctacaacact 360
ggggataaca ccaccttccc tgacgcagag gacaagggaa tccttactgt ggacgaactc 420
ctggcaatca gaatccccct taacgacctg ttcagatgca actccctttc aacccttgaa 480
aagaatgatg tggtgcaaca ctattgggac gtcctggtgc aagcctttgt gcagaatggg 540
acagtgagta ccaacgagtt cctctgtgac aaggacaaga ccagcactgt ggcccccact 600
atccacacca ctgtgcccag ccctaccact acccccaccc ctaaagagaa gccagaagct 660
ggaacctact cagtcaacaa tggaaatgac acatgcctcc ttgccaccat gggactgcag 720
ctgaacatca ctcaggacaa ggtggcctca gtgattaaca tcaaccctaa caccactcat 780
agcactggga gctgcagatc acatacagct ctgctgaggc tcaactcctc caccatcaag 840
tacctggact ttgtgtttgc tgtgaagaat gagaacaggt tctacctcaa ggaagtgaac 900
atttccatgt acctggtcaa tggttcagtg ttctctattg ccaacaacaa tctgagctac 960
tgggatgcac ccctgggatc ctcctacatg tgcaacaagg agcagactgt gagtgtgtca 1020
ggtgcttttc agatcaacac ttttgacctg agggtgcagc ccttcaatgt gactcaggga 1080
<210> 32
<211> 1080
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LAMP-2的变体
<400> 32
atggtgtgct ttagactgtt tcctgtgcct ggttcagggc tggtcctggt ctgtctggtg 60
ctgggggctg tcagaagcta tgccttggag ctgaacctca ctgatagtga aaatgccact 120
tgtctgtatg ctaagtggca gatgaacttc actgtgagat atgaaaccac caacaagact 180
tacaaaacag tgaccatctc agatcatgga actgtgacct acaacggcag catttgtgga 240
gacgaccaga acggaccaaa aatcgctgtc caatttgggc ctggattctc ctggattgcc 300
aatttcacta aagctgcctc cacatattca attgactcag tgtccttctc ctacaacact 360
ggggacaaca ctactttccc tgatgctgaa gataagggaa tcttgacagt ggatgagctg 420
ctggctatca ggatcccttt gaatgacctg tttaggtgta attcactgag cactctggag 480
aagaacgacg tggtgcagca ctactgggac gtgctggtgc aggcctttgt gcagaacggc 540
actgtgtcca ccaacgaatt cctgtgtgat aaggacaaaa cttccactgt ggcacctaca 600
attcacacta ctgtgccttc acctaccacc actccaactc caaaggaaaa gcctgaagca 660
ggaacctact ctgtgaacaa tggcaatgat acctgtctgt tggccaccat gggcctccaa 720
ctgaacatta ctcaggacaa ggtggcctca gtgattaaca ttaaccccaa cactacccac 780
tccactggca gctgtagatc acacacagcc ttgctcagac tgaatagcag caccatcaag 840
tatttggatt ttgtgtttgc agtgaagaat gaaaacaggt tctacctgaa ggaagtcaac 900
atctcaatgt acctggtgaa cggctcagtg ttcagcattg ccaacaacaa cctctcctat 960
tgggacgctc cactggggag cagctacatg tgtaacaagg aacagactgt gtcagtgtca 1020
ggagccttcc agattaacac ctttgatctg agggtccaac cctttaatgt cactcaagga 1080
<210> 33
<211> 1080
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LAMP-2的变体
<400> 33
atggtctgtt ttaggctgtt ccctgtccct ggttcaggac tggtcttagt gtgtctggtg 60
cttggagctg tcagaagcta tgccctggag ctgaacctga ctgactcaga aaatgccact 120
tgcctgtatg ccaagtggca gatgaacttc actgtcagat atgaaaccac caacaagacc 180
tataagactg tgaccatctc agaccatggc actgtgactt acaatgggtc aatttgtgga 240
gatgaccaga atggccctaa gatagctgtc cagtttggtc caggattcag ctggattgcc 300
aacttcacca aggcagccag cacctacagc attgactctg tgtccttctc ctacaacaca 360
ggagacaaca ccactttccc tgatgcagag gacaaaggta tcctgactgt ggatgagttg 420
ctggcaatca ggatcccact gaacgatctg ttcaggtgca actcactgtc cactctggaa 480
aagaatgatg tggtgcagca ctattgggat gtgctagtcc aggcctttgt ccagaatggg 540
actgtgtcaa ctaatgagtt cctgtgtgac aaggacaaga caagcactgt agcccccact 600
atccatacca cagtacctag ccccaccact actccaaccc ccaaggagaa gcctgaggct 660
ggcacctact cagtgaacaa tgggaatgac acctgtttgc tggccactat gggactccaa 720
ctgaacatca cccaggacaa agtggcctct gtgatcaata tcaatcccaa caccacccac 780
agcactgggt cctgcagaag ccacactgcc ctcctgaggc tcaactcatc aactatcaag 840
tacttggatt ttgtgtttgc agtgaagaat gagaacagat tctacctcaa agaggtcaac 900
atttcaatgt acctggtgaa tgggagtgtg ttctccattg ctaacaacaa cctgagctac 960
tgggatgccc ctctgggctc ctcatacatg tgcaacaagg aacagactgt gagtgtgtca 1020
ggggccttcc agatcaacac ttttgacctg agagtgcagc cctttaatgt gacacaggga 1080
<210> 34
<211> 410
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Met Val Cys Phe Arg Leu Phe Pro Val Pro Gly Ser Gly Leu Val Leu
1 5 10 15
Val Cys Leu Val Leu Gly Ala Val Arg Ser Tyr Ala Leu Glu Leu Asn
20 25 30
Leu Thr Asp Ser Glu Asn Ala Thr Cys Leu Tyr Ala Lys Trp Gln Met
35 40 45
Asn Phe Thr Val Arg Tyr Glu Thr Thr Asn Lys Thr Tyr Lys Thr Val
50 55 60
Thr Ile Ser Asp His Gly Thr Val Thr Tyr Asn Gly Ser Ile Cys Gly
65 70 75 80
Asp Asp Gln Asn Gly Pro Lys Ile Ala Val Gln Phe Gly Pro Gly Phe
85 90 95
Ser Trp Ile Ala Asn Phe Thr Lys Ala Ala Ser Thr Tyr Ser Ile Asp
100 105 110
Ser Val Ser Phe Ser Tyr Asn Thr Gly Asp Asn Thr Thr Phe Pro Asp
115 120 125
Ala Glu Asp Lys Gly Ile Leu Thr Val Asp Glu Leu Leu Ala Ile Arg
130 135 140
Ile Pro Leu Asn Asp Leu Phe Arg Cys Asn Ser Leu Ser Thr Leu Glu
145 150 155 160
Lys Asn Asp Val Val Gln His Tyr Trp Asp Val Leu Val Gln Ala Phe
165 170 175
Val Gln Asn Gly Thr Val Ser Thr Asn Glu Phe Leu Cys Asp Lys Asp
180 185 190
Lys Thr Ser Thr Val Ala Pro Thr Ile His Thr Thr Val Pro Ser Pro
195 200 205
Thr Thr Thr Pro Thr Pro Lys Glu Lys Pro Glu Ala Gly Thr Tyr Ser
210 215 220
Val Asn Asn Gly Asn Asp Thr Cys Leu Leu Ala Thr Met Gly Leu Gln
225 230 235 240
Leu Asn Ile Thr Gln Asp Lys Val Ala Ser Val Ile Asn Ile Asn Pro
245 250 255
Asn Thr Thr His Ser Thr Gly Ser Cys Arg Ser His Thr Ala Leu Leu
260 265 270
Arg Leu Asn Ser Ser Thr Ile Lys Tyr Leu Asp Phe Val Phe Ala Val
275 280 285
Lys Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Leu Lys Glu Val Asn Ile Ser Met Tyr
290 295 300
Leu Val Asn Gly Ser Val Phe Ser Ile Ala Asn Asn Asn Leu Ser Tyr
305 310 315 320
Trp Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Thr
325 330 335
Val Ser Val Ser Gly Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asp Leu Arg Val
340 345 350
Gln Pro Phe Asn Val Thr Gln Gly Lys Tyr Ser Thr Ala Gln Asp Cys
355 360 365
Ser Ala Asp Asp Asp Asn Phe Leu Val Pro Ile Ala Val Gly Ala Ala
370 375 380
Leu Ala Gly Val Leu Ile Leu Val Leu Leu Ala Tyr Phe Ile Gly Leu
385 390 395 400
Lys His His His Ala Gly Tyr Glu Gln Phe
405 410
<210> 35
<211> 411
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Met Val Cys Phe Arg Leu Phe Pro Val Pro Gly Ser Gly Leu Val Leu
1 5 10 15
Val Cys Leu Val Leu Gly Ala Val Arg Ser Tyr Ala Leu Glu Leu Asn
20 25 30
Leu Thr Asp Ser Glu Asn Ala Thr Cys Leu Tyr Ala Lys Trp Gln Met
35 40 45
Asn Phe Thr Val Arg Tyr Glu Thr Thr Asn Lys Thr Tyr Lys Thr Val
50 55 60
Thr Ile Ser Asp His Gly Thr Val Thr Tyr Asn Gly Ser Ile Cys Gly
65 70 75 80
Asp Asp Gln Asn Gly Pro Lys Ile Ala Val Gln Phe Gly Pro Gly Phe
85 90 95
Ser Trp Ile Ala Asn Phe Thr Lys Ala Ala Ser Thr Tyr Ser Ile Asp
100 105 110
Ser Val Ser Phe Ser Tyr Asn Thr Gly Asp Asn Thr Thr Phe Pro Asp
115 120 125
Ala Glu Asp Lys Gly Ile Leu Thr Val Asp Glu Leu Leu Ala Ile Arg
130 135 140
Ile Pro Leu Asn Asp Leu Phe Arg Cys Asn Ser Leu Ser Thr Leu Glu
145 150 155 160
Lys Asn Asp Val Val Gln His Tyr Trp Asp Val Leu Val Gln Ala Phe
165 170 175
Val Gln Asn Gly Thr Val Ser Thr Asn Glu Phe Leu Cys Asp Lys Asp
180 185 190
Lys Thr Ser Thr Val Ala Pro Thr Ile His Thr Thr Val Pro Ser Pro
195 200 205
Thr Thr Thr Pro Thr Pro Lys Glu Lys Pro Glu Ala Gly Thr Tyr Ser
210 215 220
Val Asn Asn Gly Asn Asp Thr Cys Leu Leu Ala Thr Met Gly Leu Gln
225 230 235 240
Leu Asn Ile Thr Gln Asp Lys Val Ala Ser Val Ile Asn Ile Asn Pro
245 250 255
Asn Thr Thr His Ser Thr Gly Ser Cys Arg Ser His Thr Ala Leu Leu
260 265 270
Arg Leu Asn Ser Ser Thr Ile Lys Tyr Leu Asp Phe Val Phe Ala Val
275 280 285
Lys Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Leu Lys Glu Val Asn Ile Ser Met Tyr
290 295 300
Leu Val Asn Gly Ser Val Phe Ser Ile Ala Asn Asn Asn Leu Ser Tyr
305 310 315 320
Trp Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Thr
325 330 335
Val Ser Val Ser Gly Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asp Leu Arg Val
340 345 350
Gln Pro Phe Asn Val Thr Gln Gly Lys Tyr Ser Thr Ala Glu Glu Cys
355 360 365
Ser Ala Asp Ser Asp Leu Asn Phe Leu Ile Pro Val Ala Val Gly Val
370 375 380
Ala Leu Gly Phe Leu Ile Ile Val Val Phe Ile Ser Tyr Met Ile Gly
385 390 395 400
Arg Arg Lys Ser Arg Thr Gly Tyr Gln Ser Val
405 410

Claims (58)

1.一种用于治疗受试者中的达农病的方法，所述受试者被鉴定为患有达农病或处于达农病的风险中并且/或者具有在LAMP-2基因的一种或多种同种型中的失活突变，所述方法包括：
向所述受试者施用治疗有效量的包含衣壳和载体基因组的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，
其中所述载体基因组包含编码LAMP-2蛋白、优选LAMP-2B蛋白的多核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量为小于约2×1014个载体基因组(vg)/千克(kg)受试者的体重。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量为小于约1.5×1014vg/kg受试者的体重。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量为小于约1×1014vg/kg受试者的体重。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量为至少约1×1012vg/kg受试者的体重。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量为至少约1×1013vg/kg受试者的体重。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量为约6.7×1013vg/kg受试者的体重。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量为约1.1×1014vg/kg受试者的体重。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量为约2.0×1014vg/kg受试者的体重。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的他克莫司。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的利妥昔单抗。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的他克莫司，并且向所述受试者施用有效量的利妥昔单抗。
13.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的依库珠单抗。
14.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的利妥昔单抗；向所述受试者施用有效量的他克莫司；和/或向所述受试者施用有效量的依库珠单抗。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述受试者处于非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、任选地导致可逆性血小板减少症和/或急性肾损伤(AKI)的aHUS的风险中。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的皮质类固醇。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法包括在施用有效量的他克莫司之前，向所述受试者施用有效量的皮质类固醇。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述受试者是未成年受试者，任选地具有8-14岁和/或15-17岁的年龄。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述受试者是儿童受试者，任选地具有0-8岁的年龄。
20.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述受试者是成人受试者，任选地具有18岁或以上的年龄。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的AAV是静脉内施用的。
22.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的AAV通过直接心脏注射进行施用。
23.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的AAV通过腹膜内注射进行施用。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述方法导致以下中的一种或多种：
a)通过AAV的心肌细胞和/或骨骼肌转导；
b)任选地在心肌细胞和/或骨骼肌中，编码LAMP-2B的外源核糖核酸多核苷酸的表达和/或外源LAMP-2B蛋白的表达；
c)一种或多种达农病相关的组织学异常，任选地自噬泡或肌原纤维紊乱的校正或改善；
d)心肌细胞分子标记物表达的校正或改善；和/或
e)心肌细胞组织学的校正或改善。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述方法导致以下中的一种或多种：
a)心血管病理生理学、射线照相评估和/或心肺运动/生理参数的持续改善或稳定；
b)LAMP2B基因和/或蛋白质表达的校正；
c)达农病相关的组织学异常的改善；和/或
d)针对AAV的耐受性免疫应答。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述方法导致以下中的一种或多种：
a)心血管病理生理学、射线照相评估和/或心肺运动/生理参数的持续改善或稳定；
b)LAMP2B基因和/或蛋白质表达的校正；
c)达农病相关的组织学异常的改善；和/或
d)针对AAV的耐受性免疫应答。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述方法导致以下中的一种或多种：
a)治疗中出现的不良事件(TEAE)和SAE的低发生率和/或强度；
b)心脏干预的低发生率，所述心脏干预包括心脏移植、植入式心律转复除颤器或起搏器放置、用于心脏传导异常的电生理消融手术或用于心力衰竭的后续住院治疗；
c)针对AAV的低免疫应答，任选地针对AAV和/或LAMP-2B蛋白反应性的抗体或T淋巴细胞；
d)肝毒性的低发生率和/或强度，任选地肝脏转氨酶(AST和ALT)、GGT、胆红素和ALP的低改变；和/或
e)h凝血病的低发生率和/或强度，基于血小板计数、凝血酶原时间(PT或国际标准化比值(INR))、活化部分凝血活酶时间(aPTT)、纤维蛋白原、D-二聚体、凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)和补体组分(补体3(C3)、补体4(C4)和血清膜攻击复合物(sC5b-9))距离基线的改变。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述AAV包含表达盒，所述表达盒包含与启动子可操作地连接的编码LAMP-2B蛋白的多核苷酸序列，并且其中所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:2共享至少95％的同一性，并且/或者所述LAMP-2B蛋白质与SEQ ID NO:1共享至少95％的同一性。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:2或由其组成，并且/或者所述LAMP-2B蛋白包含SEQ ID NO:1或由其组成。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述启动子是CAG启动子。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:22共享至少95％的同一性的增强子/启动子区。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述增强子/启动子区包含SEQ ID NO:22或由其组成。
33.根据权利要求28所述的方法，其中所述表达盒按5'至3'次序包含：
(a)包含SEQ ID NO:22的增强子/启动子区；
(b)编码LAMP-2B蛋白的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:3；
(c)包含SEQ ID NO:27的3'UTR序列；和/或
(d)包含SEQ ID NO:7的聚腺苷酸化序列。
34.根据权利要求28所述的方法，其中所述表达盒由以下侧接：(i)包含SEQ ID NO:11的5'ITR；以及(ii)包含SEQ ID NO:12的3'ITR。
35.根据权利要求28所述的方法，其中所述表达盒包含SEQ ID NO:8。
36.根据权利要求28所述的方法，其中所述衣壳是AAV9衣壳。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述AAV9衣壳包含一种或多种衣壳蛋白，所述一种或多种衣壳蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸1至736、SEQ ID NO:28的氨基酸138至736、或SEQ ID NO:28的氨基酸203至736。
38.一种用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其包含治疗有效量的腺相关病毒(AAV)，所述腺相关病毒(AAV)包含编码LAMP-2蛋白、优选LAMP-2B蛋白的多核苷酸序列。
39.根据权利要求38所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述治疗有效量为小于约2×1014个载体基因组(vg)/千克(kg)受试者的体重。
40.根据权利要求38所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述治疗有效量为小于约1.5×1014vg/kg。
41.根据权利要求38所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述治疗有效量为小于约1×1014vg/kg。
42.根据权利要求38-41中任一项所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述治疗有效量为至少约1×1012vg/kg。
43.根据权利要求38-41中任一项所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述治疗有效量为至少约1×1013vg/kg。
44.根据权利要求38-41中任一项所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述治疗有效量为约6.7×1013vg/kg。
45.根据权利要求38-41中任一项所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述治疗有效量为约1.1×1014vg/kg。
46.根据权利要求38-41中任一项所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述治疗有效量为约2.0×1014vg/kg。
47.根据权利要求38-46中任一项所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述AAV包含表达盒，所述表达盒包含与启动子可操作地连接的编码LAMP-2B蛋白的多核苷酸序列，并且其中所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:2共享至少95％的同一性，并且/或者所述LAMP-2B蛋白质与SEQ ID NO:1共享至少95％的同一性。
48.根据权利要求38-47中任一项所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:2或由其组成，并且/或者所述LAMP-2B蛋白包含SEQ ID NO:1或由其组成。
49.根据权利要求38-48中任一项所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述启动子是CAG启动子。
50.根据权利要求38-49中任一项所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:22共享至少95％的同一性的增强子/启动子区。
51.根据权利要求38-50中任一项所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述增强子/启动子区包含SEQ ID NO:22或由其组成。
52.根据权利要求38-51中任一项所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述表达盒按5'至3'次序包含：
(a)包含SEQ ID NO:22的增强子/启动子区；
(b)编码LAMP-2B蛋白的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:3；
(c)包含SEQ ID NO:27的3'UTR序列；和/或
(d)包含SEQ ID NO:7的聚腺苷酸化序列。
53.根据权利要求38-52中任一项所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述表达盒由以下侧接：(i)包含SEQ ID NO:11的5'ITR；以及(ii)包含SEQ IDNO:12的3'ITR。
54.根据权利要求38-53中任一项所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述表达盒包含SEQ ID NO:8。
55.根据权利要求38-54中任一项所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述衣壳是AAV9衣壳。
56.根据权利要求55所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物，其中所述AAV9衣壳包含一种或多种衣壳蛋白，所述一种或多种衣壳蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸1至736、SEQ ID NO:28的氨基酸138至736、或SEQ ID NO:28的氨基酸203至736。
57.一种试剂盒，其包含根据权利要求38-55中任一项所述的用于治疗达农病的单位剂量、药物组合物或组合物；以及治疗达农病的使用说明书。
58.根据权利要求57所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括包含以下中的一种或多种的一种或多种单位剂量、药物组合物或组合物：利妥昔单抗；他克莫司；依库珠单抗；和皮质类固醇。
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