CN116879550A - 一种人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒，其包括试剂R1，所述试剂R1包含第一缓冲溶液以及悬浮于其中的能够与活性氧作用产生化学发光信号的受体颗粒，其特征在于：所述受体颗粒包括载体，所述载体的内部填充有发光组合物，所述载体的表面键合有HIV抗原；所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不低于5％且不高于20％；每毫克质量的所述受体颗粒中的糖含量不高于25μg。本发明所述试剂盒中R1试剂的受体颗粒粒径分布变异系数C.V值不低于5％且不高于20％，每毫克质量的所述受体颗粒中的糖含量不高于25μg；进而上述R1试剂既能满足大批量生产的商业需要，同时也有超高的灵敏度，又有很宽的检测量程。

Description

一种人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒及其应用

技术领域

本技术方案涉及化学发光检测领域，更具体地，本技术方案涉及一种人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒及其应用。

背景技术

免疫分析经过半个多世纪的发展，已经发展出了很多种类。根据测定过程中是否要将待测物质与反应体系分离可以分为非均相(Heterogenous)免疫分析和均相(Homogeneous)免疫分析。非均相免疫分析，是指引入探针进行标记的操作过程中，各种相关试剂混合反应后需要进行分离，将待测物与反应体系分离后再进行检测，是现在免疫分析中的主流方法。如广为人们熟知的酶联免疫吸附法(ELISA法)和磁微粒化学发光法等。均相免疫分析则是指在测定过程中将待测物与反应体系中的相关试剂混合反应后直接测定，而没有多余的分离或清洗的步骤。截止目前，多种灵敏的检测方法被应用于均相免疫分析，比如光学检测方法、电化学检测方法等。

获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是一种由HIV病毒即人类免疫缺陷病毒(简称HIV)侵入人体后破坏人体免疫功能，使人体发生多种不可治愈的感染和肿瘤，最后导致被感染者死亡的一种严重传染病。HIV感染后主要表现为免疫系统受到严重损伤，T4淋巴细胞遭破坏，机体抵抗力下降，诱发严重感染和一些少见的癌瘤，病人容易患各种罕见的疾病，最终因长期消耗，全身衰竭而死亡。因此，HIV检测时预防和治疗获得性免疫缺陷综合征最重要的环节。

目前，HIV的检测方法情况如下：

A.酶联免疫吸附试验(ELISA)

目前应用的ELISA法有8种之多。它们的特异性和敏感性超过99％。

B.颗粒凝集法(PA)

PA为快速、简便的一种筛选方法。如属阳性，应经WB证实。PA不需任何特殊仪器，其结果用肉眼可判别。全过程仅需5分钟。缺点有假阳性，且价格昂贵。

C.快速试剂

a)人类免疫缺陷病毒(HIV)1+2型抗体诊断试剂(胶体硒法)

仅用于无偿献血员现场初筛及临床紧急情况的使用，本品检测阳性者，需进行进一步筛查确认。

b)InstantCHEK^TM-HIVl+2金标快速诊断试剂

InstantCHEK^TM-HIV1+2是一种快速、简单、灵敏的检验方法，用以检测艾滋病病毒(HIV-1和HIV-2)的抗体。该方法适用于初筛检测，凡由该试剂测定为阳性者，需用另一种方法检测如ELISA或用蛋白印记法确定。

D.HIV-抗体确认实验

免疫印迹试验(WB)、条带免疫试验(LIATEK HIVⅢ)、放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA)。国内常用的确认试验方法是WB。

a)免疫印迹实验(westernblot，WB)

广泛用于许多传染病诊断的实验方法，就HIV的病原学诊断而言，它是首选的用以确认HIV抗体的确认实验方法，WB的检测结果常常被作为鉴别其他检验方法优劣的“金标准”。

WB的敏感性一般不低于初筛实验，但它的特异性很高，这主要是基于HIV不同抗原组分的分离以及浓缩和纯化，能够检测针对不同抗原成分的抗体，因而能够用WB方法鉴别初筛实验的准确性。从WB确认试验结果看出，初筛试验尽管选择质量较好的试剂，如第三代ELISA，仍会有假阳性出现，必须通过确认试验才能得出准确结果。

b)免疫荧光实验(IFA)

IFA法经济、简便、快速，曾被FDA推荐用于WB不确定样品的诊断。但需要昂贵的荧光显微镜，需要受过良好训练的技术人员、观察和解释结果易受主观因素的影响，结果不宜长期保存，IFA不宜在一般的实验室开展和应用。

以上这些方法都存在一些难以克服的困难，化学发光法具有高灵敏度、高特异性、宽线性、快速、影响因素少、结果准确等优点，是近年来运用最为广泛的一种疾病检测方法。目前逐渐运用于HIV的检测，有助于实现感染的早发现、早诊断、早治疗，减少假阳性和漏检率。

光激化学发光的基础原理是一种均相免疫反应。它是基于两种微粒表面包被的抗原或抗体，在液相中形成免疫复合物而将两种微粒拉近。在激光的激发下，发生微粒之间的离子氧的转移，进而产生高能级的红光，通过单光子计数器和数学拟合将光子数换算为靶分子浓度。而当样本不含靶分子时，两种微粒间无法形成免疫复合物，两种微粒的间距超出离子氧传播范围，离子氧在液相中迅速淬灭，检测时则无高能级红光产生。利用光激化学发光法检测HIV，目前存在以下问题难以解决：(1)制备工艺复杂，尤其是微球制备及修饰工艺过于复杂；(2)假阳性率高。

因此，亟需开发一种能够大批量生产、成本低廉、质量合格、性能稳定，既能满足灵敏度要求、又能满足线性范围要求的HIV检测试剂盒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒。当将该试剂盒应用于均相化学发光分析检测时，本申请的发明人意外发现其既有超高的灵敏度，又具有很宽的检测量程。

基于此，本发明一方面提供一种人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒，其包括试剂R1，所述试剂R1包含第一缓冲溶液以及悬浮于其中的能够与活性氧作用产生化学发光信号的受体颗粒，所述受体颗粒包括载体，所述载体的内部填充有发光组合物，所述载体的表面键合有HIV抗原；所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不低于5％且不高于20％；每毫克质量的所述受体颗粒中的糖含量不高于25μg。

所述受体颗粒在所述试剂R1中的粒径分布变异系数C.V值不高于15％。

所述受体颗粒在所述试剂R1中的粒径分布变异系数C.V值不低于8％。

每毫克质量的所述受体颗粒中的糖含量不高于20μg。

所述第一缓冲溶液中多糖的含量为0.01～1wt％，优选为0.05～0.5wt％。

所述载体的表面没有包被糖分子而直接键合HIV抗原。

所述载体的表面上带有键合官能团，其用于将HIV抗原直接化学键合在所述载体的表面上，所述键合官能团选自胺基、酰胺基、羟基、醛基、羧基、环氧基、马来酰亚胺基和巯基中的至少一种；优选选自醛基、羧基、环氧基和马来酰亚胺基。

所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物；优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖；更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖，最优选为葡聚糖或葡聚糖衍生物。所述糖含量可以利用蒽酮法检测。

所述试剂盒还包括试剂R2，试剂R2包含生物素标记的HIV抗原。

所述试剂盒还包括Anti-HIV样品稀释液。

所述试剂盒还包括Anti-HIV阴性对照。

所述试剂盒还包括Anti-HIV-1阳性对照，其含有小牛血清和HIV-1阳性血清。

所述试剂盒还包括Anti-HIV-2阳性对照，其含有小牛血清和HIV-2多克隆抗体。

所述试剂盒还包括Anti-HIV弱阳性对照，其含有小牛血清和HIV-1阳性血清。

本发明的有益效果为：本发明所述试剂盒中R1试剂的受体颗粒粒径分布变异系数C.V值不低于5％且不高于20％，每毫克质量的所述受体颗粒中的糖含量不高于25μg；进而上述R1试剂既能满足大批量生产的商业需要，同时也有超高的灵敏度，又有很宽的检测量程。同时，本发明对受体颗粒中的糖含量进行控制，降低了糖对检测信号的影响，使检测精密度提高，也降低了生产成本。

附图说明

图1为实施例2制备的受体颗粒的Gaussian分布图。

图2是一种糖含量测定标准曲线图。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。

除非另有定义，本文使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

Ⅰ.术语

本发明所述用语“活性氧”是指机体内或者自然环境中由氧组成，含氧并且性质活泼的物质的总称，主要为一种激发态的氧分子，包括氧的一电子还原产物超氧阴离子(O₂·-)、二电子还原产物过氧化氢(H₂O₂)、三电子还原产物羟基自由基(·OH)以及一氧化氮和单线态氧(1O₂)等。

本发明所述用语“受体颗粒”是指含有能够与活性氧反应可以产生可检测信号的化合物的颗粒。供体颗粒被能量或者活性化合物诱导激活并释放高能态的活性氧，该高能态的活性氧被近距离的受体颗粒俘获，从而传递能量以激活所述受体颗粒。在本发明的一些具体实施方式中，所述受体颗粒包含发光组合物和载体，所述发光组合物填充于载体中和/或包被于载体表面。本发明所述“载体”选自带、片、棒、管、孔、微滴定板、珠、粒子和微球，其可以是本领域技术人员所公知的微球或微粒，其可以是任何尺寸的，其可以是有机的或是无机的，其可以是可膨胀或不可膨胀的，其可以是多孔的或非多孔的，其具有任何密度，但优选具有和水接近的密度，优选能漂浮于水中，且由透明、部分透明或不透明的材料构成。所述载体可以有或没有电荷，当带有电荷时，优选是负电荷。所述载体可以是乳胶颗粒或是含有有机或无机聚合物的其他颗粒、脂双层如脂质体、磷脂囊泡、小油滴、硅颗粒、金属溶胶、细胞和微晶染料。

本发明中，所述“发光组合物”即一种被称作为标记物的化合物，可进行化学反应以便引起发光，比如通过被转化为在电子激发态下形成的另一种化合物。激发态可以是单线态或是三重激发态。激发态可弛豫到基态直接发光，或者是通过将激发能量传递到发射能量受体，从而自身恢复到基态。在此过程中，能量受体颗粒将被跃迁为激发态而发光。

本发明所述“粒径分布变异系数C.V值”是指在纳米粒度仪的检测结果中，粒径在Gaussian分布中的变异系数。变异系数的计算公式为：C.V值＝(标准偏差SD/平均值Mean)×100％。标准偏差(Standard Deviation，SD)也被称为标准差，它描述各数据偏离平均数的距离(离均差)的平均数，它是离差平方和平均后的方根，用σ表示。标准差是方差的算术平方根。标准偏差能反映一个数据集的离散程度，标准偏差越小，这些值偏离平均值就越少，反之亦然。标准偏差σ为正态分布曲线上的拐点(0.607倍峰高处)至峰高与时间轴的垂线间的距离，即正态分布曲线上两拐点间距离的一半。半高峰宽(Wh/2)是指峰高一半处的峰宽，Wh/2＝2.355σ。通过正态分布曲线两侧的拐点作切线，在基线上的截距称为峰宽或称基线宽度，W＝4σ或W＝1.699Wh/2。

本发明所述用语“待测样品”是指待测的含有或疑似含有待测目标分子的一种混合物。可以被用在本发明的待测样品包括体液，如血液(可以是在收集的血液样品中通常看到的抗凝血)、血浆、血清、尿、精液、唾液、细胞培养物、组织提取物等。其他类型的待测样品包括溶剂、海水、工业水样、食品样品、环境样本诸如土或水、植物材料、真核细胞、细菌、质粒、病毒、真菌、及来自于原核的细胞。待测样品可以在使用前根据需要利用稀释液进行稀释。例如，为了避免HOOK效应，可以在上机检测前使用稀释液对待测样品进行稀释后再在检测仪器上进行检测。

本发明所述用语“待测目标分子”是指检测时待检测样本中的物质。与待测目标分子具有特异性结合亲合力的一种或多种物质会被用于检测该目标分子。待测目标分子可以是蛋白、肽、抗体或可以使其与抗体结合的半抗原。待测目标分子可以是与互补核酸或寡聚核苷酸结合的核酸或寡聚核苷酸。待测目标分子可以是可形成特异性结合配对成员的任何其他物质。其他典型的待测目标分子的例子包括：药物，诸如类固醇、激素、蛋白、糖蛋白、粘蛋白、核蛋白、磷蛋白、滥用的药物、维生素、抗细菌药、抗真菌药、抗病毒药、嘌呤、抗肿瘤试剂、安非他命、杂氮化合物、核酸和前列腺素，以及任何这些药物的代谢物；杀虫剂及其代谢物；以及受体。分析物也包括细胞、病毒、细菌和真菌。

本发明所述用语“抗体”以最广含义使用，包括任何同种型的抗体，保留对抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。在任何需要的情况下，抗体可以进一步与其它部分，诸如特异性结合配对成员中的一员，例如生物素或亲和素(生物素-亲和素特异性结合配对成员中的一员)等缀合。

本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应的物质。

本发明所述用语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用，包括但不限于如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。

本发明所述用语“特异性结合”，是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应，从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。在本发明公开的技术思想下，特异性结合反应的检测方法包括但不限于：双抗体夹心法、竞争法、中和竞争法、间接法或捕获法。

Ⅱ.具体实施方案

下面将结合实施例更详细地说明本发明。

现有的常识为：微球的粒径尺寸越均一，利用该微球进行的均相化学发光检测的性能就越好。因此目前针对均相化学发光中采用的微球的研究趋于获得更均一粒径的微球。本申请的发明人通过研究后发现，采用粒径尺寸均一的微球进行均相化学发光检测时，检测结果的灵敏度和检测量程难以同时保障。但是通过采用粒径尺寸均一性合适的微球(如微球粒径分布的变异系数＞5％)，反而既能保障光激化学发光检测的灵敏度，又能拓宽检测量程。

本发明的发明人通过控制受体试剂，即R1试剂中受体颗粒的粒径分布和糖含量，进而控制每个受体颗粒表面报告分子(如，抗体/抗原)的量(小粒径微球比表面积大，单位质量微球表面报告分子的量多，大粒径微球比表面积小，单位质量微球表面报告分子的量少)。受体颗粒在受体试剂中的粒径分布的变异系数越大，不均一程度越高，相当于体系中存在各种尺寸不一的受体颗粒，从而既有较高的灵敏度，又有很宽的检测量程。

本发明一方面提供一种人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒，其包括试剂R1，所述试剂R1包含第一缓冲溶液以及悬浮于其中的能够与活性氧作用产生化学发光信号的受体颗粒，所述受体颗粒的表面结合有HIV抗原，其特征在于：所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不低于5％且不高于20％；每毫克质量的所述受体颗粒中的糖含量不高于25μg。

所述受体颗粒包括载体，所述载体的内部填充有发光组合物，所述载体的表面键合有HIV抗原。

在一些具体实施例中，所述载体表面包被有多糖分子，所述HIV抗原通过与多糖分子的化学键合而间接结合到受体颗粒的表面。

上述受体颗粒，其在所述试剂R1中的粒径分布变异系数C.V值可以为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％。

优选的所述受体颗粒在所述试剂R1中的粒径分布变异系数C.V值不高于15％。

优选的所述受体颗粒在所述试剂R1中的粒径分布变异系数C.V值不低于8％。

优选的每毫克质量的所述受体颗粒中的糖含量不高于20μg；更优选不高于10μg。

优选的所述第一缓冲溶液中多糖的含量为0.01～1wt％，优选为0.05～0.5wt％。

在优选实施例中，所述载体的表面没有包被糖分子而直接键合HIV抗原。

所述载体的表面上带有键合官能团，其用于将HIV抗原直接化学键合在所述载体的表面上，所述键合官能团选自胺基、酰胺基、羟基、醛基、羧基、环氧基、马来酰亚胺基和巯基中的至少一种；优选选自醛基、羧基、环氧基和马来酰亚胺基。

上述实施例中，所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物；优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖；更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖，最优选为葡聚糖或葡聚糖衍生物。

上述实施例中，所述糖含量利用蒽酮法检测。

所述试剂盒还包括试剂R2，试剂R2包含生物素标记的HIV抗原。

所述试剂盒还包括Anti-HIV样品稀释液。

所述试剂盒还包括Anti-HIV阴性对照。

所述试剂盒还包括Anti-HIV-1阳性对照，其含有小牛血清和HIV-1阳性血清。

所述试剂盒还包括Anti-HIV-2阳性对照，其含有小牛血清和HIV-2多克隆抗体。

所述试剂盒还包括Anti-HIV弱阳性对照，其含有小牛血清和HIV-1阳性血清。

所述试剂盒中含有多个试剂条，每个试剂条上开设有若干盛装试剂的试剂孔槽，其中至少一个所述试剂孔槽用于盛装所述试剂R1。

本发明还提供一种上述受体试剂或上述试剂盒在化学发光分析仪上的应用。

本发明还提供一种上述受体试剂或上述试剂盒在POCT检测中的应用。POCT是指现场快速检验或在病人旁边进行的临床检测。

III.实施例

实施例1:受体颗粒a的制备

1.1载体的合成及表征

1)准备100mL的三口烧瓶，加入40mmol苯乙烯、3mmol甲基丙烯酸、10mL水，搅拌10min后通N₂ 30min；

2)称取0.11g过硫酸铵和0.2g氯化钠，溶于40mL水中配制成水溶液。将该水溶液加入到步骤1)的反应体系中，继续通N₂ 30min；

3)将反应体系升温至70℃，反应15h；

4)将反应完成后的乳液冷却至室温，用合适的滤布过滤。得到的乳液用去离子水多次离心沉降清洗，直至离心初的上清液的电导率接近去离子水，然后用水稀释，以乳液形式保存；

1.2.发光组合物的填埋过程

1)准备25mL的圆底烧瓶，加入0.1g二甲基噻吩衍生物和0.1g铕(Ⅲ)配合物(MTTA-EU³⁺)，10mL 95％乙醇，磁力搅拌，水浴升温至70℃，获得配合物溶液；

2)准备100mL的三口烧瓶，加入10mL 95％乙醇、10mL水和10mL浓度为10％、步骤1.1中获得的羧基聚苯乙烯乳胶微球，磁力搅拌，水浴升温至70℃；

3)将步骤1)中的配合物溶液缓慢滴加至步骤2)中的三口烧瓶中，70℃反应2h后停止搅拌，自然冷却；

4)将上述乳液离心1h，30000G，离心后弃去上清液，得到填埋有发光组合物的羧基聚苯乙烯微球。用20mM HEPES缓冲液定容，使其终浓度为20mg/mL。

1.3发光微球偶联HIV抗原的包被

1)将HIV抗原透析至pH值为5.0的50mM MES缓冲液，测得浓度为1mg/mL。

2)在2mL离心管中加入0.5mL羧基发光微球和0.5mL透析后的HIV抗原，混匀后加入100μL 10mg/mL EDAC溶液(50mM MES缓冲液)，2-8℃反应4h。

3)反应完毕后加入0.5mL 100mg/mL BSA溶液(50mM MES缓冲液)，2-8℃反应2h。

4)反应完毕后离心30min，20000G，离心后弃去上清液，用50mM MES缓冲液重新悬浮。重复离心清洗四次，并稀释至终浓度为100μg/mL，获得偶联HIV抗原的受体颗粒溶液，得到受体试剂A。

实施例2:受体颗粒b的制备

2.1聚苯乙烯乳胶微球的制备

1)准备100mL的三口烧瓶，加入40mmol苯乙烯、5mmol丙烯醛、10mL水，搅拌10min后通N₂ 30min；

2)称取0.11g过硫酸铵和0.2g氯化钠，溶于40mL水中配制成水溶液。将该水溶液加入到步骤1)的反应体系中，继续通N₂ 30min；

3)将反应体系升温至70℃，反应15h；

4)将反应完成后的乳液冷却至室温，用合适的滤布过滤。得到的乳液用去离子水过次离心沉降清洗，直至离心初的上清液的电导率接近去离子水，然后用水稀释，以乳液形式保存；

2.2发光组合物的填埋过程

1)准备25mL的圆底烧瓶，加入0.1g二甲基噻吩衍生物和0.1g铕(Ⅲ)配合物(MTTA-EU³⁺)，10mL 95％乙醇，磁力搅拌，水浴升温至70℃，获得配合物溶液；

2)准备100mL的三口烧瓶，加入10mL 95％乙醇、10mL水和10mL浓度为10％、步骤1.1中获得的醛基聚苯乙烯乳胶微球，磁力搅拌，水浴升温至70℃；

3)将步骤1)中的配合物溶液缓慢滴加至步骤2)中的三口烧瓶中，70℃反应2h后停止搅拌，自然冷却；

4)将上述乳液离心1h，30000G，离心后弃去上清液，得到填埋有发光组合物的醛基聚苯乙烯微球。

2.3受体颗粒的表面包被多糖

1)取50mg氨基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中，加入5mL 50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液，30℃避光搅拌溶解；

2)取100mg已制备好的填埋有发光组合物的醛基聚苯乙烯微球，加入到氨基葡聚糖溶液中搅拌2h；

3)将10mg硼氢化钠溶于0.5mL 50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反应液中，30℃避光反应过夜；

4)将反应后的混合液30000G离心后弃去上清液，加入50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液定容，使其终浓度为20mg/mL；

5)取100mg醛基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中，加入5mL 50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液，30℃避光搅拌溶解；

6)将上述微球加入到醛基葡聚糖溶液中搅拌2h；

7)将15mg硼氢化钠溶于0.5mL 50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反应液中，30℃避光反应过夜；

8)将反应后的混合液30000G离心后弃去上清液，加入50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液定容，使其终浓度为20mg/mL。

9)由纳米粒度仪测得此时微球粒径的Gaussian分布平均粒径为241.6nm，变异系数(C.V)＝12.90％，Gaussian分布曲线如图1所示。

2.4HIV抗原与受体颗粒的偶联过程

1)将HIV抗原Ⅰ透析至pH＝9.0的50mM CB缓冲液，测得浓度为1mg/mL。

2)在2mL离心管中加入0.5mL步骤2.3中获得的受体颗粒以及0.5mL的HIV抗原Ⅰ，混匀后加入100μL 10mg/mL NaBH₄溶液(50mM CB缓冲液)，2-8℃反应4h。

3)反应完毕后加入0.5mL 100mg/mL BSA溶液(50mM CB缓冲液)，2-8℃反应2h。

4)反应完毕后将离心45min，30000G，离心后弃去上清液，用50mM MES缓冲液重新悬浮。重复离心清洗四次，并稀释至终浓度为100μg/mL，获得偶联HBsAg抗原Ⅰ的受体颗粒溶液，得到受体试剂B。

实施例3:检测微球的糖含量

1)微球样品预处理：

分别取实施例1中含有1mg受体微球a的受体试剂A和实施例2中含有1mg受体微球b的受体试剂B，20000G离心40min，倒去上层清液后用纯化水超声分散，重复离心分散三次后用纯化水定容至1mg/mL。

2)葡萄糖标准溶液的配制：

用纯化水将1mg/mL葡萄糖储备液配制成0mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.075mg/mL、0.10mg/mL、0.15mg/mL的标准溶液。

3)蒽酮溶液的配制：用80％硫酸溶液配制成2mg/mL(此溶液室温下24h内稳定，现用现配)。

4)向离心管分别加入0.1mL各浓度的葡萄糖标准溶液及待测样品，每管各加1mL蒽酮试液。

5)85℃孵育30min。

6)将样品反应管15000G离心40min，移液器枪头从管底吸取澄清液体进行吸光度的测定，避免将上部悬浮物吸出。

7)恢复至室温，测量620nm的吸光度(测量最好在2h内进行)。

8)标准溶液的糖含量浓度与吸光度关系如表1所示，以标准溶液糖含量浓度为X值，吸光度为Y值，进行一次直线回归，获得如图2所示糖含量测定标准曲线，并以此为基础测定待测样品的糖含量浓度。

表1

序号	浓度mg/mL	吸光度A	吸光度B	吸光度均值
					1	0	0.0008	0.0008	0.0008
2	0.025	0.0880	0.0916	0.0898
					3	0.05	0.1547	0.1611	0.1579
4	0.075	0.2375	0.2471	0.2423
					5	0.1	0.3190	0.332	0.3255
6	0.15	0.4855	0.5053	0.4954

检测结果：

实施例1中受体微球a的糖含量不高于25μg/mg微球；

实施例2中受体微球b的糖含量为60.5μg/mg微球。

实施例4:HIV检测试剂盒的制备及其性能验证

本试剂盒由试剂R1(由实施例1制备所得)、试剂R2(生物素标记HIV抗原)、另外包括含有供体颗粒的感光试剂R3、Anti-HIV阴性对照、Anti-HIV-1阳性对照、Anti-HIV-2阳性对照、Anti-HIV弱阳性对照、Anti-HIV样品稀释液组成。各组分分别制备，试剂R1和试剂R2组合成Anti-HIV试剂盒，阴、阳性对照、弱阳性对照及样品稀释液分别独立分装，再组装成盒。其制备工艺概括如下：

⑴试剂R1(受体颗粒包被HIV抗原)：将实施例1中制备得到的受体颗粒，加入第一缓冲溶液配制而成，浓度为50μg/mL。

⑵试剂R2(生物素标记HIV抗原)：将处理好的HIV抗原与生物素按照一定的浓度和比例混匀反应形成连接物，经透析后，加入一定量的缓冲溶液配制而成。

⑶Anti-HIV阴性对照：Anti-HIV定性参考品稀释液。

⑷Anti-HIV-1阳性对照：使用Anti-HIV定性参考品稀释液稀释HIV-1阳性血清配制而成。

⑸Anti-HIV-2阳性对照：使用Anti-HIV定性参考品稀释液稀释HIV-2多克隆抗体配制而成。

⑹Anti-HIV弱阳性对照：使用Anti-HIV定性参考品稀释液稀释HIV-1阳性血清配制而成。

本试剂盒可对人类免疫缺陷病毒HIV(1+2型)抗体进行定性检测，检测时请使用配套的Anti-HIV弱阳性对照、Anti-HIV阴性对照、Anti-HIV-1阳性对照、Anti-HIV-2阳性对照，Anti-HIV弱阳性对照加2孔、Anti-HIV阴性对照、Anti-HIV-1阳性对照、Anti-HIV-2阳性对照各加1孔进行实验。试剂使用前需平衡至环境温度。

步骤1：将待测样品用Anti-HIV样品稀释液进行11倍稀释，并充分混匀(如将10μL样品加入100μL样品稀释液中)；

步骤2：在反应孔中分别加入25μL稀释样品及Anti-HIV阴性对照、Anti-HIV-1阳性对照、Anti-HIV-2阳性对照、Anti-HIV弱阳性对照；

步骤3：在反应孔中依次加入25μL试剂R1、25μL试剂R2和25μL感光试剂R3；

步骤4：放入博阳生物科技(上海)有限公司生产的LiCA500全自动光激化学发光检测仪，由仪器自动操作，具体步骤如下：

A.振动

B.37℃温育15min

C.自动加入感光试剂175μL

D.37℃温育10min

E.激光照射微孔并计算每孔发出光子量

F.由软件计算S/CO值(待测样本光信号值与Anti-HIV弱阳性对照光信号的比值)，并判定阴阳性。

【试剂盒有效性判定方法】

每次试验时均需加Anti-HIV弱阳性对照、Anti-HIV阴性对照、Anti-HIV-1阳性对照、Anti-HIV-2阳性对照

Anti-HIV阴性对照的S/CO值应<0.6，Anti-HIV-1阳性对照的S/CO值应≥3，Anti-HIV-2阳性对照的S/CO值应≥3，如结果异常，则本次试验结果不可信，需重复。

【试剂盒检测结果判定方法】

S：待测样本光信号值；

CO：Anti-HIV弱阳性对照光信号值(CUT OFF参考值)；

软件自动计算S/CO值，当S/CO<1时待测样品被判定为阴性，当S/CO≥1时待测样品被判定为阳性。

经检测，本实施例的试剂盒具有以下良好性能：

(1)阴性参考品符合率：用国家参考品进行检定，20份HIV抗体阴性参考品符合率不低于18份；

(2)阳性参考品符合率：用国家参考品进行检定，18份HIV-1型抗体阳性参考品不得出现假阴性，且RLUP12≥RLUP11；2份HIV-2型抗体阳性样品不得出现假阴性；

(3)灵敏度：用国家参考品进行检定，6份灵敏度参考品血清中，1份基质血清为阴性，5份稀释血清中至少3份出现阳性；

(4)精密性：用国家参考品进行检定，C.V≤15％(n＝10)；

(5)临床灵敏度、临床特异性：对500份临床判定为阳性的血清样本的检测中，499例样本均被检出阳性，临床灵敏度达到99.8％，在对600份临床判定为阴性的血清样本的检测中，600例样本均被检测为阴性，临床特异性达到100％。

实施例5：受体颗粒的C.V值对检测结果的影响

5.1制备不同C.V值的受体颗粒

按照实施例1中所述方法，获得粒径分布的变异系数不同的偶联HIV抗原的受体颗粒溶液，具体为：

受体颗粒1：Gaussian分布平均粒径为211.8nm，粒径分布变异系数C.V值＝3.5％；Nicomp分布为单峰。

受体颗粒2：Gaussian分布平均粒径为214.4nm，粒径分布变异系数C.V值＝5.0％；Nicomp分布为单峰。

受体颗粒3：Gaussian分布平均粒径为212.1nm，粒径分布变异系数C.V值＝6.9％；Nicomp分布为单峰。

受体颗粒4：Gaussian分布平均粒径为213.9nm，粒径分布变异系数C.V值＝8.3％；Nicomp分布为单峰。

受体颗粒5：Gaussian分布平均粒径为212.4nm，粒径分布变异系数C.V值＝14.8％；Nicomp分布为单峰。

受体颗粒6：Gaussian分布平均粒径为211.2nm，粒径分布变异系数C.V值＝20.0％；Nicomp分布为双峰。

受体颗粒7：Gaussian分布平均粒径为210.8nm，粒径分布变异系数C.V值＝30.3％；Nicomp分布为双峰。

5.2试剂盒检出限和HOOK样本的测定

定义最低检出限为0.5NCU康彻思坦质控品检出能力判定，当某一实验组样本测试信号刚好大于CO信号，即RLU(Cx)>RLU(C0)，则测试结果为阳性。定义HOOK样本为待测物浓度高于试剂中抗原抗体浓度的样本，测试结果存在假性偏低的风险，检测结果为S/CO＝RLU(Cx)/RLU(C0)。

实验步骤如下：

1、将0.5NCU康彻思坦质控品样品作为检出限样本通过S/CO值大小以及阴阳性判断检出能力差异；

2、将HOOK样本以2倍梯度稀释成系列样本后待测；

3、将不同粒径C.V的受体颗粒偶联HIV抗原后配制成20μg/mL的浓度，与稀释后的康彻思坦质控品和HOOK样本同步测试；

4、比较不同粒径C.V的受体颗粒对检出限和HOOK样本的影响。

检测结果如下表2所示：

表2

从表2可知，当所述受体颗粒粒径分布的变异系数(C.V值)大于等于5％且不高于20％时，包含该受体颗粒的试剂盒既有对低浓度样本检出能力，又有较好的抗HOOK能力。当所述受体颗粒粒径分布的变异系数大于等于8％且不高于15％时，包含该受体颗粒的试剂盒既有对低浓度样本检出能力，抗HOOK能力更好。

实施例6:糖含量对检测结果的影响

实验步骤：

1、挑选10例肿瘤患者干扰样本，经过确证试剂验证为HIV无反应性的样本；以及20例经确证试剂验证的HIV阳性样本；

2、将不同糖含量的受体颗粒偶联HIV抗原后配制成20μg/mL的浓度与30例样本反应后测试信号值；

3、计算每个样本的S/CO值后，当S/CO大于等于1时为检测结果为阳性，反之为阴性；

4、当肿瘤干扰样本中出现阳性结果则为假阳结果，若HIV阳性样本出现阴性结果则为漏检。

检测结果如下表3所示：

表3

从上表结果分析可见，当受体颗粒的糖含量不高于25μg的时候，灵敏度高，低值样本检出能力高，假阳样本受干扰较小。

实施例7：正常人与疑似感染HIV病毒患者的样本中HIV抗体水平的检测

一、HIV试剂的临床验证(采用实施例1中制备得到的受体试剂A)：

1、随机选择100例正常体检样本，50例肿瘤患者样本，50例疑似感染HIV病毒患者的样本；

2、将受体试剂A配制成20μg/mL的浓度与200例样本反应后测试信号值；

3、计算每个样本的S/CO值后，当S/CO大于等于1时为检测结果为阳性，反之为阴性；

检测结果如下表4所示：

表4

结果分析：150例阴性样本符合率为100％，不存在假阳性；50例阳性样本符合率为100％，不存在漏检。

Claims (10)

1.一种人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒，其包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包含第一缓冲溶液以及悬浮于其中的能够与活性氧作用产生化学发光信号的受体颗粒，其特征在于：所述受体颗粒包括载体，所述载体的内部填充有发光组合物，所述载体的表面键合有HIV抗原；所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不低于5％且不高于20％；所述试剂R2包含生物素标记的HIV抗原。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述载体的表面没有包被糖分子而直接键合HIV抗原。

3.根据权利要求2所述的人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：所述载体的表面上带有键合官能团，其用于将HIV抗原直接化学键合在所述载体的表面上，所述键合官能团选自胺基、酰胺基、羟基、醛基、羧基、环氧基、马来酰亚胺基和巯基中的至少一种；优选选自醛基、羧基。

4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述受体颗粒在所述试剂R1中的粒径分布变异系数C.V值不高于15％。

5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述受体颗粒在所述试剂R1中的粒径分布变异系数C.V值不低于8％。

6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于：每毫克质量的所述受体颗粒中的糖含量不高于25μg，优选不高于20μg。

7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述第一缓冲溶液中糖含量为0.01～1wt％，优选为0.05～0.5wt％。

8.根据权利要求1-7任一项所述的人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的糖为含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物；优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖；更优选选自葡聚糖或葡聚糖衍生物。

9.一种如权利要求1-8任一项所述的人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤:将待测样品用稀释液进行稀释，然后向其中加入试剂R1和试剂R2后加入感光试剂，激光照射并计算光子量，根据光子量判断待测样品HIV阴性或阳性。

10.一种如权利要求1-8任一项所述的人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒在化学发光分析仪上的应用。