CN116867906A

CN116867906A - 用于测序或感测核酸的具有多层石墨烯片的半导体纳米传感装置

Info

Publication number: CN116867906A
Application number: CN202180091216.1A
Authority: CN
Inventors: 克里斯塔·弗雷特斯
Original assignee: Gentroma Co ltd
Current assignee: Gentroma Co ltd
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2023-10-10

Abstract

本申请公开一种用于高通量核酸测序或感测的纳米传感装置。所述装置是硅芯片，具有氮化硅顶层、穿过所述芯片的开口、顶层中的孔以及位于顶层及孔上方的石墨烯片。具有p型层褶的石墨烯层被放置在所述孔上方，并且所述石墨烯层中的一个或多个纳米孔可以被提供在孔上方。被运送到所述芯片上的核酸链可以在微流体力的作用下通过纳米孔及孔进行移位。跨越纳米孔的电动势可以用膜片钳放大器测量，以进行核碱基指定及DNA测序。另外，没有纳米孔以及与层褶的相互作用被用于感测核酸聚合物的存在。

Description

用于测序或感测核酸的具有多层石墨烯片的半导体纳米传感装置

技术领域

本发明涉及使用芯片的核酸测序及感测，所述芯片采用多层石墨烯纳米结构及所述芯片中至少一个孔上方的p型层褶(p-type crinkle ruga)。

背景技术

从Sanger测序到纳米孔测序的一代又一代DNA测序技术已被开发出来，以解决基因测序的重要应用，其中最重要的应用是针对癌症、遗传疾病和复杂疾病治疗的个性化医疗。同样需要高效DNA测序平台的其他应用包括疫苗研究、流行病预防、食品监测、法医样本分析、基因药物开发和消费者基因测试等。虽然目前大多数测序方法都涉及对DNA进行化学改变、扩增和标记，但个性化医疗和单细胞测序中的某些应用需要无标记的实时测序以保留原始DNA样本，并在数小时内完成更快的周转时间。

纳米孔测序是当前技术[1-3]，也是目前唯一一种在DNA测序领域无标记且得到广泛研究的方法。DNA或RNA样品从溶液中的电场通过，被引导到嵌在膜基质上的生物或固态纳米孔中[4]。当DNA碱基在电场作用下通过纳米孔进行移位时，通过膜的离子电流会发生实时变化，并通过灵敏的电流测定探测器进行测定。纳米孔测序允许实时测序而无需标记DNA，目前一次运行中的读取长度甚至可以达到1至2Mb[5]。

虽然这种方法具有合理地长读(long-read)DNA测序能力，但存在阻碍其将个性化医疗和其他期待已久的应用变为现实的效率和能力的问题。首先，虽然市售装置可以提供高达250碱基/秒的速度，但这种速度不适合个性化医疗应用，因为在个性化医疗应用中，必须更快地对大量基因组进行测序。其次，对于许多应用来说，低于99％的碱基准确率是合理的，但对于单体型分析和个性化医疗来说是不够的。因此，为了使一些最基本的基因组测序应用变得普遍，这项技术仍需取得更大进展。

本发明提供了一种替代设备和方法，用于检测由于碱基穿过石墨烯制成的新型纳米结构内的纳米孔进行移位而形成的离子电流的可检测变化，以使测序更快、更准确以及高通量。由于石墨烯能够形成原子细孔和不同的结构，因此石墨烯作为纳米孔基底材料备受关注[6]。用于测序领域的石墨烯纳米结构的主要结构包括石墨烯纳米孔、薄片、纳米管和纳米间隙。最近，Kim等人的一项研究中描述了一种与“层褶(crinkle ruga)”结构有关的新形状，即石墨烯在矩形凹槽上弯曲形成沟[7]。褶皱具有锯齿状轮廓，其表面完全平坦，而峰及沟的端部则高度弯曲。层褶结构具有挠曲电效应，或极化和应变梯度的机电耦合。如二氧化硅或硅基板所示，当施加应变时，石墨烯向内弯曲，从而分别产生负电荷或正电荷梯度，在褶皱沟处累积，这是挠曲电效应的极化密度效应。累积电荷的类型取决于带有凹槽的材料，因为材料凹槽边缘处存在的范德华力将直接导致石墨烯与材料的挠曲电耦合效应。另外还描述了利用基板选择和用于弯曲石墨烯的曲率半径来控制结构性质和局部化。Kim等人进一步研究了褶皱处的分子效应，例如观察DNA链线性化，表明了用石墨烯褶皱来研究和控制极性分子位置的可能性。这是石墨烯在该领域许多生物分子研究中的诸多优势之一。

对于DNA测序，石墨烯已被证明能够进行超快测序，NIST的一项研究表明，移位的速度可达每秒6600万个碱基[8]。由于这些速度，电检测需要控制DNA移位的方法，需要一种特殊的电解质溶液，其会在成功减缓DNA移位的同时增加困难，例如给信号检测增加更多的干扰。此外，妨碍当前纳米孔测序有效性的另一个特征是孔内碱基的方向影响离子电流信号，因此成为该方法准确率<99％的原因之一。纳米孔测序探测核苷碱基的结构性质，并根据结构特征在当前信号中创建电子指纹，从而导致结构相似的鸟嘌呤和腺嘌呤之间的信号重叠，如Derrington等人[9]及Manrao等人所证实[10]。如果纳米孔测序能够在电子测定之外结合另一种物理测定方法，并结合使用其他特征(如分子相互作用)来区分每个碱基的方法(除仅取样的碱基范围外)，那么纳米孔测序可以得到改进。

通过施加外部电压，尺寸略小于孔径的分子通过静电势穿过孔。纳米尺寸的孔通常嵌入生物膜中，通常为蛋白质纳米孔，这在移位控制和准确性方面存在许多问题[5]。它们也形成于诸如硅或石墨烯的固态薄膜中，固态膜将含有导电电解质的两个储层分成顺式和反式隔室。浸没在每个腔室中的电极产生磁场并帮助检测电子信号。在偏压下，溶液中的电解质离子以电泳方式通过孔隙，从而产生离子电流信号。当孔被分析物(例如添加到顺式室中的带负电的DNA分子)堵塞时，流经纳米孔的电流将被阻断，从而中断电流信号[5]。目标分子的理化性质可以通过统计分析移位事件产生的瞬时电流阻断的幅度和持续时间来计算(Venkatesan等人，[11])。与生物纳米孔相比，固态纳米孔具有许多优点，包括更高的稳定性。尤其是石墨烯纳米孔表现出极高的DNA测序潜力，显示出更高的空间分辨率。

DNA碱基的快速移位是当前使用纳米孔测序的问题之一[12]。核苷酸提供了与孔中的取向和电荷性质有关的独特电子标识[5]。控制核苷酸在纳米孔中的位置将有助于提高纳米孔测序的准确性和实用性。

本发明解决了用于分子检测的快速、廉价和高通量纳米孔装置的持续需求，该装置可用于现场对核酸样品进行实时和无标记测序。快速、廉价但准确的DNA测序是一项持续的挑战。个性化医疗领域可以通过一种与基于液滴的DNA转移方法匹配的实时测序装置大大受益，该装置可以在较短的时间内对许多基因组进行快速测序，特别是在新生儿健康分析和流行病危机领域。当前装置的纳米孔仍然需要特定的电解质溶液和DNA环境，从而阻碍了该领域的进展，减缓了纳米孔测序向某些领域的过渡。

鉴于这些现有技术，亟需一种改进现有纳米孔的技术，该技术可以直接和多样地测定电子信号的变化，以匹配孔中核碱基的移位速度。同样必要的还有具备更高感测能力的纳米孔，为了更好的辨识，通过探测分子特征以及每个碱基的相互作用行为，并直接控制纳米孔内的分子取向，以在所用介质质量不同的情况下获得可重复的结果。这些方法可以灵活地与各种解决方案和方法配合使用，以满足不同行业和研究领域的不同需求及目的。

发明内容

因此，本文提供一种用于对核酸链进行测序的芯片。所述芯片可具有一基板，所述基板由宽度约1.0mm至约10mm、长度约1.0mm至约10mm、厚度约50μm至500μm(优选为200μm)的硅制成，其中所述基板具有厚度为20nm至500nm(优选为200nm)的氮化硅(Si₃N₄)的顶层，以及选择性地具有厚度为20nm至500nm(优选为200nm)的氮化硅的底层。

在一个实施例中，所述芯片可以在底侧具有一开口，所述开口通向所述芯片中心的5至50μm的正方形(优选为20μm)的窗口，所述开口从选择性的底层穿透到所述芯片的基板中，其中所述开口不穿透氮化硅的顶层。在一个实施例中，在以所述窗口为中心的所述氮化硅的顶层中提供一孔，其中所述孔的宽度为50nm至1000nm(优选为350至400nm)以及长度为50nm至1000nm(优选为500至600nm)，其中所述孔的形状为圆形或简单多边形(优选为沙漏形状)。

在一个替代的实施例中，利用TEM或电子束在所述芯片上钻孔，在这种情况下则没有窗口，而是有一根穿过所述芯片的直轴。

在一个实施例中，厚度约1至60nm的一多层石墨烯片沿一横向方向贴附所述顶部基板上的所述SiN层，以及其中所述石墨烯片受到横向压缩而在所述至少一个孔上方产生一p型层褶，所述p型层褶具有一皱褶形成于其上，以及所述石墨烯片可以具有以所述孔为中心的直径为0.3至3.0nm的一个或多个纳米孔。

在一个实施例中，所述芯片在所述孔的相对端上可以具有一对电极，其中所述电极连接到能够测量所述石墨烯片上的一电荷的膜片钳放大器。

在一个实施例中，提供一种检测核酸链中的核碱基的方法，所述方法包括：具有一石墨烯片的一芯片，将包含一核碱基链的核酸的盐水溶液导向所述石墨烯片中的一纳米孔，其中所述核碱基链通过所述孔移位并与所述多层石墨烯片的层相互作用，以及所述膜片钳放大器测量所述离子电流的变化，并检测通过所述纳米孔移位的所述核酸链中的每个核碱基，并指定所述核酸序列。

附图说明

图1A是根据一实施例的硅/氮化硅芯片的顶部的立体图。

图1B是根据一实施例的硅/氮化硅芯片的底部的立体图。

图2是根据一实施例的硅/氮化硅芯片的俯视图。示出石墨烯片。

图3A是通过图2中标记为A-A’的线所示的硅/氮化硅芯片的横截面。在该实施例中，通过化学蚀刻从所述芯片的底部形成窗口，这产生了截头棱锥形空腔。

图3B是根据一替代实施例的硅/氮化硅芯片的横截面，其中所述孔钻穿所述芯片。

图3C是根据一替代实施例的硅/氮化硅芯片的横截面，其中多个孔钻穿所述芯片。在该实施例中，可以存在一网格的孔。显示四个孔。

图4是本发明的芯片的顶部中的沙漏形开口的示意图。

图5是根据本发明的芯片的顶部的立体图，该芯片具有横跨所述顶部的石墨烯片、位于开口上方的石墨烯中的折痕、折痕中的纳米孔以及两个电极。

图6A是根据本发明的一实施例的芯片的底部的正视图，其具有显示通过化学蚀刻形成的多个窗口的网格，每个窗口中具有孔。

图6B是根据本发明的芯片的顶部的正视图，该芯片具有通过钻孔形成的较大网格的孔(122)。

图7是根据本发明的一实施例的圆形硅芯片的示意图，该圆形硅芯片刻有网格，该网格将被切割以形成硅/氮化硅芯片。

图8是本发明的一实施例的示意图，其中DNA探针被连接到石墨烯片140。

具体实施方式

本文公开一种能够进行高通量核酸测序的纳米传感装置，其中极化石墨烯片或薄片与核酸链或聚合物相互作用，以检测及鉴定核酸链中的核碱基。或者，该装置可以感测核酸聚合物。所述装置包括其上钻出或蚀刻有一个或多个孔的半导体芯片，以及层叠在所述芯片的顶面上方的多层石墨烯(MLG)片，其中石墨烯受到压缩压力，以在每个孔上方形成p型层褶。层褶的折痕的机电效应可以将核酸聚合物吸引到折痕中。

纳米传感装置半导体芯片具有“顶侧”及“底侧”。顶部方向表示(1)贴有MLG的一侧，以及(2)核酸聚合物接近芯片以进行测序或感测的一侧。核酸聚合物将与本发明的芯片的顶面上的石墨烯相互作用以用于本发明的感测及测序实施例。

在一个实施例中，在孔上方的石墨烯片中提供至少一个纳米孔，其迫使核酸链通过纳米孔移位，并与能够检测及识别核酸链中的核碱基的传感器近距离对齐。另外，也可以不采用纳米孔。

当包含核酸链的核碱基通过石墨烯相互作用或移位时，可以通过几种方法进行核碱基的检测或感测。在一个实施例中，离子电流可以与离子电流检测器一起使用，离子电流检测器可确定特定核碱基通过石墨烯片中的纳米孔移位时的电特征，并基于电特征指定核碱基(A、C、T/U、G)。可以在芯片的孔的两侧的一对电极上测量离子电流。

核酸链可以包括核苷酸或核苷，并且可以来自天然来源，例如从细胞(例如细菌、植物或动物细胞)分离，或者从病毒来源提取。核酸聚合物可以包括脱氧核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。如本文所用，“核酸链(nucleic acid strand)”相当于“核酸聚合物(nucleicacid polymer)”。术语“感测”是指检测核酸的存在，无论是一般的还是具有特定序列的核酸，而不需要阐明该核酸的序列。

在一个实施例中，具有纳米孔的装置用于阐明核酸序列，其中核酸聚合物通过纳米孔移位。在一个实施例中，一种不具有纳米孔的装置，用于根据在孔的两侧的一对电极上测量的电特性来感测核酸，其中孔上方的层褶与核酸相互作用，并提供由与核酸链的相互作用引起的通过所述孔的电流的特性特征。

在一个实施例中，本发明公开一种高通量单细胞测序装置，该装置能够进行无标记测序，不需要对待分析的单个细胞进行化学修饰或细胞培养。所公开的测序仪器将能够进行大规模并行和无标签测序，与制药行业、生物技术研发和医疗保健中应用的传统单细胞核酸测序技术相比，该测序技术可以更快(不到2小时)且更低成本地完成。在一个实施例中，公开一种利用纳米孔测序技术的平台，该平台使用具有光学或电学性质的石墨烯纳米孔，其可以检测及区分核酸链中的核酸碱基。发明人已经证明与DNA的相互作用是无标签和经济高效测序的理论验证数据。本发明能够将DNA片段的液滴传输整合到测序仪中，通过电或光相互作用直接读取核苷酸，从而使得用于个性化医疗以及遗传学和免疫治疗应用的单细胞测序快速、高通量、经济高效。

如本文所用，术语“约”表示一个不精确的尺寸，术语“约”表示所述值的±20％。

如图所示，本申请公开高通量纳米孔生物传感装置的一个实施例，包括一芯片100，具有约1.0mm至约10mm的宽度(图1A，尺寸M)、约1.0mm至约10mm的长度(图1A、尺寸N)的一硅基板114。在一个实施例中，所述芯片100的宽度为约1.5mm至约3.0mm且长度为1.5mm至3.0mm，或宽度为约1.5mm或2.0mm且长度为约1.5mm或2.0mm。在一个实施例中，芯片100的总厚度可以为约50μm至500μm(图1A，尺寸Q)。在一个实施例中，芯片100的总厚度可以为约150μm至300μm，或约200μm。

术语“芯片”是指使用半导体方法制造的半导体芯片。基板可以被切割成正方形或矩形，也可以是圆形。例如，宽度及长度为1.5mm至10.0mm的芯片可以由2英寸直径(5cm)的晶圆150制成，在该晶圆150中切割或蚀刻一网格的凹槽152。如图7所绘示。然后对网格152进行切割以获得适合本发明的尺寸的芯片。

在本专利申请的附图或文本中，术语“SiN”是指氮化硅(Si₃N₄)。

在一个实施例中，芯片100具有上表面(116)及下表面(118)。上表面及下表面在本文中可替换地称为“顶”面及“底”面。

在一个实施例中，可以提供形成芯片100的顶表面(116)的一层氮化硅(110)。氮化硅110可以具有约20nm至约500nm的厚度。或者，氮化硅110的厚度可以为约100nm至300nm。或者，氮化硅100可以具有200nm的厚度。选择性地，所述芯片可以具有形成底面118的氮化硅的底层(112)。或者，底面118可以是硅基板114的底部。如果存在的话，层112可以具有20nm至500nm的厚度。在一个实施例中，层112的厚度可以为约100nm至300nm。或者，氮化硅112可以具有200nm的厚度。

在所述芯片的底部的中心可以有一个方形窗口130(图1B)。或者，窗口130可以被称为具有“开口”。窗口130的横截面如图3A所示。如果提供氮化硅的底层114，则窗口130穿透该底层。所述开口可以从所述芯片的底面穿过所述硅基板到顶部的氮化硅层，并且不穿透顶部的氮化硅。在一个实施例中，所述开口的上边界是正方形窗口，在所述基板的顶部约5μm至50μm(优选为20μm)(尺寸P)处。所述窗口130可以通过氢氧化钾(KOH)蚀刻来形成。KOH蚀刻将在硅基板中产生角度为54.7°的壁，因此该壁不会是垂直的[13]。因此，刚才描述的开口将是一个截头方棱锥(truncated square pyramid)，也称为截头棱锥，棱锥的截头顶部(所述“窗口”)在一侧形成5μm至50μm(优选20μm)(尺寸P)的正方形。棱锥的底部具有尺寸T的边缘。对于20μm的截头棱锥的顶部及200μm厚度的基板，由于硅中KOH蚀刻的角度，在每一侧的方形截头棱锥的底部为约302μm。如图3A所示是多层石墨烯片140及可选的纳米孔146。

在一个实施例中，在以窗口为中心的氮化硅的顶层中提供一个孔120(图2及4)，其中该孔的宽度为约50nm至约1000nm(优选为350至400nm)(图4，尺寸S)，长度约50nm至1000nm(优选为约500至600nm)(图4，尺寸U)，其中孔为圆形或简单多边形。在一个实施例中，如图4所示，孔可以具有沙漏形状(120)。在另一个实施例中，孔的宽度为350至500nm，长度为350至500nm，并且包括选自圆形、三角形、正方形、矩形及六边形的简单多边形。

或者，孔120可以通过用显微镜方法钻孔形成，例如用透射电子显微镜(TEM)或电子束技术(图3B及3C)。通过钻孔制造的孔将不会像130中那样具有带有倾斜壁的窗口。相反，直轴132将贯穿所述芯片的整个厚度。还示出不具有纳米孔的石墨烯片140或141。

在另一个实施例中，可以提供多个孔122，其中，例如，一网格或阵列的孔及窗口形成在芯片100上。如图6A及6B所示。图6A显示具有一网格的蚀刻窗口130的芯片104的底部118。还示出每个窗口130中的孔121。孔121是孔120的底部。在蚀刻窗口130的情况下，网格可以高达约10×10，并且可以更小，例如6×6、5×5或4×4。

多个孔的另一个实施例如图6B所示，图6B是具有多个孔122的芯片102的俯视图。在如图所示的实施例中，钻孔是直轴132。该实施例中的网格或阵列可以具有比蚀刻方法更多的孔，高达100×100的网格。网格也可以更小，例如，30×30网格、20×20网格或10×10网格。图6B显示铺设在网格上的MLG片材141。在一个实施例中，在钻出孔122之后，将片材固定到表面116，然后钻出纳米孔146(未示出)。具有钻孔的实施例也如图3C所示，其显示具有多个钻孔122的芯片102的横截面。

在图6A及6B的阵列实施例中，电极阵列可用于测量网格中的每个孔上的电势。[14，15]

在一个实施例中，将厚度约1至60nm的石墨烯片140沿横向方向放置在硅芯片的顶面上方(图2、3及5)，其中石墨烯片受到横向压缩而在生物传感芯片中的每个孔120上方形成p型层褶，所述p型层褶具有一皱褶形成于其上，以在生物传感芯片中的每个孔120上方形成具有皱褶的p型层褶。石墨烯可以是放置在芯片表面上方的多层石墨烯(MLG)片，其可以是2至7片(或更多)石墨烯。石墨烯将自然粘附在氮化硅表面。可以施加横向压力以在所述孔的上方形成具有皱褶或折痕的p型层褶。选择性地，所述石墨烯片中的一个或多个纳米孔146(图2)可以设置在孔上方，其中所述纳米孔的直径为0.3至3.0nm。透射电子显微镜(TEM)或电子束技术可用于在石墨烯皱褶中钻出所需的纳米孔。

在一个实施例中，在MLG中钻出的纳米孔146具有利用小液滴(beads)进行捕获及运输DNA的微流体能力。“微流体”是指流体的行为、精确控制及操作，这些流体在几何学上被限制在小尺度(通常为亚毫米)，在小尺度下，表面力主导体积力。这种设计的优点是液滴可以运输DNA，有效地加快单细胞测序过程，并通过利用位于皱褶中的正电荷容易地吸引DNA，使DNA被拉入Si内的石墨烯层褶中。层褶还通过物理方式将液滴吸引到皱褶中，再加上石墨烯层中的正电荷，使纳米孔过渡以及使移位变得更容易。目前使用的传统平面基板的纳米孔技术(例如，[16])由于必须将大液滴完美地对准亚2纳米孔并在溶液中可靠地将DNA引导到纳米孔，因此无法结合液滴。本发明的设计能够使液滴首先被捕获在结构中，然后正电荷将DNA拉入并对准纳米孔，从而使得DNA能够更容易地移位到宽度为2nm或更小的纳米孔中。集成的微流体系统可以用电解质溶液冲洗纳米孔，以允许电泳移位。

在一个实施例中，凝胶珠(gel beads)可用于将DNA分子运输至本发明的测序芯片。将含有条形码寡核苷酸的凝胶珠与样品混合，所述样品可以是高分子量(HMW)DNA。然后将凝胶珠及样品添加到油表面活性剂溶液中以形成“乳液中的多个凝胶珠”(GEMs)，其作为单独的反应囊泡，其中凝胶珠被溶解，并对样品进行条形码标记(见[17])。在某些情况下，经条形码标记的产品被汇集用于下游反应，以创建短读测序仪兼容的文库。在本发明的一个实施例中，这些片段将被直接测序，以读取其基因组中感兴趣的相似区域中的相似DNA片段的细胞之间的碱基差异，并且还通过直接读取条形码序列直接映射回原始细胞，这是由于无标记的纳米孔测序可以捕获这些液滴(然后在珠及DNA之间发生分离)并以高度平行的方式对单细胞转录组进行测序。测序后，可以用生物信息学分析得到的条形码短读序列，该生物信息学使用条形码信息将读取映射回其原始DNA序列。

在一个实施例中，一个或多个核酸探针160可以共价结合到MLG 140(图8)[3]。在本发明的生物传感芯片的感测或测序操作期间，探针可以与互补核酸链162杂交。图8显示三个核酸探针160，其中所述探针上的一个与互补链162杂交。在DNA/RNA感测的实施例中，探针与互补核酸序列杂交，这引起穿过孔120的电势的特征性变化，该特征性变化可以被检测以确认适当的DNA/RNA序列存在于穿过所述传感器的样品中。在核酸测序的实施例中，探针160可以倾向于增加MLG与核酸样品的相互作用，这可以提高测序过程的灵敏度。在一个实施例中，探针160尽可能靠近褶皱142或在褶皱142内结合到MLG，其最靠近电热点以提高杂交事件的灵敏度。

在一个实施例中，在每个孔120的相对端的石墨烯片上提供一对电极144(图5)，其中电极连接到能够测量石墨烯片上的电荷的膜片钳放大器。

在一个实施例中，提供一种检测核酸链中的核碱基的方法，该方法包括：一芯片，具有连接到一膜片钳放大器的一石墨烯片，并且将包含核碱基链的核酸的盐水溶液导向所述石墨烯片中的纳米孔，其中所述核碱基链通过所述孔移位并与所述多层石墨烯片的层相互作用，并且所述膜片钳放大器测量离子电流的变化并检测通过所述纳米孔移位的核酸链中的每个核碱基并指定核酸序列。

在一个实施例中，本发明可以通过使用石墨烯褶皱142内的正电荷作为对孔内每个核苷酸进行电子检测和静电定位的方式来改进测定。导向所述石墨烯上的孔的核苷酸链将分离并通过芯片上的孔及孔洞进行移位。吸引带负电荷的DNA分子的正电荷也将减缓移位，从而提供一种控制移位的手段，同时用石墨烯中的电荷1)将核苷酸定位在孔内，使其在孔内具有更可靠的方向，同时2)与核苷酸形成临时静电相互作用以提高单碱基分辨率，3)分析特定碱基的电荷特性，可将0.3至1M KCl溶液中离子电流的测定简化为单碱基分辨率。

用膜片钳放大器等检测设备，例如Axon^TM Axopatch^TM 200B，可以在120至180mV跨膜电位下有效地测定离子电流。在DNA通过纳米孔移位过程中，由于纳米孔内的堵塞而产生的离子电流波动的电信号将通过记录放大器或贴片设备信息的电路转换为核苷酸特异性读数[18]，从而指定穿过所述生物传感芯片中的纳米孔或孔的特定核碱基。离子电流的波动将在毫秒的时间范围内反映石墨烯皱褶中的电荷，所述波动与石墨烯层内极化和核苷酸之间的纳米级电子相互作用直接相关。信息将通过专门的软件进行获取并转换为可读格式的碱基指定(assignments)，所述软件使用在测序运行期间进行的离子电流测定中已知电子签名的转换算法。减少干扰和提高信号质量的可能性是显而易见的，因为石墨烯皱褶内的正电荷将减缓移位并可能改善信号质量，从而消除传统纳米孔方法中增加电解质溶液以减缓DNA移位的需要[19]。液滴输送方法的兼容性也被暗示，因为褶皱的自然曲率和电荷极化将共同作用将DNA引入纳米孔，而无需精细的酶或复杂的微流控过程。这一优势将为该领域增加多重实时单细胞测序技术，该技术还可保持样本质量，并通过电子探针直接分析DNA的物理、结构和表观基因组特性，这为每次运行的单细胞分析提供了新的数据层，大大减少了化学制剂，缩短了时间。

参考号列表

数字描述

100 半导体生物传感芯片

102 具有多个钻孔窗口的半导体生物传感芯片

104 具有多个蚀刻窗口的半导体生物传感芯片

105 圆形硅芯片

106 具有网格的圆形硅芯片

110 上(顶部)氮化硅(Si₃N₄)层

112 下(底部)氮化硅(Si₃N₄)层

114 硅基板层

116 生物传感芯片100的上(顶部)表面

118 生物传感芯片100的下(底部)表面

120 孔

121 孔(底视图)

122 多个钻孔

130 窗口—通过蚀刻倾斜壁而形成

132 钻孔形成的轴贯通芯片

140 多层石墨烯(MLG)片

141 层叠在多个孔上的MLG

142 MLG中的折痕或褶皱

144 电极

146 MLG中的纳米孔

150 5cm的芯片，其上蚀刻有生物传感芯片的网格

152 生物传感芯片的网格蚀刻在5cm直径的芯片上

160 核酸链探针

162 与核酸探针杂交的互补核酸聚合物

参考文献

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Claims

1.一种用于对核酸链进行测序的芯片，其特征在于：所述芯片包括：

(a)一芯片，由宽度约1.0mm至约10mm、长度约1.0mm至约10mm、厚度约50μm至500μm的硅制成的基板形成；

(b)其中所述基板具有厚度为20nm至500nm的氮化硅Si₃N₄的顶层；

(c)其中所述基板选择性地具有厚度为20nm至500nm的氮化硅的底层；

(d)其中所述芯片具有通过一显微镜方法钻出的至少一个孔，所述孔穿透所述芯片的整体厚度，以及其中所述孔的宽度为50nm至1000nm以及长度为50nm至1000nm，其中所述孔的形状为圆形或简单多边形；

(e)其中厚度约1至60nm的一多层石墨烯片沿一横向方向贴附所述顶部基板上的所述Si₃N₄层，以及其中所述石墨烯片受到横向压缩而在所述至少一个孔上方产生一p型层褶，所述p型层褶具有一皱褶形成于其上；以及

(f)其中在所述石墨烯片上的每个孔的相对端上提供一对电极，其中所述电极连接到能够测量所述石墨烯片上的一离子电流的电检测设备。

2.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述石墨烯片包括以所述孔为中心的直径为0.3至3.0nm的一个或多个纳米孔，使得一核酸聚合物链可以通过至少一个纳米孔移位。

3.如权利要求2所述的芯片，其特征在于：通过至少一个纳米孔移位的一核酸链的所述离子电流的波动被所述电检测设备测量并被转换成核碱基指定。

4.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述石墨烯片不具有纳米孔。

5.如权利要求4所述的芯片，其特征在于：由一核酸聚合物引起的穿過一孔的所述离子电流的波动被所述电检测设备测量并被转换成感应信息。

6.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述基板的宽度为1.5mm或3.0mm以及长度为1.5mm或3.0mm。

7.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述基板具有厚度为200nm的氮化硅Si₃N₄的顶层。

8.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述基板具有厚度为100nm至300nm的氮化硅的底层。

9.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述基板具有厚度为200nm的氮化硅的底层。

10.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述氮化硅的顶层中以所述孔为中心的至少一个孔为沙漏形状。

11.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述芯片进一步包括一网格的孔，其中所述网格最多为100×100的网格。

12.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述芯片进一步包括一网格的孔，其中所述网格最多为20×20的网格。

13.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述芯片进一步包括一网格的孔，其中所述网格最多为10×10的网格。

14.如权利要求11所述的芯片，其特征在于：所述芯片进一步包括一电极阵列。

15.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述芯片进一步包括结合到所述多层石墨烯片的一个或多个核酸探针。

16.一种用于对核酸链进行测序的芯片，其特征在于：所述芯片包括：

(d)其中所述芯片具有至少一个开口，所述开口限定从所述基板的一底面穿透到所述芯片的所述基板的一顶面的一方形平截头棱锥体的基部，其中所述开口不穿透所述氮化硅的顶层，以及其中所述方形平截头棱锥体的顶部是每侧5至50μm的方形窗口；

(e)其中在以所述窗口为中心的所述氮化硅的顶层中提供一孔，其中所述孔的宽度为50nm至1000nm以及长度为50nm至1000nm，其中所述孔的形状为圆形或简单多边形；

(f)其中厚度约1至60nm的一多层石墨烯片沿一横向方向贴附所述顶部基板上的所述Si₃N₄层，以及其中所述石墨烯片受到横向压缩而在所述至少一个孔上方产生一p型层褶，所述p型层褶具有一皱褶形成于其上；以及

(g)其中在所述石墨烯片上的每个孔的相对端上提供一对电极，其中所述电极连接到能够测量所述石墨烯片上的一离子电流的电检测设备。

17.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述石墨烯片包括以所述孔为中心的直径为0.3至3.0nm的一个或多个纳米孔，使得一核酸链可以通过至少一个纳米孔移位。

18.如权利要求17所述的芯片，其特征在于：通过至少一个纳米孔移位的一核酸链的所述离子电流的波动被所述电检测设备测量并被转换成核碱基指定。

19.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述基板的宽度为1.5mm至3.0mm以及长度为1.5mm至3.0mm。

20.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述基板的厚度为150μm至300μm。

21.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述基板的厚度为200μm。

22.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述基板具有厚度为100nm至300nm的氮化硅Si₃N₄的顶层。

23.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述基板具有厚度为200nm的氮化硅Si₃N₄的顶层。

24.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述基板具有厚度为100nm至300nm的氮化硅的底层。

25.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述基板具有厚度为200nm的氮化硅的底层。

26.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述氮化硅的顶层中以所述窗口为中心的所述至少一个孔的宽度为350至400nm及长度为500至600nm。

27.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述氮化硅的顶层中以所述窗口为中心的所述至少一个孔的宽度为350至500nm及长度为350至500nm，并且包括选自圆形、三角形、正方形、长方形及六角形中的简单多边形。

28.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述氮化硅的顶层中以所述窗口为中心的至少一个孔为沙漏形状。

29.如权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述芯片进一步包括一网格的孔，其中所述网格最多为10×10的网格。

30.一种检测核酸链中的核碱基的方法，其特征在于：所述方法包括：根据权利要求2或17所述的具有一石墨烯片的一芯片，并且将包含一核碱基链的核酸的盐水溶液导向所述石墨烯片中的一纳米孔，其中所述核碱基链通过所述孔移位并与所述多层石墨烯片的层相互作用，以及其中连接到每个孔的所述电极上的一膜片钳放大器测量所述离子电流的变化，并检测通过所述纳米孔移位的所述核酸链中的每个核碱基，并指定所述核酸序列。

31.一种用于感测核酸链的芯片，其特征在于：所述芯片包括：

(e)其中厚度约1至60nm的一多层石墨烯片沿一横向方向贴附所述顶部基板上的所述Si₃N₄层，以及其中所述石墨烯片受到横向压缩而在所述至少一个孔上方产生一p型层褶，所述p型层褶具有一皱褶形成于其上，以及其中在所述多层石墨烯片中不存在纳米孔；以及

(f)其中在所述石墨烯片上的每个孔的相对端上提供一对电极，其中所述电极连接到能够测量所述石墨烯片上的一离子电流的一膜片钳放大器，以及其中测量所述离子电流的波动并将其转换成核碱基指定。

32.一种用于感测核酸链中的核碱基的方法，其特征在于：所述方法包括：根据权利要求31所述的具有一石墨烯片的一芯片，并且将包含一核碱基链的核酸的盐水溶液导向所述芯片上的一层褶，其中所述核碱基链与所述多层石墨烯片的层相互作用，以及其中连接到位于每个孔的所述电极的一膜片钳放大器测量所述离子电流的变化及所述核酸链的特征电特性。