CN116850206A - 一种黑色素复合体及制备方法和应用 - Google Patents
一种黑色素复合体及制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种黑色素复合体及制备方法和应用，属于生物材料技术领域。针对目前在时序性治疗过程中抗生素仅针对病原微生物发挥作用，而忽视感染性疾病伴随着过度炎症的问题，本发明黑色素复合体的制备方法，先将黑色素材料制得黑色素纳米粒，再加入AgNO3/NaBH4，通过原位还原，超滤离心、干燥后制得黑色素复合体。黑色素复合体在溶液中或近红外光照条件下，伴随银离子的释放，黑色素抗氧化性能恢复，实现时序性抗菌‑抗氧化功能的转变，适用于细菌或真菌导致的炎症性疾病治疗，前期发挥抗菌/抗真菌作用，后期清除组织部位高水平ROS缓解炎症，加速组织功能恢复。解决了此类疾病中难以兼顾抗菌‑抗氧化需求的问题，在生物医学领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种具有时序治疗作用的黑色素复合体及制备方法和应用。
背景技术
细菌或真菌感染对人类健康造成巨大威胁，典型感染性疾病包括牙周炎、肺部感染、糖尿病足、角膜炎、关节炎等。当病原微生物入侵机体时，在感染初期，机体会通过氧化应激，产生活性氧(ROS)，促进炎症反应，有利于清除病原微生物。但若机体长期处于氧化应激状态，高水平的ROS会对周围组织造成持续、非特异性损伤。目前针对病原微生物感染，临床常用的治疗方式为使用抗生素，但是某些抗生素存在水溶性差的问题，且用量的差异也会导致不同程度的危害。例如用量过大易导致明显毒副作用，用量过少则难以彻底杀灭病原菌，而病原菌易产生耐药性。目前新型抗生素的开发速度远远跟不上耐药菌对抗抗生素的耐药速度。更重要的是，目前治疗方式中抗生素仅仅针对病原微生物发挥作用，而忽视感染性疾病伴随着过度的炎症反应的影响。如何针对病原微生物感染兼顾抗菌和抗氧化对于疾病治疗具有重要意义。
发明内容
针对目前在时序性治疗过程中抗生素仅针对病原微生物发挥作用，而忽视感染性疾病伴随着过度炎症的问题，本发明提供了一种黑色素复合体的制备方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种黑色素复合体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，制备黑色素纳米粒：将黑色素材料MNP的粉末溶于pH为8～14的碱液中，通过超声破碎，超滤离心，干燥后得到黑色素纳米粒；
步骤2，制备黑色素复合体：将黑色素纳米粒溶解后，加入AgNO3/NaBH4，通过原位还原，再通过超滤离心或者透析、干燥后制得黑色素复合体。
进一步，所述黑色素材料MNP的分子结构包含2个酚羟基和1个羧基。黑色素材料(MNP)，其主要成分如图1所示，包括但不限于商品化试剂以及墨鱼、鱿鱼、乌骨鸡、菜粕、山杏核壳、黑萝卜、黑芝麻、黑米等生物体中提取出的黑色素。
进一步，所述步骤1中超声破碎的参数为50W～1500W，脉冲开启(pulseon)1～10s，脉冲关闭(pulseoff)1～10s，1～10min，-20℃～40℃。
进一步，所述步骤1中超滤离心过程中的截留分子量Mwco为：10000～50000，离心转速为3000～10000r/min，处理时间为5～30min、加水，反复进行2～8次。
进一步，所述步骤2中黑色素纳米粒、AgNO3与NaBH4的质量比为1:0.1～10:0.1～10。
进一步，所述步骤2中原位还原的反应条件是在10℃～60℃下避光反应1～10h。
进一步，所述步骤2中超滤离心过程中的截留分子量Mwco为10000～50000，离心转速为3000～10000r/min、处理时间为5～20min、加水，反复3～10次。
进一步，所述步骤1中干燥包括蒸发干燥、鼓风干燥、真空干燥、冻干；所述步骤2中干燥包括冻干、旋干、蒸发干燥、鼓风干燥、真空干燥。
一种如上述制备方法制得的黑色素复合体。
一种如上述制备方法制得的黑色素复合体在抗感染或炎症中的应用。
一种如上述制备方法制得的黑色素复合体在制造治疗由细菌或真菌导致的感染性疾病或炎症性疾病的药物中的应用。
进一步，黑色素复合体在酸性条件或近红外光照条件下，时序性抗菌-抗氧化性能转变加快。
原理：时序治疗是针对同时治疗提出的概念，相比同时治疗，时序治疗可最大化治疗效率，同时降低潜在毒副作用。纳米银具有优异、广谱的抗菌/抗真菌性能，其在溶液中易转变为银离子，通过破坏细菌的细胞壁、细胞膜、蛋白质以及DNA等发挥作用。银以及银离子相关抗菌产品(如银尔通活性银离子抗菌液)目前已经广泛用于人体。但是纳米状态的银容易聚集，导致抗菌性能降低。作为一种优异的天然抗氧化剂，黑色素材料(MNP)具有酚羟基以及羧基，可作为具有抗氧化功能的载体进行功能化。银离子与黑色素上的羧基通过静电作用吸附后，通过原位还原可以得到黑色素-纳米银复合体(MNP-AgNP)。在溶液中，随着纳米银转化为银离子，银离子会与黑色素上的酚羟基形成配位键，影响黑色素的酚醛转换，导致抗氧化性能降低，而随着时间延长，银离子逐渐释放，黑色素抗氧化性能恢复。该黑色素复合体的这种抗菌与抗氧化性能的转变适配病原微生物感染的前后期目标，可发挥时序治疗作用，最大化治疗效率，具有重要临床转化意义。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
1.本发明制备的黑色素复合体属于首次提出的具有时序性治疗作用的黑色素类生物功能材料。
2.本发明制备的黑色素复合体，尤其适用于细菌或真菌导致的感染性疾病，可兼顾抗菌与抗氧化的需求。
3.本发明进一步拓宽了黑色素材料的应用范围，具有良好的临床转化前景。
附图说明
图1是黑色素材料(MNP)主要成分示意图；
图2是制备的水溶性黑色素纳米粒的粒径分布图。
图3是制备的水溶性黑色素纳米粒的透射电子显微镜图。
图4是制备的水溶性黑色素纳米粒的紫外-可见吸收光谱图及相应的标准曲线。
图5是制备的水溶性黑色素纳米粒的Zeta电位图。
图6是制备的水溶性黑色素纳米粒的红外光谱图。
图7是合成的黑色素复合体的粒径分布图。
图8是合成的黑色素复合体的透射电子显微镜图。
图9是合成的黑色素复合体的紫外-可见吸收光谱图。
图10是合成的黑色素复合体通过ICP-MS测定的银含量图。
图11是合成的黑色素复合体的Zeta电位图。
图12是合成的黑色素复合体在不同浓度下的总抗氧化能力结果图。
图13是合成的黑色素复合体在不同浓度下的DPPH自由基清除率结果图。
图14是制备的水溶性黑色素纳米粒及黑色素复合体在不同浓度下的羟自由基清除率结果图。
图15是合成的黑色素复合体在不同pH条件下、不同时间银释放后抗氧化能力变化结果图。
图16是合成的黑色素复合体在照光前后抗氧化能力变化的示意图。
图17是合成的黑色素复合体不同pH条件下、照光处理前后银含量的变化。
图18是不同浓度的黑色素复合体对S.aureus、E.coli的抑菌实验结果对比图。
图19是合成的黑色素复合体在银释放前后对S.aureus的抑菌效果对比图。
具体实施方式
实施例中所用原料说明如下：黑色素原料来源于SIGMA-ALDRICH公司(CAS：8049-97-6)；氢氧化钠购自天津市北辰方正试剂厂；硝酸银购自天津市风船化学试剂有限公司；硼氢化钠购自雄大化工有限公司；总抗氧化(T-AOC)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；1.1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；对苯二甲酸(TA)购自上海源叶生物科技有限公司；BHI肉汤培养基购自广东环凯生物科技有限公司；实验中所用的超纯水均由Milli-Q智能超纯水系统制备。
实施例1：黑色素纳米粒的制备
步骤一，称取20mg的黑色素粉末溶于4mL、0.1mol/LNaOH溶液中，在240W的超声功率下超声震荡5min得到表面油光发亮的黑色素溶液；
步骤二，在冰浴条件下，利用细胞破碎仪对上述液体进行破碎，调整功率参数为90W、超声破碎时间为2min30s，随后改变功率参数为75W、超声破碎时间改为3min30s，边破碎边缓慢滴加0.1mol/LHCl直至溶液pH为中性；
步骤三，将破碎后的液体置于截留分子量为30000的超滤离心管中，以3500rpm/min的速度离心，时间设定为8min2次、10min3次。收集离心管上层液体后放入真空冷冻干燥机，冷冻干燥24小时得到水溶性黑色素纳米粒(MNP)；
步骤四，标准曲线的绘制：称取冻干后的黑色素纳米粒配置成浓度分别为500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL的液体，用紫外可见分光光度计测量液体在600nm波长处吸收，绘制标准曲线。
图4是黑色素纳米粒的标准曲线图，其回归方程式如下：Y＝-0.00806X+4.0207，R2＝0.99992。
实施例2：黑色素复合体的制备
步骤一，称取3mg的黑色素纳米粒与1mg硝酸银于液闪瓶中，加入1mL超纯水溶解以使黑色素浓度保持在3mg/mL，室温避光搅拌30min；
步骤二，反应30min后，向上述液闪瓶中加入2mg的硼氢化钠，继续室温避光搅拌4h；
步骤三，将反应4h后的液体置于截留分子量为30000的超滤管中，以3500rpm/min的速度离心8min2次、10min3次。收集上层液体后冷冻干燥得到黑色素复合体(MNP-AgNP)。
实施例3：黑色素纳米粒及黑色素复合体的基本表征
(1)紫外-可见吸收光谱(UV-vis)分析
将制备得到的MNP及MNP-AgNP稀释至100μg/mL后，置于四通石英比色皿中，采用紫外-可见吸收光谱(UV-vis)仪在200～800nm范围内进行全波段扫描，绘制吸收曲线。图4、9分别是合成的MNP及MNP-AgNP的紫外-可见吸收光谱图，由两图可见MNP无明显特征吸收峰，与银复合后在415nm附近出现银的吸收峰，表明材料成功结合。
(2)傅立叶红外光谱(FTIR)分析
用镊子夹取极少量MNP放入研钵中，再加入分析纯级溴化钾(KBr)研磨至细粉使其充分混合，在12MPa的压力下将样品压制成透明薄片，通过傅立叶红外光谱仪(FT-IR)在4000～500cm-1范围进行红外光谱扫描测定获得MNP的红外光谱图。如图6所示，材料在3437cm-1处出现了强的吸收峰，对应于羟基(-OH)的伸缩振动；1631cm-1、1384cm-1处的吸收峰对应于羰基(-C＝O)和羧酸盐(-COO-)的伸缩振动。
(3)动态光散射粒度分析仪(DLS)分析
将制备得到的MNP及MNP-AgNP稀释至100μg/mL，利用四通石英比色皿分析材料的粒径分布，利用电位皿进行材料的电位表征。如图2、5所示，MNP的水合粒径在1～10nm范围内，电位为-14.2mV。图7、11所示MNP-AgNP的粒径相对较大，分布在10nm左右，电位为-15.0mV。
(4)银含量测定
取制备好的MNP-AgNP(200μg/mL，黑色素的相对含量)利用电感耦合等离子体-质谱法(ICP-MS)检测银含量，如图10所示，对应Ag的浓度为39.54μg/mL，进行换算MNP-AgNP中银的载药量为16.5％。
(5)透射电镜(TEM)分析
粉末状样品溶解后，用电镜专用镊子轻轻夹住铜网在样品溶液中涮几次，使样品尽可能多的附在铜网上，将沾有样品的铜网置于滤纸上过夜晾干。为减少对铜网的破坏，也可使用移液枪将溶液滴至铜网上约2～3滴，自然晾干后采用JEM-2100F型透射电子显微镜(TEM)观察材料的形貌和尺寸。图3、8分别是合成的MNP及MNP-AgNP的透射电镜图，结果表明MNP-AgNP的形貌为10nm左右的球形，与DLS检测数据结果图相符。
实施例4：黑色素纳米粒及黑色素复合体不同浓度下的抗氧化能力
总抗氧化能力分析
使用商品化的总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒检测MNP-AgNP的总抗氧化能力，用Trolox溶液作为标准品进行检测时，样品的抗氧化能力用Trolox-EquivalentAnyioxidantCapacity(TEAC)来表示。图12是MNP-AgNP在不同浓度下的总抗氧化能力结果图，以10μg/mL为例，该浓度下材料的总抗氧化能力相当于0.53244mM的Trolox。同时证明MNP-AgNP的总抗氧化能力具有浓度依赖性。
DPPH自由基清除能力分析
取1mg1.1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)粉末溶解于19mL乙醇，配制一系列浓度梯度的待测样品，每个样品取1mL加入2mLDPPH溶液中作为待测溶液，不加样品组设为空白对照，记为A0，于37℃黑暗环境中孵育30min。然后紫外检测每个样品在519nm处的吸光度，根据样品的不同所采用的基线也不同，将待测样品中2mLDPPH溶液换为2mL作为每个样品的基线，利用公式(A0-Ax)/A0*100％计算材料的DPPH清除率。如图13所示MNP-AgNP的DPPH自由基清除性能具有浓度依赖性。
羟自由基清除能力分析
对苯二甲酸(TA)作为一种非荧光化合物可以捕获HO·，产生2-羟基对苯二甲酸(Ex:320nm，Em:425nm)，通过测量荧光2-羟基对苯二甲酸的存在来得到样品的HO·清除效率。在PBS(25mM，pH7.4)中制备含有TA(0.5mM)、H2O2(10mM)和不同浓度梯度MNP-AgNP的混合溶液，将混合物孵育12h，检测荧光光谱中425nm处的荧光信号，从而分析不同浓度MNP-AgNP的羟自由基清除能力，同样也可以测定MNP的羟自由基清除能力。图14是制备的MNP及MNP-AgNP在不同浓度下的羟自由基清除率结果图，荧光强度越低，表明产生的2-羟基对苯二甲酸越少，材料羟自由基的清除能力越强。测试发现MNP及MNP-AgNP的羟自由基清除能力均具有浓度依赖性，且在相同浓度下MNP的羟自由基清除能力更强。
实施例5：黑色素复合体时序释放银能力及应用
为了验证MNP-AgNP的可时序治疗作用，将MNP-AgNP与不同pH的缓冲液按1:1体积比混合后置于37℃条件下，分别在释放4h、12h、24h后取出1mL样品离心，条件设置为3500rpm/min的速度8min、3次，检测上层液体在银释放后不同时间内抗氧化能力的变化。如图15所示，随着时间的延长、银离子的释放，黑色素抗氧化性能逐步恢复，且在酸性条件下抗氧化功能恢复更好。类似地，也验证了照光处理前后样品的抗氧化性能变化，如图16所示，照光处理后的抗氧化效果优于单独与缓冲液作用的样品。
同时，在不同pH与光照(pH＝4.5、pH＝4.5+808nmlaser、pH＝7.4、pH＝7.4+808nmlaser)条件下，通过超滤离心法研究银的释放特性。将1mL400μg/mL的MNP-AgNP与1mL缓冲液混合后置于37℃条件下，在释放4h、12h、24h后将所有液体放入截留分子量为30000的超滤管中离心，条件同样设置为3500rpm/min的速度8min、3次，收集确定体积的下层液，并将离心后的上层液体补充至原体积继续释放，通过ICP-MS检测每个时间段内下层液体的银含量，并计算银的累计释放量。图17可以得到酸性条件照光处理后银的累积释放量最大。
实施例6：黑色素复合体抗菌性能
采用微量肉汤稀释法检测材料的最小抑菌浓度(MIC)，以此判断材料的抗菌性能。选用革兰氏阴性菌-大肠杆菌(ATCC25922)和革兰氏阳性菌-金黄色葡萄球菌(ATCC25923)作为模型细菌。在96孔板中加入200μL最高浓度的材料，其余孔中依次加入100μLBHI培养基，在含200μL高浓度材料的孔中取100μL进行倍比稀释，得到不同浓度梯度的材料各100μL。利用紫外可见吸收光谱测定菌悬液在600nm的吸光度值(OD600)，用PBS进行稀释，得到所需要的细菌浓度。在稀释好的材料中加入100μL浓度为1×106CFU/mL的细菌悬液，摇匀用酶标仪记录初始吸光度后放入37℃恒温摇床中，24h后取出再次测定吸光度，培养液澄清透明的孔对应的最小浓度即为MNP-AgNP对该种细菌的最小抑菌浓度(MIC)。图18为黑色素复合体对S.aureus、E.coli的抑菌实验结果图，由图可知，黑色素复合体对S.aureus、E.coli的MIC值在50μg/mL。图19为黑色素复合体在银释放前后对S.aureus的抑菌效果对比图，可以看到释放前黑色素复合体对S.aureus的MIC值仍保持在50μg/mL，当银释放后，材料的抑菌效果明显降低，MIC值＞200μg/mL。
综上所述，本发明的黑色素复合体表现出广谱抗菌性能，且相比黑色素抗氧化性能降低。更重要的是，该黑色素复合体在溶液中或近红外光照条件下，伴随银离子的释放，黑色素抗氧化性能恢复，实现时序性抗菌-抗氧化功能的转变，可适用于细菌或真菌导致的炎症性疾病治疗，即前期发挥抗菌/抗真菌作用，后期清除组织部位高水平ROS缓解炎症，加速组织功能恢复。该黑色素复合体解决了此类疾病中难以兼顾抗菌-抗氧化需求的问题，在生物医学领域具有良好的应用前景。
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
Claims (10)
1.一种黑色素复合体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，制备黑色素纳米粒：将黑色素材料MNP的粉末溶于pH为8～14的碱液中，通过超声破碎，超滤离心，干燥后得到黑色素纳米粒；
步骤2，制备黑色素复合体：将黑色素纳米粒溶解后，加入AgNO3/NaBH4，通过原位还原，再通过超滤离心或者透析、干燥后制得黑色素复合体。
2.根据权利要求1所述的一种黑色素复合体的制备方法，其特征在于：所述黑色素材料MNP的分子结构包含2个酚羟基和1个羧基。
3.根据权利要求1所述的一种黑色素复合体的制备方法，其特征在于：所述步骤1中超声破碎的参数为50W～1500W，脉冲开启1～10s，脉冲关闭1～10s，1～10min，-20℃～40℃；所述步骤1中超滤离心过程中的截留分子量Mwco为：10000～50000，离心转速为3000～10000r/min，处理时间为5～30min、加水，反复进行2～8次；所述步骤2中超滤离心过程中的截留分子量Mwco为10000～50000，离心转速为3000～10000r/min、处理时间为5～20min、加水，反复3～10次。
4.根据权利要求1所述的一种黑色素复合体的制备方法，其特征在于：所述步骤2中黑色素纳米粒、AgNO3与NaBH4的质量比为1:0.1～10:0.1～10。
5.根据权利要求1所述的一种黑色素复合体的制备方法，其特征在于：所述步骤2中原位还原的反应条件是在10℃～60℃下避光反应1～10h。
6.根据权利要求1所述的一种黑色素复合体的制备方法，其特征在于：所述步骤1中干燥包括蒸发干燥、鼓风干燥、真空干燥、冻干；所述步骤2中干燥包括冻干、旋干、蒸发干燥、鼓风干燥、真空干燥。
7.一种如权利要求1～6任意一项所述制备方法制得的黑色素复合体。
8.一种如权利要求1～6任意一项所述制备方法制得的黑色素复合体在抗感染或炎症中的应用。
9.一种如权利要求1～6任意一项所述制备方法制得的黑色素复合体在制造由细菌或真菌导致的感染性疾病或炎症性疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的黑色素复合体的应用，其特征在于：黑色素复合体在酸性条件或近红外光照条件下，抗菌-抗氧化性能转变加快。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310625364.8A CN116850206A (zh) | 2023-05-30 | 2023-05-30 | 一种黑色素复合体及制备方法和应用 |
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Publications (1)
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|---|---|
| CN (1) | CN116850206A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118649283A (zh) * | 2024-06-24 | 2024-09-17 | 中北大学 | 一种生物相容性优异的抗菌水凝胶基伤口敷料及制备方法 |
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2023
- 2023-05-30 CN CN202310625364.8A patent/CN116850206A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118649283A (zh) * | 2024-06-24 | 2024-09-17 | 中北大学 | 一种生物相容性优异的抗菌水凝胶基伤口敷料及制备方法 |
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