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CN116829690A - 用于生产细胞培养支架的方法和系统 - Google Patents

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CN116829690A
CN116829690A CN202180088228.9A CN202180088228A CN116829690A CN 116829690 A CN116829690 A CN 116829690A CN 202180088228 A CN202180088228 A CN 202180088228A CN 116829690 A CN116829690 A CN 116829690A
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solution
coating
alcohol
cell culture
reservoir
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CN202180088228.9A
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R·T·亚当斯
A·M·R·布莱克利
A·W·道尔
J·W·马特森
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Corning Inc
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Abstract

提供了用于三维细胞生长应用的可消化支架的连续生产的系统和方法。用于生产细胞培养支架的系统包括壳体和多个模块化部件，这些模块化部件以串联布置的方式设置在壳体内，这些模块化部件通过多个微流体流动通道连接。模块化部件可以包括乳化器、涂覆反应器和分离器。任选地，系统可以包括多孔膜。方法包括使聚合物溶液交联成离散形状的凝胶；将细胞生长培养基层结合至凝胶；以及对凝胶进行干燥或脱水以形成经功能以用作细胞生长培养基的气凝胶。

Description

用于生产细胞培养支架的方法和系统
相关申请的相交引用
本申请根据35U.S.C.§119要求2020年10月30日提交的序列号为63/107,660的美国临时申请的优先权权益，本文以该申请的内容为基础并通过引用将其全文纳入本文。
技术领域
本说明书一般涉及制造的系统和方法，更具体地，涉及制造用于细胞培养的支架的方法和系统。
背景技术
以三维形式培养的细胞可以比作为单层以二维形式培养的对应物表现出更加类似体内的功能性。在2D细胞培养系统中，细胞被迫使粘附在刚性表面并受到几何约束，细胞采取平坦的形态，该形态改变了细胞内信号传导中重要的细胞骨架调节，因此可以影响细胞生长、迁移和凋亡。此外，对细胞分化、增殖和基因表达具有重要意义的ECM的组织在大多数2D细胞中都不存在。
当细胞以3D形式生长时，细胞倾向于彼此相互作用而不是附着于基材。3D培养物的额外维度被认为是导致细胞应答差异的原因，因为其影响了参与同周围细胞相互作用的细胞表面受体的空间组织，还诱导了对细胞的物理约束。3D培养物中的这些空间和物理因素被认为影响了从细胞外到细胞内的信号转导，并最终影响基因表达和细胞行为。因此，在细胞通迅和胞外基质的形成方面，3D培养的细胞与体内组织更为相似。
为了产生3D细胞培养物，必须在适当的条件下用细胞培养基使细胞生长或培养细胞，细胞培养基为细胞生长提供营养。一些传统的3D细胞培养方法涉及在培养过程中使用珠或支架。然而，这种珠或支架的现有生产方法是时间密集型的，并且在工艺阶段会遇到重大瓶颈。由于加工所涉及的设备类型，现有的生产方法缓慢且依赖于操作员，并很难改变，导致制造过程中的不确定性。
发明内容
用于细胞培养的支架的成功生产需要工艺速度和灵活性，以及一致且可重复的制造实践。本文公开的系统和方法为产生经涂覆的微载体提供了可重复的、有效的方法，其可以调整为适用于各种应用的尺寸和形状。本文描述的实施方式消除了由各个重要工艺阶段的手动操作引入的可变性，通过保持从凝胶化到干燥的封闭系统来降低污染风险，并通过使用醇溶剂保持无菌环境。
根据一个方面，用于生产细胞培养支架的系统包括壳体；和以串联布置的方式设置在壳体内的多个模块化部件，这些模块化部件通过多个微流体流动通道连接。
在一些实施方式中，模块化部件可以包括乳化器、涂覆反应器和分离器。
在一些实施方式中，乳化器可以包括输入，输入包括：有机溶液流动通道和交联溶液流动通道；以及输出，输出包括与涂覆反应器连通的乳化流动通道。
在一些实施方式中，有机溶液流动通道和交联溶液流动通道通过设置在有机溶液流动通道与交联溶液流动通道之间的微流体孔连通。
在一些实施方式中，乳化器进一步包含多孔膜。在一些实施方式中，每个细胞培养支架的临界尺寸(critical size)由多孔膜的孔径决定。在一些实施方式中，多孔膜是可移除和可替换的。
在一些实施方式中，系统还包括具有到乳化器的输入管线的有机溶液储存器；和具有到乳化器的输入管线的交联溶液储存器。在一些实施方式中，系统还包括设置在有机溶液储存器和乳化器之间的泵。在一些实施方式中，有机溶液储存器输入管线还包括质量流量控制器。
在一些实施方式中，系统还包括设置在交联溶液储存器和乳化器之间的泵。在一些实施方式中，交联溶液储存器输入管线还包括质量流量控制器。在一些实施方式中，交联溶液的流率大于或等于有机溶液的流率。
在一些实施方式中，有机溶液包括聚合物溶液或糖溶液。在一些实施方式中，有机溶液包括聚半乳糖醛酸(PGA)溶液。
在一些实施方式中，有机溶液包括油、非极性流体、醇、水、表面活性剂或其任意组合。在一些实施方式中，非极性流体可包括非极性烃、其它非极性流体或其组合。在一些实施方式中，醇可以包括不同链长的醇、醇的混合物、醇和水的混合物，或其组合。
在一些实施方式中，交联溶液包括离子盐溶液。在一些实施方式中，离子盐溶液包括离子钙盐溶液。在一些实施方式中，乙醇是离子钙盐溶液中的溶剂。
在一些实施方式中，涂覆反应器包括输入和输出，输入包括与乳化器连通的乳化流动通道和与乳化流动通道相交的涂覆溶液流动通道；输出包括与分离器连通的涂覆后的乳化流动通道。
在一些实施方式中，系统还包括具有到涂覆反应器的输入管线的涂覆溶液储存器。在一些实施方式中，系统还包括设置在涂覆溶液储存器和涂覆反应器之间的泵。在一些实施方式中，涂覆溶液储存器输入管线还包括质量流量控制器。在一些实施方式中，涂覆溶液包括聚合物涂覆溶液或肽涂覆溶液。在一些实施方式中，涂覆反应器是连续流动涂覆反应器。
在一些实施方式中，到分离器的输入包括与涂覆反应器连通的涂覆后的乳化流动通道；和与涂覆后的乳化流动通道连通的超临界流体供应器。
在一些实施方式中，来自分离器的输出包括溶剂蒸发通道，其中来自涂覆后的乳化的溶剂通过超临界流体蒸发并除去；和包括细胞培养支架的固体。
在一些实施方式中，超临界流体包括超临界CO2。在一些实施方式中，系统进一步包括CO2储存器和压力调节器。在一些实施方式中，CO2储存器和压力调节器在壳体的外部。
在一些实施方式中，系统进一步包括醇储存器和压力调节器。在一些实施方式中，醇储存器和压力调节器在壳体的外部。在一些实施方式中，醇储存器中的醇包括乙醇。在一些实施方式中，来自醇储存器的醇被供应到第一醇洗涤器中，第一醇洗涤器设置在乳化器和涂覆反应器之间，其中用醇对离开乳化器后且进入涂覆反应器前的乳化流体进行洗涤。
在一些实施方式中，来自醇储存器的醇被供应到第二醇洗涤器中，第二醇洗涤器设置在涂覆反应器和分离器之间，其中用醇对离开涂覆反应器后且进入分离器前的涂覆后的乳化流体进行洗涤。
在一些实施方式中，细胞培养支架包括无动物源的可消化的细胞培养基基材。
在一些实施方式中，细胞培养支架包括聚合物珠或团(slug)。
在一些实施方式中，细胞培养支架包括可溶性微载体(DMC)。在一些实施方式中，可溶性微载体可以被酶或螯合剂溶解或消化。在一些实施方式中，每个可溶性微载体包括约300μm或更小的临界尺寸。
在一些实施方式中，系统对壳体外的气氛是封闭的并且是无菌的。
根据一个方面，一种生产细胞培养支架的方法包括使水性有机溶液交联为成形凝胶；将细胞生长培养基的层或涂层结合到成形凝胶；以及对经涂覆的成形凝胶进行干燥以形成细胞培养支架，细胞培养支架包括经功能化以用作细胞生长培养基的气凝胶。
在一些实施方式中，水性有机溶液包括聚合物溶液或糖溶液。在一些实施方式中，水性有机溶液包括聚半乳糖醛酸(PGA)溶液。
在一些实施方式中，有机溶液包括油、非极性流体、醇、水、表面活性剂或其任意组合。在一些实施方式中，非极性流体可包括非极性烃、其它非极性流体或其组合。在一些实施方式中，醇可以包括不同链长的醇、醇的混合物、醇和水的混合物，或其组合。
在一些实施方式中，方法包括细胞培养支架的持续生产。在一些实施方式中，细胞培养支架用于三维细胞生长应用。在一些实施方式中，细胞培养支架包括可消化的细胞培养支架。
在一些实施方式中，交联、结合和干燥步骤是在单个装置内发生的模块化过程。
在一些实施方式中，交联步骤包括通过微流体通道或孔将水性有机溶液引入交联溶液中，以在乳液中形成成形凝胶，其中乳液包括作为分散相的成形凝胶和作为连续相的溶剂。
在一些实施方式中，交联溶液包括盐溶液。在一些实施方式中，盐溶液包括钙盐溶液，钙盐溶液包括醇中的CaCl2、CaCO3、CaSO4或其组合。
在一些实施方式中，方法进一步包括将成形凝胶暴露于醇洗阶段。
在一些实施方式中，结合步骤包括通过由交联试剂促进的交联反应将细胞生长培养基结合至成形凝胶。
在一些实施方式中，细胞生长培养基包括聚合物涂覆培养基或肽涂覆培养基。
在一些实施方式中，方法进一步包括将经涂覆的成形凝胶暴露于醇洗阶段。
在一些实施方式中，干燥步骤还包括使用微通道中的小孔或膜将乳液的分散相的经涂覆的成形凝胶与连续相的溶剂分离。
在一些实施方式中，经涂覆的成形凝胶被运载至分离容器。在一些实施方式中，从经涂覆的成形凝胶中除去溶剂。在一些实施方式中，通过超临界流体萃取从经涂覆的成形凝胶中除去溶剂。在一些实施方式中，方法进一步包括对溶剂进行减压和回收。
在以下的具体实施方式中提出了本文所述的实施方式的其他特征和优点，其中的部分特征和优点对本领域的技术人员而言，根据所作描述就容易看出，或者通过实施包括以下具体实施方式、权利要求书以及附图在内的本文所述的实施方式而被认识。
应理解，前述的一般性描述和下文的详细描述都描述了各个实施方式且都旨在提供用于理解所要求保护的主题的性质和特性的总体评述或框架。包括的附图提供了对各个实施方式的进一步理解，附图并入本说明书中并构成本说明书的一部分。附图例示了本文所描述的各个实施方式，并且与说明书一起用于解释所要求保护的主题的原理和操作。
附图简要说明
图1示出了根据本文所描述的实施方式的系统的示意图。
图2示出了根据本文所描述的实施方式的系统的示意图。
图3示出了根据本文所描述的实施方式的系统的流程图。
图4示出了根据本文所描述的实施方式的珠生成步骤的示意图。
现在将详细参考生产细胞培养支架的系统和方法的实施方式，其实例在附图中示出。只要可能，在全部附图中将使用相同的附图标记来表示相同或相似的部件。
具体实施方式
本文所述的实施方式包括用于三维细胞生长应用的可消化支架的连续生产。根据本文描述的实施方式的系统和方法包括微通道形成器、反应器和分离容器的串联模块化布置，其用于经涂覆的气凝胶的连续生产，特别是用于三维细胞生长应用的经涂覆的气凝胶。更具体地，本文所述的实施方式提供了系统和方法，其用于使多糖溶液交联(本文也称为凝胶化)成离散形状的凝胶；将细胞生长培养基层结合至凝胶；以及对凝胶进行干燥或脱水以形成功能化的用作细胞生长培养基的气凝胶。
细胞培养支架的常规生产方法分为三个总体单元操作或间歇工艺阶段，即凝胶化、涂覆和干燥。生产方法是时间密集型的，并且关于每个工艺阶段描述了显著的瓶颈。例如，在常规的生产方法中，将藻酸盐、淀粉溶液或多糖溶液滴入水性盐浴中。在藻酸盐、淀粉溶液或多糖溶液中，阳离子与各个单体、二聚体、三聚体等相互作用，使它们交联并形成水凝胶。水凝胶滴在交联过程中保持其球形，从而产生相对单分散的水凝胶珠。将这些珠暴露于醇洗中，以置换所得水凝胶中的任何水，形成醇基凝胶(“醇凝胶”)。在用细胞生长培养基“涂覆”之前，将醇凝胶保存在间歇式反应器中。在此，“涂覆”可以是真正的涂覆过程，也可以包括细胞生长培养基与凝胶表面物理和/或化学结合的现象。在一些实施例中，将细胞生长培养基添加到反应器中以附着到凝胶的表面，这为凝胶提供了针对细胞生长具体功能化的涂层。经涂覆的珠可以在反应的下游经过多次醇洗。在涂覆过程之后，湿的经涂覆的珠(醇凝胶)经过一系列干燥步骤，例如加热旋转蒸发步骤，其中湿的醇凝胶被放入旋转蒸发器中，并在显著的热和真空下干燥数小时。然后，可以将干燥珠送至冷冻干燥步骤(冻干)，以完全去除材料中的所有水，这可能需要几天以上的时间。
与传统技术中使用的间歇生产方法不同，本文所述的系统和方法允许按需连续生产用于三维细胞生长应用的支架。本文所述的系统和方法可通过乳化技术、涂覆反应器和分离容器的模块化布置进行无动物源、可消化的细胞培养基基材的快速生产。在实施方式中，细胞培养支架可以包括可消化的细胞培养基基材。在一些实施方式中，细胞培养支架的临界尺寸可以小于300微米(μm)。该系统包括微流体孔和流动通道，以允许培养基所需的小长度尺度。在实施方式中，系统和方法可用于生产可溶性微载体(DMC)珠。在实施方式中，系统和方法可用于生产聚合物珠或团，并且可包括这种聚合物珠或者团的原位形成、涂覆和干燥。
在实施方式中，本文所述的方法提供了下述：使多糖溶液交联(本文也称为凝胶化)成离散形状的凝胶；将细胞生长培养基层结合至这些凝胶；以及对这些凝胶进行干燥或脱水以形成功能化的用作细胞生长培养基的气凝胶。
根据本文描述的实施方式的系统提供了细胞培养支架的高效、有效的生产。在一些实施方式中，细胞培养支架是可溶性细胞培养支架。在一些实施方式中，细胞培养支架是经涂覆的气凝胶珠。在一些实施方式中，细胞培养支架是经涂覆的聚合物珠或团。在一些实施方式中，细胞培养支架是可溶性微载体(DMC)珠。在一些实施方式中，方法和系统提供了可溶性微载体(DMC)的可靠的、连续的生产。本文所述的系统通过微流体乳化器、涂覆器和分离容器的串联布置快速生产这些类型的细胞培养支架。方法和工艺包括形成步骤，随后是涂覆步骤，随后为干燥步骤。特别地，形成步骤包括珠和滴的形成，涂覆步骤包括珠涂覆，以及干燥步骤包括珠干燥。
微流体通道或孔与水性有机溶液和交联溶液之间的流动分布(profile)相交。水性有机溶液的非限制性示例包括聚合物溶液或糖溶液。在一些实施方式中，交联溶液是盐溶液。盐溶液的非限制性示例包括离子盐溶液或钙盐溶液。通常，盐溶液的流率大于或等于有机溶液的流率。两种溶液之间的界面张力促使有机溶液破裂成滴、团或其他分散形状，从而形成乳液。在大多数情况下，连续相和分散相的表面张力值之间存在很大的差异。乳液包括分散在盐溶液中的有机溶液滴。盐溶液中的钙离子充当交联剂，保持乳液中分散相的形状。通过使用离子钙盐(例如CaCl2、CaCO3、CaSO等)的掺混物来控制交联的速率。
将乳液向下游输送到连续流动涂覆反应器，其中聚合物或肽溶液涂覆或结合到分散相的表面，通常产生功能化表面。涂覆溶液与乳液流相交，迫使溶液之间发生层流或湍流混合。通常，涂覆溶液将表现出相对亲分散相和相对疏连续相。这种对分散相的亲和性将促使涂覆溶液包裹或以其他方式粘附于分散相。交联剂的加入将促进涂覆溶液和分散相之间的化学结合，从而建立坚固的涂层。
包括连续相和经涂覆的分散相(具有涂覆溶液涂层或层的经交联的有机溶液)的乳液，其流向设计为利用超临界流体萃取(SFE)或其他萃取技术的分离容器。通过选择的萃取技术从系统中去除连续相中的溶剂。在一些实施方式中，溶剂是醇。将溶剂从分散相的经交联的基质和连续相中去除，得到经聚合物涂覆的气凝胶。在一些实施方式中，由于SFE在回收萃取的溶剂方面的高产率，萃取技术是SFE。在一些实施方式中，溶剂在连续相中的消耗是最小的。
与常规技术不同，本文描述的实施方式不依赖于操作者干预。该系统对大气(例如，壳体外的气氛)封闭，减少了潜在的污染源，也减少了外部过程扰动的可能性。此外，由于主要基于醇的溶液的存在，提供了无菌气氛(例如，壳体内的气氛)。此外，根据本文所述的实施方式的系统和工艺不依赖于长的、耗时的或能源密集型的干燥工艺，而是提供了对工艺变量的实时、原位监测和控制。本文所述的实施方式还由于占地面积减少和工艺复杂性减少而节省了成本，由于操作员时间减少而减少了操作费用，由于实时监测工艺变量和特性而减少了浪费，以及由于改进了昂贵涂料的使用而减少了操作开支。此外，该系统和工艺提供了对珠的尺寸的高度控制，以及对涂层的高度控制。该工艺被配置为按需工艺，并且可以立即满足用户需要。
图1示出了根据本文描述的实施方式的系统100的示意图。如图1所示，乳化器120、涂覆反应器130和分离器140设置在壳体110内。在乳化器120内，显示了有机溶液122的流体通道121，以及与有机溶液122的流体通道相交的交联溶液124的流体通道123。在该实施方式中，有机溶液122是水中的PGA，交联溶液124是乙醇中的钙。在相交处，两种溶液合并从而在微流体通道152中形成乳液。两种溶液之间的界面张力促使PGA溶液破裂成滴或PGA珠162。珠162是交联溶液164的连续相(CP)中的乳液的分散相(DP)。乳液在乳化流动通道154中被运载至下游的涂覆反应器130。涂覆反应器130包括与乳化流动通道154相交的涂覆溶液流动通道133。涂覆溶液135涂覆或结合到PGA珠162的表面以产生功能化表面。在一些实施方式中，涂覆溶液135包括细胞生长培养基，例如US 2019/0153256中描述的Synthemax(康宁股份有限公司，纽约康宁)(本文称为SMII)，所述文献的内容通过引用全文纳入本文。现在乳液包括连续相164和经涂覆的分散相166，其在涂覆后的乳化流动通道156中被运载到下游的分离器140。在分离器140内是包括超临界流体的流动通道158。在该实施方式中，超临界流体是CO2。超临界CO2将溶剂从乳液中去除，从而从经涂覆的PGA珠168中分离出乙醇和CO2。系统100可以进一步包括珠储存器(未示出)，其用于储存在分离器140中处理后的干燥的、经涂覆的珠。系统100还可以包括与系统100连通的控制器(未示出)，其用于监测和控制流率、压力、温度、传感器和任何其他系统控制特征。
图2示出了根据本文所述的一个实施方式的系统200的示意图。如图2所示，乳化器220、涂覆反应器230和分离器240设置在壳体210内并通过微流体流动通道252、254、256、258连接。该系统和方法可分为三个模块化过程单元：在乳化器220中形成凝胶，在涂覆反应器230中涂覆凝胶，以及在分离器240中干燥凝胶。在乳化器220内，向微流体通道252给予交联溶液222。例如，交联溶液222可以包括乙醇中的钙。有机溶液224以不与流动相反的角度被泵入相同的通道252。例如，有机溶液224可以包括水中的PGA。PGA通过小通道或孔226与钙溶液相交，表面张力和剪切力促使PGA溶液破裂成珠262。珠262是交联溶液264的连续相(CP)中的乳液的分散相(DP)。乳液在乳化流动通道254中被运载至下游的涂覆反应器230。涂覆反应器230包括与乳化流动通道254相交的涂覆溶液流动通道233。涂覆溶液235涂覆或结合到PGA珠262的表面以产生功能化表面。例如，涂覆溶液可包括细胞生长培养基，如(康宁股份有限公司，纽约康宁)。现在乳液包括连续相264和经涂覆的分散相266，其在涂覆后的乳化流动通道256中被运载到下游的分离器240。在分离器240内是包括超临界流体的流动通道258。例如，超临界流体可以包括CO2。超临界CO2从乳液中去除溶剂，从而从经涂覆的PGA珠中分离出乙醇和CO2。然后，乙醇和CO2可以从分离器中输出并任选地回收，同时得到干燥的、经涂覆的PGA珠。该系统还可以包括用于干燥的、经涂覆的PGA珠268的存储器270。在一些实施方式中，珠存储器可以在壳体的内部(未示出)。在一些实施方式中，珠存储器可以在壳体外部。系统200进一步包括控制器280。控制器280与系统200连通，用于监测和控制流率、压力、温度、传感器和任何其他系统控制特征。
根据本文描述的实施方式的系统可以包括控制器。控制器可用于监测和控制系统内的传感器、流率、压力、温度和其他可控特征。在一些实施方式中，控制器可以与系统的部件无线连通。控制器可以包括内存和处理器。在一些实施方式中，控制器与用户界面连通。
控制器可以处理从系统部件获取的数据。数据可以包括压力、温度和/或流率数据。控制器可以通过处理器从泵或传感器接收数据，或者以其他方式将数据操纵成用户指定的参数。例如，用户可以使用用户界面来选择模块的各种参数或规格。接收和/或处理的数据可以被传输到显示装置以进一步处理和/或显示。数据传输可以通过数据接口进行，例如数据链路或USB连接。控制器还可以包括内存。内存可以用于存储数据。数据可以是未处理的数据，或是已处理的数据。存储的数据可以被下载到外部计算机进行处理，并且可以离线处理。
在一些实施方式中，系统可以进一步包括成像部件，例如照相机或散射系统来在线监测珠的形成和颗粒尺寸，和/或测量光学清晰度。
图3示出了根据本文所描述的实施方式的工艺流程图(PFD)。特别地，提供了用于连续制造经涂覆的气凝胶珠的PFD。整个PFD可以在单个单元中进行，同时凝胶形成、洗涤、涂覆和分离过程是模块化过程。在实施方式中可以包括压力调节和气体(例如CO2)和醇(例如乙醇)的质量补充。在一些实施方式中，压力调节以及CO2和乙醇的质量补充在该过程之外。
在凝胶形成过程中，可以使用约0.5-3重量％的水性有机溶液作为分散相。在一些实施方式中，水性有机溶液可以包括1.7重量％的聚半乳糖醛酸(PGA)溶液。在一些实施方式中，可以使用约3-6重量％的交联溶液作为连续相。在一些实施方式中，包括4重量％钙盐(例如CaCl2、CaCO3和/或CaSO4的混合物)的醇(例如乙醇)溶液的交联溶液被用作连续相。如果系统中的界面能低，就像在水-醇系统中，滴将不会自发形成。在一些实施方式中，为了形成滴，可以振动由分散相形成的稳定射流(例如通过压电器或其他装置)。在一些实施方式中，分散相受到机械扰动(例如，通过振动或旋转力)。一些实施方式可以使用PGA/葡萄糖溶液作为分散相。连续相将作为PGA溶液的交联溶液。钙溶液通过注射泵(或其他方法)以约5至约200mL/min的速率提供给微流体通道。PGA溶液以不与流动相反的角度以比钙溶液的流率低约1倍至约40倍的速率被泵送到相同的通道中。通过单个通道或喷嘴的流率可以变化。PGA通过小通道或孔与钙溶液相交。表面张力和剪切力有助于将PGA溶液破裂为珠、滴或团。在实施方式中，珠、滴或团的临界尺寸可以为约100微米至约500微米(μm)。
分散相中PGA的形状和大小取决于通道大小和各溶液的流率。在一些实施方式中，形成的是PGA聚合物珠。在一些实施方式中，形成的是PGA“团”。在此，凝胶制备相的壁足够小，分散相(DP)和连续相(CP)的流率足以产生长形，例如“子弹”或椭圆形。
表面张力是影响珠的形成(如珠的尺寸、形状和一致性)的一个重要因素。在一些实施方式中，有机溶液可以包括用于形成珠或支架的任何合适的流体。在一些实施方式中，流体可以包括油、非极性烃、其他非极性流体、不同链长的醇、醇的混合物、醇和水的混合物、水，和表面活性剂，其可以用于控制凝胶化培养基的表面张力。在一些实施方式中，珠可以是球形的，并且流体可以包括油、非极性烃和/或其他非极性流体。例如，表面活性剂的添加可以允许实现圆形珠而不是洋葱形珠。由于其对射流破裂模式的影响，表面活性剂和表面活性剂浓度可以在微流体滴的形成中发挥关键作用。例如，表面活性剂浓度的增加可有助于在分散相中形成长“线”。尽管其机理尚不清楚，但是认为表面活性剂的存在影响液体射流的稳定性。滴的形成可以发生在连续相和分散相的接合处(即滴掐断(pinch-off))，或者可以是由于接合处下游的分散相的破裂(即线破裂)而发生，或通过许多其他破裂模式而发生。表面活性剂在系统中存在的程度被认为会影响破裂模式。
CaCl2∶CaCO3∶CaSO4的相对比例决定了PGA溶液的凝胶化动力学，并且可以进行调整以适应工艺和最终产品的规格。溶液中的游离钙离子有助于PGA的凝胶化，并在破裂后保持分散相的形状。凝胶化的PGA/Ca2+/乙醇基质形成基于醇的凝胶或“醇凝胶”。
醇凝胶由连续相运载到涂覆微反应器。在一些实施方式中，醇凝胶可以暴露于醇洗阶段以去除凝胶制备阶段期间未消耗的任何钙离子。在一些实施方式中，设计为无动物源的细胞生长培养基的聚合物可以用作涂覆培养基。在一些实施方式中，涂覆培养基可以包括(SMII)(可商购自康宁股份有限公司，纽约康宁)。在一些实施方式中，胶原可以被用作涂覆培养基用于其他细胞生长应用。涂覆培养基通过交联反应结合至醇凝胶，交联反应通常通过交联试剂(如戊二醛)得到促进。涂覆培养基与溶液中醇凝胶的流动分布相交。每种物质的流率取决于涂覆微反应器中通道的尺寸和涂覆反应(在该实例中为交联)的反应动力学。本文所述的系统和方法可以使用溶液流变来进行调整。例如，溶液中PGA的量和等级可以影响所形成的珠。在实施方式中，通道的宽度通常会大于醇凝胶的宽度，这消除了在交联的初始阶段期间，当聚合物涂层可能是易碎的时候，对聚合物涂层的剪切。然而，一些实施方式可以在涂覆阶段使用壁剪切来促进通道内醇凝胶的旋转，这可以产生更均匀的涂层。在涂覆阶段，涂覆培养基可以以5-500毫升/分钟的速率给予。
在一些实施方式中，可将涂覆的醇凝胶转移至醇洗以去除涂覆过程中任何未反应的SMII或其他试剂。经涂覆的醇凝胶由连续相运载到分离容器，从而将凝胶与连续相分离，并从凝胶基质中去除任何连续相。微通道中的小孔或膜将分散相与连续相分离。分散相被运载至分离容器，而连续相被送去回收或废弃。在该实施方式中，通过使用超临界CO2(sCO2)的超临界流体萃取(SFE)从醇凝胶中去除醇溶剂。然而，可以使用任何液体/流体萃取的方法来从溶液中去除醇。在该实施方式中，sCO2由CO2气体在大于72.9atm的压力和304.25K的温度下形成。将经涂覆的醇凝胶暴露于sCO2，sCO2作为醇凝胶基质中醇的溶剂。将sCO2和醇的混合物运载到减压容器以形成气态CO2和液态醇。该醇可以被回收并重复用于任何溶化或洗涤阶段。干燥的、经涂覆的PGA气凝胶从微流体系统被运载到存储容器或其他容纳单元。
在一些实施方式中，亚临界液体CO2将被用于从溶液中去除溶剂。或者，在一些实施方式中，系统的整个组件可以在高于CO2临界点的温度和压力下操作，因为在这样的温度和压强下操作可以通过使整个组件适合于超临界CO2的形成来加速交联反应和降低设计复杂性。
在一些实施方式中，CO2是用于乙醇/培养基萃取的超临界流体。在一些实施方式中，其他超临界流体可用于乙醇/其他培养基萃取。其他超临界流体的非限制性示例包括氮气和甲烷，它们是在比CO2低得多的压力下超临界的气体，这可以节省再加压成本并为珠提供机械更稳定的环境(即，较低的压力可以导致较小的机械变形；对涂覆层的形态的潜在影响较小)。将N2或CH4维持为超临界流体所需的低温可以与冷冻干燥步骤“热集成”，从而抵消与维持低温超临界流体相关的成本。
在一些实施方式中，可以使用乙醇去除/回收方法(例如使用冷凝器的传统热驱动蒸发)来回收乙醇。例如，可以使用这样的乙醇去除和回收方法来避免高压CO2对珠的不良影响(例如珠的不可逆变形、涂层形态的不希望的变化或涂层的分层)。在一些实施方式中，方法可以包括处理回收的醇或超临界流体以保持所需的纯度水平。
此外，在实施方式中，可以提供均匀尺寸分布的微载体。均匀的尺寸分布可以确保在使用过程中从上清液中更快、更干净地分离微载体，这可以使培养基交换和最终生产分离的可预测性更高、更可靠、更便宜。在实施方式中，微载体尺寸可以精确地调整到不同的范围。这允许在不改变珠的材料特性的情况下定制珠的沉降速度以匹配不同的生物工艺需求。
微载体珠可以是球形的或基本上是球形的。珠可以是任何合适的尺寸，并且本文所述的系统和方法能够调节参数以实现不同的珠尺寸。在一些实例中，可以通过针对目标应用的所述调整来实现珠尺寸的定制分布。在一些实施方式中，珠的平均直径可以在10微米至500微米的范围内，例如10、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500微米，包括在前述值中的任意值之间的范围。在实施方式中，可以制造在窄的和特定的尺寸范围内的微载体珠。也就是说，可以对其进行尺寸控制。由于一些原因，微载体珠的尺寸的控制是重要的。如果存在从小微载体到大微载体的宽尺寸分布，则尺寸较小的微载体将比尺寸较大的微载体悬浮更长时间。该过程中的确切沉降时间要长得多(因为较小珠的存在)或难以确定。使用中，将需要更多的时间来确保上清液与微载体分离干净。
窄的尺寸分布使得珠能够以一致的速度沉降，这允许在培养基交换或培养产物分离期间能更好地预测从上清液中分离微载体。微载体的尺寸可以微调到不同的范围以控制沉降速度。这使得能够定制沉降速度，以满足不同的工艺需求。尺寸受控的微载体具有均匀的表面积，这为每个微载体的细胞接种提供了相同的可用面积。这使得计算可用于细胞接种的表面积变得更容易。此外，细胞将在相同或相似的时间达到融合。如本文所用，术语“融合”或“融合的”被用于指示细胞何时在生长表面上形成连贯层，其中所有细胞都与其他细胞接触，使得所有可用的生长表面几乎都被利用。例如，“融合”常规上被定义为所有细胞在其整个周围上与其他细胞接触并且不留有未覆盖的可用基材的情况。被细胞覆盖的生长表面的量可以称为融合的比例。例如，大约一半的生长表面被细胞覆盖的情况在本文中被称为50％融合，或者，替代地，被称为半融合。尺寸受控的微载体可以在相同的搅拌条件下悬浮，这允许精细控制剪切力以平衡微载体的良好悬浮，并且可以允许具有对细胞造成较少损伤的条件。不同组的尺寸受控的微载体的明确定义的沉降时间可以有助于在连续细胞培养过程中容易分离，以防止在不同时间饲养的珠上的细胞生长不均匀。例如，可以先将细胞接种在尺寸为250μm的尺寸受控的微载体上。在细胞达到半融合后，可以在生物反应器中加入尺寸为350μm的尺寸受控的微载体来进行珠到珠的转移。在250μm微载体融合时，可以通过其特有的沉降速度或过滤去除该尺寸的微载体。生物反应器中只剩下尺寸为350μm的半融合的珠。然后，可以添加新鲜的250μm微载体。在350μm微载体达到融合后，可以将其收集起来并添加新鲜的350μm微型载体。该方法可以确保所有珠在到达融合时都被去除。相反，在使用相同尺寸的微载体进行珠对珠转移和连续细胞培养的情况下，更早饲养的珠上的细胞在生物反应器中停留的时间会比后饲养的珠上的细胞长得多，并且细胞的质量会由于过度融合而劣化。
在实施方式中，可以在使用振动包封器(vibration encapsulator)的制造过程中对可溶性微载体进行尺寸控制。尺寸受控的珠可以通过穿过具有限定的孔尺寸、流率和/或振动频率的微流体通道、喷嘴、膜或网而形成。可以将所获得的珠的尺寸控制在变化系数小于10％的窄范围内。
本文提供的珠的尺寸可以根据水合测量法来测量。作为非限制性的例子，使用水合基测量法(water-hydrated base measurement)，例如在珠形成后涂覆和干燥前测量珠。
根据本文所述的系统和方法，乳化器可以包括用于珠形成的微流体装置。微流体装置可以是微流体通道、膜或网。在一些实施方式中，可以使用网来控制珠尺寸。网的非限制性例子包括开口尺寸为约25微米至约1000微米的限定开口的PET网。在一些实施方式中，可以通过使用膜来进一步控制珠尺寸。
图4示出了根据一个实施方式的在乳化器420中产生珠的流程图。交联溶液422(例如，醇(如乙醇)中的钙)充当连续相，并通过泵427行进到微流体流动通道。有机溶液储备器424(例如PGA储备溶液)充当分散相。有机溶液424行进通过泵428并且由质量流量控制器429控制，同时被泵送到有机溶液压力容器431。加压的PGA溶液流过具有指定孔径的膜432，以在微流体流动通道中产生已知直径的珠462。珠然后向下游流动以进行进一步的加工和涂覆。
膜的非限制性示例包括孔径为0.2-0.8微米的膜，例如由德国的Membraflow制造的膜；孔径为0.2-10微米的膜，例如由英国的飞力工业陶瓷有限公司(Fairey IndustrialCeramics LTD)制造的膜；孔径为0.05-14微米的膜，例如由日本旭硝子玻璃公司(AsahiGlass Company)制造的膜；孔径为0.05-14微米的膜，例如由法国Membralox，SCT制造的膜；以及孔径为7-60微米的膜，例如由英国的微孔技术有限公司(Micropore Technologies，LTD)制造的膜。
在实施方式中，膜可以是可移除和可更换的，以便通过替换具有不同孔径的膜来调节孔径。对交联溶液、PGA溶液或其组合的质量流量的调节可用于定制和控制最终的珠直径。
本公开的一些实施方式涉及制备用于细胞培养的可溶性支架的方法。在一些实施方式中，本文所公开的支架以可溶性和不可溶性来描述。如本文所用，术语“不可溶性”是指在常规细胞培养条件(包括例如细胞培养基)下不可溶解并且保持交联的材料或材料组合。另外，如本文所用的术语“可溶性”用于指当暴露于适当浓度的消化或分解材料或材料组合的酶时被消化的该材料或材料组合。本文所述的可溶性支架是具有开孔结构和高度互连的孔的多孔支架。支架的孔为细胞培养提供了受保护的环境，其中细胞与细胞的相互作用和3D方式的ECM的形成得到了帮助。可溶性支架可以被完全消化，这允许使用蛋白酶处理和/或机械收获技术在不损伤细胞的情况下收获细胞。
在实施方式中，系统和方法可用于生产可消化或可溶性微载体(DMC)珠。在一些实施方式中，支架包括用作细胞生产培养基的可溶性微载体(DMC)。在一些实施方式中，微载体包括涂覆有II-SC(可商购自康宁股份有限公司，纽约康宁)的DMC，例如国际公开号WO2016/200888和WO 2019/104069中所述的DMC，所述文献各自的内容通过引用全文纳入本文。可消化的细胞培养制品在国际公开号WO2014/209855中公开，所述文献的内容通过引用全文纳入本文。
在实施方式中，由本文所述的系统和方法形成的细胞培养制品可以促进细胞附着和生长。PGA珠由于其水凝胶性质和负电荷，在没有经过特定处理的情况下不容易支持细胞附着。为了促进锚着依赖性细胞的附着，可以为珠提供涂层或其他表面处理。例如，可以用促进细胞粘附的分子(例如肽，例如包含RGD序列的肽)来对PGA珠进行功能化。
其他候选肽包括那些含有可能被整合素家族的蛋白质所识别的或导致与能够维持细胞粘附的细胞分子相互作用的氨基酸序列的肽。示例包括但不限于BSP、玻连蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、I型和IV型胶原、变性胶原(明胶)以及类似肽及其混合物。其他示例性肽是BSP和玻连蛋白(VN)肽。
在实施方式中，用细胞粘附促进重组蛋白对珠进行表面功能化，该重组蛋白可以被接枝或作为涂层施加。示例性重组蛋白包括以商品名和/>plus市售的纤连蛋白样工程蛋白，尽管也可以使用其他促进锚着依赖性细胞附着的重组蛋白。
根据本公开的实施方式，本文所述的支架还可以包括附着聚合物涂层。附着聚合物可以包括肽。示例性的肽可以包括但不限于BSP、玻连蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、I型和IV型胶原、变性胶原(明胶)以及类似肽及其混合物。另外，肽可以是具有RGD序列的肽。所述涂层例如可以是II-SC(商购自康宁股份有限公司，纽约康宁)。
在一些实施方式中，有机溶液可以包括多糖溶液。在一些实施方式中，多糖溶液可以包括聚半乳糖醛酸(PGA)溶液。通常，多糖具有有益于细胞培养应用的属性。多糖具有亲水性，无细胞毒性，在培养基中稳定。示例包括果胶酸，也称为聚半乳糖醛酸(PGA)，或其盐，部分酯化的果胶酸或其盐或部分酰胺化的果胶酸或其盐。果胶酸可以通过某些果胶酯的水解形成。果胶是细胞壁多糖，在天然中对植物具有结构上的作用。果胶的主要来源包括柑橘果皮(例如，柠檬和酸橙的果皮)以及苹果皮。果胶主要是基于1,4-连接的α-D-半乳糖醛酸酯骨架的线性聚合物，骨架由1,2-连接的L-鼠李糖随机中断。其平均分子量在约50,000至约200,000道尔顿的范围内。
在一些实施方式中，PGA溶液可以包括果胶的聚半乳糖醛酸链，其被部分酯化，例如甲酯化，并且游离的酸基团可以用单价离子(例如钠、钾或铵离子)部分或完全中和。用甲醇部分酯化的聚半乳糖醛酸被称为果胶酯酸，其盐被称为果胶酯酸盐(pectinate)。高甲氧基(HM)果胶的甲基化程度(DM)可为例如60摩尔％至75摩尔％，而低甲氧基(LM)果胶的甲基化程度可为1摩尔％至40摩尔％。本文所述的部分酯化的聚半乳糖醛酸的酯化程度可以小于约70摩尔％，或小于约60摩尔％，或小于50摩尔％，或者甚至小于约40摩尔％，以及其间的所有值。不希望囿于任何特定理论，认为最少量的游离羧酸基团(未酯化)会促进离子移变交联(ionotropic crosslinking)的程度，其允许形成可溶性支架，其是不可溶的。
在一些实施方式中，PGA溶液可包括部分酰胺化的果胶的聚半乳糖醛酸链。部分酰胺化的聚半乳糖醛酸可以通过例如用氨处理来产生。酰胺化果胶含有羧基(～COOH)，甲酯基(～COOCH3)和酰胺化基团(-CONH2)。酰胺化的程度可以变化，并且可以是，例如，约10％至约40％酰胺化。
根据一些实施方式，可溶性支架可以包括果胶酸和部分酯化的果胶酸的混合物。也可以使用具有相容性聚合物的掺混物。例如，果胶酸和/或部分酯化的果胶酸可以与其他多糖(例如，葡聚糖、取代的纤维素衍生物、藻酸、淀粉、糖原、阿拉伯木聚糖、琼脂糖等)混合。还可使用糖胺聚糖(Glycosaminoglycans)，如透明质酸和硫酸软骨素，或者各种蛋白质，如弹性蛋白、纤维蛋白、丝纤蛋白、胶原及其衍生物。水溶性合成聚合物也可与果胶酸和/或部分酯化的果胶酸掺混。示例性的水溶性合成聚合物包括但不限于聚亚烷基二醇、聚(羟基烷基(甲基)丙烯酸酯)、聚(甲基)丙烯酰胺及其衍生物、聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)和聚乙烯基醇。
本文所述的可溶性支架可以经过交联以增加其机械强度，并防止支架被放置为与细胞培养基接触时溶解。交联可以通过如下所述的离子移变凝胶化进行，其中，离子移变凝胶化是基于聚电解质在多价抗衡离子的存在下交联以形成交联支架的能力。不希望囿于任何特定理论，认为可溶性支架的多糖的离子移变凝胶化是二价阳离子和多糖之间强烈相互作用的结果。
在一些实施方式中，可溶性支架是可溶性泡沫支架。例如，可溶性泡沫支架可以包括含开孔结构的多孔泡沫。本文所述的可溶性多孔泡沫支架可以具有约85％至约96％的孔隙率。例如，本文所述的泡沫支架可以具有约91％至约95％，或约94％至约96％的孔隙率。如本文所用，术语“孔隙率”是指可溶性泡沫支架中开孔体积的量度，并以％孔隙率表示，其中％孔隙率是可溶性泡沫支架总体积中孔隙的百分比。本文所述的泡沫支架的平均孔径可以在约50μm和约500μm之间。例如，平均孔径可以在约75μm和约450μm之间，或者在约100μm和约400μm之间、或者甚至在150μm和约350μm之间以及其间的所有值。可溶性支架在支架的孔内为细胞培养提供了受保护的环境。此外，当暴露于适当的消化或分解材料的酶时，可溶性支架可以被溶解，这有助于在不损伤细胞的情况下收获在支架中培养的细胞。
本文所述的支架的湿密度可以小于约0.40g/cc。例如，本文所述的支架的湿密度可以小于约0.35g/cc，或小于约0.30g/cc，或小于约0.25g/cc。本文所述的支架的湿密度可以在约0.16g/cc和约0.40g/cc之间、或约0.16g/cc和约0.35g/cc之间，或约0.16g/cc和约0.30g/cc之间或甚至约0.16g/mc和约0.25g/cc之间以及其间的所有值。本文所述的支架的干密度可以小于约0.20g/cc。例如，本文所述的支架的干密度可以小于约0.15g/cc，或小于约0.10g/cc，或小于约0.05g/cc。本文所述的支架的干密度可以在约0.02g/cc和约0.20g/cc之间、或约0.02g/cc和约0.15g/cc之间，或约0.02g/cc和约0.10g/cc之间或甚至约0.02g/mc和约0.05g/cc之间以及其间的所有值。
支架中可能存在几种孔类型。开孔允许细胞在支架双侧接近支架，并允许液体通过可溶性支架及营养物质通过可溶性支架运输。部分开孔允许细胞在支架的一侧接近支架，但营养物质和废物的大规模运输限于扩散。闭孔没有开口，细胞或营养物质和废物的大量运输不可及。在一些实施方式中，细胞培养支架包括具有开孔构造和高度互连的孔的可溶性泡沫支架。通常，开孔构造和高度互连的孔使细胞能够迁移到可溶性支架的孔中，并促进增强营养物质、氧气和废物的大量运输。开孔构造还通过为细胞间相互作用提供高表面积和为ECM再生提供空间来影响细胞粘附和细胞迁移。
由本文所述的系统和方法生产的细胞培养制品可以进一步允许在不使用蛋白酶的情况下收获细胞。示例性细胞培养制品是微载体，其也被称为珠或微珠(统称为“微载体”)。在实施方式中，细胞培养制品是光滑且透明(或半透明)的珠，其包含凝胶，所述凝胶包括果胶酸、部分酯化的果胶酸或其盐。细胞培养制品可以是球形的或基本上是球形的，并且通过凝胶化形成。可以调节细胞培养制品的钙含量，以提供在减轻对细胞损伤的温和条件下的快速细胞收获。促进锚着依赖性细胞附着的分子可以通过化学偶联或物理吸附附着在细胞培养制品的表面。
适用于消化微载体，收获细胞或两者的非蛋白水解酶包括果胶分解酶或果胶酶，它们是水解果胶物质的相关酶的异质组。
细胞收获涉及使载有细胞的微载体与溶液接触，该溶液包含果胶分解酶或果胶酶和二价阳离子螯合剂的混合物。收获所培养的细胞的示例方法包括在本文公开的微载体表面上培养细胞，并使所培养的细胞与果胶酶和螯合剂的混合物接触从而将细胞从微载体中分离。当暴露于消化或分解材料的适当的酶、螯合剂或其组合时，如本文所述的可溶性支架被消化。适用于消化支架、收获细胞或两者的非蛋白水解酶包括果胶分解酶或果胶酶，它们是水解果胶物质的相关酶的异质组。
果胶酶(聚半乳糖醛酸酶)是将复杂的果胶分子分解成较短的半乳糖醛酸分子的酶。果胶酶催化果胶低聚糖(POS)从聚半乳糖醛酸释出。果胶酶由真菌、酵母、细菌、原生动物、昆虫、线虫和植物产生。果胶酶的商购来源一般是多酶，例如Novozyme PectinexTMULTRASPL，一种由棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的选定的株产生的果胶酶制剂。NovozymePectinexTMULTRA SP-L主要含有聚半乳糖醛酸酶,(EC 3.2.1.15)果胶反式消去酶(EC4.2.2.2)和果胶酯酶(EC:3.1.1.11)。EC名称是酶委员会根据酶催化的化学反应对酶进行的分类方案。已知果胶酶水解果胶。它们可以攻击甲酯化果胶或去酯化果胶。消化溶液中果胶分解酶的浓度可以是1至200U，例如1、2、5、10、20、50、100、150或200U，包括上述任意值之间的范围。
根据本公开的实施方式，可溶性支架的消化还可以包括将支架暴露于二价阳离子螯合剂。示例性的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、环己二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇四乙酸(ETGA)、柠檬酸和酒石酸。消化溶液中的螯合剂浓度可以是1至200mM，例如10、20、50、100、150或200mM。为了防止细胞毒性副作用，消化溶液中螯合剂的浓度可以是10mM或更低，例如1、2、5或10mM，包括上述任意值之间的范围。
在实施方式中，包含果胶分解酶和螯合剂的消化溶液的总体积小于微载体体积的10倍，例如，微载体的体积的1倍、2倍、4倍、5倍或10倍，包括前述任意值之间的范围。
本文所述的可溶性支架完全消化的时间可以小于约1小时。例如，支架完全消化的时间可以小于约45分钟，或小于约30分钟，或小于约15分钟，或在约1分钟至约25分钟之间，或在约3分钟至约20分钟之间，或者甚至在约5分钟至约15分钟之间。
根据消化时间、温度和添加的果胶分解酶的量，可以选择或预先确定珠的消化程度。已经观察到，在珠被完全消化之前，细胞从微载体表面脱离。因此，在有或没有完全消化珠的情况下可收获细胞。在从部分消化的微载体收获细胞的实施方式中，可以通过过滤、倾析、离心和类似处理中的一种或多种将细胞从残余微载体中分离。
当其钙含量小于2g/升湿珠，例如小于2、1.5、1、0.8或0.5g/升湿珠时，珠很容易被消化。当在收获阶段时珠的钙含量大于1g/1，可以使用更大体积和/或更高浓度的果胶分解酶和二价阳离子螯合剂。完全消化的时间可以小于一小时，例如10、15、30或45分钟。如本文所用，术语“完全消化”是指微载体的消化使得微载体颗粒计数符合《美国药典》(TheUnited States Pharmacopeia)和《国家处方集》(The National Formulary)第788节(USP＜788＞)中题为“注射剂中的颗粒物(Particulate Matter in Injections)”的颗粒计数测试。如USP<788>所示,如果被测单位中存在的平均颗粒数每毫升不超过25个等于或大于10微米的颗粒，并且每毫升不超过3个等于或大于25微米的颗粒，则制剂符合测试要求。在实施方式中，微载体消化后，尺寸大于或等于10微米的颗粒的微载体颗粒计数小于10个颗粒，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8或9个颗粒，包括上述任意值之间的范围。在实施方式中，微载体消化后，尺寸大于或等于25微米的颗粒的微载体颗粒计数小于1个颗粒，例如0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9个颗粒，包括上述任意值之间的范围。
如本文所定义的“湿珠”体积是倾析或离心后的珠床的体积。该床包括胀珠(swollen bead)以及间隙水(即胀珠之间存在的水)。根据测量，湿珠含有70体积％的胀珠和30体积％的间隙水。胀珠含有99％的水(对于1％PGA溶液)，98％的水(对于2％PGA溶液)，97％的水(对于3％PGA溶液)等。
实施例
在一个实施方式中，将约0.5-3重量％的水性PGA溶液(分散相，DP)与钙的乙醇溶液交联，所述钙的乙醇溶液由溶解在纯乙醇中的0-5％CaCO3、0-5％CaSO4和90-100％CaCl2的盐混合物组成，以形成约1g至约10g盐/100g溶液(连续相，CP)。CP以5-200mL/min的流率流动通过直径为1/16”的通道。DP以5-200mL/min的总流率，与CP的流率相切或不相反地流动通过通道中的一系列孔——如在错流膜乳化(cross-flow membrane emulsification)配置中。通过单个通道或喷嘴的流率可以变化。如有必要，可以对DP施加扰动(例如，旋转或振动)，以促进均匀破裂，并且该扰动标称上是通过瑞利(Rayleigh)预测的频率。凝胶化发生在直径为100-500微米且形状接近球形的PGA滴离开孔之后，但在滴有机会在CP中聚结之前。针对凝胶化时间和凝胶光学清晰度对CaCO3:CaCl2:CaSO4的比例进行优化。
用乙醇洗涤溶液，洗涤速率与置换本体溶液中的乙醇相等。将洗涤后的溶液送到涂覆反应器中，用SMII涂覆每个珠，使总表面积覆盖率为60-100％。反应器的宽度足够大到防止珠上的壁剪切。
涂覆珠被送到下游的洗涤阶段，其与第一(阶段)平行。这些洗涤过的珠在被送往分离容器之前首先通过膜分离与CP机械分离，在分离容器中珠与sCO2接触标称3s的停留时间。sCO2的质量流率约为1kg/min。将sCO2减压以将气态CO2与液态乙醇分离，将气态CO2再加压为超临界CO2，并回收液态乙醇用于洗涤阶段。将气凝胶珠缓慢减压并送往储存器。
示例性实施方案
以下是对本公开的主题的实施方案的各个方面的描述。每个方面可以包括所公开的主题的各种特征、特性或优点中的一种或多种。实施方案旨在例示所公开的主题的几个方面，并且不应被认为是对所有可能的实施方案的全面或详尽的描述。
方面1涉及一种用于制造细胞培养支架的系统，其包括：壳体；和以串联的布置方式设置在壳体内的多个模块化部件，所述模块化部件通过多个微流体流动通道连接。
方面2涉及如方面1所述的系统，其中所述模块化部件包括乳化器、涂覆反应器和分离器。
方面3涉及如方面2所述的系统，其中，所述乳化器包括：输入，其包括：有机溶液流动通道，和交联溶液流动通道；以及输出，其包括与涂覆反应器连通的乳化流动通道。
方面4涉及如方面3所述的系统，其中，所述有机溶液流动通道和交联溶液流动通道通过设置在有机溶液流动通道与交联溶液流动通道之间的微流体孔连通。
方面5涉及如方面3所述的系统，其中，所述乳化器还包括多孔膜。
方面6涉及如方面5所述的系统，其中，每个细胞培养支架的临界尺寸由多孔膜的孔径决定。
方面7涉及如方面5所述的系统，其中所述多孔膜是可移除和可替换的。
方面8涉及如方面3所述的系统，其中，所述系统还包括：具有到乳化器的输入管线的有机溶液储存器；和具有到乳化器的输入管线的交联溶液储存器。
方面9涉及如方面8所述的系统，其还包括设置在所述有机溶液储存器和乳化器之间的泵。
方面10涉及如方面9所述的系统，其中有机溶液储存器输入管线还包括质量流量控制器。
方面11涉及如方面8所述的系统，其还包括设置在所述交联溶液储存器和乳化器之间的泵。
方面12涉及如方面11所述的系统，其中交联溶液储存器输入管线还包括质量流量控制器。
方面13涉及如方面8所述的系统，其中所述交联溶液的流率大于或等于有机溶液的流率。
方面14涉及如方面3所述的系统，其中所述有机溶液包括聚合物溶液或糖溶液。
方面15涉及如方面3所述的系统，其中所述有机溶液包括聚半乳糖醛酸(PGA)溶液。
方面16涉及如方面3所述的系统，其中所述有机溶液包括油、非极性流体、醇、水、表面活性剂或其任意组合。
方面17涉及如方面3所述的系统，其中所述交联溶液包括离子盐溶液。
方面18涉及如方面17所述的系统，其中所述离子盐溶液包括离子钙盐溶液。
方面19涉及如方面18所述的系统，其中所述离子钙盐溶液中的溶剂是乙醇。
方面20涉及如方面3所述的系统，其中，所述涂覆反应器还包括：输入和输出，输入包括与乳化器连通的乳化流动通道，和与乳化流动通道相交的涂覆溶液流动通道；输出包括与分离器连通的涂覆后的乳化流动通道。
方面21涉及如方面20所述的系统，其中所述系统还包括涂覆溶液储存器，所述涂覆溶液储存器具有到涂覆反应器的输入管线。
方面22涉及如方面21所述的系统，其还包括设置在所述涂覆溶液储存器和涂覆反应器之间的泵。
方面23涉及如方面21所述的系统，其中涂覆溶液储存器输入管线还包括质量流量控制器。
方面24涉及如方面20所述的系统，其中涂覆溶液包括聚合物涂覆溶液或肽涂覆溶液。
方面25涉及如方面20所述的系统，其中所述涂覆反应器是连续流动涂覆反应器。
方面26涉及如方面20所述的系统，其中，到所述分离器的输入包括：与涂覆反应器连通的涂覆后的乳化流动通道；和与涂覆后的乳化流动通道连通的超临界流体供应器。
方面27涉及如方面26所述的系统，其中，从所述分离器的输出包括：溶剂蒸发通道，其中来自涂覆后的乳化的溶剂通过所述超临界流体蒸发并除去；和包括细胞培养支架的固体。
方面28涉及如方面26所述的系统，其中，所述超临界流体包括超临界CO2。
方面29涉及如方面26所述的系统，其进一步包括CO2储存器和压力调节器。
方面30涉及如方面29所述的系统，其中，所述CO2储存器和压力调节器在壳体的外部。
方面31涉及如方面3所述的系统，其进一步包括醇储存器和压力调节器。
方面32涉及如方面31所述的系统，其中，所述醇储存器和压力调节器在壳体的外部。
方面33涉及如方面31所述的系统，其中所述醇储存器中的醇包括乙醇。
方面34涉及如方面31所述的系统，其中，将来自醇储存器的醇供应到第一醇洗涤器中，所述第一醇洗涤器设置在乳化器和涂覆反应器之间，其中用醇对离开乳化器后且进入涂覆反应器前的乳化流体进行洗涤。
方面35涉及如方面31所述的系统，其中将来自醇储存器的醇供应到第二醇洗涤器中，所述第二醇洗涤器设置在涂覆反应器和分离器之间，其中用醇对离开涂覆反应器后且进入分离器前的涂覆乳化流体进行洗涤。
方面36涉及如方面27所述的系统，其中所述细胞培养支架包括无动物源的可消化的细胞培养基基材。
方面37涉及如方面27所述的系统，其中所述细胞培养支架包括聚合物珠或团。
方面38涉及如方面27所述的系统，其中所述细胞培养支架包括可溶性微载体。
方面39涉及如方面38所述的系统，其中所述可溶性微载体可以被酶或螯合剂溶解或消化。
方面40涉及如方面38所述的系统，其中每个可溶解微载体包括约300μm或更小的临界尺寸。
方面41涉及如方面1所述的系统，其中所述系统对大气是封闭的并且是无菌的。
方面42涉及一种用于生产细胞培养支架的方法，其包括：使水性有机溶液交联为成形凝胶；将细胞生长培养基的层或涂层结合到成形凝胶；以及对经涂覆的成形凝胶进行干燥以形成细胞培养支架，细胞培养支架包括经功能化以用作细胞生长培养基的气凝胶。
方面43涉及如方面42所述的方法，其中所述水性有机溶液包括聚合物溶液或糖溶液。
方面44涉及如方面42所述的方法，其中所述水性有机溶液包括聚半乳糖醛酸(PGA)溶液。
方面45涉及如方面42所述的方法，其中所述有机溶液包括油、非极性流体、醇、水、表面活性剂或其任意组合。
方面46涉及如方面42所述的方法，其中所述方法包括细胞培养支架的连续生产。
方面47涉及如方面42所述的方法，其中所述细胞培养支架用于三维细胞生长应用。
方面48涉及如方面42所述的方法，其中所述细胞培养支架包括可消化的细胞培养支架。
方面49涉及如方面42所述的方法，其中交联、结合和干燥步骤是在单个装置内发生的模块化过程。
方面50涉及如方面42所述的方法，其中，所述交联步骤包括通过微流体通道或孔将水性有机溶液引入交联溶液中，以在乳液中形成成形凝胶，其中所述乳液包括作为分散相的成形凝胶和作为连续相的溶剂。
方面51涉及如方面50所述的方法，其中所述交联溶液包括盐溶液。
方面52涉及如方面51所述的方法，其中所述盐溶液包括钙盐溶液，所述钙盐溶液包括醇中的CaCl2、CaCO3、CaSO4或其组合。
方面53涉及如方面50所述的方法，其进一步包括将成形凝胶暴露于醇洗阶段。
方面54涉及如方面42所述的方法，其中所述结合步骤包括通过由交联试剂促进的交联反应将细胞生长培养基结合至成形凝胶。
方面55涉及如方面54所述的方法，其中所述细胞生长培养基包括聚合物涂覆培养基或肽涂覆培养基。
方面56涉及如方面54所述的方法，其进一步包括将经涂覆的成形凝胶暴露于醇洗阶段。
方面57涉及如方面50所述的方法，其中，所述干燥步骤还包括使用微通道中的小孔或膜将乳液的分散相的经涂覆的成形凝胶与连续相的溶剂分离。
方面58涉及如方面57所述的方法，其中，所述经涂覆的成形凝胶被运载至分离容器。
方面59涉及如方面57所述的方法，其中从经涂覆的成形凝胶中去除溶剂。
方面60涉及如方面59所述的方法，其中通过超临界流体萃取从经涂覆的成形凝胶中除去溶剂。
方面61涉及如方面60所述的方法，其进一步包括对所述溶剂进行减压和回收。
应理解，各个公开的实施方式可以涉及与特定实施方式一起描述的特定特征、要素或步骤。还应理解，虽然以涉及一个特定实施方式的形式进行描述，但是特定特征、要素或步骤可以与各个未例示的组合或排列方式中的替代性实施方式互换或组合。
还应理解，本文中使用的术语"该"、"一"或"一个/种"是指"至少一个/种"，并且不应限于"只有一个/种"，除非有明确相反的说明。因此，例如，提到的“开口”包括具有两个/种或更多个/种这样的“开口”的例子，除非文中有另外的明确表示。
除非另外说明，本文中使用的所有科技术语的含义具有本领域通用的含义。本文提供的定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本公开的范围构成限制。
如在本文中所使用的，"具有"、"具备"、"含有"、"包括"、"包含"、"含"等以其开放含义使用，通常表示"包括但不限于"。
本文中，范围可以表示为从"约"一个特定值和/或至"约"另一个特定值。当表述这种范围时，实例包括自某一具体值始和/或至另一具体值止。类似地，当通过使用先行词"约"表示数值为近似值时，应理解，该具体值构成了另一方面。还应理解，每个范围的端点在与另一个端点有关以及与另一个端点无关时都是重要的。
本文表示的所有数值应理解为包括"约"，无论是否如此陈述，另有明确指明的除外。然而，还应当理解的是，所述的每个数值也可以考虑是精确值，无论其是否以"约"该数值表示。因此，“小于10mm的尺寸”和“小于约10mm的尺寸”都包括“小于约10mm的尺寸”和“小于10mm的尺寸”的实施方式。
除非另有明确说明，否则本文所述的任何方法都不应被解释为要求以特定顺序执行其步骤。因此，当方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，都不旨在暗示该任意特定顺序。
虽然使用过渡语"包含"可以公开特定实施方式的各个特征、要素或步骤，但是应理解的是，这暗示了包括可采用过渡语"由……组成"或"基本上由……组成"描述在内的替代性实施方式。因此，例如，包含A+B+C的方法的隐含的替代性实施方式包括其中方法由A+B+C组成的实施方式以及其中方法基本上由A+B+C组成的实施方式。
尽管已在详细描述中描述本公开的多个实施方式，但应当理解，公开不限于所公开的实施方式，而是能够在不脱离公开的情况下如以下权利要求所规定和定义的进行多次重排、修改和替换。

Claims (61)

1.一种用于生产细胞培养支架的系统，其包括：
壳体；和
以串联的布置方式设置在壳体内的多个模块化部件，所述模块化部件通过多个微流体流动通道连接。
2.如权利要求1所述的系统，其中所述模块化部件包括乳化器、涂覆反应器和分离器。
3.如权利要求2所述的系统，其中所述乳化器包括：
输入，其包括：
有机溶液流动通道，和
交联溶液流动通道；以及
输出，其包括与所述涂覆反应器连通的乳化流动通道。
4.如权利要求3所述的系统，其中，所述有机溶液流动通道和交联溶液流动通道通过设置在有机溶液流动通道与交联溶液流动通道之间的微流体孔连通。
5.如权利要求3所述的系统，其中所述乳化器还包括多孔膜。
6.如权利要求5所述的系统，其中，每个细胞培养支架的临界尺寸由多孔膜的孔径决定。
7.如权利要求5所述的系统，其中所述多孔膜是可移除和可替换的。
8.如权利要求3所述的系统，其中，所述系统还包括：
有机溶液储存器，其具有到乳化器的输入管线；和
交联溶液储存器，其具有到乳化器的输入管线。
9.如权利要求8所述的系统，其还包括设置在所述有机溶液储存器和乳化器之间的泵。
10.如权利要求9所述的系统，其中有机溶液储存器输入管线还包括质量流量控制器。
11.如权利要求8所述的系统，其还包括设置在交联溶液储存器和乳化器之间的泵。
12.如权利要求11所述的系统，其中交联溶液储存器输入管线还包括质量流量控制器。
13.如权利要求8所述的系统，其中所述交联溶液的流率大于或等于有机溶液的流率。
14.如权利要求3的系统，其中所述有机溶液包括聚合物溶液或糖溶液。
15.如权利要求3的系统，其中所述有机溶液包括聚半乳糖醛酸(PGA)溶液。
16.如权利要求3的系统，其中所述有机溶液包括油、非极性流体、醇、水、表面活性剂或其任意组合。
17.如权利要求3的系统，其中所述交联溶液包括离子盐溶液。
18.如权利要求17的系统，其中所述离子盐溶液包括离子钙盐溶液。
19.如权利要求18所述的系统，其中所述乙醇是离子钙盐溶液中的溶剂。
20.如权利要求3所述的系统，其中所述涂覆反应器包括：
输入，其包括
与乳化器连通的乳化流动通道，和
与乳化流动通道相交的涂覆溶液流动通道；以及
输出，其包括与分离器连通的涂覆后的乳化流动通道。
21.如权利要求20所述的系统，其中所述系统还包括涂覆溶液储存器，所述涂覆溶液储存器具有到涂覆反应器的输入管线。
22.如权利要求21所述的系统，其还包括设置在所述涂覆溶液储存器和涂覆反应器之间的泵。
23.如权利要求21所述的系统，其中涂覆溶液储存器输入管线还包括质量流量控制器。
24.如权利要求20的系统，其中涂覆溶液包括聚合物涂覆溶液或肽涂覆溶液。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述涂覆反应器是连续流动涂覆反应器。
26.如权利要求20所述的系统，其中到所述分离器的输入包括：
与涂覆反应器连通的涂覆后的乳化流动通道；和
与所述涂覆后的乳化流动通道连通的超临界流体供应器。
27.如权利要求26所述的系统，其中来自所述分离器的输出包括：
溶剂蒸发通道，其中来自涂覆后的乳化的溶剂通过所述超临界流体蒸发并除去；和
包括细胞培养支架的固体。
28.如权利要求26所述的系统，其中所述超临界流体包括超临界CO2。
29.如权利要求26所述的系统，其还包括CO2储存器和压力调节器。
30.如权利要求29所述的系统，其中，所述CO2储存器和压力调节器在壳体的外部。
31.如权利要求3所述的系统，其还包括醇储存器和压力调节器。
32.如权利要求31所述的系统，其中，所述醇储存器和压力调节器在壳体的外部。
33.如权利要求31所述的系统，其中所述醇储存器中的醇包括乙醇。
34.如权利要求31所述的系统，其中，来自醇储存器的醇被供应到第一醇洗涤器中，所述第一醇洗涤器设置在乳化器和涂覆反应器之间，其中用醇对离开乳化器后且进入涂覆反应器前的乳化流体进行洗涤。
35.如权利要求31所述的系统，其中，来自醇储存器的醇被供应到第二醇洗涤器中，所述第二醇洗涤器设置在涂覆反应器和分离器之间，其中用醇对离开涂覆反应器后且进入分离器前的涂覆乳化流体进行洗涤。
36.如权利要求27所述的系统，其中所述细胞培养支架包括无动物源的可消化的细胞培养基基材。
37.如权利要求27所述的系统，其中所述细胞培养支架包括聚合物珠或团。
38.如权利要求27所述的系统，其中所述细胞培养支架包括可溶性微载体。
39.如权利要求38所述的系统，其中所述可溶性微载体能够被酶或螯合剂溶解或消化。
40.如权利要求38所述的系统，其中每个可溶性微载体包括约300μm或更小的临界尺寸。
41.如权利要求1所述的系统，其中所述系统对大气是封闭的并且是无菌的。
42.一种生产细胞培养支架的方法，其包括：
使水性有机溶液交联为成形凝胶；
将细胞生长培养基的层或涂层结合到所述成形凝胶；和
干燥经涂覆的成形凝胶以形成细胞培养支架，所述细胞培养支架包括经功能化以用作细胞生长培养基的气凝胶。
43.如权利要求42的系统，其中所述水性有机溶液包括聚合物溶液或糖溶液。
44.如权利要求42的方法，其中所述水性有机溶液包括聚半乳糖醛酸(PGA)溶液。
45.如权利要求42的方法，其中所述有机溶液包括油、非极性流体、醇、水、表面活性剂或其任意组合。
46.如权利要求42所述的方法，其中所述方法包括细胞培养支架的连续生产。
47.如权利要求42所述的方法，其中所述细胞培养支架用于三维细胞生长应用。
48.如权利要求42所述的方法，其中所述细胞培养支架包括可消化的细胞培养支架。
49.如权利要求42所述的方法，其中交联、结合和干燥步骤是在单个装置内发生的模块化过程。
50.如权利要求42所述的方法，其中，所述交联步骤包括通过微流体通道或孔将水性有机溶液引入交联溶液，以在乳液中形成成形凝胶，其中所述乳液包括作为分散相的成形凝胶和作为连续相的溶剂。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述交联溶液包括盐溶液。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述盐溶液包括钙盐溶液，所述钙盐溶液包括醇中的CaCl2、CaCO3、CaSO4或其组合。
53.如权利要求50所述的方法，其还包括将成形凝胶暴露于醇洗阶段。
54.如权利要求42所述的方法，其中所述结合步骤包括通过由交联试剂促进的交联反应将细胞生长培养基结合至成形凝胶。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述细胞生长培养基包括聚合物涂覆培养基或肽涂覆培养基。
56.如权利要求54所述的方法，其还包括将经涂覆的成形凝胶暴露于醇洗阶段。
57.如权利要求50所述的方法，其中，所述干燥步骤还包括使用微通道中的小孔或膜将乳液的分散相的经涂覆的成形凝胶与连续相的溶剂分离。
58.如权利要求57所述的方法，其中，所述经涂覆的成形凝胶被运载至分离容器。
59.如权利要求57所述的方法，其中从经涂覆的成形凝胶中去除溶剂。
60.如权利要求59所述的方法，其中通过超临界流体萃取从经涂覆的成形凝胶中除去溶剂。
61.如权利要求60所述的方法，其还包括对所述溶剂进行减压和回收。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3881699B2 (ja) * 1996-10-09 2007-02-14 ジボーダン―ルール（アンテルナシヨナル）ソシエテ アノニム 食品添加剤としてのビーズの製造方法
SG131015A1 (en) * 2005-09-15 2007-04-26 Millipore Corp Method and apparatus for making porous agarose beads
US8235577B2 (en) * 2006-11-14 2012-08-07 Rensselaer Polytechnic Institute Methods and apparatus for coating particulate material
AU2012256403B2 (en) 2011-03-17 2016-10-20 Corning Incorporated Synthetic coating for cell culture
EP3190175B1 (en) 2013-06-24 2018-08-08 Corning Incorporated Cell culture article and methods thereof
CN107849528A (zh) 2015-06-08 2018-03-27 康宁股份有限公司 用于细胞培养的可消化底物
EP3165240A1 (en) * 2015-11-05 2017-05-10 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Natural polymer-derived scaffold material and methods for production thereof
CN111372984B (zh) 2017-11-21 2022-09-09 康宁股份有限公司 用于细胞培养的可溶性泡沫支架及其制造方法

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