CN116802278A - 溶瘤病毒与经改造的免疫细胞联合治疗肿瘤 - Google Patents
溶瘤病毒与经改造的免疫细胞联合治疗肿瘤 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116802278A CN116802278A CN202180062625.9A CN202180062625A CN116802278A CN 116802278 A CN116802278 A CN 116802278A CN 202180062625 A CN202180062625 A CN 202180062625A CN 116802278 A CN116802278 A CN 116802278A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- composition
- virus
- cell
- immune
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 244000309459 oncolytic virus Species 0.000 title claims abstract description 118
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 53
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 title claims description 26
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 claims abstract description 76
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims abstract description 76
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 71
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 31
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 169
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 105
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 103
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 100
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 68
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 claims description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 59
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 53
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 claims description 48
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 claims description 45
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 claims description 43
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 claims description 43
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 42
- 102220506215 Lysophospholipid acyltransferase 5_M51R_mutation Human genes 0.000 claims description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 34
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 32
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 claims description 31
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 claims description 31
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 30
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 claims description 25
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims description 22
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 claims description 21
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 17
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 16
- 101000831007 Homo sapiens T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Proteins 0.000 claims description 15
- 102100024834 T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Human genes 0.000 claims description 15
- 101000666896 Homo sapiens V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Proteins 0.000 claims description 14
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims description 13
- 102100038282 V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Human genes 0.000 claims description 13
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 12
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 claims description 12
- 101710083479 Hepatitis A virus cellular receptor 2 homolog Proteins 0.000 claims description 12
- 229940126547 T-cell immunoglobulin mucin-3 Drugs 0.000 claims description 12
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 claims description 12
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 12
- IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N fluquinconazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1N1C(=O)C2=CC(F)=CC=C2N=C1N1C=NC=N1 IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 claims description 11
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 11
- 101150030213 Lag3 gene Proteins 0.000 claims description 11
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 11
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 claims description 10
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 claims description 9
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 9
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 9
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 9
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 8
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 claims description 7
- 101710185679 CD276 antigen Proteins 0.000 claims description 7
- 102100029527 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 ligand 1 Human genes 0.000 claims description 7
- 101710201161 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 ligand 1 Proteins 0.000 claims description 7
- 108010079206 V-Set Domain-Containing T-Cell Activation Inhibitor 1 Proteins 0.000 claims description 7
- 102100038929 V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1 Human genes 0.000 claims description 7
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 claims description 7
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100034980 ICOS ligand Human genes 0.000 claims description 6
- 101710093458 ICOS ligand Proteins 0.000 claims description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 claims description 5
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 claims description 5
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 claims description 5
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 claims description 5
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 claims description 4
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 claims description 4
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 4
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 4
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 4
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 claims description 4
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 claims description 2
- 101000652359 Homo sapiens Spermatogenesis-associated protein 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 241000907663 Siproeta stelenes Species 0.000 claims 1
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 206010024627 liposarcoma Diseases 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 21
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 15
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 37
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 34
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 239000000306 component Substances 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 108700041558 Vesicular stomatitis virus M Proteins 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 8
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 7
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 7
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 7
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 6
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 6
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 6
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 6
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 description 5
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 5
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 5
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 229940090044 injection Drugs 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 4
- 101100519206 Homo sapiens PDCD1 gene Proteins 0.000 description 4
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 4
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 4
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 4
- 101150087384 PDCD1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 102000048362 human PDCD1 Human genes 0.000 description 4
- 230000005918 in vitro anti-tumor Effects 0.000 description 4
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000837158 Senecavirus A Species 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- -1 B7 -H2 Proteins 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 101100510617 Caenorhabditis elegans sel-8 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102100031351 Galectin-9 Human genes 0.000 description 2
- 101710121810 Galectin-9 Proteins 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 2
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010073137 Myxoid liposarcoma Diseases 0.000 description 2
- 241000700562 Myxoma virus Species 0.000 description 2
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 2
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 2
- 101710094000 Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 206010073139 Round cell liposarcoma Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 201000010882 cellular myxoid liposarcoma Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 101150051188 Adora2a gene Proteins 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 102000004452 Arginase Human genes 0.000 description 1
- 108700024123 Arginases Proteins 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 1
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 1
- 102100036008 CD48 antigen Human genes 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102220473604 Cytochrome b5_M51A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 229940113491 Glycosylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000716130 Homo sapiens CD48 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001043809 Homo sapiens Interleukin-7 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 1
- 101000984190 Homo sapiens Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000984189 Homo sapiens Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 1
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000863873 Homo sapiens Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100021593 Interleukin-7 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 101150062031 L gene Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025584 Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100025583 Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 102100020862 Lymphocyte activation gene 3 protein Human genes 0.000 description 1
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 238000010806 PrimeScriptTM RT Reagent kit Methods 0.000 description 1
- HCBIBCJNVBAKAB-UHFFFAOYSA-N Procaine hydrochloride Chemical compound Cl.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 HCBIBCJNVBAKAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008156 Ringer's lactate solution Substances 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102100039367 T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710174757 T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101710090983 T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Proteins 0.000 description 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 102100029948 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 229940093181 glucose injection Drugs 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 230000005099 host tropism Effects 0.000 description 1
- 102000053464 human BTLA Human genes 0.000 description 1
- 102000043321 human CTLA4 Human genes 0.000 description 1
- 102000049823 human TIGIT Human genes 0.000 description 1
- 102000057058 human VSIR Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000004296 naive t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000032965 negative regulation of cell volume Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009589 pathological growth Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000005426 pharmaceutical component Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 229960001309 procaine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 1
- WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M sodium bisulfate Chemical compound [Na+].OS([O-])(=O)=O WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000342 sodium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 231100000402 unacceptable toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
- A61K35/766—Rhabdovirus, e.g. vesicular stomatitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
- A61K40/41—Vertebrate antigens
- A61K40/42—Cancer antigens
- A61K40/4267—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
- A61K40/4269—NY-ESO
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/145—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus, Duvenhage virus, Mokola virus or vesicular stomatitis virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
- A61K2239/57—Skin; melanoma
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种溶瘤病毒和经修饰的免疫效应细胞联合治疗肿瘤，提供了包含溶瘤病毒和经修饰的免疫效应细胞的组合物、药物组合物及试剂盒。还提供了所述组合物、药物组合物及试剂盒的制备方法及在治疗肿瘤和制备治疗肿瘤药物中的用途。
Description
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及溶瘤病毒与经改造的免疫细胞联合治疗肿瘤。
免疫效应细胞是人体内参与免疫应答的细胞，免疫检查点是免疫系统中存在的一些抑制性分子，通过配体-受体调控免疫应答的强度或广度，避免过度应答引起机体的损伤和破坏，是正常机体负反馈调节机制之一。但在肿瘤的发生和过程中，免疫检查点却成为诱导肿瘤免疫耐受的主要原因，导致机体抗肿瘤免疫应答的效率低下。
病毒治疗癌症的方法近二十年来发展迅速，目前病毒治疗最大的进展之一是利用肿瘤细胞与正常细胞的差异，对某些病毒结构进行改造，使其能被选择性地在肿瘤细胞中复制，最终达到杀死肿瘤细胞的目的。这些被改造后的病毒称为溶瘤病毒，其来源于疱疹病毒、痘病毒等。目前发现某些野生型病毒也具有在细胞中选择性复制从而溶瘤的功能。然而，使用溶瘤病毒单独治疗肿瘤的疗效有时并不十分理想，溶瘤病毒与化疗药物联合使用治疗肿瘤时，由于化疗药物对正常细胞同等杀伤，会带来强烈的副作用。
因此，目前在肿瘤和/或癌症的免疫治疗中，仍然需要更加有效的治疗方案及药物。
发明内容
本申请提供了一种组合物，其包含：(a)溶瘤病毒；以及(b)经修饰的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的免疫效应细胞相比，免疫检查点的表达量和/或活性被调整。本申请还提供了一种药物组合物，其包含：(a)所述的至少一种溶瘤病毒和/或药学上可接受的载剂；以及(b)所述的至少一种免疫效应细胞和/或药学上可接受的载剂。本申请还提供了一种试剂盒，其包含所述溶瘤病毒、制备所述溶瘤病毒的工具、所述经修饰的免疫效应细胞、制备所述免疫效应细胞的工具和/或药学上可接受的载剂。另一方面，本申请还提供了所述组合物、所述药物组合物、所述试剂盒的制备方法。本申请还提供了所述溶瘤病毒在所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫效应细胞的联用中的应用，所述经修饰的免疫效应细胞在所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫细胞联用中的应用。本申请还提供了一种治疗肿瘤的方法，其包含向有需要的受试者施用所述组合物、所述药物组合物和/或所述试剂盒。本申请还提供了所述组合物、所述药物组合物、所述试剂盒在制备治疗肿瘤的药物中的应用。 溶瘤病毒与经修饰的免疫效应细胞联用，有效发挥了两者的协同作用，增强了肿瘤的杀伤力，提高了肿瘤的治疗效果。
一方面，本申请提供了一种组合物，其包含：(a)溶瘤病毒；以及(b)经修饰的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的免疫效应细胞相比，免疫检查点的表达量和/或活性被调整。
在某些实施方式中，所述溶瘤病毒包含天然的溶瘤病毒和经过改造的溶瘤病毒。
在某些实施方式中，所述溶瘤病毒选自下组：水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。
在某些实施方式中，所述水疱性口炎病毒包含基质蛋白M、核衣壳蛋白N、磷蛋白P、大聚合酶蛋白L和/或糖蛋白G。
在某些实施方式中，所述水疱性口炎病毒的基质蛋白M经过改造。
在某些实施方式中，所述水疱性口炎病毒基质蛋白M的改造包含一个以上位点的突变。
在某些实施方式中，所述水疱性口炎病毒基质蛋白M的突变位点选自下组中的一个或多个：M51、L111、V221和S226。
在某些实施方式中，所述水疱性口炎病毒基质蛋白M的突变位点选自下组单个位点的突变：
a)M51R；
b)ΔL111；
c)V221F；以及
d)S226R。
在某些实施方式中，所述水疱性口炎病毒基质蛋白M的突变位点的组合选自下组中的任一组：
a)M51R且ΔL111；
b)M51R且V221F；
c)M51R且S226R；
d)ΔL111且V221F；
e)ΔL111且S226R；
f)V221F且S226R；
g)M51R、ΔL111且V221F；
h)M51R、ΔL111且S226R；
i)M51R、V221F且S226R；
j)ΔL111、V221F且S226R；以及，
k)M51R、ΔL111、V221F且S226R。
在某些实施方式中，所述突变位点组合选自M51R、V221F且S226R的水疱性口炎病毒基质蛋白M包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述突变位点组合选自M51R、ΔL111、V221F且S226R的水疱性口炎病毒基质蛋白M包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞选自下组：T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包含自体细胞和异体细胞。
在某些实施方式中，所述免疫检查点的数量为一个以上。
在某些实施方式中，所述免疫检查点选自下组中的一个或多个：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、BTLA、VISTA、TIGIT、B7-H2、B7-H3、B7-H4和B7-H6。
在某些实施方式中，所述免疫检查点为PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、BTLA、VISTA、TIGIT、B7-H2、B7-H3、B7-H4或B7-H6。
在某些实施方式中，所述免疫检查点为选自下组的组合：
a)PD-1和CTLA-4；
b)PD-1和PD-L1；
c)PD-L1和CTLA4；
d)LAG-3和CTLA-4；
e)TIM-3和CTLA-4；
f)VISTA和CTLA-4；以及
g)PD1、CTLA-4和PD-L1。
在某些实施方式中，所述免疫检查点表达量的调整包含与未经修饰的免疫效应细胞相比，所述免疫检查点表达量的上调、下调和/或缺失。
在某些实施方式中，所述免疫检查点活性的调整包含与未经修饰的免疫细胞相比，所述免疫检查点活性的增加、降低和/或缺失。
在某些实施方式中，所述免疫检查点的调整包含免疫检查点基因表达水平、转录水平和/或翻译水平的调控。
在某些实施方式中，所述基因表达水平的调控包含基因编辑、过表达、点突变和/或同源 重组。
在某些实施方式中，所述基因编辑方法选自下组的一种或多种：CRISPR/Cas9、类转录激活因子效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和单碱基编辑(BE)。
在某些实施方式中，所述基因编辑包含设计序列的sgRNA。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞敲除针对选自SEQ ID NO：1的PD-1基因的靶序列。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞敲除针对选自SEQ ID NO：2的CTLA-4基因的靶序列。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其包含：(a)所述的至少一种溶瘤病毒和/或药学上可接受的载剂；以及(b)所述的至少一种经修饰的免疫效应细胞和/或药学上可接受的载剂。
另一方面，本申请还提供了试剂盒，其包含选自下组中的一种或多种：
a)所述的至少一种溶瘤病毒和制备所述的至少一种经修饰的免疫效应细胞的工具，和/或药学上可接受的载剂；
b)所述的至少一种经修饰的免疫效应细胞和制备所述的至少一种溶瘤病毒的工具，和/或药学上可接受的载剂；以及，
c)制备所述的至少一种溶瘤病毒的工具和制备所述的至少一种经修饰的免疫效应细胞的工具，和/或药学上可接受的载剂；
另一方面，本申请还提供了所述组合物、所述药物组合物、所述试剂盒的制备方法。
另一方面，本申请还提供了所述溶瘤病毒在所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫效应细胞的联用中的应用。
另一方面，本申请还提供了所述经修饰的免疫效应细胞在所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫细胞联用中的应用。
另一方面，本申请还提供了一种治疗肿瘤的方法，其包含向有需要的受试者施用所述组合物、所述药物组合物、所述试剂盒的制备方法。
在某些实施方式中，所述溶瘤病毒通过静脉内和/或瘤内途径向有需要的受试者施用，其中所述免疫效应细胞通过静脉内和/或局部给药方式向有需要的受试者施用。
在某些实施方式中，所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫细胞同时施用，施用剂量为治疗有效量。
在某些实施方式中，所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫细胞分别施用，施用剂量为治疗 有效量。
在某些实施方式中，所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫细胞一次施用或多次施用。
另一方面，本申请还提供了所述组合物、所述药物组合物、所述试剂盒在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
在某些实施方式中，本申请所述肿瘤包含实体瘤和/或血液瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤选自下组中的一种或多种：头颈部癌、黑色素瘤、软组织肉瘤、乳腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、宫颈癌、神经母细胞瘤、滑膜肉瘤、圆细胞型脂肪肉瘤。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是各经改造的溶瘤病毒在体外的LLC细胞和MEF细胞内复制能力示意图；
图2显示的是各经改造的溶瘤病毒对体外的LLC细胞、Hela细胞核MEF细胞杀伤能力示意图；
图3显示的是各经改造的溶瘤病毒对体外LLC细胞和MEF细胞内IFN-β表达水平影响示意图；
图4显示的是CRISPR/Cas9融合质粒元件示意图；
图5显示的是流式细胞术检测人外周血T细胞经修饰后表面PD-1分子的表达；
图6显示的是经改造的溶瘤病毒的体外抗肿瘤效果检测；
图7显示的是经改造的溶瘤病毒联合敲除PD-1分子的T细胞治疗策略；
图8显示的是经改造的溶瘤病毒联合敲除PD-1分子的T细胞的肿瘤杀伤效果检测。
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书 所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“组合物”包含至少两种组分。在本申请中，所述组合物中的各组分可以混合放置，也可以分开放置。在本申请中，所述组合物中的各组分可以同时施用，也可以分别施用。所述分别施用可以区分先后顺序。例如，先施用组合物中的一个组分，再施用组合物中的另一个组分。在一个具体的实施方案中，组合物包含所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫效应细胞。
在本申请中，术语“溶瘤病毒”通常指能够在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞的病毒。在某些实施方案中，所述病毒被改造以提高肿瘤细胞的选择性。溶瘤病毒包括但不限于水疱性口炎病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。在优选的实施方案中，溶瘤病毒使水疱性口炎病毒。优选的水疱性口炎病毒可以是水疱性口炎病毒MuddSummer亚型株，其基质蛋白M基因进行定点基因突变。
在本申请中，术语“经修饰的”是指本发明的分子或细胞的改变的状态或结构。可以以许多方式——包括化学地、结构上和功能上——修饰分子。可以通过引入核酸来修饰细胞。
在本申请中，术语“免疫效应细胞”可与“免疫细胞”互换使用，通常指在免疫应答中起作用的细胞。免疫效应细胞包括：淋巴细胞，如T细胞和B细胞、天然的杀伤细胞；骨髓细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞和粒细胞。
在本申请中，术语“T细胞”是指胸腺衍生的细胞。其参与各种细胞介导的免疫反应，包括胸腺细胞、初始T淋巴细胞、不成熟的T淋巴细胞、成熟的T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化的T淋巴细胞。在某些实施方案中，T细胞群包括但不限于辅助性T细胞(HTL；CD4+T细胞)、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞或者T细胞的任何其它亚群。在某些实施方案中，T细胞群包括但不限于表达下述标志物中的一种或多种的T细胞：CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD197和HLA-DR，并且若需要，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。
在本申请中，术语“免疫检查点”通常指免疫细胞表面上的一组分子，其通过下调或抑制肿瘤免疫应答来调整免疫应答。免疫检查点包括但不限于CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、PD-L2、TIM-3、TIM-4、LAG-3、BTLA、SIRPα、CD47、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、精氨酸酶、CD73和 A2aR(参见例如WO 2012/177624)。所述术语还涵盖生物活性蛋白质片段，以及编码全长免疫检查点蛋白及其生物活性蛋白质的片段的核酸。在某些实施方案中，所述术语还涵盖根据本申请提供的同源性描述的任何和片段。
在本申请中，术语“表达量降低”可以与“表达量减少”、“表达量下调”互换使用，通常指与在野生型细胞中分子的表达量相比，经修饰的细胞中的分子表达量的下降。术语“表达量升高”可以与“表达量增加”、“表达量上调”互换使用，通常指与在野生型细胞中分子的表达量相比，经修饰的细胞中的分子表达量的上升。在某些实施方案中，表达量的下降可以是蛋白的表达量下降了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在某些实施方案中，通过测量由目标基因编码的RNA水平的下降和/或分子表达水平的下降，可以评估分子表达量的下降。
在本申请中，术语“活性降低”可以与“活性减少”、“活性下调”互换使用，通常指与野生型细胞中的活性量相比，在经修饰的细胞中分子的活性量的下降。术语“活性升高”可以与“活性增加”、“活性上调”互换使用，通常指与野生型细胞中的活性量相比，在经修饰的细胞中分子的活性量的上升。降低的活性水平或降低的表达水平可以是分子的活性下降了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在某些实施方案中，分子的合成的量没有下降，但是氨基酸序列经过修饰，使得分子活性直接地或间接的下降。
在本申请中，术语“缺失”通常指目的分子表达量和/或活性的失去。缺失可以是基因水平的缺失，也可以是转录水平或翻译水平的缺失，在某些实施方案中，缺失可以指检测不到目的分子的表达和活性。
在本申请中，术语“调整”可以与“调节”互换使用，通常指目的分子的表达量和/或活性中的变化或改变。调整可以是目的分子的特定活性或功能量级中的增加或减少。在某些实施方案中，活性和功能包括但不限于结合特征、酶促活性、细胞受体激活和信号转导。
在本申请中，术语“天然的”通常是指天然存在的，未经修饰改造的。例如，存在于生物(包括病毒)中的天然的多肽或多核苷酸序列，可分离自天然来源，并且还没有在实验室被有意修饰或以其它方式修饰。
在本申请中，术语“经过改造的”通常指通过人工手段对天然的分子等加以改变。改变的方式可以是对所述分子进行修饰、突变、合成等。“经过改造的”可以区别于天然存在的。例如：如果细胞或生物体经操作使得其基因信息改变(例如引入先前不存在的新基因材 料，例如通过转型、匹配、体细胞杂交、转染、转导或其它机制，或改变或移除先前存在的基因材料，例如通过取代或缺失突变)，那么其被视为“经过改造的”。
在本申请中，术语“大聚合酶蛋白L”可以与“L蛋白”互换使用，通常指水疱性口炎病毒RNA聚合酶蛋白。VSV L基因编码RNA poly E蛋白，L蛋白涉及起始、延伸、甲基化、戴帽、聚A尾形成等过程。
在本申请中，术语“核衣壳蛋白N”可以与“N蛋白”互换使用，通常指水疱性口炎病毒核蛋白。N蛋白可有效保护病毒RNA免受各种核酸酶的消化。N蛋白呈群特异性，为许多型和亚型所共有，有高的抗原性，可以刺激机体产生非中和抗体。
在本申请中，术语“磷蛋白P”又称“P蛋白”，通常指水疱性口炎病毒磷酸蛋白。P基因呈高度不一的磷酸化。P、L、N蛋白-RNA复合物对转录酶活性的发挥是必需的。
在本申请中，术语“基质蛋白M”可以与“M蛋白”互换使用，通常指水疱性口炎病毒基质蛋白。基质蛋白M是VSV重要的毒力因子，也是水疱性口炎病毒中已知可干扰小鼠天然免疫应答的蛋白。
在本申请中，术语“糖蛋白G”可以与“G蛋白”互换使用，通常指水疱性口炎病毒的糖蛋白。
在本申请中，术语“M51R”指的是第51位甲硫氨酸M突变为精氨酸R；术语“ΔL111”指的是第111位亮氨酸缺失。
在本申请中，术语“突变”通常是指野生型分子的核苷酸或氨基酸序列中的变化，例如，野生型CTLA4细胞外结构域的DNA和/或氨基酸序列中的变化。DNA中的突变可以改变密码子，从而导致氨基酸序列中的变化。DNA变化可以包括置换、缺失、插入、可变剪接或截短。氨基酸变化可以包括置换、缺失、插入、添加、截短、或蛋白质的加工或切割错误。可替代地，核苷酸序列中的突变可以导致如本领域充分理解的氨基酸序列中的沉默突变。在那点上，某些核苷酸密码子编码相同的氨基酸。例子包括编码氨基酸精氨酸(R)的核苷酸密码子CGU、CGG、CGC和CGA；或编码氨基酸天冬氨酸(D)的密码子GAU和GAC。因此，蛋白质可以由在其具体核苷酸序列方面不同，但仍编码具有相同序列的蛋白质分子的一种或多种核酸分子编码。
在本申请中，“单碱基编辑(BE)”通常指单碱基转换的基因编辑技术。该技术基于无核酸酶活性的dCas9或有单链DNA切口酶活性的Cas9n(Cas9 nickase)、胞嘧啶脱氨酶、尿嘧啶糖基化酶抑制子(UGI)以及sgRNA形成的复合体，在不引起双链DNA断裂的情况下，实现在一定的活性窗口内C到T到G到A的单碱基精准编辑。
在本申请中，术语“点突变”具有广义和狭义的概念。广义点突变可以是碱基替换、碱基插入或碱基缺失。狭义点突变也称单碱基改变，其可以是单碱基替换。碱基替换又可以分为转换和颠换。
同源重组在本申请中，术语“同源重组”通常指由两个基因组基因座共同拥有的保守区处的核苷酸序列交换。同源重组包括对称同源重组和不对称同源重组。不对称同源重组也称不等重组。
在本申请中，术语“自体细胞”通常指来源于一个个体，后来被重新引入同一个体的细胞。所述个体可以是人，也可以是动物。
在本申请中，术语“异体细胞”通常指来源于一个个体，然后被引入另一个个体的细胞。所述个体可以是人，也可以是动物。
在本申请中，术语“体外扩增”通常指在机体外部的环境下，给予一定的营养和刺激因子促使细胞增殖。
在本申请中，术语“转录”通常指产生起始核酸的核酸拷贝的过程。转录通常涉及DNA核酸的RNA拷贝的生成，并且有时还可以涉及起始RNA核酸的DNA拷贝的生成(例如，反转录)。
在本申请中，术语“翻译”涉及在核糖体处的过程，其中mRNA链控制氨基酸序列的组装以生成蛋白或肽。
在本申请中，术语“过表达”又称“超表达”或“过表达的”，通常指基因以高于正常细胞中基因表达水平的水平表达。
在本申请中，术语“基因编辑”通常指在所靶向的基因组DNA位点处或其附近指导或实现一个或多个核酸的改变(例如缺失)。
在本申请中，术语“类转录因子效应核酸酶”又称“TALEN”，通常指较宽泛的含义，包括可以在没有来自另一TALEN的辅助下切割双链DNA的单体TALEN。术语“TALEN”还指被工程化设计为一起起作用以在相同位点处切割DNA的一对TALEN的一个或两个成员。一起工作的TALENs可以指左TALEN和右TALEN，其涉及DNA或TALEN-对的手性。
已经报道了TAL的密码(PCT公开WO 2011/072246)，其中每个DNA结合重复序列负责识别DNA靶序列中的一个碱基对。残基可经组装，以靶向DNA序列。简而言之，确定TALEN结合的靶位点，创建包含核酸酶和识别靶位点的一系列RVD的融合分子。结合后，核酸酶切割DNA，以便细胞修复机构可以操作，以在切割端进行基因修饰。术语 TALEN指的是包含转录激活因子样(TAL)效应物结合结构域和核酸酶结构域的蛋白质，包括本身具有功能的单体TALEN以及需要与另一单体TALEN二聚化的其它TALEN。当两个单体TALEN相同时，二聚化可得到同型二聚体TALEN，或者，当两个单体TALEN不同时，二聚化可得到异型二聚体TALEN。已经表明，TALEN利用两个主要的真核DNA修复通路，非同源末端连接(NHEJ)和同源介导修复，在永生人类细胞中诱导基因修饰。TALEN通常成对使用，但也已知有单体TALEN。
采用TALEN或其它工具开展的基因修饰可以，例如，选自由插入，缺失，外源核酸片段的插入，和取代组成的组。一般来说，鉴定处DNA靶位点，并创建能够与该位点特异性结合的TALEN对。例如，作为蛋白质、mRNA，或通过编码TALEN的载体，将TALEN递送到细胞或胚胎内。TALEN切割DNA以形成双链断裂，然后对该双链断裂进行修复，这通常导致形成插入缺失，或并入在伴随的外源核酸中所包含的序列或多态性，该外源核酸被插入到染色体中，或起到使用经修饰的序列修复断裂的模板的作用。这种模板驱动的修复是改变染色体的有用的方法，为细胞染色体提供有效的改变。
在本申请中，术语“锌指核酸酶”又称“ZFN”，通常指通过锌指DNA-结合结构域与DNA-切割结构域融合产生的人工限制酶。锌指结构域可以经工程改造，以靶向期望的DNA序列，这样使锌指核酸酶能够靶向复杂基因组内的唯一序列。利用内源DNA修复机构，这些试剂可用于改变高级有机体的基因组。在某些实施方案中，ZFN可在基因失活方法中使用。
锌指DNA结合结构域具有大约30个氨基酸，并折叠成稳定的结构。每个锌指主要与DNA底物内的三联体结合。关键位置处的氨基酸残基有助于与DNA位点的大多数序列特异性相互作用。这些氨基酸可以发生改变，同时使剩余氨基酸保持必要的结构。通过几个结构域串联，可以与更长的DNA序列结合。其它功能，如非特异性FokⅠ切割结构域(N)、转录激活因子结构域(A)、转录抑制因子结构域(R)和甲基酶(M)可以与ZFP融合，以分别形成ZFN、锌指转录激活因子(ZFA)、锌指转录抑制因子(ZFR)和锌指甲基酶(ZFM)。采用锌指锌指核酸酶制造基因修饰的动物的材料和方法在，例如，专利US8106255；US2012/0192298；US2011/0023159和US2011/0281306中进行了公开。
在本申请中，术语“敲除”通常指一种或多种基因的基因表达被清除。
在本申请中，术语“试剂盒”通常是指所述组分的集合，所述组分可或可不包装，可或可不包装在一起。试剂盒的组分可包含在分开的容器中(即具有分开部分的试剂盒)，可在单个容器内提供，可不放置在容器内。另外，试剂盒可以包含实施所述方法的说明书。说明 书可通过纸或电子形式的用户手册提供。例如，手册可包含用于解释当使用本申请的试剂盒实施上述方法时得到的结果的说明。
在本申请中，术语“工具”通常指能够制备目的分子所需要的元件、组分、试剂、分子等。
在本申请中，术语“受试者”通常是指需要诊断、预后、改善、预防和/或治疗疾病的人或非人动物(包括哺乳动物)，特别是需要所述溶瘤病毒表达载体的受试者。在一些实施方式中，所述受试者可以包括癌症患者。在某些实施方式中，所述受试者是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物可以以包括任何除人之外的哺乳动物物种，例如家畜动物(例如，牛、猪、羊、鸡、兔或马)，或啮齿类动物(例如，大鼠和小鼠)，或灵长类动物(例如，大猩猩和猴子)，或家养动物(例如，狗和猫)。“受试者”可以是雄性或者雌性，也可以是不同年龄阶段。人类“受试者”可以是高加索人、非洲人、亚洲人、闪族人，或其他种族，或各种族的杂合体。人类“受试者”可以是老年、成年、青少年、儿童或者婴儿。
在本申请中，术语“药物组合物”通常指以允许活性成分的生物学活性有效的形式的制剂，并且其不含有对所述制剂待施用的受试者有不可接受的毒性的另外成分。在某些实施方案中，这些制剂可以包含药物的活性组分以及药学上可接受的载剂。在某些实施方式中，所述药物组合物包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中的药物组合物。药物组合物可以通过不同方式给药，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。
在本申请中，术语“药学上可接受”通常是指在合理医学判断的范围内，适宜用于与人和动物的组织接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应或者其他问题或并发症，具有合理的收益/风险比的佐剂。在一些实施方式中，药学上可接受的佐剂可以指由管理机构批准(如美国食品药品管理局、中国食品药品管理局或欧洲药品局)或者列于普遍认可的药典中(如美国药典、中国药典或欧洲药典)的用于动物(更特别地用于人)的那些佐剂。在本申请中，药学上可接受的佐剂可以是基于铝的佐剂、矿物盐佐剂、张力活性佐剂、细菌来源的佐剂、乳化佐剂、脂质体佐剂、细胞因子佐剂、糖类佐剂和DNA和RNA寡聚体佐剂及其他。
在本申请中，术语“有效量”或“有效剂量”可互换使用，通常指足够获得或至少部分获得预期疗效的量。术语“治疗有效量”通常是指在一个已经患病的受试者中足够治愈或至少部分阻止该病及其并发症的量。对于这种用途有效的量将依赖于感染的严重程度和病人自身免疫系统的整体状态。
在本申请中，术语“联用”又称“共同施用”，通常指在另一个药物成分之前，或之后，或同时给药。联用的两个或多个药物成分可以是通过相同的给药方式给药，也可以是通过不同给药方式给药，可以是同时施用，也可以是先后施用。例如，联用的一种治疗剂可以是所述溶瘤病毒，第二种治疗剂可以是所述经修饰的免疫效应细胞。联用也可以包含第三种甚至更多种治疗剂。
在本申请中，术语“治疗”通常指消除或改善疾病，或与疾病相关的一种或多种症状。在某些实施方案中，治疗通常指向患有这种疾病的患者施用一种或多种药物使得疾病消除或缓解。在某些实施方案中，“治疗”可以是在特定疾病的症状发作后，在其他药物存在或不存在的情况下施用所述组合物。
在本申请中，术语“载剂”通常指药物制剂中除了活性组分以外，对受试者无毒的组分。在某些实施方案中，本申请的组合物、药物组合物或试剂盒中的药学上可接受的载剂可以包括但不限于，例如，药学可接受的液体、凝胶或固体载剂、水相介质(例如，氯化钠注射液、林格氏液注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、葡萄糖或乳酸林格注射液)、非水相介质(例如，植物来源的不挥发性油、棉花子油、玉米油、芝麻油或者花生油)、抗微生物物质、等渗物质(例如，氯化钠或葡萄糖)、缓冲液(例如，磷酸盐或枸橼酸盐缓冲液)、抗氧化剂(例如，硫酸氢钠)、麻醉剂(例如，盐酸普鲁卡因)、悬浮剂/分散剂(例如，羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮)、螯合剂(例如，EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸))、乳化剂(例如，聚山梨醇酯80(吐温-80))、稀释剂、佐剂、辅料、无毒辅助物质、其他本领域公知的组分或以上的多种组合。适用的组分可包括，例如，填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、搅味剂、增稠剂、着色剂或乳化剂。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指任何新的病理性的组织增生。肿瘤可能是良性的，如血管瘤、胶质瘤、畸胎瘤等，也可能是恶性的，如腺癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等。用于研究时，可通过本领域技术人员熟知的方法从易于获得的资源中将这些组织分离出来。
在本申请中，术语“Cas9”或“Cas9分子”是指来自细菌II型CRISPR/Cas系统的负责DNA切割的酶。Cas9还包括野生型蛋白质及其功能性和非功能性突变体。在某些实施方案中，Cas9可以为酿脓链球菌的Cas9。
在本申请中，术语“CTLA-4”又称细胞毒性T淋巴细胞抗原-4，通常指属于CD28家族的免疫抑制受体。CTLA-4在体内专门表达于T细胞上，并结合两种配体，CD80和CD86 (也分别称为B7-1和B7-2)。完整hCTLA-4序列可见于GenBank登录号AAB59385下。例如，人CTLA-4的氨基酸序列可如SEQ ID NO:12所示。
术语“LAG-3”也称“CD223”，通常指淋巴细胞活化基因3。术语“人类LAG-3”指人类序列LAG-3，如具有Genbank登录号NP_002277的人类LAG-3的完整氨基酸序列。
在本申请中，术语“PD-1”通常是指程序性细胞死亡1，也称为“程序性死亡1”、“CD279”、“分化簇279”、“PD1”、“PDCD1”。PD-1通常在T细胞、B细胞、自然杀伤T细胞、活化的单核细胞和树突细胞(DC)上表达，并参与细胞凋亡。PD-1通常包含一个细胞外IgV结构域，跨膜区和胞内结构域。PD-1可结合两种配体，PD-L1和PD-L2。人PD-1氨基酸序列可见于GenBank登录号NP_005009.2下。例如，人PD-1氨基酸序列可如SEQ ID NO:11所示。
在本申请中，术语“PD-L1”通常指程序性死亡配体1，又称为分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)。PD-L1是PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一。PD-1受体/PD-L1配体复合物可以下调T细胞活化和细胞因子分泌。完整hPD-L1序列可见于GenBank登录号Q9NZQ7下。
在本申请中，术语“TIGIT”通常指具有Ig和ITIM域的T细胞免疫受体。其可以来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然TIGIT。TIGIT在本领域也称作DKFZp667A205，FLJ39873，含有V集和免疫球蛋白域的蛋白9，含有V集和跨膜域的蛋白3，VSIG9，VSTM3，和WUCAM。一种人TIGIT的氨基酸序列可以见UniProt登录号Q495A1。
在本申请中，术语“TIM-3”通常指含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的分子3。TIM-3的天然配体是半乳糖凝集素9(Gal9)。
在本申请中，术语“BTLA”通常指B和T淋巴细胞衰减剂。在具体实施方式中，BTLA可以为人BTLA。
在本申请中，术语“VISTA”通常指T细胞活化V结构域Ig抑制蛋白。在某些实施方式中，VISTA可以为人VISTA，其通常指具有人氨基酸序列的VISTA蛋白。其氨基酸序列可见于GenBank登录号NP_071436下。
发明详述
组合物中的溶瘤病毒
在本申请中，所述溶瘤病毒可以从目前鉴定的任何病毒成员获得。与非分裂细胞相比，所述溶瘤病毒在分裂细胞中具有更高的复制并具有杀灭细胞的倾向性。本申请所述溶瘤病毒 包括具有溶瘤作用的经改造的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒，其包括但不限于：水疱性口炎病毒、痘病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒、马拉巴病毒，α病毒、慢病毒、流感病毒、Sinbis病毒、粘液瘤病毒、弹状病毒、小核糖核酸病毒、细小病毒等。
在某些实施方案中，所述溶瘤病毒也可以是衍生自例如单纯疱疹病毒、牛痘病毒、水疱性口炎病毒、自主细小病毒、粘液瘤病毒、新城疫病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、麻疹病毒、逆转录病毒、流感病毒、辛德比斯病毒或痘病毒。其中“衍生自”参考病毒的溶瘤病毒包含所述参考病毒拥有的核酸序列或氨基酸序列。在某些实施方案中，“衍生自”参考病毒的溶瘤病毒包含所述参考病毒拥有的一个或多个基因。在某些实施方案中，“衍生自”参考病毒的溶瘤病毒编码所述参考病毒编码的一种或多种蛋白质。
在某些实施方案中，衍生自参考病毒的溶瘤病毒可包含编码所述参考病毒的一个或多个功能元件的核酸序列。“功能元件”可以是例如转录调节子(例如启动子/增强子)、转录后加工的调节子、翻译调节子、转录后加工的调节子、响应元件、重复序列或病毒蛋白。
所述溶瘤病毒可以是天然的溶瘤病毒，也可以是经过改造的溶瘤病毒。其中所述经过改造的溶瘤病毒可以是经过基因水平改造的溶瘤病毒，如经过一个或多个基因的修饰来改造，从而提高其肿瘤选择性和/或在分裂细胞中优先复制。所述基因水平的改造可以为修饰参与DNA复制、核酸代谢、宿主向性、表面附着、毒力、裂解和扩散过程的基因，也可以为整合外源基因的改造，所述外源基因包括外源免疫调节基因、外源筛选基因、外源报告基因等。所述经过改造的溶瘤病毒也可以是经过氨基酸水平改造的溶瘤病毒，如一个或多个氨基酸的插入、缺失、替换。所述经过改造的溶瘤病毒也可以是蛋白表达水平和活性与野生型相比发生改变的溶瘤病毒。
在某些实施方案中，本申请的溶瘤病毒选自水疱性口炎病毒(VSV)，水疱性口炎病毒是一种原型非节段负链RNA病毒，其大小11kb基因组编码5种蛋白：核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大聚合酶蛋白(L)。具体地，例如，所述水疱性口炎病毒可以为水疱性口炎病毒印第安纳株，VSV MuddSummer亚型，其编码M蛋白的基因序列如SEQ ID NO：3所示，M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在某些实施方案中，所述M蛋白可以为天然的未经修饰的，可以为天然突变的，也可以为人工改造发生突变的。
例如，VSV可以为野生型，未经修饰。
例如，VSV M蛋白可以进行如下修饰：M51R。
例如，VSV M蛋白可以进行如下修饰：M51R且ΔL111。
例如，VSV M蛋白可以进行如下修饰：M51R、V221F且S226R。
例如，VSV M蛋白可以进行如下修饰：M51R、ΔL111、V221F且S226R。
在某些实施方案中，编码VSV M蛋白(M51R、V221F且S226R)的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，VSV M蛋白(M51R、V221F且S226R)的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在某些实施方案中，编码VSV M蛋白(M51R、ΔL111、V221F且S226R)的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，VSV M蛋白(M51R、ΔL111、V221F且S226R)的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
在某些实施方案中，所述水疱性口炎病毒基质蛋白M的突变位点还可以为单个位点的突变，例如：ΔM51；M51A；ΔL111；V221F；S226R。
在某些实施方案中，所述水疱性口炎病毒基质蛋白M的突变位点还可以为多个位点的组合突变，例如：M51R且V221F；M51R且S226R；ΔL111且V221F；ΔL111且S226R；V221F且S226R；M51R、ΔL111且V221F；M51R、ΔL111且S226R；ΔL111、V221F且S226R。
在某些实施方案中，所述水疱性口炎病毒基质蛋白M的突变位点还可以为连续位点的突变，例如：M51-54A；ΔM51-54；ΔM51-57。
在某些实施方案中，所述水疱性口炎病毒基质蛋白M的突变位点还可以为连续位点和单个位点突变的组合，例如：M51-54A、V221F且S226R；ΔM51-54、V221F且S226R；ΔM51-57、V221F且S226R。
组合物中的经修饰的免疫效应细胞
免疫效应细胞通常是指参与免疫应答，行使效应功能的免疫细胞。本申请所述的免疫效应细胞可以为已知的各种类型的免疫效应细胞，并且可以通过常规的生物学方法得到，其包括但不限于：淋巴细胞，如T细胞、B细胞、NK细胞；骨髓细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞、嗜中性粒细胞和树突状细胞。
在某些实施方案中，所述T细胞包括但不限于：辅助CD4+T细胞、调节CD4+T细胞、杀手CD8+T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、粘膜相关恒定T细胞、γδT细胞。
例如，所述T细胞可以为人外周血T细胞。
在本申请中，所述免疫效应细胞可以为自体细胞，也可以为异体细胞。所述免疫效应细 胞可以为经体外扩增得到的免疫效应细胞。免疫效应细胞的大规模体外扩增培养技术是已知的。
在本申请中，所述免疫检查点可以包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、BTLA、VISTA、TIGIT、B7-H2、B7-H3、B7-H4和B7-H6。
在某些实施方案中，所述免疫检查点表达量和/或活性的调整可以包括一个免疫检查点的调整，例如：PD-1的调整、PD-L1的调整、CTLA-4的调整、LAG-3的调整、TIM-3的调整、BTLA的调整、VISTA的调整、TIGIT的调整、B7-H2的调整、B7-H3的调整、B7-H4的调整和B7-H6的调整。
在某些实施方案中，所述免疫检查点表达量和/或活性的调整可以包括两个至多个免疫检查点的组合的调整，例如：PD-1和PD-L1；PD-1和CTLA-4；PD-1和LAG3；PD-L1和CTLA-4；LAG-3和CTLA-4；TIM-3和CTLA-4；VISTA和CTLA-4；PD-1、CTLA-4和PD-L1。
在某些实施方案中，其中所述免疫检查点表达量的调整包含与未经修饰的免疫效应细胞相比，所述免疫检查点表达量的上调、下调和/或缺失。
在某些实施方案中，其中所述免疫检查点活性的调整包含与未经修饰的免疫效应细胞相比，所述免疫检查点活性的增加、降低和/或缺失。
在某些实施方案中，其中所述免疫检查点表达量和/或活性的调整可以为所述免疫检查点表达量和/或活性的上调、下调或缺失；也可以为其中一个以上调整的免疫检查点表达量和/或活性的上调以及其余调整的免疫检查点的表达量和/或活性的下调和/或缺失。例如：PD-1的表达量和/或活性的上调和CTLA-4表达量和/或活性的下调，PD-L1的表达量和/或活性的上调、CTLA4的表达量和/或活性的下调和LAG-3的表达量和/或活性的缺失。
在本申请中，所述免疫检查点的调整包含免疫检查点基因水平、转录水平和/或翻译水平的调控。
在某些实施方案中，可以使用其中一种方法来进行调控，也可以使用两种以上方法来进行调控。
在某些实施方案中，所述基因水平的调控方法包括例如：基因编辑、过表达、点突变、同源重组。所述基因编辑方法包括例如：CRISPR/Cas9、类转录激活因子效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和单碱基编辑(BE)。
在一个实施方案中，所述免疫检查点的调整为T细胞的PD-1分子的表达被降低，具体方法为使用CRISPR/Cas9基因编辑技术对人外周血T细胞的PDCD1基因进行敲除，降低PD-1分子的表达。
在某些实施方案中，所述CRISPR/Cas9基因编辑技术可以包含设计序列的sgRNA。所述sgRNA可以与Cas9蛋白结合识别剪辑目的基因。
在某些实施方案中，所述免疫效应细胞敲除针对选自SEQ ID NO：1的PD-1基因的靶序列。
在某些实施方案中，所述免疫效应细胞敲除针对选自SEQ ID NO：2的CTLA-4基因的靶序列。
组合物、药物组合物和试剂盒
在本申请中，提供了一种组合物，其包含：(a)所述溶瘤病毒；以及(b)所述经修饰的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的免疫效应细胞相比，其免疫检查点的表达量和/或活性被调整。
在本申请中，所述组合物可以包含经改造的溶瘤病毒和经修饰的免疫细胞，例如，所述经改造的溶瘤病毒包含经改造的VSV，所述VSV的基质蛋白M与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相比，包含M51R，V221F和S226R的氨基酸突变，且所述经修饰的免疫细胞包含PD-1基因敲除的T细胞。在某个实施方式中，在所述组合物中，所述经改造的溶瘤病毒的基质蛋白M包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，且所述经修饰的免疫细胞包含PD-1基因敲除的T细胞。
在本申请中，所述组合物可以包含经改造的溶瘤病毒和经修饰的免疫细胞，例如，所述经改造的溶瘤病毒包含经改造的VSV，所述VSV的基质蛋白M与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相比，包含M51R，ΔL111，V221F和S226R的氨基酸突变，且所述经修饰的免疫细胞包含PD-1基因敲除的T细胞。在某个实施方式中，在所述组合物中，所述经改造的溶瘤病毒的基质蛋白M包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，且所述经修饰的免疫细胞包含PD-1基因敲除的T细胞。
在本申请中，还提供了一种药物组合物，其包含：(a)所述的至少一种溶瘤病毒和/或药学上可接受的载剂；以及(b)所述的至少一种经修饰的免疫效应细胞和/或药学上可接受的载剂。
在本申请中，还提供了一种试剂盒，其包含选自下组中的一种或多种：(a)所述的至少一种溶瘤病毒和制备所述的至少一种修饰的免疫效应细胞的工具，和/或药学上可接受的载剂；(b)所述的至少一种修饰的免疫效应细胞和制备所述的至少一种溶瘤病毒的工具，和/或药学上可接受的载剂；以及，(c)制备所述的至少一种溶瘤病毒的工具和制备所述的至少一种修饰的免疫效应细胞的工具和药学上可接受的载剂。
在某些实施方案中，所述试剂盒中制备所述的至少一种修饰的免疫效应细胞的工具指的是任何个体可以通过使用该所述工具获得所述修饰的免疫效应细胞，例如获得PD-1分子敲除的T细胞使用的设计序列的sgRNA。所述试剂盒中制备所述的至少一种溶瘤病毒的工具指的是任何个体可以通过使用该所述工具获得所述溶瘤病毒。例如质粒、各突变位点的引物。
在某些实施方案中，所述组合物、药物组合物和试剂盒可以被配制成用于临床用途的药物，并且可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。所述组合物、药物组合物和试剂盒可以被配制用于局部、肠胃外、全身、腔内、静脉内、动脉内、肌肉内、鞘内、眼内、结膜内、瘤内、皮下、皮内、鞘内、口服或透皮给药途径，其可包括注射或输注。合适的制剂可以在无菌或等渗培养基中包含病毒和/或细胞。组合物、药物组合物和试剂盒还可以配制成流体，包括凝胶形式。可配制流体制剂用于通过注射或输注(例如通过导管)施用于人体或动物体的选定区域。
方法、应用、用途
在本申请中，提供了所述组合物、所述药物组合物、所述试剂盒的制备方法。
在某些实施方式中，所述组合物、所述药物组合物、所述试剂盒中的各组分可以在同一个容器内，也可以放置在不同容器内。
在某些实施方案中，所述溶瘤病毒可以被配制用于肿瘤内施用。
在某些实施方案中，所述溶瘤病毒和所述免疫效应细胞可以被配制用于静脉内给药。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞可以被配制用于局部给药。
在本申请中，还提供了一种治疗肿瘤的方法，其包含向有需要的受试者施用所述的组合物、所述的药物组合物和/或所述的试剂盒。
在某些实施方式中，可以向有需要的受试者施用所述组合物、所述药物组合物和所述试剂盒中的一种或多种。
在某些实施方式中，所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫细胞同时施用。同时施用可以是各组分混合在一起施用，也可以是分开施用。可以以相同方式施用，例如施用于同一条静脉或其他血管，也可以是不同方式施用，例如静脉内施用和瘤内施用同时进行。
在某些实施方式中，所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫细胞先后施用。施用的顺序可以是先施用所述溶瘤病毒，再施用所述免疫效应细胞；也可以是先施用所述免疫效应细胞，再施用所述溶瘤病毒。可以以相同方式施用，也可以以不同方式施用。各组分可以一次施用，也可以分多次施用。在某些实施方案中，先后施用可以是以任何时间间隔施用，包括分钟、小时、天、周、月或年。在某些实施方案中，先后施用是指以至少2分钟、5分钟、10分钟、 30分钟、1小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、6周、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月之一的时间间隔分开的施用。
在某些实施方案中，施用的剂量为治疗有效量。
在本申请中，还提供了所述溶瘤病毒在所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫效应细胞的联用中的应用。即用于所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫联合应用的所述溶瘤病毒。
在本申请中，还提供了所述经修饰的免疫效应细胞在所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫细胞联用中的应用。即用于所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫联合应用的所述经修饰的免疫细胞。
另一方面，本申请还提供了所述组合物、所述药物组合物、所述试剂盒在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
另一方面，本申请还提供了所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫效应细胞，其用于治疗肿瘤。
在某些实施方案中，所述肿瘤包含实体瘤和/或血液瘤。
在某些实施方案中，所述肿瘤包括但不限于：头颈部癌、黑色素瘤、软组织肉瘤、乳腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、宫颈癌、神经母细胞瘤、滑膜肉瘤和圆细胞型脂肪肉瘤。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的各个技术方案，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1：水疱性口炎病毒突变株的构建及效果展示
1、按表1的方式，对所述水疱性口炎病毒印第安纳株基质蛋白M进行定点突变，获得3组突变后的突变株。未进行基因突变的组别编号为：JBS000，作为对照。
表1：各组突变情况展示表
突变株的具体构建方法为本领域的常规技术，方法如下：
(1)构建质粒。以pVSV-XN2质粒为模板，利用PCR方法引入如表1所述的不同的突变位点。将质粒与各突变位点的引物共同进行PCR，再将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，随后通过凝胶回收试剂盒进行割胶回收，获得M基质蛋白不同突变的质粒。
(2)病毒拯救。按MOI＝5，用表达T7RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3感染接种BHK-21细胞，感染1h后，使用DPBS缓冲液漂洗一次BHK-21细胞。随后制备质粒转染预混液，具体包括：pBS-N、pBS-P、pBS-L、步骤(1)制备的突变质粒。其中pBS-N、pBS-P、pBS-L分别指克隆了VSV N、VSV P、VSV L蛋白基因的表达质粒，分别表达病毒挽救所需的N、P和L蛋白。按lipofectamine 2000使用说明书所述的方法进行质粒转染，4h后更换新鲜的含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，48h后吸取上清，用0.22μm的滤膜去除痘病毒。将滤液加入到新鲜的BHK-21细胞中；每天观察细胞病变情况，待细胞出现病变情况时收取上清，经RTPCR鉴定确认成功后，用病毒空斑实验纯化病毒。即获得突变株。
(3)M蛋白基因测序。利用Trizol试剂盒抽提病毒基因组RNA，用随机引物进行逆转录反应，用针对M蛋白基因序列设计的引物对逆转录出来的cDNA进行PCR。引物序列为：5'-AAAAAAGTAACAGATATCAC-3'(SEQ ID NO:9)；5'-ACATTTTTCCAGTTTCCTTTTTGG-3'(SEQ ID NO:10)。产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收，并送往测序公司进行测序。
2、不同突变株对细胞的体外侵染能力展示。
不同突变株对细胞的体外侵染能力展示。分别在MEF细胞(人的成纤维细胞)培养液、LLC细胞(鼠源非小细胞肺癌细胞)培养液中，分别加入JBS000、JBS001、JBS002、JBS003、JBS004各200pfu，检测各组突变株产生的半数组织培养感染剂量(Tissue culture infective dose,TCID50)。具体测试方法为：
(1)在6孔培养板中每孔加入细胞悬液3mL，使细胞量达到4×10
5个/孔，共6个孔，37℃、5％CO2条件下培养16h。
(2)在各孔中分别加入病毒JBS000、JBS001、JBS002、JBS003、JBS004各200pfu，设正常细胞对照2个孔。在24h时，取细胞上清100μL。
(3)在96孔培养板中，每孔加入Vero细胞悬液100μL，使细胞量达到1×10
4个/mL，37℃、5％CO
2条件下培养16h。
(4)在1.5mLEP管中将步骤(2)中收获的上清作连续10倍的稀释，10
-1～10
-11，共11个滴度。
(5)将稀释好的上清接种到步骤(3)的96孔培养板中，每一稀释度接种一列(共8孔)，每孔接种100μL。设正常细胞对照组一列。
(6)48h后观察每孔细胞荧光情况，有荧光则记为此孔被感染。
(7)按Karber法计算TCID50。
结果如图1所示，结果显示：VSV突变株在体外肺癌细胞(LLC)中的复制扩增能力显著提高，而在正常的成纤维细胞(MEF)内的复制感染能力均显著下降。因此：突变株对肿瘤细胞具有特异性侵染能力。
3、不同突变株对细胞的体外杀伤能力展示。使用等量各突变株分别体外感染不同细胞，24h后MTT法检测细胞活力。具体方法如下：
(1)在96孔培养板中每孔加入细胞悬液100μL，使细胞量达到1×10
4个/孔，37℃，5％CO
2条件下培养16h。测试的细胞种类为：LLC、MEF、Hela(人肿瘤细胞)。
(2)分别将JBS000、JBS001、JBS002、JBS003、JBS004稀释到MOI(multiplicity of infection，感染复数)分别为0.001、0.01、0.1、1.0，每一稀释梯度接种4个孔，每孔接种100μL，在37℃，5％CO
2条件下培养40h。
(3)弃去96孔培养板中的上清，加入新鲜的DMED培养基，再加入5mg/mL的MTT溶液，20μL/孔。在37℃，5％CO
2条件下培养4h。
(4)将96孔板离心，设置转速2500g/min，室温离心5分钟。随后使用1mL一次性无菌注射器，轻轻吸掉上清。
(5)再向每孔中加入DMSO，100μL/孔，37℃放置10分钟。
(6)使用多功能酶标仪，震荡2分钟，在570nm波长下，测定各孔的OD值。
结果如图2所示，结果显示：所有突变株都展现了良好的肿瘤细胞杀伤的能力，除JBS000外，均对MEF细胞无显著的杀伤。即体外状态下，除JBS000外，各减毒株均对肿瘤细胞具 有特异性杀伤，对正常细胞无显著影响。
4、不同突变株在细胞内清除难易度测试
以IFN-β指标进行测试。按上述步骤3的步骤(1)、(2)培养细胞并加入突变株。随后破碎各组细胞，用TRIzol(Invitrogen)从各细胞中提取总RNA，利用PrimeScript RT Reagent Kit with DNA Eraser(Takara)反转录试剂盒逆转录成cDNA，并用LightCycler 480SYBR Green I Master(Roche)染料进行染色，在LightCycler 480定量PCR仪上检测各个基因的Ct值。用ΔΔCt法计算目的基因IFN-β、VSV-G相对表达量。
结果如图3所示，结果显示：在LLC细胞系中，除JBS000外，所有突变株均可引起IFN-β表达水平的提高；而在MEF细胞中，所有病毒均可上调IFN-β的表达水平。
实施例2：CRISPR/Cas9技术敲除T细胞PD-1分子
1、PD-1-sgRNA-CRISPR/Cas9质粒构建
根据人PD-1分子编码基因PDCD1的结构，针对其第二外显子设计2条sgRNA，构建携带有识别人PDCD1基因的sgRNA及Cas9酶的融合质粒。融合质粒元件示例如图4所示。
2、人外周血T细胞表面表达PD-1分子检测
利用梯度离心分离新鲜的人外周血PBMC，取1×10
6个PBMC细胞流式检测T细胞表面PD-1分子的表达水平，结果显示人外周血T细胞表面表达PD-1分子，如图5所示，表明人外周血T细胞可以作为分析PDCD1基因敲除效果的工具细胞。
3、PD-1-sgRNA-CRISPR/Cas9系统下调人外周血T细胞表面PD-1分子的表达
将PD-1-sgRNA-CRISPR/Cas9质粒电转入新鲜分离的人外周血PBMC细胞，电转后的PBMC细胞用CD3和CD28抗体激活，并在37℃5％CO
2条件下培养，电转后24h和第8天分别取培养细胞检测T细胞表面PD-1分子的表达情况。
结果显示：电转后的24h的PDCD1基因敲除组细胞表面PD-1分子表达下调不明显，培养至第8天时敲除组相较于阴性对照组，细胞表面PD-1分子表达下调显著，如图5所示。表明使用CRISPR/Cas9技术敲低了PDCD1基因，且能使人外周血T细胞表面PD-1分子表达持续下调。图5中，未编辑组指的是未进行基因敲除组的细胞，编辑组指的是进行基因敲除组的细胞。
实施例3：CRISPR/Cas9技术敲除T细胞PD-1分子和CTLA-4分子
1、PD-1和CTLA-4双基因敲除载体的构建
根据人PD-1和CTLA-4基因的序列，设计gRNA序列。用BbsⅠ酶切pU6gRNA-CMV- Cas9-GFP表达载体，回收后与PD-1oligo序列形成的oligo双链连接，构建含有一个gRNA的PD-1基因敲除载体。
以pU6gRNA-CMV-Cas9表达载体为模板，用引物将表达载体线性化，断裂点位于gRNA和CMV启动子序列之间，并在两段添加HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点。然后以pU6gRNA-CMV-Cas9-GFP表达载体为模板，用引物克隆gRNA表达单元，并连入pUC19，然后通过BbsⅠ酶切连入CTLA-4oligo序列获得中间载体。用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切线性化的pU6gRNA-CMV-Cas9-GFP表达载体和中间载体，回收后将二者连接，获得可以表达两个不同target序列gRNA的敲除载体pU6gRNA-Cas9-GFP。
2、pU6gRNA-Cas9-GFP系统下调人外周血T细胞表面PD-1分子和CTLA-4的表达
将pU6gRNA-Cas9-GFP质粒电转入新鲜分离的人外周血T细胞，用CD3和CD28抗体激活，并在在37℃5％CO2条件下培养，电转后第8天取细胞进行流式检测T细胞表面PD-1和CTLA-4分子的表达情况。
结果显示：gRNA及Cas9融合电转质粒均使T细胞表面PD-1分子和CTLA-4分子表达下调，表明gRNA均能有效敲低T细胞中PD-1和CTLA-4基因的表达。
实施例4：经改造的VSV的体外肿瘤杀伤力检测
溶瘤病毒体外抗肿瘤实验展示。使用JBS003溶瘤病毒感染肿瘤细胞，48h后使用CCK8法检测肿瘤细胞的杀伤率。具体方法如下：
(1)在96孔培养板中每孔加入A549肿瘤细胞株(人非小细胞肺癌)悬液100μL，使细胞量达到4×10
3个/孔，37℃，5％CO
2条件下培养16h。
(2)将溶瘤病毒按感染复数(multiplicity of infection，MOI)稀释至0.001、0.01、0.1和1.0和10.0共五个梯度；每孔接种溶瘤病毒100μL，每一稀释梯度均接种4个复孔，在37℃，5％CO2条件下培养48h。
(3)弃去96孔培养板中的上清，加入新鲜的DMED培养基(100μL/孔)，再加入CCK8溶液(10μL/孔)。在37℃，5％CO2条件下培养4h。
(4)使用多功能酶标仪，震荡2分钟，在450nm波长下，测定各孔的OD值并计算肿瘤杀伤率。
(5)肿瘤杀伤率计算公式：肿瘤细胞杀伤率(％)＝(肿瘤细胞对照组OD值－实验组OD值)/肿瘤细胞对照组OD值×100％。
溶瘤病毒的体外抗肿瘤实验结果如图6所示，结果显示，溶瘤病毒具有一定的抗肿瘤能力。
实施例5：敲除PD-1分子的T细胞的体外肿瘤杀伤力检测
使用PD-1敲除的T细胞与肿瘤细胞混合培养48小时后，CCK8法检测PD-1敲除的T细胞对肿瘤细胞杀伤率。具体方法如下：
(1)在96孔培养板中每孔加入A549肿瘤细胞株(人非小细胞肺癌)悬液100μL，使细胞量达到4×10
3个/孔，37℃，5％CO
2条件下培养16h。
(2)将PD-1敲除的T细胞按效靶比(E:T)分别稀释至1:1、5:1、10:1和20:1共四个梯度；每孔接种PD-1敲除的T细胞100μL，每一稀释梯度均接种4个复孔，在37℃，5％CO2条件下培养48h。
(3)弃去96孔培养板中的上清和淋巴细胞，加入新鲜的DMED培养基(100μL/孔)，再加入CCK8溶液(10μL/孔)。在37℃，5％CO
2条件下培养4h。
(4)使用多功能酶标仪，震荡2分钟，在450nm波长下，测定各孔的OD值并计算肿瘤杀伤率。
(5)肿瘤杀伤率计算公式：肿瘤细胞杀伤率(％)＝(肿瘤细胞对照组OD值－实验组OD值)/肿瘤细胞对照组OD值×100％。
PD-1分子敲除的T细胞的体外抗肿瘤结果如图8的部分结果所示，结果显示，PD-1分子敲除的T细胞具有较好的抗肿瘤能力。
实施例6：经改造的VSV和敲除PD-1分子的T细胞联合治疗黑色素瘤(移植瘤)的肿瘤杀伤力检测
选择差异不显著的96只C57BL/6小鼠，分别皮下接种2×10
6个B16-F10-NY-ESO-1黑色素瘤细胞。接种第9天，待移植瘤体积长至100mm
3左右时，将所有小鼠分为12组：对照组(PBS组)瘤内注射50μL PBS，其余11组为治疗组，分别进行瘤内接种JBS000、JBS001、JBS002、JBS003、JBS004、敲除PD-1的T细胞、JBS000和敲除PD-1的T细胞、JBS001和敲除PD-1的T细胞、JBS002和敲除PD-1的T细胞、JBS003和敲除PD-1的T细胞、JBS004和敲除PD-1的T细胞。每2天给药1次，共给药3次，单次接种量均为10
8pfu/只。自开始给药至实验终点，每2天记录一次移植瘤体积，体积(mm
3)＝(长径×短径
2)/2。
结果显示：与对照组相比，各治疗组对黑色素瘤均有一定的治疗效果。
实施例7：经改造的VSV和敲除PD-1分子的T细胞联合治疗纤维肉瘤(移植瘤)的肿瘤杀伤力检测
选择差异不显著的96只C57BL/6小鼠，分别皮下接种2×10
6个MCA-205-NY-ESO-1纤 维肉瘤细胞。接种第9天，待移植瘤体积长至100mm
3左右时，将所有小鼠分为12组：对照组(PBS组)瘤内注射50μL PBS，其余11组为治疗组，分别进行瘤内接种JBS000、JBS001、JBS002、JBS003、JBS004、敲除PD-1的T细胞、JBS000和敲除PD-1的T细胞、JBS001和敲除PD-1的T细胞、JBS002和敲除PD-1的T细胞、JBS003和敲除PD-1的T细胞、JBS004和敲除PD-1的T细胞。每2天给药1次，共给药3次，单次接种量均为10
8pfu/只。自开始给药至实验终点，每2天记录一次移植瘤体积，体积(mm
3)＝(长径×短径
2)/2。
结果显示：与对照组相比，各治疗组对纤维肉瘤均有一定的治疗效果。
实施例8：经改造的VSV和敲除PD-1分子及CTLA-4分子的T细胞联合治疗黑色素瘤(移植瘤)的肿瘤杀伤力检测
按照实施例5的方法对小鼠进行处理，皮下接种2×10
6个B16-F10-NY-ESO-1黑色素瘤细胞。待移植瘤体积长至100mm
3左右时进行处理。将所有小鼠分为10组：对照组(PBS组)瘤内注射50μL PBS，其余9组为治疗组，分别进行瘤内接种JBS000、JBS001、JBS002、JBS003、JBS004、敲除PD-1及CTLA-4的T细胞、JBS000和敲除PD-1及CTLA-4的T细胞、JBS001和敲除PD-1及CTLA-4的T细胞、JBS002和敲除PD-1及CTLA-4的T细胞、JBS003和敲除PD-1及CTLA-4的T细胞、JBS004和敲除PD-1及CTLA-4的T细胞。每组8只动物，每2天给药1次，共给药3次，单次接种量均为10
8pfu/只。自开始给药至实验终点，每2天记录一次移植瘤体积。
结果显示：与对照组相比，各治疗组对黑色素瘤均有一定的治疗效果。
实施例9：经改造的VSV和敲除PD-1分子及CTLA-4分子的T细胞联合治疗纤维肉瘤(移植瘤)的肿瘤杀伤力检测
按照实施例5的方法对小鼠进行处理，皮下接种2×10
6个MCA-205-NY-ESO-1纤维肉瘤细胞。待移植瘤体积长至100mm
3左右时进行处理。将所有小鼠分为12组：对照组(PBS组)瘤内注射50μL PBS，其余11组为治疗组，分别进行瘤内接种JBS000、JBS001、JBS002、JBS003、JBS004、敲除PD-1及CTLA-4的T细胞、JBS000和敲除PD-1及CTLA-4的T细胞、JBS001和敲除PD-1及CTLA-4的T细胞、JBS002和敲除PD-1及CTLA-4的T细胞、JBS003和敲除PD-1及CTLA-4的T细胞、JBS004和敲除PD-1及CTLA-4的T细胞。每组8只动物，每2天给药1次，共给药3次，单次接种量均为10
8pfu/只。自开始给药至实验终点，每2天记录一次移植瘤体积。
结果显示：与对照组相比，各治疗组对纤维肉瘤均有一定的治疗效果。
实施例10：经改造的VSV和敲除PD-1分子T细胞联合治疗的效果评估
选择经评估合格的受试者数人，分为2组，采取不同先后顺序给药，给药策略如图7所示，VSV-OVV-01表示的是本申请中经改造的溶瘤病毒，具体给药策略如下：
A组(先用敲除PD-1分子的T细胞，图7A)：敲除PD-1分子的T细胞从第1周第1天(W1D1，W表示周，D表示天)开始用固定剂量(总量3.6×10
9～4.4×10
9或1.8×10
9～2.2×10
9细胞数)给药，分别以总剂量的20％、30％、50％的方式分3次，每次间隔1天给药，从W1D1开始，每4周为一个周期，如未发生：疾病进展、出现不可耐受的毒性反应、死亡、退出研究、失访、申办方终止研究或受试者开始新的肿瘤治疗，则连续用药4个周期；VSV-OVV-01采用固定剂量，即第一阶段的临床有效剂量或最高剂量，从W2D1开始给药，每2周1次，如未发生：疾病进展、出现不可耐受的毒性反应、死亡、退出研究、失访、申办方终止研究或受试者开始新的肿瘤治疗，则连续用药8次。自开始给药至实验终点，需定期进行安全性随访以及疗效随访，时间点如下：
安全性随访
在基线、每次用药前7天内(W2D1、W4D1、W5D1、W6D1、W8D1、W9D1、W10D1、W12D1、W13D1、W14D1和W16D1)各进行一次；同时在每次疗效访视时(基线、W6D7、W12D7和W20D7)各进行一次；其中基线、W13D1与W12D7为同一时间点，因此，共进行安全性访视13次。
疗效随访
基线、W6D7、W12D7和W20D7各进行1次，时间窗为-7d。
(A.先用敲除PD-1分子的T细胞，B.先用VSV-OVV-01)
B组(先用VSV，图7B)：OVV-01采用固定剂量给药，即第一阶段的临床有效剂量或最高剂量，在W1D1第1次给药，在W4D1第2次给药，之后每2周1次，连续7次，共给药8次。敲除PD-1分子的T细胞从W5D1开始给药，采用固定剂量(总量3.6×10
9～4.4×10
9或1.8×10
9～2.2×10
9细胞数)，分别以总剂量的20％、30％、50％的方式分3次，每次间隔1天给药，从W5D1开始，每4周为一个周期，如未发生：疾病进展、出现不可耐受的毒性反应、死亡、退出研究、失访、申办方终止研究或受试者开始新的肿瘤治疗，则连续用药4个周期。自开始给药至实验终点，需定期进行安全性随访以及疗效随访，时间点如下：
安全性随访
在基线、每次用药前7天内(W4D1、W5D1、W6D1、W8D1、W9D1、W10D1、W12D1、W13D1、W14D1、W16D1和W17D1)各进行一次；同时在每次疗效访视时(基线、W6D7、 W12D7和W20D7)各进行一次；其中基线、W13D1与W12D7为同一时间点，因此，共进行安全性访视14次。
疗效随访
基线、W6D7、W12D7和W20D7各进行1次，时间窗为-7d。
结果显示：联合用药下受试者无进展生存期与单药使用相比增加30％到50％以上。
实施例11：经改造的溶瘤病毒和敲除PD-1分子的T细胞联用的体外肿瘤杀伤能力
使用MOI＝10的JBS003溶瘤病毒体外感染A549肿瘤细胞，同时加入不同效靶比的PD-1敲除T细胞，48h后CCK8法检测细胞活力。具体方法如下：
(1)在96孔培养板中每孔加入A549肿瘤细胞株(人非小细胞肺癌)悬液100μL，使细胞量达到4×10
3个/孔，37℃，5％CO
2条件下培养16h。
(2)将溶瘤病毒按感染复数(multiplicity of infection，MOI)稀释至10；去除96孔板中原来培养基，每孔接种溶瘤病毒100μL。
(3)同时将PD-1敲除的T细胞按效靶比(E:T)分别稀释至1:1、5:1、10:1和20:1共四个梯度；每孔接种PD-1敲除的T细胞100μL，每一稀释梯度均接种4个复孔。
(4)在37℃，5％CO
2条件下培养48h后，弃去96孔培养板中的上清和PD-1敲除的T细胞，加入新鲜的DMED培养基(100μL/孔)，再加入CCK8溶液(10μL/孔)。在37℃，5％CO
2条件下培养4h。
(5)使用多功能酶标仪，震荡2分钟，在450nm波长下，测定各孔的OD值并计算肿瘤杀伤率。
(6)肿瘤杀伤率计算公式：肿瘤细胞杀伤率(％)＝(肿瘤细胞对照组OD值－实验组OD值)/肿瘤细胞对照组OD值×100％。
经改造的溶瘤病毒联合PD-1敲除的T细胞的肿瘤杀伤结果如图8所示，图中显示了单独使用经改造的溶瘤病毒、单独使用PD-1敲除的T细胞、以及联合使用经改造的溶瘤病毒和PD-1敲除的T细胞；结果显示，在经改造的溶瘤病毒和PD-1敲除的T细胞联合用药中，显示出了非常强的抗肿瘤能力，经改造的溶瘤病毒与PD-1敲除的T细胞发挥协同作用，显著提高了抗肿瘤的作用。
Claims (39)
- 一种组合物，其包含：(a)溶瘤病毒；以及，(b)经修饰的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的免疫效应细胞相比，免疫检查点的表达量和/或活性被调整。
- 根据权利要求1所述的组合物，其中所述溶瘤病毒包含天然的溶瘤病毒和经过改造的溶瘤病毒。
- 根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述溶瘤病毒选自下组：水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。
- 根据权利要求3所述的组合物，其中所述水疱性口炎病毒包含基质蛋白M、核衣壳蛋白N、磷蛋白P、大聚合酶蛋白L和/或糖蛋白G。
- 根据权利要求4所述的组合物，其中所述水疱性口炎病毒的基质蛋白M经过改造。
- 根据权利要求4-5中任一项所述的组合物，其中所述水疱性口炎病毒基质蛋白M的改造包含一个以上位点的突变。
- 根据权利要求4-6中任一项所述的组合物，其中所述水疱性口炎病毒基质蛋白M的突变位点选自下组中的一个或多个：M51、L111、V221和S226。
- 根据权利要求4-7中任一项所述的组合物，其中所述水疱性口炎病毒基质蛋白M的突变位点选自下组单个位点的突变：a)M51R；b)ΔL111；c)V221F；以及，d)S226R。
- 根据权利要求4-8中任一项所述的组合物，其中所述水疱性口炎病毒基质蛋白M的突变位点的组合选自下组中的任一组：a)M51R且ΔL111；b)M51R且V221F；c)M51R且S226R；d)ΔL111且V221F；e)ΔL111且S226R；f)V221F且S226R；g)M51R、ΔL111且V221F；h)M51R、ΔL111且S226R；i)M51R、V221F且S226R；j)ΔL111、V221F且S226R；以及，k)M51R、ΔL111、V221F且S226R。
- 根据权利要求9所述的组合物，其中所述突变位点组合选自M51R、V221F和S226R的水疱性口炎病毒基质蛋白M包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求9所述的组合物，其中所述突变位点组合选自M51R、ΔL111、V221F和S226R的水疱性口炎病毒基质蛋白M包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述免疫效应细胞选自下组：T细胞、NK细胞、B细胞和巨噬细胞。
- 根据权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述免疫效应细胞包含自体细胞和异体细胞。
- 根据权利要求1-13中任一项所述的组合物，其包含经体外扩增得到的免疫效应细胞。
- 根据权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点的数量为一个以上。
- 根据权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点选自下组中的一个或多个：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、BTLA、VISTA、TIGIT、B7-H2、B7-H3、B7-H4和B7-H6。
- 根据权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点为PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、BTLA、VISTA、TIGIT、B7-H2、B7-H3、B7-H4或B7-H6。
- 根据权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点为选自下组中任一组的组合：a)PD-1和CTLA-4；b)PD-1和PD-L1；c)PD-L1和CTLA4；d)LAG-3和CTLA-4；e)TIM-3和CTLA-4；f)VISTA和CTLA-4；以及g)PD1、CTLA-4和PD-L1。
- 根据权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点表达量的调整包含与未经修饰的免疫效应细胞相比，所述免疫检查点表达量的上调、下调和/或缺失。
- 根据权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点活性的调整包含与未经修饰的免疫细胞相比，所述免疫检查点活性的增加、降低和/或缺失。
- 根据权利要求1-20中任一项所述的组合物，其中所述免疫检查点的调整包含免疫检查点基因水平、转录水平和/或翻译水平的调控。
- 根据权利要求21所述的组合物，其中所述基因表达水平的调控包含基因编辑、过表达、点突变和/或同源重组。
- 根据权利要求22所述的组合物，其中所述基因编辑方法选自下组的一种或多种：CRISPR/Cas9、类转录激活因子效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和单碱基编辑(BE)。
- 根据权利要求22-23中任一项所述的组合物，其中所述基因编辑包含设计序列的sgRNA。
- 根据权利要求1-24中任一项所述的组合物，其中所述免疫效应细胞包含敲除针对选自SEQ ID NO：1的PD-1基因的靶序列。
- 根据权利要求1-25中任一项所述的组合物，其中所述免疫效应细胞敲除针对选自SEQ ID NO：2的CTLA-4基因的靶序列。
- 药物组合物，其包含：(a)权利要求1-26中任一项所述的至少一种溶瘤病毒和/或药学上可接受的载剂；以及(b)权利要求1-26中任一项所述的至少一种免疫效应细胞和/或药学上可接受的载剂。
- 试剂盒，其包含选自下组中的一种或多种：a)权利要求1-27中任一项所述的至少一种溶瘤病毒和制备权利要求1-27中任一项所述的至少一种修饰的免疫效应细胞的工具，和/或药学上可接受的载剂；b)权利要求1-27中任一项所述的至少一种修饰的免疫效应细胞和制备权利要求1-27中任一项所述的至少一种溶瘤病毒的工具，和/或药学上可接受的载剂；以及，c)制备权利要求1-27中任一项所述的至少一种溶瘤病毒的工具和制备权利要求1-27中任一项所述的至少一种修饰的免疫效应细胞的工具，和/或药学上可接受的载剂。
- 权利要求1-26中任一项所述的组合物、权利要求27所述的药物组合物和权利要求28所述的试剂盒的制备方法。
- 权利要求1-29中任一项所述溶瘤病毒在所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫效应细胞的联用中的应用。
- 权利要求1-30中任一项所述经修饰的免疫效应细胞在所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫细胞联用中的应用。
- 一种治疗肿瘤的方法，其包含向有需要的受试者施用根据权利要求1-26中任一项所述的组合物、根据权利要求27所述的药物组合物和/或根据权利要求28所述的试剂盒。
- 根据权利要求32所述的方法，其中所述溶瘤病毒通过静脉内和/或瘤内途径向有需要的受试者施用，其中所述免疫效应细胞通过静脉内和/或局部给药方式向有需要的受试者施用。
- 根据权利要求32-33中任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫细胞同时施用，施用剂量为治疗有效量。
- 根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫细胞分别施用，施用剂量为治疗有效量。
- 根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒和所述经修饰的免疫细胞一次施用或多次施用。
- 权利要求1-26中任一项所述的组合物、权利要求27所述的药物组合物、权利要求28所述的试剂盒在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
- 根据权利要求32-36中任一项所述的方法，或根据权利要求37所述的应用，其中所述肿瘤包括实体瘤和/或血液瘤。
- 根据权利要求32-36中任一项所述的方法，或根据权利要求37所述的应用，其中所述肿瘤包含选自下组的一种或多种：头颈部癌、黑色素瘤、软组织肉瘤、乳腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、宫颈癌、神经母细胞瘤、滑膜肉瘤和圆细胞型脂肪肉瘤。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2020109886333 | 2020-09-18 | ||
| CN202010988633 | 2020-09-18 | ||
| PCT/CN2021/119114 WO2022057904A1 (zh) | 2020-09-18 | 2021-09-17 | 溶瘤病毒与经改造的免疫细胞联合治疗肿瘤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116802278A true CN116802278A (zh) | 2023-09-22 |
Family
ID=80775941
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202180062625.9A Pending CN116802278A (zh) | 2020-09-18 | 2021-09-17 | 溶瘤病毒与经改造的免疫细胞联合治疗肿瘤 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116802278A (zh) |
| TW (1) | TW202214279A (zh) |
| WO (1) | WO2022057904A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117402836A (zh) * | 2022-07-14 | 2024-01-16 | 上海荣瑞医药科技有限公司 | 重组溶瘤病毒及其应用 |
| CN117402837A (zh) * | 2022-07-14 | 2024-01-16 | 上海荣瑞医药科技有限公司 | 一种重组溶瘤病毒及其应用 |
| CN116350759A (zh) * | 2023-03-30 | 2023-06-30 | 上海荣瑞医药科技有限公司 | 溶瘤病毒疫苗和免疫细胞联合治疗肿瘤的方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017044780A1 (en) * | 2015-09-09 | 2017-03-16 | Tvax Biomedical I, Llc | Methods for combining adoptive t cell therapy with oncolytic virus adjunct therapy |
| JP2019501205A (ja) * | 2016-01-11 | 2019-01-17 | ターンストーン リミテッド パートナーシップ | 腫瘍崩壊性ウイルス及びチェックポイント阻害剤の併用療法 |
| CN110461346A (zh) * | 2017-03-15 | 2019-11-15 | 美国安进公司 | 溶瘤病毒单独或与检查点抑制剂组合用于治疗癌症的用途 |
| US20200085891A1 (en) * | 2017-04-21 | 2020-03-19 | Sillajen, Inc | Oncolytic vaccinia virus and checkpoint inhibitor combination therapy |
| CN111065410A (zh) * | 2017-09-06 | 2020-04-24 | 弗雷德哈钦森癌症研究中心 | 用于改善过继细胞疗法的方法 |
| CN107794269A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-03-13 | 成都美杰赛尔生物科技有限公司 | 促进基因编辑t细胞活化及扩增的生物膜、制法及应用 |
| CN111320677A (zh) * | 2018-12-14 | 2020-06-23 | 苏州奥特铭医药科技有限公司 | 溶瘤病毒疫苗和过继性免疫细胞联合疗法 |
| CN111743923B (zh) * | 2019-03-27 | 2024-11-08 | 北京康万达医药科技有限公司 | 包含分离的重组溶瘤腺病毒和免疫细胞的治疗剂及其应用 |
| CN111286493B (zh) * | 2020-05-12 | 2020-10-27 | 上海荣瑞医药科技有限公司 | 一种溶瘤病毒疫苗及其与免疫细胞联合治疗肿瘤的药物 |
| CN111467489B (zh) * | 2020-05-12 | 2022-06-03 | 上海荣瑞医药科技有限公司 | 一种治疗肿瘤的药物 |
-
2021
- 2021-09-17 CN CN202180062625.9A patent/CN116802278A/zh active Pending
- 2021-09-17 TW TW110134910A patent/TW202214279A/zh unknown
- 2021-09-17 WO PCT/CN2021/119114 patent/WO2022057904A1/zh active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022057904A1 (zh) | 2022-03-24 |
| TW202214279A (zh) | 2022-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7263327B2 (ja) | 細胞の遺伝子修飾のための非組込みｄｎａベクター | |
| US20240100106A1 (en) | Isolated recombinant oncolytic adenoviruses, pharmaceutical compositions, and uses thereof for drugs for treatment of tumors and/or cancers | |
| CN109415687A (zh) | 嵌合抗原受体t细胞组合物 | |
| CN116802278A (zh) | 溶瘤病毒与经改造的免疫细胞联合治疗肿瘤 | |
| JP2022513652A (ja) | 機能および抑制性環境に対する抵抗性を増強するための免疫細胞のマルチプレックスゲノム編集 | |
| JP2018188475A (ja) | カスパーゼポリペプチドを使用して部分的なアポトーシスを誘導するための方法 | |
| KR20230004561A (ko) | 종양을 병용 치료하는 종양 용해성 바이러스와 면역 관문 억제제 | |
| CN110616187A (zh) | CRISPR-Cas9高效敲入嵌合抗原受体基因到T细胞特定基因组位点的方法及应用 | |
| AU2020267641A1 (en) | Engineered T cells | |
| JP2022513586A (ja) | 抗ｌｉｖ１免疫細胞癌療法 | |
| BR112020025439A2 (pt) | Receptores de antígenos quiméricos cd79a | |
| CN111205361A (zh) | 白介素21蛋白（il21）突变体及其应用 | |
| TW202321457A (zh) | 靶向ｃｄ４之病毒載體之用途 | |
| JP2014509197A (ja) | 標的性治療人腫瘍治療の腫瘍溶解性アデノウイルス及びその応用 | |
| TW202342757A (zh) | 經修飾副黏液病毒科附著醣蛋白 | |
| JP7698321B2 (ja) | Ｂ細胞のｃａｒ形質導入とｃｒｉｓｐｒ遺伝子編集との大規模での組み合わせ | |
| CN105218682B (zh) | 经il-12/cd62l融合蛋白改造的肿瘤治疗剂及其制法和用途 | |
| TW202135840A (zh) | 工程化自然殺手細胞以靶向cd70陽性腫瘤之方法 | |
| CN115485294A (zh) | T细胞受体 | |
| BR112021004451A2 (pt) | método para produção de um arenavírus antitumoral, bem como mutantes de arenavírus | |
| KR20210005637A (ko) | 종양 치료용 콕삭키바이러스 b | |
| WO2018168586A1 (ja) | ボルナウイルスベクター及びその利用 | |
| WO2016015684A1 (zh) | 携带人乳头瘤病毒16型突变型e7抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 | |
| CN105176937A (zh) | 一种重组新城疫病毒及其在制备抗癌药物中的应用 | |
| US20230272423A1 (en) | Dna molecules producing custom designed replicating and non-replicating negative stranded rna viruses and uses there of |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |