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CN116789807B - 抗腺病毒单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗腺病毒单克隆抗体及其应用 Download PDF

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CN116789807B CN202310709351.9A CN202310709351A CN116789807B CN 116789807 B CN116789807 B CN 116789807B CN 202310709351 A CN202310709351 A CN 202310709351A CN 116789807 B CN116789807 B CN 116789807B
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Abstract

本发明涉及一种新的抗腺病毒(AdV)单克隆抗体、包括该抗体的试剂盒、及其相关应用。本发明的抗腺病毒单克隆抗体可以特异性结合多种型别的腺病毒的六邻体蛋白，表现出针对腺病毒的高灵敏度和高特异性，能够用于多种型别的腺病毒的检测，并且极大地提高了腺病毒的检测率，降低了检测成本，为呼吸道和消化道的腺病毒的快速检测提供了可行性方案。

Description

抗腺病毒单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，并具体地涉及一种抗腺病毒(AdV)单克隆抗体、包括该抗体的试剂盒及相关应用。
背景技术
腺病毒颗粒呈无囊膜球形结构，直径为70～90nm，每个病毒颗粒包含一个36kb的线性双链DNA。腺病毒衣壳呈二十面体对称，由252个直径8～10nm的壳粒组成，其中二十面体顶角壳粒为12个五邻体(penton)，除五邻体外有240个非顶角壳粒，称为六邻体(Hexon)。六邻体带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，可以作为诊断不同血清型的标准。
腺病毒在自然界分布十分广泛，能感染人的腺病毒有A-G共7个组，目前已知有55个不同的血清型，其中最常见的致病型为1-8型，55型腺病毒是由人11型和14型腺病毒重组产生的新型病毒。
腺病毒主要通过空气飞沫传播，多数型别的腺病毒也可通过消化道途径传播。腺病毒感染人类后会引发多种疾病，如腺病毒急性上呼吸道感染、腺病毒肺炎、暴发性眼结膜炎、急性出血性膀胱炎及婴幼儿肠胃炎等。腺病毒肺炎约占儿童期肺炎的10％，多见于6个月至2岁的婴幼儿，病情重，是目前导致婴幼儿肺炎死亡和致残的重要原因之一，其中3型和7型是导致婴幼儿腺病毒肺炎主要的型别，55型是引起成人腺病毒社区型肺炎最常见的型别。
目前诊断腺病毒感染主要有以下方法：病毒分离和血清学鉴定、病毒核酸检测及抗原检测。传统的病毒分离和血清型方法是诊断腺病毒的金标准，但不适于临床早期诊断，病毒核酸检测灵敏度高，但诊断成本较高，实验条件要求严格。针对腺病毒衣壳六邻体的抗原检测，以鼻咽拭子、痰液或粪便为标本，在发病3-5天内即可高效率检测。
我国地域辽阔，腺病毒呼吸道感染一年四季均可发生。腺病毒感染的型别在时间和空间上呈现复杂化和差异化的流行病特征。不同地区流行的腺病毒优势毒株型别、时间均有所不同，在我国北方以冬春季节多见，而南方以春夏季节更加常见。北方、西北方和南方地区的优势流行株属于HAdV-B组，以3型和7型为主；而东部地区的优势流行株属于HAdV-C组，主要是1型和2型；同时我国南方和北方近年多地均局部发生新型腺病毒55型的感染流行。肠道腺病毒，以F亚群的40型和41型为主，是仅次于轮状病毒的，引起儿童腹泻的第二大原因。
腺病毒流行型别在地区和时间的差异化，给腺病毒感染的快速诊断带来了不便。目前一种抗体通常只能检测一种型别的腺病毒，所以在检测如咽拭子样本或粪便样本时需要使用多种抗体来提高抗体检测率，提高了检测成本，并且仍存在一定的假阴性概率。
因此，需要一种能同时检测多种型别、特异性高、灵敏度高的腺病毒检测产品和方法。
发明内容
如前所述，本领域需要一种具有高特异性和高灵敏度且适用于多种型别腺病毒的抗腺病毒抗体。
考虑到不同型别的腺病毒的六邻体蛋白有很高的保守性(78％～95％)，型间与组织特异性抗原表位定位于这些保守区域，可能具有一定的抗原性，本发明人以六邻体蛋白作为腺病毒感染抗原诊断的靶位点，用3型腺病毒(HAdV3)六邻体蛋白(Hexon)(氨基酸序列为SEQ ID NO:62)免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由ELISA方法筛选出对多种型别的腺病毒的六邻体蛋白均特异结合的杂交瘤细胞株，构建重组抗体，获得靶向腺病毒的六邻体蛋白的重组抗腺病毒抗体。由此，实现了本发明。
因此，在第一方面，本发明提供了一种抗腺病毒单克隆抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中，
a)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4-6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
b)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
c)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
d)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:12-14所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:15-17所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；或者
e)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:18-20所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:15、SEQID NO:16和SEQ ID NO:21所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在第二方面，提供了一种核酸分子，其编码第一方面所述的抗腺病毒单克隆抗体。
在第三方面，提供了一种载体，其包含第二方面所述的核酸分子。
在第四方面，提供了一种表达细胞，其包含第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的载体。
在第五方面，提供了一种检测腺病毒的方法，所述方法用于非诊断目的或者诊断目的，包括使用第一方面所述的抗腺病毒单克隆抗体的步骤。
在第六方面，提供了第一方面所述的抗腺病毒单克隆抗体在制备用于检测腺病毒的试剂中的用途。
在第七方面，提供了一种用于检测腺病毒试剂盒，其包括第一方面所述的抗腺病毒单克隆抗体以及使用说明。
综上，本发明提供了一种新的抗腺病毒单克隆抗体，其能够特异性结合包括1型、2型、3型、4型、7型、40型、41型和55型在内的多种型别的腺病毒的六邻体蛋白，由此用于多种型别的腺病毒的检测，表现出针对腺病毒的高灵敏度和高特异性，可以实现如皮克级浓度的更灵敏检测，极大地提高了腺病毒的检测率，降低了检测成本，为呼吸道和消化道的腺病毒的快速检测提供了可行性方案。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示出了本发明的单克隆抗体A18与八种型别的腺病毒的六邻体蛋白以及新冠病毒Np蛋白(对照)的结合反应结果图。
图2示出了本发明的单克隆重组抗体A18与八种型别的腺病毒的六邻体蛋白以及新冠病毒Np蛋白(对照)的结合反应结果图。
图3示出了根据本发明的一个实施方案制备得到的单克隆抗体A54、A15、A5、A7、A13、A1、A27和A8与八种型别的腺病毒的六邻体蛋白以及新冠病毒Np蛋白(对照)的结合反应结果图。
具体实施方式
在下文中，将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。
在提供数值范围的情况中，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且此类实施方案也包括在所述主题内，受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。
在本发明的上下文中，很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述，表示不仅包括该表述后面具体列出的各要素、组分、组件、方法步骤等外，还包括其他的要素、组分、组件、方法步骤。另外，在本文中，表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述，表示仅包括该表述后面具体列出的各要素、组分、组件、方法步骤，而不包括任何其他的要素、组分、组件、方法步骤。此时，该表述等同于表述“由……组成”。
为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围，除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指出，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。
如本文所用，术语“抗体”是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且可以据此分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区(铰链区)连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为框架区(FR)的区域。对于每条重链或轻链，其可变区各自包含三个CDR，即CDR1、CDR2和CDR3。因此，各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
将氨基酸分配至各区域或结构域的分配规则在多篇文献中给出了相关定义：Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda M.d.(1987and 1991))；Chothia&Lesk J.Mol.Biol.1987；196:901-917；Chothia et al.,Nature 1989；342:878-883；Ehrenmann,Francois,Quentin Kaas,andMarie-PauleLefranc."IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF andMhcSF."Nucleic acids research 2009；38(suppl_1):D301-D307。
CDR的确切边界已根据不同系统不同地限定，Kabat系统不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定3个CDR的精确残基边界，这些CDR被称为Kabat CDR；Chothia发现Kabat系统CDR内的某些亚部分尽管在氨基酸序列水平上具有很大多样性，但具有几乎相同的肽主链构象，这些亚部分被称为Chothia CDR，Chothia CDR具有与Kabat CDR重叠的边界。上述重叠的边界又由Padlan和MacCallum描述，CDR边界定义可能不严格遵守上述系统，例如AbM定义。在本文中，可以根据这些系统中任何一种限定的CDR，尽管优选实施方案使用Chothia等人的抗体编号系统来定义CDR。
如本文中所使用，术语“单抗”或“单克隆抗体”是指来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。所述抗体分子可以是免疫球蛋白，无论其是天然免疫球蛋白还是部分或全部通过合成方法获得的免疫球蛋白。所述抗体分子还可以包括具有抗体结构结合域的所有多肽或蛋白质，具有抗体结构域的抗体片段是诸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd的分子，以及双功能抗体。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(G,Milstein C.Continuouscultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J].nature,1975；256(5517):495)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent 4,816,567)。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文所使用的，术语“重组抗体”表示通过分子生物学技术将抗体基因克隆到表达载体中再将该表达载体转染到合适的宿主细胞系中进行表达得到的抗体。重组抗体编码基因可以与天然来源的抗体编码基因完全相同，也可以不完全相同。例如，可以将通过免疫动物获得的抗体的完整编码基因克隆到表达载体中进行表达，由此获得与免疫动物获得的抗体完全相同的抗体，也可以将通过免疫动物获得的抗体的编码可变区(包括重链可变区和轻链可变区)的基因与另一物种(例如人)来源的抗体的编码恒定区的基因一起克隆到表达载体中进行表达，由此获得与包括来自一个物种的重链和轻链可变区序列及来自另一物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的小鼠重链和轻链可变区的抗体。该抗体在本领域中通常被称为“嵌合抗体”。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。
在本发明中，还采用引物对编码抗体的核苷酸序列进行了PCR扩增。在引物序列中，一些位点仅仅涉及单独的一种碱基，如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)中的任一种，而一些位点却涉及两种、三种或者四种碱基的组合，在这种情况下，这些碱基被称为彼此的简并碱基，其主要是基于密码子的简并性确定的。简并碱基可以用字母R、Y、M、K、S、W、H、B、V、D、N表示，其中，R代表A/G，Y代表C/T，M代表A/C，K代表G/T，S代表C/G，W代表A/T，H代表A/T/C，B代表G/T/C，V代表G/A/C，D代表G/A/T，以及N代表A/T/C/G。
本文中使用的术语序列“同一性”、“一致性”或者“同源性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列同一性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列同一性(参见，例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，NewYork，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；and SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的同一性的方法，但是术语“同一性”是技术人员公知的在肽或蛋白中适合于保守型氨基酸置换的，并且一般可以进行而不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸置换基本上不改变生物活性(参见例如Watson et al.，Molecular Biology of the Gene，4thEdition，1987，The Benjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。
如前所述，本发明旨在提供一种具有高灵敏度、高特异性且针对多种型别腺病毒的抗腺病毒单克隆抗体。如前所述，本发明人以六邻体蛋白作为腺病毒感染抗原诊断的靶位点，用3型腺病毒(HAdV3)六邻体蛋白(Hexon)(氨基酸序列为SEQ ID NO:62)免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由ELISA方法筛选出对多种型别的腺病毒的六邻体蛋白均特异结合的杂交瘤细胞株，分别命名为A54、A15、A5、A1、A27、A8、A18、A7、A13。
因此，在第一方面，本发明提供了一种抗腺病毒单克隆抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中，
a)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4-6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
b)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
c)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
d)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:12-14所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:15-17所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；或者
e)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:18-20所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:15、SEQID NO:16和SEQ ID NO:21所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一个具体的实施方案中，所述抗体为包含可变区和恒定区的完整抗体。对于本发明的抗体而言，可以使用任何构架区(FR)以及任何恒定区。本发明的抗体中使用的FR或恒定区的氨基酸序列可以是作为来源的原FR或恒定区的氨基酸序列，也可以是对原FR或恒定区的氨基酸序列进行1个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入等而得到的不同的氨基酸序列。用于支持本发明所述CDR或CDR组的结构通常属于抗体重链或轻链序列或其主要部分，其中所述CDR或CDR组位于与重排免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR或CDR组相应的位置上。
作为一个示例，各构架区(FR)可以具有如下序列：
HFR1(重链构架区1)：QLQQSGPGLVAPSQSLSITCTVS
HFR2(重链构架区2)：WMHWVMQRPGQGLEWIGVI
HFR3(重链构架区3)：TNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMN SLQSEDSAVYYCAR
HFR4(重链构架区4)：WGQGTTLTVS
LFR1(轻链构架区1)：VVMTQTPLTLSVTIGQPASISC
LFR2(轻链构架区2)：WYLQKPGQSPKLLIY
LFR3(轻链构架区3)：GVPSRFSSSGSGTDFVFKISRVEAEDLG VYYC
LFR4(轻链构架区4)：FGGGTKLEI
在一个具体的实施方案中，所述抗体的所述重链可变区包括SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或与SEQID NO：45所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上、或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述抗体的所述重链可变区包括SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或与SEQID NO：47所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上、或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述抗体的所述重链可变区包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列或与SEQID NO：49所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上、或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述抗体的所述重链可变区包括SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列或与SEQID NO：51所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上、或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述抗体的所述重链可变区包括SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％的一致性的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或与SEQID NO：53所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上、或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％的一致性的序列。
在一个具体的实施方案中，所述抗体还包括恒定区序列，例如但不限于选自IgG、lgA、IgM、IgE和IgD中任一种的恒定区序列，本领域技术人员能够基于需要进行选择，本文对此并无特别限定。
在又一个具体的实施方案中，所述恒定区序列种属来源可以为大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、马、狗、牛、猪、鸡、鸭、鹅或人类，但不限于此。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗体的恒定区来源于小鼠。
在一些实施方案中，所述恒定区序列种属来源为小鼠。
在一个具体的实施方案中，所述单克隆抗体靶向腺病毒的六邻体蛋白。六邻体蛋白是腺病毒中具有很高的保守性(78％～95％)且带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，可以作为诊断不同血清型的标准。
在第二方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码第一方面所述的抗腺病毒单克隆抗体。
对于本领域技术人员而言，在知晓某种蛋白例如本发明的抗腺病毒单克隆抗体的氨基酸序列的情况下，确定其核酸编码序列完全在其能力范围内。此外，为了通过重组方式获得单克隆抗体，可以将所述核酸分子克隆到载体中，并将该载体进一步导入表达细胞中，以利用该表达细胞来表达该抗体蛋白。
在第三方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明第二方面的核酸分子。
在一个优选的实施方案中，所述载体可以为质粒载体，例如pEE12、pCAGGS、pTOPO、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ。
在一个具体的实施方案中，所述载体为pTOPO载体。
在又一个具体的实施方案中，所述载体为真核表达载体。
在一个优选的实施方案中，所述pcDNA载体可以为pCDNA3.1载体。
在第四方面，本发明提供了一种表达细胞，其包含第二方面所述的核酸分子或第三方面的载体。
所述表达细胞是通过将上述的核酸分子或上述的载体通过本领域技术人员熟知的分子生物学方法导入宿主细胞内来制备的。
如前所述，本发明人以六邻体蛋白作为腺病毒感染抗原诊断的靶位点，用3型腺病毒(HAdV3)六邻体蛋白(Hexon)免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由ELISA方法筛选出对多种型别的腺病毒的六邻体蛋白均特异结合的杂交瘤细胞株，分别命名为A54、A15、A5、A1、A27、A8、A18、A7、A13。在筛选出分泌目标抗体的单克隆细胞株后，可以通过逆转录酶-PCR从细胞株回收重链和轻链可变区cDNA，并选择合适的免疫球蛋白恒定区(例如人恒定区)，然后将所述重链和轻链可变区cDNA以及恒定区cDNA转入宿主细胞诸如COS或CHO细胞中，由此得到本发明的表达目标抗体的表达细胞。利用单克隆抗体及其他抗体和重组DNA技术可以产生保留了原始抗体的特异性的其他抗体或嵌合分子，这些技术可包括将编码抗体免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDR)的DNA导入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区外加构架区。
在一个具体的实施方案中，所述表达细胞可以为哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞、人胚胎肾细胞。在一个更具体的实施方案中，所述表达细胞可以为例如经SV40转化的猴肾细胞(COS-7，ATCC CRL1651)、人胚胎肾细胞(HEK293或经亚克隆以供在悬浮培养中生长的HEK293细胞，Graham et al.,1977，J.Gen Virol.36：59)、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR1(CHO，Urlaub et al.,1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216；例如DG44)、小鼠胸腺瘤细胞(NSO)、小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251)、猴肾细胞(CV-1，ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)、水牛鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL75)、人肝细胞(HepG2，HB8065)、小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)、TR1细胞(Mather et al.,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68)、MRC5细胞、FS4细胞等，但不限于此。
在第五方面，本发明提供了一种检测腺病毒的方法，所述方法用于非诊断目的或者诊断目的，包括使用第一方面所述的抗腺病毒单克隆抗体的步骤。
在一个具体的实施方案中，所述检测腺病毒是通过本发明的抗腺病毒单克隆抗体特异性结合腺病毒六邻体蛋白来实现的。
在又一个具体的实施方案中，所述检测是通过免疫层析法、酶标抗体法(ELISA)、化学发光法、电化学发光法来进行的。
在一个优选的实施方案中，所述检测可以为直接法、间接法、夹心法和竞争法。
在一个优选的实施方案中，所述免疫层析法包括但不限于荧光微球免疫层析法、胶体金免疫层析法、基于彩色乳胶微球的免疫层析法、时间分辨荧光微球免疫层析法、磁性微球免疫层析法及量子点免疫层析法。
在本发明中，所述抗腺病毒单克隆抗体可以作为标记抗体使用。例如所述抗腺病毒单克隆抗体可以与磁珠、微球、酶、荧光染料、生物素、链霉亲和素、量子点、胶体金等结合。
不期望被理论束缚，本发明的所述抗腺病毒单克隆抗体也可以作为包被抗体使用。例如抗腺病毒单克隆抗体可以与固相如固相支持物结合。对在本发明的检测方法中使用的所述固相支持物没有特别限制，其可以是多孔或无孔材料，例如磁珠、乳胶微球、荧光微球、微量滴定板、硝酸纤维素膜、微流控芯片等。
举例来说，当进行胶体金免疫层析测试时，可以用胶体金标记本发明的抗腺病毒单克隆抗体(如A54、A5等，但不限于此)，本发明(如抗体A15、A7、A13，但不限于此)或现有技术的另一种抗腺病毒单克隆抗体包被硝酸纤维素膜(NC膜)，划膜得到检测线(T线)。按照免疫试纸条制备方式，组装得到胶体金检测试纸。检测时，阳性样品中的待测物与胶体金标记抗腺病毒单克隆抗体结合形成复合物，所述复合物在T线处与包被抗体结合，形成夹心复合物，此处胶体金发生聚集沉淀显示红色，指示样品为阳性。
本领域技术人员知道，在本发明的上下文中，“另一种抗腺病毒单克隆抗体”是指能够与本发明的抗腺病毒单克隆抗体结合相同抗原、优选结合相同抗原的不同表位的抗体，其可以是本发明抗腺病毒单克隆抗体之一，也可以是现有技术的其他抗腺病毒单克隆抗体，但不限于此。值得注意的是，本发明的抗腺病毒单克隆抗体无论是作为包被抗体还是标记抗体，与另一种抗腺病毒单克隆抗体结合使用时，都能够以高灵敏度和高特异性的方式实现对腺病毒的检测。
在第六方面，本发明提供了第一方面所述的抗腺病毒单克隆抗体在制备用于检测腺病毒的试剂中的用途。
在一个具体的实施方案中，所述检测腺病毒是通过本发明的抗腺病毒单克隆抗体特异性结合腺病毒六邻体蛋白来实现的。
在又一个具体的实施方案中，所述检测是通过免疫层析法、酶标抗体法(ELISA)、化学发光法、电化学发光法来进行的。所述免疫层析法可以包括但不限于荧光微球免疫层析法、胶体金免疫层析法、基于彩色乳胶微球的免疫层析法、时间分辨荧光微球免疫层析法、磁性微球免疫层析法及量子点免疫层析法等。本领域技术人员能够根据需要对检测进行选择，本发明对此并无特别限定。
在又一个优选的实施方案中，ELISA可以是直接法、间接法、夹心法和竞争法。
如前所述，本发明的抗腺病毒单克隆抗体既可以作为标记抗体使用，也可以作为包被抗体使用。例如所述抗腺病毒单克隆抗体可以与磁珠、微球、酶、荧光染料、生物素、链霉亲和素、量子点、胶体金等结合，作为标记抗体使用。又例如，抗腺病毒单克隆抗体可以与固相如固相支持物结合，作为包被抗体使用。对在本发明的检测方法中使用的所述固相支持物没有特别限制，其可以是多孔或无孔材料，例如磁珠、乳胶微球、荧光微球、微量滴定板、硝酸纤维素膜、微流控芯片等。
在本发明的上下文中，还可以使用“另一种抗腺病毒单克隆抗体”。“另一种抗腺病毒单克隆抗体”是指能够与本发明的抗腺病毒单克隆抗体结合相同抗原、优选结合相同抗原的不同表位的抗体，其可以是本发明抗腺病毒单克隆抗体之一，也可以是现有技术的其他抗腺病毒单克隆抗体。值得注意的是，本发明的抗腺病毒单克隆抗体无论是作为包被抗体还是标记抗体，与(本发明或现有技术的)另一种抗腺病毒单克隆抗体结合使用时，在用于免疫层析反应如基于胶体金的免疫层析反应中，都能够以高灵敏度和高特异性的方式实现对腺病毒的检测。
在第七方面，本发明提供了一种用于检测腺病毒试剂盒，其包括第一方面所述的抗腺病毒单克隆抗体以及使用说明。
本发明的试剂盒可以用于即时检验(POCT)或电化学免疫测定系统。根据本发明的试剂盒和其任何示例性形式可以在自动化和半自动化系统中使用，并进行优化。
实施例
在下述实施例中，示出了本发明的抗体的制备方法与相关性质的表征。如无特殊说明，其中采用的试验方法均为常规方法，并且如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
应注意，本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。
实施例1：抗腺病毒单克隆抗体的制备
抗原偶联和免疫：将纯化出的三型腺病毒六邻体蛋白(氨基酸序列为SEQ ID NO:62：MATPSMMPQWAYMHIAGQDASGYLSPGLVQFARATDTYFS MGNKFRNPTVAPTHDVTTDRSQRLMLRFVPVDREDNTYSYKVRYTLAVGDNRVLDMASTFFDIRGVLDRGPSFKPYSGTAYNSLAPKGAPNTSQWIVTTNGDNAVTTTTNTFGIASMKGGNITKEGLQIGKDITTTEGEEKPIYADKTYQPEPQVGEESWTDTDGTNEKFGGRALKPATNMKPCYGSFARPTNIKGGQAKNRKVKPTTEGGVETEEPDIDMEFFDGRDAVAGALAPEIVLYTENVNLETPDSHVVYKPETSNNSHANLGQQAMPNRPNYIGFRDNFVGLMYYNSTGNMGVLAGQASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSLGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGIEDELPNYCFPLNGIGPGHTYQGIKVKTDDTNGWEKDANVAPANEITIGNNLAMEINIQANLWRSFLYSNVALYLPDVYKYTPPNITLPTNTNTYEYMNGRVVSPSLVDSYINIGARWSLDPMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAVKNLLLLPGSYTYEWNFRKDVNMVLQSSLGNDLRTDGATISFTSINLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQSFNDYLSAANMLYPIPANATNIPISIPSRNWAAFRGWSFTRLKTKETPSLGSGFDPYFVYSGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAIMFDSSVSWPGNDRLLSPNEFEIKRTVDGEGYNVAQCNMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPEGYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDEVNYTDYKAVTLPYQHNNSGFVGYLAPTMRQGEPYPANYPYPLIGTTAVKSVTQKKFLCDRTMWRIPFSSNFMSMGALTDLGQNMLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYLLFEVFDVVRVHQPHRGVIEAVYLRTPFSAGNATT)作为免疫原以用于免疫小鼠。小鼠选取6-8周龄、雌性BALB/c小鼠。将小鼠共免疫4次，每次免疫间隔2周，免疫剂量为100μg/只小鼠。首次免疫将六邻体蛋白与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合，经背部皮下多点注射，后三次免疫将六邻体蛋白与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合，经腹腔注射。第四次免疫后7天，对小鼠断尾采血，分离血清，采用间接ELISA方法检测免疫小鼠抗血清的抗体效价水平，以观察免疫应答效果。选取血清抗体效价高于1：10000的小鼠进行细胞融合实验，在细胞融合实验前3天用不加佐剂的六邻体蛋白经腹腔注射加强免疫(100μg/只)。
杂交瘤细胞的建立：融合当天，在无菌条件下取出经免疫小鼠的脾脏并将该器官制成单细胞悬液。取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与上述经免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1：5的比例融合，充分混匀，在与PEG融合前，洗涤细胞两次。加入预热的PEG1500，轻轻振荡，以预热的无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞，再用HAT选择性培养基重悬细胞。将该细胞悬液以200μL/孔铺板至96孔培养板中，并且在37℃、5％CO2条件下培养细胞。培养4至7天后，改用HT培养基进行培养，当融合的细胞生长至96孔板的孔的底面积的1/10-1/5时，取上清进行抗体检测。
阳性杂交瘤细胞的筛选：取六邻体蛋白，用包被缓冲液(0.05mol/L，pH9.6，PBS)稀释，最终浓度为1μg/ml，以100μL/孔加入至96孔板中，于4℃包被过夜；弃包被液，用磷酸缓冲液(PBST)洗涤3次，拍干；用含2％ BSA的PBST封闭，150μL/孔，于37℃孵育2h，用PBST洗涤3次，拍干；将融合细胞上清、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清(作为阳性对照)和1:1000稀释的小鼠阴性血清(作为阴性对照)以100μL/孔加入至相应孔内，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干；加入1：4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)，100μL/孔，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干；加入四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine，TMB)底物，100μL/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μL的2mol/L硫酸终止反应。
在酶标仪的450nm波长下，检测酶标板中所有孔的OD450nm值。当阴性血清的OD450nm≤0.1，以测定孔的吸光值OD450nm值是阴性孔OD450nm的2.1倍以上为阳性作为判断标准。筛选出阳性杂交瘤细胞以进行下一步克隆化。
阳性细胞株克隆化：将分泌抗体的阳性细胞孔取样计数后，稀释成100个细胞/10mL培养基，将稀释的细胞悬液以100μL/孔铺板至96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。6-7天后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，标记出单个克隆生长孔，取出细胞上清，进行ELISA检测(与上述融合检测相同)，选出阳性的单克隆细胞。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取ELISA检测得到的OD450nm阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。最后获得九株稳定分泌抗六邻体抗体的细胞株，命名为杂交瘤细胞株A54、A15、A5、A1、A27、A8、A18、A7、A13。
细胞上清单抗的制备与纯化：将杂交瘤细胞株用含15％血清的RPMI-1640培养基于10cm培养皿中培养，当扩培至约4×107个/皿时，以800rpm离心5min，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3×105个/ml，转瓶培养。继续培养1～2周后，当细胞死亡率达到80％-90％时(此时细胞密度大概为1×106-2×106个/ml)，收取细胞悬液，以6000rpm高速离心20min，取上清，对该上清液采用Protein A免疫层析法进行纯化。
将由杂交瘤细胞制备的单克隆抗体也分别记作A54、A15、A5、A1、A27、A8、A18、A7、A13抗体。
经微量分光光度计鉴定，上述单克隆抗体的浓度均大于4mg/mL。将纯化后的单抗浓度测定，并分装，保存在4℃-8℃。
用SDS-PAGE电泳鉴定上述单克隆抗体，抗体具有约51KD的抗体重链条带和约26KD的抗体轻链条带。
纯度检测：用体积排阻色谱(SEC-HPLC)分析单克隆抗体，在保证待测样品中所有组份均出峰的情况下，利用峰面积归一法计算出主峰的纯度百分比，纯度均达到大于98％。
实施例2：间接ELISA法检测抗体效价
用pH 9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释六邻体蛋白，使其浓度为1μg/ml，以100μL/孔加入至96孔酶标板，于4℃包被过夜，在自动洗板机上用PBST洗涤3次，拍干。用含2％BSA的PBST封闭，150μL/孔，于37℃孵育2h，用PBST洗涤3次，拍干。用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液对实施例1中获得的九种抗腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体分别进行梯度稀释，抗体起始浓度为5μg/ml，依次按三倍进行梯度稀释，得到一系列不同浓度的单克隆抗体样品。将稀释好的单克隆抗体样品以100μL/孔加入至上述酶标板，于37℃孵育1h，洗涤3次，拍干。加入1：5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自sigma)，100μL/孔，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干。TMB底物以100μL/孔加入，于室温避光显色10min。以50μL/孔加入2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪测定OD450nm值，结果示于图1和图3中。图1示出了单克隆抗体A18与八种型别的腺病毒(Adv)的六邻体蛋白及新冠病毒Np蛋白(作为对照)的结合反应的结果。由图1可以得出，单克隆抗体A18与八种型别的腺病毒的六邻体蛋白都能结合，与新冠病毒Np蛋白不结合，抗体特异性好。除抗体A18之外，其他八种单克隆抗体也能够与八种型别的腺病毒的六邻体蛋白结合，但不与新冠病毒Np蛋白结合(如图3所示)。
此外，进一步通过软件分析上述ELISA结果，以获得各单克隆抗体与八种型别的腺病毒的六邻体蛋白的EC50值，EC50值如下表1所示。
表1：九种单克隆抗体与八种型别的腺病毒的六邻体蛋白的EC50(nM)值
从表1中给出的数据可以看出，九个克隆与各型别的腺病毒的六邻体蛋白亲和力都在nM级，其中A54、A27与55型腺病毒六邻体蛋白的亲和力最高，A15、A1、A18与3型腺病毒六邻体蛋白的亲和力最高，A5与7型腺病毒六邻体蛋白的亲和力最高。
实施例3：抗体可变区序列的克隆和测序
从实施例1中获得的九株杂交瘤细胞株分离总RNA，通过反向转录制备cDNA，以从杂交瘤细胞株克隆免疫球蛋白序列，并对上述杂交瘤细胞株抗体可变区序列进行测定，具体如下。
a.RNA的提取：参照细胞总RNA M5抽提试剂盒(购自北京聚合美生物科技有限公司)说明书，对上述杂交瘤细胞株进行总RNA提取；
b.RNA反转录成为cDNA：参照M5 First Strand cDNA Synthesis Kit聚合美(购自北京聚合美生物科技有限公司)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录，制得cDNA，冻存于-20℃备用；
c.可变区序列的PCR扩增及回收：以上一步骤中所得cDNA为模板，用通用重链引物Mu Ig VH 5′-A和Mu IgG VH 3′-2，通过PCR扩增免疫球蛋白重链(IgH)cDNA；相似地，使用轻链引物Mu IgκVL 5′-A和Mu IgκVL 3′-1，通过PCR扩增免疫球蛋白轻链(IgK)cDNA，将PCR产物进行回收；PCR反应全程使用热稳定性PfuDNA聚合酶。
d.可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pTOPO-Blunt Cloning kit(购自北京聚合美生物科技有限公司)说明书，将重链和轻链可变区基因分别与pTOPO载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，交由北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。
对测序得到杂交瘤细胞株的抗体重链可变区基因序列和轻链可变区基因序列进行分析，重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列如下表2所示。
表2：九种单克隆抗体的重链互补决定区和重链可变区以及轻链互补决定区序列和轻链可变区
实施例4：重组抗体的制备与纯化
构建重组抗体，通过真核表达制备稳定表达抗体的细胞株，并大规模培养纯化。
采用PCR方法，以反转录得到的cDNA为模板，扩增鼠单克隆抗体重链和轻链可变区基因(VH和VL)，并经测序确定序列。针对表2中给出的九种抗体的VL和VH基因，用分子克隆的方法构建重组抗体真核表达载体。将抗体的重链与轻链基因表达质粒pCDNA3.1电转导入CHO宿主细胞，电转后加入压力筛选培养基(50μM MSX)中培养20d后取上清进行ELISA检测(用辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG为二抗进行筛选，方法同上)筛选出稳定表达的重组抗体细胞株。
将筛选出的稳转细胞株采用细胞滚瓶培养技术进行细胞大规模培养，进行重组抗体制备。用培养基(Vega CHO)将细胞以(0.2-0.3)×106cells/ml接种于滚瓶中，1L滚瓶含300ml培养基(Vega CHO)，根据生产需求决定接种瓶数量，将接种细胞的滚瓶放入细胞转瓶机中在细胞培养箱中培养。培养条件为900转/小时，温度为37℃，二氧化碳为5％。培养7-9天后取样显微镜下观察，当细胞活率小于50％，离心收样。将样品用protein A亲和层析柱进行亲和纯化后即得到重组单克隆抗体。
根据实施例2所述方法，检测各重组抗体与八种型别的腺病毒的六邻体蛋白的结合能力。图2示出了重组抗体A18与八种型别的腺病毒的六邻体蛋白的结合曲线。从图中可以看出，重组抗体A18结合八种型别的腺病毒的六邻体蛋白的能力也很强，而与对照(新冠病毒Np蛋白)不结合，抗体特异性好。除抗体A18之外，其他八种单克隆抗体得到能够与八种型别的腺病毒的六邻体蛋白结合，但不与新冠病毒Np蛋白的类似结果(结果未示出)。
进一步地，通过软件分析上述ELISA结果，获得九种重组抗体的EC50(nM)值，分别如下表3所示。
表3：重组抗体与八种型别的腺病毒的六邻体蛋白的EC50(nM)值
重组抗体 1型 2型 3型 4型 7型 40型 41型 55型
A54 0.481 0.357 0.311 0.426 0.301 0.589 0.614 0.276
A15 0.348 0.413 0.292 0.474 0.328 0.615 0.607 0.331
A5 0.459 0.466 0.306 0.339 0.292 0.507 0.535 0.347
A7 0.421 0.418 0.427 0.544 0.527 0.302 0.323 0.456
A13 0.347 0.327 0.458 0.612 0.421 0.306 0.284 0.518
A1 0.472 0.357 0.276 0.531 0.323 0.608 0.601 0.303
A27 0.328 0.362 0.299 0.432 0.307 0.608 0.605 0.284
A18 0.291 0.291 0.271 0.333 0.414 0.312 0.315 0.333
A8 0.329 0.335 0.532 0.302 0.507 0.638 0.614 0.613
从表3给出的数据可以看出，九个重组抗体与各型别的腺病毒的六邻体蛋白亲和力都在nM级，亲和力与其来源的单克隆抗体基本类似。
实施例5：双夹心ELISA法验证重组抗体灵敏性
在本实施例中，使用本发明的一个重组抗体(第一抗体)作为标记抗体，使用本发明的另一个重组抗体(第二抗体)为包被抗体，进行以下步骤：
a)以辣根过氧化物酶(HRP)标记第一抗体，得到第一抗体-HRP偶合物。
b)采用双抗体夹心ELISA根据以下步骤验证第一抗体-HRP的灵敏性：
包被：用pH 9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释包被抗体/第二抗体，使其浓度为1μg/mL，以100μL/孔加入至96孔酶标板，于4℃包被过夜，在自动洗板机上用PBST洗涤3次，拍干；
封闭：每孔加入120μL封闭液(含2％ BSA的PBST)，37度封闭2小时，甩干晾干后待用；
加样：分别加入待测样本和阳性对照、阴性对照各50μL，置37℃孵育60min；
加酶：将第一抗体-HRP偶合物按照一定浓度加入酶稀释液中，混匀。每孔加入50μL，置37℃温育30min；
洗涤：拍去孔板中液体，洗板5次；
显色：每孔加入显色剂TMB底物100μL，轻轻振荡混匀，室温避光显色30min；
终止：每孔50μL/孔加入2mol/L硫酸终止反应，轻轻振荡混匀；
读值：在酶标仪上，于450nm，630nm处读取OD值；
将重组六邻体蛋白从100ng/mL开始倍比稀释若干梯度，然后使用本发明的重组抗体检测不同浓度的六邻体蛋白，同时稀释相同浓度的(新冠病毒Np蛋白)作为对照。以新冠病毒Np蛋白的检测值作为标准，以检测值大于或等于相同新冠病毒Np蛋白浓度检测值的2.1倍的六邻体蛋白的最低浓度作为本方法检测该抗原的灵敏度。九种重组单克隆抗体的检测结果如下表4所示。
表4：本发明的重组单克隆抗体检测不同浓度的重组六邻体蛋白的结果
由表4的结果可知，即使将重组腺病毒六邻体蛋白的浓度稀释至10pg/mL(即0.01nm/mL)时，由本发明的抗体得到的ELISA检测结果仍是相应浓度的新冠病毒Np(作为对照)的约3-5倍，因此根据上述判断标准，本发明的抗体检测八种型别的腺病毒的重组六邻体蛋白的最低浓度可达10pg/mL。这一结果也证明了本发明的重组单克隆抗体具有良好的亲和力和极高的灵敏度。
实施例6：胶体金免疫层析测试
在本实施例中，使用本发明的一个重组抗体(第一抗体)作为为标记抗体，使用本发明的另一个重组抗体(第二抗体)，进行胶体金免疫层析测试。
胶体金制备：在三角烧瓶中加入200ml超纯水，加热至沸腾，加入1ml 2％氯金酸(Sigma-Aldrich公司，货号：16961-25-4)溶液，沸腾后立刻加1ml 2％柠檬酸三钠(Sigma-Aldrich公司，货号：6132-04-3)水溶液，继续搅拌沸腾10分钟，自然冷却备用。
标记胶体金偶合物：取10ml上述胶体金放入烧杯中，搅拌中加入140μL的0.2MK2CO3调节pH至7.4，继续搅拌10秒；加入100μg第一抗体，继续搅拌5分钟；加入0.1ml 10％BSA，继续搅拌5分钟；12000g离心10分钟，弃掉上清，将沉淀用胶体金稀释液(10mM PB，150mM NaCl，0.2％BSA，0.1％TritonX-100，3％Sucrose，0.01％Proclin300)定容至1ml，作为抗腺病毒六邻体蛋白抗体胶体金复合物。
制备胶体金垫：将上述胶体金复合物分别用胶体金稀释液10倍稀释后浸泡玻璃纤维(上海金标公司)，冻干，即制成金标垫。
硝酸纤维素膜(NC膜)包被：稀释第二抗体至1.2mg/ml，制成检测线工作液，用点膜仪划线到硝酸纤维素膜(Millipore公司，货号：HF135002)的相应位置上，50℃干燥1小时，备用。
胶体金免疫层析测试试剂条的组装：将上述金标垫、包被有抗体的硝酸纤维素膜、吸水纸、聚酯板、样品垫料组装成胶体金免疫检测试剂条。
灵敏度检测：检测不同浓度的八种型别的腺病毒的六邻体蛋白抗原样本。具体地，将80μl待测样本滴加至样品垫处，室温放置10-15分钟，判定结果。根据显示条带颜色的深浅，可以指示出样本中抗原与抗体结合的活性。将胶体金试纸反应显色的T线条带颜色与标准色卡进行比较，选出最接近的颜色，将该颜色对应的色号的档数来标记产物的活性。结果如下表5所示。
表5：本发明的重组单克隆抗体对八种型别的腺病毒的六邻体蛋白的检测结果
*A1/A2，其中A1表示第一抗体，A2表示第二抗体。
由上述结果可知，当本发明的重组单克隆抗体组装为胶体金层析试剂时，对八种型别的腺病毒的六邻体蛋白的最低检出限可达100pg(C8)。
特异性检测：使用本发明的重组单克隆抗体制备的试剂条对500份健康人群的鼻咽拭子样品进行测试。结果显示，本发明的重组单克隆抗体制备的试剂条无假阳性结果，特异性为100％。

Claims (19)

1.一种抗腺病毒单克隆抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中，
a）所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO: 12-14所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO: 15-17所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；或者
b）所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO: 18-20所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO: 15、SEQ IDNO: 16和SEQ ID NO: 21所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗腺病毒单克隆抗体，其中，
a）所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO: 50所示的序列或与SEQ ID NO：50所示的序列具有80%以上一致性的序列，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO: 51所示的序列或与SEQ ID NO：51所示的序列具有80%以上一致性的序列；或者
b）所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO: 52所示的序列或与SEQ ID NO：52所示的序列具有80%以上一致性的序列，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO: 53所示的序列或与SEQ ID NO：53所示的序列具有80%以上一致性的序列。
3.一种核酸分子，其编码权利要求1或2所述的抗腺病毒单克隆抗体。
4.一种载体，其包含权利要求3所述的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的载体，其中，所述载体为质粒载体。
6.根据权利要求5所述的载体，其中，所述质粒载体为pEE12、pCAGGS、pTOPO、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ中的任一种。
7.根据权利要求5所述的载体，其中，所述质粒载体为pCDNA3.1。
8.一种表达细胞，其包含权利要求3所述的核酸分子或权利要求4-7中任一项所述的载体。
9.根据权利要求8所述的表达细胞，其中，所述表达细胞为哺乳动物细胞。
10.根据权利要求9所述的表达细胞，其中，所述哺乳动物细胞选自中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞、人胚胎肾细胞。
11.一种检测腺病毒的方法，所述方法用于非诊断目的，包括使用权利要求1或2所述的抗腺病毒单克隆抗体的步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述检测是通过免疫层析法、酶标抗体法、化学发光法、电化学发光法来进行的。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述免疫层析法包括荧光微球免疫层析法、胶体金免疫层析法、基于彩色乳胶微球的免疫层析法、时间分辨荧光微球免疫层析法、磁性微球免疫层析法及量子点免疫层析法。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述酶标抗体法为直接法、间接法、夹心法和竞争法。
15.根据权利要求1或2所述的抗腺病毒单克隆抗体在制备用于检测腺病毒的试剂中的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其中，所述检测是通过免疫层析法、酶标抗体法、化学发光法、电化学发光法来进行的。
17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述免疫层析法包括荧光微球免疫层析法、胶体金免疫层析法、基于彩色乳胶微球的免疫层析法、时间分辨荧光微球免疫层析法、磁性微球免疫层析法及量子点免疫层析法。
18.根据权利要求16所述的用途，其中，所述酶标抗体法为直接法、间接法、夹心法和竞争法。
19.一种用于检测腺病毒试剂盒，其包括权利要求1或2所述的抗腺病毒单克隆抗体以及使用说明。
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