CN116769786A - 飞蝗气味结合蛋白LmOBP11基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了飞蝗气味结合蛋白LmOBP11基因及其编码蛋白与应用。本发明LmOBP11基因的核苷酸基序列如SEQ ID NO.1、氨基酸序列如SEQ ID NO.2;本发明LmOBP11基因可调节昆虫免疫力,通过激活其表达可以降低飞蝗对绿僵菌的免疫力,尤其苯乙醇和绿僵菌的混合使用可更好防控飞蝗,从而提高对农作物的保护。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,具体涉及飞蝗气味结合蛋白LmOBP11基因及其编码蛋白与应用。
背景技术
昆虫依赖嗅觉来寻找食物、栖息地以及配偶等。昆虫的嗅觉识别过程被认为是通过一类在昆虫嗅觉组织中高表达的化合物结合相关蛋白,尤其气味结合蛋白(odorantbinding proteins,OBPs)和化学感知蛋白(chemosensory proteins,CSPs),识别进入嗅觉淋巴液中的脂类、醇类、脂肪酸类等小分子化合物后将其携带到嗅觉受体(odorantreceptors,ORs)上来调节昆虫的行为应答。然而,越来越多研究发现一些嗅觉蛋白除了在嗅觉组织中高表达外,在昆虫免疫组织包括血细胞、脂肪体中也广泛表达,且病原微生物的侵染以及共生菌的定植均能引起昆虫嗅觉相关蛋白发生显著差异表达。这暗示昆虫嗅觉蛋白除了发挥行为调控作用外,可能在免疫调控中也发挥重要作用。
昆虫病原真菌在害虫绿色防控中具有重要应用潜力,但面临杀虫速度慢、防效不稳定等不足。杀虫速度慢与防效不稳定受真菌毒力、环境因素及寄主防卫体系等多方面因素影响。一方面,一些昆虫被认为可以通过识别真菌释放的挥发性化合物来调节自身的趋避行为。基于昆虫气味结合蛋白与真菌化合物的结合能力,可以用于筛选调节昆虫趋避行为的关键化合物,进而开发成昆虫趋避剂。另一方面,通过研究嗅觉蛋白在调节昆虫与病原真菌免疫互作中的作用,有望开发作用于害虫嗅觉蛋白的高效真菌杀虫剂。飞蝗(Locustamigratoria)是一种重要的作物害虫,一旦发生蝗灾,大量的飞蝗会吞食禾田,使农产品完全遭到破坏,引发严重的经济损失以致粮食短缺。绿僵菌(M.anisopliae)是广谱的昆虫病原菌,据统计,绿僵菌寄主昆虫达200种以上,能寄生金龟甲、象甲、金针虫、鳞翅目害虫幼虫和半翅目蝽象等。绿僵菌对人畜无害,对天敌昆虫安全,不污染环境。然而,绿僵菌同样面临杀虫速度慢、防效不稳定等不足,增强绿僵菌对飞蝗的毒力具有重要意义。通过基于昆虫嗅觉蛋白调节昆虫与病原真菌互作机制从而获得飞蝗趋避与高效杀虫真菌是一种长效、高效的抵御害虫的方法。本发明基于害虫嗅觉蛋白(飞蝗LmOBP11蛋白)调节昆虫(飞蝗)与病原真菌(绿僵菌)互作得到嗅觉蛋白的新应用,并获得了增强绿僵菌对飞蝗的毒力的方法。
发明内容
鉴于此,本发明的目的之一是提供飞蝗气味结合蛋白LmOBP11基因,其特征在于,LmOBP11基因的碱基序列与SEQ ID NO.1的序列相似性在90%以上。
优选地,LmOBP11基因的碱基序列与SEQ ID NO.1的序列相同。
本发明的目的之二是提供飞蝗气味结合蛋白LmOBP11基因编码的蛋白,其特征在于,LmOBP11基因的蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO.2的序列相似性在80%以上。
优选地,LmOBP11基因的蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO.2的序列相同。
由于飞蝗物种较多,不同飞蝗中该基因的序列不会完全相同,因此与SEQ ID NO.1序列和SEQ ID NO.2序列相似性较高(相似性分别大于90%和80%)的基因序列均为该基因。
本发明的目的之三是提供飞蝗气味结合蛋白LmOBP11基因在调节昆虫免疫力中的应用。LmOBP11基因的碱基序列与SEQ ID NO.1序列相似性大于90%,氨基酸序列与SEQ IDNO.2序列相似性大于80%均具有调节昆虫免疫力的功能。
优选地,LmOBP11基因在降低飞蝗对绿僵菌免疫力中的应用。LmOBP11基因的碱基序列与SEQ ID NO.1相同、氨基酸序列与SEQ ID NO.2相同。
优选地,LmOBP11基因在降低飞蝗对绿僵菌免疫力中的应用中使用的绿僵菌中混有苯乙醇(PEA)。通过加入苯乙醇,苯乙醇浓度甚至低至0.000001mol/L,均可以诱导飞蝗LmOBP11基因的表达,从而降低抵御免疫效应基因(defensin)的表达,最终导致飞蝗对绿僵菌的免疫力降低,从而防控飞蝗。
优选地,使用的苯乙醇的浓度小于1mol/L,使不影响绿僵菌的正常生长。
本发明的目的之四是提供一种抵御飞蝗的方法,通过在需要抵御的地方使用苯乙醇和绿僵菌的混合物达到抵御作用。可以将苯乙醇和绿僵菌的混合物喷洒在作物上,也可以加入土壤中或者制备成其他制剂,从而防御飞蝗。
优选地,苯乙醇的浓度小于1mol/L,使不影响绿僵菌的正常生长。而且喷洒苯乙醇和绿僵菌的混合物的方法简单、重复性高,可定期进行,有效抵御飞蝗。飞蝗对苯乙醇具有明显的趋避行为,最低趋避浓度为0.01mol/L,在具体使用时,苯乙醇的浓度在1mol/L以下均可,若苯乙醇浓度高(0.01-1mol/L),LmOBP11基因结合苯乙醇使飞蝗产生趋避,保护农作物,浓度低(<0.01mol/L)仍可诱导飞蝗LmOBP11基因的表达,从而降低飞蝗对绿僵菌的免疫力,致死率更高。
本发明飞蝗气味结合蛋白LmOBP11基因,尤其是序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示,利用该基因的蛋白结合气味分子苯乙醇从而产生趋避,同时苯乙醇还能激活该基因的表达,而该基因的表达将降低defensin基因的表达从而降低飞蝗对绿僵菌的免疫能力,提升对飞蝗的抵御,从而提高对农作物的保护,减少农作物的损失。
附图说明
图1为本发明LmOBP11基因的RNAi效率分析图;
图2为本发明LmOBP11蛋白的表达和纯化图;
图3为本发明LmOBP11蛋白对气味分子的结合分析图;
图4为本发明飞蝗对苯乙醇的触角电生理应答分析图和趋避分析图;
图5为本发明LmOBP11沉默飞蝗抵抗绿僵菌侵染能力分析图;
图6为本发明LmOBP11沉默对真菌侵染后不同飞蝗组织的免疫效应基因(defensin)表达影响图;
图7为本发明苯乙醇对LmOBP11基因表达的影响和苯乙醇和M.anisopliae单独或混合处理对飞蝗存活的影响图。
具体实施方式
下面将结合实施例和附图来详细说明本发明,这些实施例和附图仅起说明性作用,并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例,凡不违背本发明精神所做出的修改及变形,均应包括在本发明范围之内。
实验例1:飞蝗气味结合蛋白LmOBP11基因的克隆和生物信息学鉴定
按照Trizol reagent(Takara,Japan)说明书提取东亚飞蝗的总RNA并使用Reverse transcription kit(Thermofisher,USA)反转录为cDNA。以飞蝗的cDNA为模版,PCR扩增LmOBP11基因的ORF得到。PCR扩增用引物对为:
正向引物:5’-TCGCCTACCGTCGCCACCAT-3’
反向引物:5’-CAACGTATTCTTCAAATTCTCTTGA-3’
PCR扩增的反应体系为2000ng/μL cDNA模板1μL、2×金牌mix(green)25μL、10μM正向引物2μL、10μM反向引物2μL,RNase Free ddH2O补充至50μL;反应程序为98℃3min;98℃10s,57℃15s,72℃30s,35个循环;72℃5min,4℃保持。
PCR扩增获得的片段亚克隆至pUC19-T vector后测序获得飞蝗气味结合蛋白LmOBP11基因序列,即SEQ ID NO.1,对应的LmOBP11蛋白序列为SEQ ID NO.2,LmOBP11蛋白是由155个氨基酸组成的蛋白质,蛋白分子量为16.43KDa,等电点为4.56,含有信号肽20aa。
实验例2:飞蝗LmOBP11基因RNAi沉默
根据特异性和RNAi效率分析设计了LmOBP11的dsRNA基因沉默靶序列,设计dsRNA引物序列5’-AGCGATGTAAAAGCCTGCAT-3’,5’-AGCAGTTGGCAACGATGACT-3’。使用MEGAscript转录试剂盒(Ambion,Austin,TX,USA)合成LmOBP11/GFP的dsRNA。简要地,通过PCR扩增dsRNA模板,并使用胶纯化试剂盒纯化dsRNA。将dsRNA模板与相应反转录试剂在体外转录反转录获得dsRNA。使用LiCl溶液沉淀dsRNA产物。用DNase消化该产物中的DNA模板,并进行苯酚/氯仿抽提纯化目标产物。通过NanoVue Plus分光光度计(GE Healthcare LifeSciences,Little Chalfont,英国)计算获得的dsRNA浓度。将5μL dsRNA溶液(300ng/μl)注射到飞蝗血淋巴中。为了测试dsRNA的敲除效率,分别在注射dsRNA后的3天和7天随机选择五只飞蝗,解剖其触角分析目的基因相比对照处理的表达量。如图1所示,以GFP dsRNA处理为对照,LmOBP11 dsRNA处理和LmOBP11dsRNA+M.anisopliae(绿僵菌)处理的飞蝗中LmOBP11的RNAi效率结果为:在注射后3天以及7天后,LmOBP11的转录水平均降低到了对照组的10%左右,表明LmOBP11基因被有效沉默。
实验例3:LmOBP11识别飞蝗趋避相关气味物质
1、重组LmOBP11蛋白的表达和纯化
将LmOBP11开放阅读框将去除对应信号肽序列后克隆到pET32a载体(Novagen,Darmstadt,Germany)中,并转化到大肠杆菌BL21菌株中。本基因对所述重组载体的骨架载体没有特殊限制,采用本领域所熟知的表达载体即可。选择在LB琼脂平板(100μg/mL,氨苄青霉素)上生长的单个阳性菌落,并在5mL LB液体培养基(100μg/mL,氨苄青霉素)中于37℃下以220rpm振荡培养过夜。将细胞培养物接种在500mL LB/氨苄青霉素液体培养基中,直到OD(600nm)达到0.6至0.8。然后,将0.5mM IPTG添加到培养物中,在11℃以220rpm/min振荡过夜,诱导蛋白表达。通过以3,000rpm的转速离心收集细胞沉淀并重悬于HEPES缓冲液(10mM HEPES、100mM NaCl、pH 7.5)中。在14,000rpm和4℃下超声和离心30分钟后,分别收集上清液和沉淀。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证实重组蛋白为可溶(图2(A))。使用His-trap亲和柱(Cobalt Chelating Resin,G-Biosciences,USA)纯化该蛋白。用含有逐渐增加的咪唑从50mM到500mM的HEPES缓冲液洗脱结合的蛋白质。电泳分析后将含有重组蛋白的溶液合并,并在4℃下用3 L HEPES缓冲液透析3次,过夜。His-tag抗体(Thermofisher,USA)用于进行蛋白质印迹以进一步确认重组蛋白的大小,如果图2(B)所示,蛋白大小与理论值相符。
2、重组LmOBP11蛋白对气味分子的结合实验
检测LmOBP11蛋白对气味分子(即6种绿僵菌挥发性化合物:2-乙氧基乙醇、乙二醇乙酸酯、苯乙醇、2-正己基楑酸、n-十六烷酸和2,4-二叔丁基苯酚)的结合情况,使用重组LmOBP11蛋白,并采用荧光竞争性结合进行。荧光竞争性结合实验预先测定LmOBP11与荧光探针1-NPN的适用性分析,LmOBP11与1-NPN的荧光值随1-NPN浓度的增加均存在饱和效应,表明LmOBP11具有单一的结合位点,可用于荧光竞争性结合力测定,LmOBP11与1-NPN的结合常数K1-NPN=11.62μM。以1-NPN作为荧光探针进行配体气味分子的竞争结合实验,结果表明LmOBP11对2-乙氧基乙醇(Ki=3.62μM)的结合力最强,其次为乙二醇乙酸酯(Ki=7.23μM)和苯乙醇(Ki=9.37μM),2-正己基楑酸(Ki=10.76μM),n-十六烷酸(Ki=15.37μM),对2,4-二叔丁基苯酚结合能力最弱(Ki=20.58μM)(图3)。
3、基于触角电生理分析的飞蝗对苯乙醇的识别能力实验
将飞蝗触角切下后插入带有两个银电极(记录电极和参比电极)的玻璃毛细管中,通过EAG系统(荷兰Syntech)分析EAG应答。放大的电生理信号由基于Syntech PC的信号处理系统(Kirchzarten,Germany)记录。剂量效应实验中,分别使用五个不同浓度的苯乙醇(10-4、10-3、10-2、0.1和1mol/L),每个剂量在每个触角上每隔1分钟测试一次,共测试五次。在每组飞蝗中,分别分析了至少5只飞蝗的不同触角。结果表明,LmOBP11沉默飞蝗对不同浓度(10-4mol/L-0.1mol/L)2-苯乙醇的电生理应答能力显著降低,但对1mol/L苯乙醇的电生理应答与对照相比并无显著差异)(图4A)。
4、飞蝗趋避行为实验
每个密闭的正方形笼子包含15只飞蝗,在笼子对角线处分别放入一盘PEA+麦麸(乙醇溶解的1mL 0.01mol/L PEA溶液与1.5g麦麸混合)以及一盘1mL乙醇+1.5g麦麸混合,黑暗条件下进食12小时后,分别计算食物消耗量。结果表明,对照组飞蝗对苯乙醇具有明显的趋避行为,最低趋避浓度为0.01mol/L,相反LmOBP11沉默飞蝗对苯乙醇的趋避能力相比对照组飞蝗显著降低(图4B)。
实施例4:LmOBP11在调节飞蝗免疫应答中的作用
1、LmOBP11 RNAi可提高飞蝗在绿僵菌侵染下的存活率
LmOBP11 RNAi飞蝗在注射dsRNA的3天后,接种绿僵菌孢子,然后每隔12小时计算存活率。结果表明,不接种绿僵菌孢子,LmOBP11 RNAi不会影响飞蝗的存活率(GFP RNAi为对照)(图5A),而接种绿僵菌孢子,与单独绿僵菌侵染组相比,LmOBP11 RNAi组飞蝗的存活率显著提高(图5A),而且半致死时间延长约0.5天(图5B)。
2、定量PCR分析LmOBP11沉默飞蝗的免疫效应基因(defensin)
对飞蝗进行GFP RNAi、GFP RNAi+M.anisopliae、LmOBP11 RNAi、LmOBP11 RNAi+M.anisopliae处理,GFP RNAi组为对照,然后根据RT-qPCR标准程序进行定量PCR实验检测免疫效应基因(defensin)的表达。定量PCR使用的试剂为Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseHPlus)试剂盒(TaKaRa,Shiga,Japan)。使用的定量PCR仪为iCycler iQ实时PCR检测系统(Bio-Rad,Hercules,CA)。反应条件如下:95℃ 3分钟,95℃ 15s和65℃ 30s的40个循环。如图6所示,结果表明:在不同飞蝗组织(表皮、血细胞、脂肪体和触角)中,绿僵菌侵染的飞蝗的免疫效应基因的表达均升高,其中飞蝗表皮和脂肪体中的defensin的表达更高,尤其是在表皮和脂肪体中LmOBP11 RNAi+绿僵菌侵染组的免疫效应基因表达极其显著。表明LmOBP11沉默,提高了绿僵菌侵染的飞蝗的免疫效应基因的表达,与本实施例第1点的存活率提高结果一致。
3、苯乙醇能激活LmOBP11表达
使用不同浓度PEA(0.0001mol/L和0.000001mol/L)注射到飞蝗体内,定量PCR检测飞蝗不同组织(触角、表皮、血细胞和脂肪体)中LmOBP11表达的变化,如图7A所示,各组织LmOBP11表达均有升高,其中脂肪体中提高更多。表明PEA能激活LmOBP11基因表达。进一步地,检测defensin基因的表达情况,如图7C所示,PEA处理使defensin基因的表达降低。
将终浓度为0.0001mol/L的PEA与5μL M.anisopliae孢悬浮液单独活混合注射到飞蝗体内,每天检测飞蝗的存活数量。PEA和M.anisopliae混用组的飞蝗的存活率比单独的M.anisopliae处理组有降低(图7B)。表明,绿僵菌与苯乙醇共同使用能提升绿僵菌的毒力,即降低飞蝗的存活率。
需要说明的是,上述实验例中所涉及的实验操作,部分实验操作具有一定的通用性,因而未加详细描述,未详细描述部分内容参考其它实验例中相关操作或参考现有技术,不再赘述。
Claims (10)
1.飞蝗气味结合蛋白LmOBP11基因,其特征在于,所述基因的碱基序列与SEQ ID NO.1的序列相似性在90%以上。
2.如权利要求1所述的飞蝗气味结合蛋白LmOBP11基因,其特征在于,所述基因的碱基序列与SEQ ID NO.1的序列相同。
3.飞蝗气味结合蛋白LmOBP11基因编码的蛋白,其特征在于,所述编码的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.2的序列相似性在80%以上。
4.如权利要求3所述的飞蝗气味结合蛋白LmOBP11基因编码的蛋白,其特征在于,所述基因的氨基酸序列与SEQ ID NO.2的序列相同。
5.飞蝗气味结合蛋白LmOBP11基因在调节昆虫免疫力中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,LmOBP11基因在降低飞蝗对绿僵菌免疫力中的应用。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述绿僵菌中混有苯乙醇。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述苯乙醇的浓度小于1mol/L。
9.一种防控飞蝗的方法,其特征在于,在需要防控的地方使用苯乙醇和绿僵菌的混合物。
10.如权利要求9所述的应用,其特征在于,所述苯乙醇的浓度小于1mol/L,所述使用的方法为喷洒。
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