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CN116746681A - 一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)的应用 - Google Patents

一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)的应用 Download PDF

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CN116746681A
CN116746681A CN202310441540.2A CN202310441540A CN116746681A CN 116746681 A CN116746681 A CN 116746681A CN 202310441540 A CN202310441540 A CN 202310441540A CN 116746681 A CN116746681 A CN 116746681A
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China
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uric acid
clostridium
clostridium bolteae
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bacteria
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CN202310441540.2A
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宁光
李常坤
顾燕云
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SHANGHAI INSTITUTE OF ENDOCRINE AND METABOLIC DISEASES
Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Original Assignee
SHANGHAI INSTITUTE OF ENDOCRINE AND METABOLIC DISEASES
Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)的应用。本发明中发明人预料不到的发现鲍氏梭菌能在体内和体外降解尿酸。本发明相较于药物靶向肾脏促进尿液排泄或靶向肝脏抑制尿酸产生，通过本发明鲍氏梭菌通过降低肠道中尿酸来降低血尿酸对于高尿酸血症等更具安全性。

Description

一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)的应用
技术领域
本发明属于菌领域，特别涉及一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)的应用。
背景技术
尿酸代谢紊乱通常伴随促炎因子和氧化应激水平的升高，线粒体和内质网功能的损伤，肾素-血管紧张素系统的激活等；除了诱发痛风和关节炎，血尿酸升高还会诱发心血管疾病、高脂血症、高血压和2型糖尿病等代谢性疾病。多项人群队列研究显示，血尿酸升高是儿童或老年人群罹患代谢综合征的显著预测因子。高尿酸血症及其并发症明显影响患者的生活质量，已然成为影响现代人类健康的重大隐患。
高尿酸血症常用的药物有别嘌呤醇、苯溴马隆、非布索坦、氯沙坦和雷西那德等，主要作用于肝脏或肾脏，通过降低尿酸合成和促进排泄两个方面缓解高尿酸血症。然而，别嘌呤醇和非布索坦易引起终末期肾病患者的过敏反应和心血管事件而被限制使用。苯溴马隆由于严重的肝脏和肾脏毒性以及对细胞色素P450代谢酶的强烈抑制而不得不退出欧洲市场，雷西那德也有损伤肝肾的风险。现存高尿酸血症药物治疗的难题长期困扰着高尿酸血症及其相关疾病的治疗，肝脏和肾脏作为药物作用靶点有一定的缺陷，因此寻找较小副作用的高尿酸血症预防和治疗方案是目前代谢病领域的一个亟待突破的研究方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)的应用。
本发明的一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)在降解尿酸中的应用。
本发明的一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)在制备降解体外尿酸制剂中的应用。
本发明的一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)在制备降解体内血尿酸制剂中的应用。
本发明的一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)在制备降解尿酸的食品或食品添加剂中的应用。
本发明的一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)在制备治疗或预防高尿酸血症药物中的应用。
本发明的一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)在制备治疗或预防痛风疾病药物中的应用。
所述药物的制剂型包括口服液、胶囊剂、油滴剂、粉剂、片剂或注射剂。
本发明所述鲍氏梭菌为鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)DSM29485。
有益效果
本发明中发明人预料不到的发现鲍氏梭菌能在体内和体外降解尿酸。
本发明相较于药物靶向肾脏促进尿液排泄或靶向肝脏抑制尿酸产生，通过本发明鲍氏梭菌通过降低肠道中尿酸来降低血尿酸对于高尿酸血症等更具安全性。
附图说明
图1中a表CB菌发酵20h过程中尿酸含量变化；b-c分别表示CB菌发酵20h过程中尿素和NH3含量变化；其中CB组表将CB菌接种到培养基中、UA+CB组表示将CB菌接种到含有尿酸(UA)的培养基中；“*”表示显著性P<0.05；“**”表示显著性P<0.01；“***”表示显著性P<0.001；
图2中a-b表血液中尿酸和血氨浓度；c-d表24h内排泄尿液中尿酸和氨的总量；e-f表24h内排泄粪便中尿酸和氨的总量；g-h分别表示灌胃和鼠尾注射状态下，小鼠血液中尿酸实时变化情况；Control组表示只给与腹腔注射PBS的对照组、OXO组表示腹腔注射OXO，同时灌胃PBS的模型组高尿酸小鼠、OXO+CB表示腹腔注射OXO，同时灌胃CB菌的试验组小鼠；“*”表示显著性P<0.05；“**”表示显著性P<0.01；“***”表示显著性P<0.001；
图3为CB菌对肠道和肾脏尿酸转运蛋白及肝脏尿酸合成蛋白表达量的影响；其中a中OXO组代表UOX抑制剂构建的高尿酸血症小鼠模型组，OXO+CB表高尿酸血症模型小鼠灌胃CB菌组；b中XOD表示肝脏黄嘌呤氧化酶；
图4回肠组织中IL-6表达量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)DSM29485(CB菌)(德国国家菌种保藏中心DSMZ)
尿酸检测试剂盒(MAK077，美国Sigma公司)
实施例1
在本发明中如无特殊说明，表示浓度的“％”均为重量百分比，“：”均为重量比，“份”均为重量份。
(1)本发明涉及以下CB菌培养基：配置1L的发酵液需要添加如下质量或体积的物质。
表1CB菌培养基配方
混合盐溶液：CaCl2·2H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO4 1.0g，KH2PO4 1.0g，NaHCO310g，NaCl 2g，水1000mL。
(2)菌株的活化与鉴定：
取待试菌株，在CB菌培养基上划线或涂布，获取单菌落。CB菌菌落为乳白色圆形菌落，革兰氏阳性菌，细菌形态为短梭状杆菌。
将待试菌株分别接种于CB菌培养基中，厌氧条件下37℃恒温培养24h，按照2％的接种量传代培养2-3代后，取5mL对数生长末期的菌体培养物置于试管内，4℃下8000×g离心3min收集菌体，弃上清，采用微生物DNA提取试剂盒(QIGEN公司)提取菌株的基因组DNA；
以菌体DNA为扩增模板，采用通用引物PCR扩增16S rRNA基因区域，扩增产物经纯化后进行16S rRNA基因序列测定，然后通过基因序列比对和系统发育关系研究进行种属鉴定，待试菌株鉴定为鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)；
所述通用引物包括：
正向引物：
5′-CCTCTTGACCGGCGTGT-3′，如SEQ ID NO.1所示；
反向引物：
5′-CCTAGAGTGCCCAGCTTTACCTG-3′，如SEQ ID NO.2所示。
实施例2
鲍氏梭菌DSM29485在CB菌培养基中降解尿酸的测定
(1)待试菌株接种到CB培养基中活化，连续转接三次，每次37℃培养24h培养，活化三代的待试菌株以接种量1×107cfu/mL接种到含0.4mM CB菌培养基中，37℃培养20h，取发酵液以4000×g离心10min，上清液经0.22um微膜过滤，-20℃冰箱保存备用；采用尿酸检测试剂盒(Sigma公司)测定发酵上清液中尿酸浓度。
测定CB菌体外生长过程中直接降解尿酸(图1a)，尿酸的次级代谢物尿素(图1b)和氨(图1c)的含量在20h时达到最大，证明CB菌代谢尿酸生成尿素和氨等次级代谢物，该结果进一步说明CB菌直接降解尿酸是其发挥降尿酸作用的关键。
实施例3
鲍氏梭菌DSM29485在高尿酸血症小鼠体内降低血尿酸的测定：
将32只C57/6J小鼠(上海吉辉实验动物饲养有限公司)随机均分为4组，采用腹腔注射Oxonic acid(OXO)来构建高尿酸血症小鼠模型(每日腹腔注射250mg/kg·体重，连续2周，杀鼠当天连续注射3次，间隔时间为2h)。结果显示高尿酸模型组(OXO)血尿酸含量显著高于对照组(Control)(图2a)，且是对照组的两倍，证明本实验构建的高尿酸模型是成功的；OXO+CB组小鼠血尿酸含量明显低于OXO组(图2a)，说明CB菌在体内能发挥优良的降血尿酸功效。
采用代谢笼收集小鼠24h内所有的尿液和粪便，并测定其中尿酸和氨(NH3)在24h内的排泄总量。尿液中OXO+CB组较OXO组尿酸和氨的总排泄量无显著性差异(图2c-d)，说明CB菌对肾脏尿酸排泄无明显影响。粪便中OXO+CB组尿酸总量显著低于OXO组，且尿酸代谢产物NH3的总量则显著高于OXO组(图2e-f)，说明CB菌主要通过在肠道中降解尿酸来降低血尿酸水平，肠道是CB菌缓解高尿酸血症的主要靶器官。
为了评价CB菌对体内尿酸的实时控制作用，对OXO组和OXO+CB菌组小鼠口腔灌胃或鼠尾注射尿酸(8mmol/kg·只)，然后测定不同时间点血尿酸含量，结果显示CB菌干预下能降低外源尿酸引起的血尿酸升高(图2g-h)。因此CB菌可能通过阻碍肠道尿酸吸收和促进血液尿酸排泄两个方面发挥降低血尿酸的作用。
实施例4
对实施例3中小鼠的回肠、结肠组织进行蛋白免疫印迹(Western Blot)定量分析，分析尿酸转运蛋白(ATP Binding Cassette Subfamily G Member 2,ABCG2)(ab207732,美国Abcam公司)的表达量。
CB菌对肾脏尿酸排泄蛋白和肝脏尿酸合成蛋白表达无影响，其主要通过上调肠道尿酸转运蛋白ABCG2促进尿酸从肠道排泄：
CB菌干预下对肾脏尿酸转运蛋白ABCG2蛋白的表达量无明显影响(图3a)，同时CB菌组肝脏XOD蛋白表达量与其他组无显著差异(图3b)，结合CB菌干预组尿液中总尿酸排泄量与其他组无显著差异。因此推测CB菌影响尿酸代谢的主要靶点是肾脏和肝脏以外的其它靶器官。
OXO+CB组回肠ABCG2蛋白表达量明显高于OXO组(图3a)，表明CB菌可促进肠道尿酸转运蛋白ABCG2表达，再结合24h内粪便中尿酸总量降低和NH3含量显著增高的结果，可知CB菌主要通过在肠道内降解尿酸，并促进肠道尿酸转运来发挥降低血尿酸的作用。
实施例5
对实施例3中小鼠的血液采用ELISA试剂盒分析血液中IL-6的含量，进行免疫因子白细胞介素-6(IL-6)定量分析(如图4所示)。并对肠道组织的IL-6转运因子进行定量分析，结果显示，CB菌干预下显著降低了IL-6的表达，有一定的降低炎症作用。而IL-6在痛风的发病过程中起到重要的作用，因此，CB菌具有潜在的治疗痛风的作用。

Claims (8)

1.一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)在降解尿酸中的应用。
2.一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)在制备降解体外尿酸制剂中的应用。
3.一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)在制备降解体内血尿酸制剂中的应用。
4.一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)在制备降解尿酸的食品或食品添加剂中的应用。
5.一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)在制备治疗或预防高尿酸血症药物中的应用。
6.一种鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)在制备治疗或预防痛风疾病药物中的应用。
7.根据权利要求5-6任一所述应用，其特征在于，所述药物的制剂型包括口服液、胶囊剂、油滴剂、粉剂、片剂或注射剂。
8.根据权利要求1-6任一所述应用，其特征在于，所述鲍氏梭菌为鲍氏梭菌(Clostridiumbolteae)DSM29485。
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