CN116715741A - 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA16及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA16及其编码基因与应用。本发明通过水稻谷蛋白分选突变体gpa16的表型分析和目标基因的初步定位，最终克隆得到谷蛋白分选相关蛋白OsGPA16，该相关蛋白由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.3所示。本发明的谷蛋白分选相关蛋白影响水稻胚乳中谷蛋白的分选过程，将所述蛋白的编码基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，可以得到成熟谷蛋白含量正常的转基因植物，因此，本发明的蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA16及其编码基因与应用。
背景技术
水稻是世界上重要的粮食作物，它是世界上一半以上人口的主粮，在我国有60%以上的人口以大米为主食。我国的水稻育种经历了矮化育种、杂种优势利用和超级稻培育三次飞跃，不但实现种源基本自给自足，产量大幅提升，还奠定了水稻育种科研水平国际领先地位。然而，随着我国人民群众生活水平提高，人均大米消费量却有所下降，人们对优质食味、营养健康大米需求明显增加。我国稻米品质改良虽然取得显著成效，但与国外优质水稻相比仍存在一定差距。
淀粉是稻米的主要营养成分，约占水稻种子干重80%，其含量、结构、理化性质是决定稻米品质的重要因素，因此目前对稻米食味品质遗传改良通常以淀粉为主。水稻贮藏蛋白作为稻米中仅次于淀粉的第二大类营养物质，在稻米食味品质形成中的作用也不容忽视。谷蛋白是水稻贮藏蛋白的主要组成部分，约占蛋白质总含量的60%-80%，是稻米蛋白品质改良的首选目标。因此，从遗传、细胞、生化等层面解析谷蛋白合成、转运、加工、积累的遗传机制对改良稻米蛋白品质具有重要理论意义和实践价值。
谷蛋白前体积累（57H）突变体是谷蛋白前体不能进入蛋白体II或即便进入但不能被液泡加工酶切割而形成的一类遗传资源，是解析谷蛋白合成运输机理的理想遗传素材。通过对谷蛋白前体积累突变体进行基因克隆和功能研究，可以系统阐明谷蛋白从合成到沉积的分子网络途径。迄今为止，已经克隆了多个调控谷蛋白转运的关键基因，初步描绘了谷蛋白分选的分子机制，但是谷蛋白分选的完整调控网络依然不够清晰，需要我们持续定位、克隆更多关键基因来进一步揭示谷蛋白分选机制。本发明人从粳稻品种Kitaake的化学诱变突变体库中筛选获得了一个新的57H突变体gpa16，目前尚无报道关于OsGPA16蛋白参与水稻贮藏蛋白合成相关的研究。
发明内容
本发明人通过水稻谷蛋白分选突变体gpa16克隆得到谷蛋白分选相关蛋白OsGPA16，从而提供一种谷蛋白分选相关蛋白及其编码基因与应用。本发明的谷蛋白分选相关蛋白影响水稻胚乳中谷蛋白的分选过程。将所述蛋白的编码基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，可以得到成熟谷蛋白含量正常的转基因植物。本发明所述的蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。
本发明提供的谷蛋白分选相关蛋白（OsGPA16），来源于稻属水稻（Oryza sativavar.Kitaake），是如下（a）或（b）的蛋白质：
（a）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且仍具有所述功能的衍生蛋白质。
SEQ ID NO.1由695个氨基酸残基组成。
为了使（a）中的OsGPA16便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1 标签的序列
上述（b）中的OsGPA16可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的OsGPA16的编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5´端和/或3´端连上表1所示的标签的编码序列得到。
同时，本发明还提供编码上述贮藏蛋白分选相关蛋白的基因（OsGPA16）。
所述基因OsGPA16的核苷酸序列可为如下1）或2）或3）或4）：
1）SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
2）SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的核苷酸序列；
4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码谷蛋白分选相关蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO.2由2088个核苷酸组成。
含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体可为在pCAMBIA1305.1载体的多克隆位点EcoRI和NcoI之间重组插入所述基因（OsGPA16）得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为pCAMBIA1305.1-OsGPA16；所述pCAMBIA1305.1-OsGPA16是将由OsGPA16基因组编码序列连同上游2113bp的启动子区和下游891bp的片段通过重组技术插入到pCAMBIA1305.1多克隆位点EcoRI和NcoI之间得到的(Takara公司，In-fusion重组试剂盒)。
将含有OsGPA16的pCAMBIA1305.1命名为pCAMBIA1305.1-OsGPA16。
含有以上任一所述基因（OsGPA16）的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种培育谷蛋白分选正常的转基因植物的方法，该方法是将所述基因导入谷蛋白分选异常的植物中，得到谷蛋白分选正常的转基因植物；所述谷蛋白分选异常植物为胚乳中谷蛋白前体剧增并伴随成熟谷蛋白含量降低的植物；所述谷蛋白分选正常的转基因植物为谷蛋白前体能被正常加工成为成熟谷蛋白的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入谷蛋白分选异常植物中；所述谷蛋白分选异常植物可为GPA16蛋白功能缺陷突变体。
所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。
本发明的谷蛋白分选相关蛋白影响水稻胚乳中谷蛋白的分选过程。将所述蛋白的编码基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，可以得到成熟谷蛋白含量正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。
附图说明
图1 野生型Kitaake和突变体gpa16的外观表型，其中，A为Kitaake和gpa16干种子以及胚乳横切表型，B为Kitaake和gpa16胚乳横切扫描电镜图片；
图2 野生型Kitaake和突变体gpa16SDS-PAGE和Western blot分析，其中，A为Kitaake和gpa16胚乳贮藏蛋白组分SDS-PAGE图，B为Kitaake和gpa16谷蛋白Western-Blot分析图；
图3 野生型Kitaake和突变体gpa16发育胚乳的半薄切片观察，其中，A为Kitaake和gpa16发育中期胚乳半薄切片考马斯亮蓝染色结果，B为Kitaake和gpa16发育中期胚乳半薄切片免疫荧光分析；
图4 野生型Kitaake和突变体gpa16发育胚乳的免疫胶体金观察，其中，A-C为Kitaake和gpa16发育中期胚乳中蛋白体形态结构，D-E分别为Kitaake和gpa16发育中期胚乳中高尔基体的形态；F-J为Kitaake和gpa16发育中期胚乳中胞外空间结构差异以及壁旁体形成过程；
图5 突变基因的图位克隆，其中，A为gpa16的精细定位图，B为gpa16的突变位点；
图6 转基因互补家系的表型分析，其中，A为Kitaake和gpa16以及转基因互补家系干种子以及胚乳横切表型，B为Kitaake和gpa16以及互补家系贮藏蛋白组分SDS-PAGE图，C为Kitaake和gpa16以及互补家系发育中期胚乳厚切片细胞壁染料染色观察结果；
图7 pCAMBIA1305.1载体图谱。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：水稻中谷蛋白分选相关蛋白及其编码基因的发现
一、水稻谷蛋白分选突变体gpa16的表型分析
在粳稻品种kitaake的化学诱变突变体库中筛选出籽粒粉质的突变株系gpa16。与野生型相比，gpa16的主要特征是籽粒粉质，不透明（见图1中A）。扫描电镜分析证实gpa16中淀粉颗粒松散，可能是导致胚乳粉质不透明的主要原因（见图1中B）。gpa16种子蛋白的SDS-PAGE图谱显示谷蛋白57 kDa前体增加，相应成熟的谷蛋白酸性亚基和碱性亚基含量降低，同时球蛋白含量也有所降低（见图2中A）。Western blot分析证实了gpa16中成熟的谷蛋白酸性亚基含量降低（见图2中B）。
发育中期胚乳半薄切片经过考马斯亮蓝染色后观察发现，野生型存在两类蛋白体，球形的蛋白体I和不规则形状的蛋白体II，蛋白体II略大于蛋白体 I（见图3中A左图，箭头标示蛋白体I，三角标示蛋白体II）。而在gpa16中蛋白体II相比野生型形状更加不规则（见图3中A右图，三角标示）。有趣的是，在gpa16中除上述两种蛋白体外，在细胞壁附近还发现一类填充有大量蛋白质的壁旁体类结构（见图3中A右图，虚线框标示）。进一步的发育中期胚乳半薄切片免疫荧光实验也验证了上述结果（见图3中B）。以上结果表明gpa16突变体中的蛋白体II发育异常，大量蛋白质填充在细胞壁附近形成的壁旁体类结构中。
为了解析壁旁体类结构的形成过程，利用透射电镜结合免疫胶体金技术观察了发育中期的胚乳（见图4）。与半薄切片观察到的细胞学结果一致，gpa16中蛋白体II填充物形状不规则，内容物比野生型更少（图4中A-C）。研究表明谷蛋白的后高尔基体运输由致密囊泡介导，突变体gpa16中致密囊泡可以从高尔基体正常出芽，与野生型一致（图4中D和E）。然而，有趣的是，gpa16中大量致密囊泡错误分选到胞外体空间，逐渐积累并形成大的壁旁体类结构（图4中F-J）。
综上所述，上述结果证实gpa16中负责运输谷蛋白的致密囊泡发生错误分选，进而导致大量谷蛋白前体进入质外体空间而不能被切割为成熟的酸性亚基和碱性亚基。
二、目标基因定位
1、目标基因的初步定位
利用突变体gpa16与广亲和品种Dular（购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库）杂交，在gpa16/Dular的F2分离群体中选取10粒gpa16表型（籽粒粉质不透明且谷蛋白前体增加）的隐性极端个体，抽提种子DNA。利用覆盖水稻全基因组的引物进行连锁分析，将负责gpa16突变体表型的突变基因定位在第12号染色体，连锁在标记I12-10和RM270之间。
2、目标基因的精细定位
依据初定位结果，在连锁标记I12-10和RM270之间寻找公共图谱上的分子标记，并依据NCBI公布的水稻基因组序列信息在此区间自行开发连锁标记。检测自行设计的标记引物检测在Kitaake和Dular之间的多态性，表现多态者用作精细定位的分子标记。利用335个隐性极端个体对目标基因进行了精细定位（分子标记见表2）。
表2 用于精细定位的分子标记
最终将目标基因OsGPA16精细定位在连锁标记1-18和3-3之间，物理距离为185 kb（图5中A）。经过对该区间内基因进行测序，发现基因OsGPA16的第7个外显子上存在一个单碱基的替换，使得目标蛋白氨基酸发生替换（图5中B）。
三、目标基因OsGPA16的获得
提取粳稻品种kitaake叶片cDNA，以cDNA为模板，采用引物primer1和引物primer2进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，测序结果如SEQ ID NO.2所示，其编码的蛋白质如SEQID NO.1所示。
primer1：5'- ATGATTCTGTCGGCGCTCGC-3'(SEQ ID NO:16)；
primer2：5'-CTAAGACAATAGAGGTGTAG-3'(SEQ ID NO:17)。
将SEQ ID NO.1所示的蛋白质命名为OsGPA16蛋白，由695个氨基酸残基组成。将编码OsGPA16蛋白的基因命名为OsGPA16基因，其开放阅读框如SEQ ID NO.2所示。
实施例2：OsGPA16蛋白及其编码基因的应用
一、基因组互补载体的构建
将pCAMBIA1305.1载体的EcoRI和NcoI酶切位点之间的小片段替换为序列表中SEQID NO.3所示的双链DNA分子（包括OsGPA16基因上游2113bp的启动子序列和下游891bp的终止子序列），得到pCAMBIA1305.1-OsGPA16基因组互补载体（已测序验证），pCAMBIA1305.1载体图谱见图7。
二、互补转基因植物的获得
1、将步骤一得到的pCAMBIA1305.1-OsGPA16互补载体导入农杆菌EHA105菌株（美国英俊公司），得到重组农杆菌。
2、采用步骤1得到的重组农杆菌转化粳稻品种kitaake（野生型），具体步骤如下：
（1）取步骤1得到的重组农杆菌菌体，采用N6液体培养基（Sigma公司，C1416）重悬并调整菌液OD600nm为0.5；
（2）将培养至一个月的粳稻品种kitaake（野生型）成熟胚胚性愈伤组织在步骤（1）得到的菌液中侵染30 min，滤纸吸干菌液后转入含有10 g/L 琼脂的固体N6培养基（Sigma公司，C1416）中，24℃共培养3天；
（3）将步骤（2）培养的愈伤组织接种在含有10 g/L 琼脂，100 mg/L潮霉素的固体筛选N6固体培养基（Sigma公司，C1416）上培养16天（第一次筛选）；
（4）将步骤（3）培养后的健康愈伤组织接种在含有10 g/L 琼脂，100 mg/L潮霉素的固体筛选N6培养基（Sigma公司，C1416）上培养15天（第二次筛选）；
（5）将步骤（4）培养后的健康愈伤组织接种在含有10 g/L 琼脂，100 mg/L潮霉素的固体筛选N6培养基（Sigma公司，C1416）上培养15天（第三次筛选）；
（6）将步骤（4）培养后的健康愈伤组织接种在分化培养基（PhytoTechnologyLaboratories 公司，M524）上分化，得到T0代植株。
3、对步骤2得到的T0代植株进行鉴定，提取待测植株叶片的总DNA，采用引物primer3和引物primer4进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，突变位点为双峰的为转基因阳性植株。
primer3：5'-CCCCATGACGTTTATTGGCC-3'(SEQ ID NO:18)；
primer4：5'-TGCACGGTTGAGGAAGAGAT-3'(SEQ ID NO:19)。
三、表型鉴定
分别将T0代转pCAMBIA1305.1-OsGPA16植株，gpa16和野生型Kitaake种植在中国农业科学院转基因试验田内。结果显示转基因株系T2种子中出现了透明的籽粒（图6中A），SDS-PAGE检测透明种子（L1，L2）与野生型表现一样（图6中B），发育中期胚乳半薄切片考马斯亮蓝染色结果也与野生型一致（图6中C）。由此验证了转基因前的不透明粉质和谷蛋白前体增加性状是由OsGPA16基因控制的，即该OsGPA16基因为谷蛋白分选相关基因。将pCAMBIA1305.1-OsGPA16转化水稻gpa16突变体，可以使其成熟谷蛋白含量上升至正常水平。
Claims (6)
1.一种谷蛋白分选相关蛋白或其编码基因在植物育种中的应用，其特征在于，其用于将谷蛋白分选异常的植物培育成谷蛋白分选正常的转基因植物；
所述谷蛋白分选相关蛋白是由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物是烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿。
4.一种培育谷蛋白分选正常的转基因植物的方法，其特征在于，将谷蛋白分选相关蛋白的编码基因导入谷蛋白分选异常的植物中，得到谷蛋白分选正常的转基因植物；其中所述谷蛋白分选异常为谷蛋白前体异常积累；
所述谷蛋白分选相关蛋白是由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3所示。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述基因通过重组表达载体导入谷蛋白分选异常的植物中，其中所述植物是烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿。
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|---|---|
| CN (1) | CN116715741B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN120025417A (zh) * | 2025-04-16 | 2025-05-23 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA15及其编码基因与应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101855355A (zh) * | 2007-09-14 | 2010-10-06 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有提高的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 |
| CN102617717A (zh) * | 2012-03-26 | 2012-08-01 | 南京农业大学 | 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA3及其编码基因与应用 |
| CN108752441A (zh) * | 2018-05-04 | 2018-11-06 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA5及其编码基因与应用 |
| CN112521469A (zh) * | 2020-11-10 | 2021-03-19 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsD15及其编码基因与应用 |
| CN112521468A (zh) * | 2020-11-10 | 2021-03-19 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA10及其编码基因与应用 |
| CN113150090A (zh) * | 2021-02-05 | 2021-07-23 | 南京农业大学 | 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA7及其编码基因与应用 |
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2023
- 2023-08-01 CN CN202310959712.5A patent/CN116715741B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101855355A (zh) * | 2007-09-14 | 2010-10-06 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有提高的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 |
| CN102617717A (zh) * | 2012-03-26 | 2012-08-01 | 南京农业大学 | 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA3及其编码基因与应用 |
| CN108752441A (zh) * | 2018-05-04 | 2018-11-06 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA5及其编码基因与应用 |
| CN112521469A (zh) * | 2020-11-10 | 2021-03-19 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsD15及其编码基因与应用 |
| CN112521468A (zh) * | 2020-11-10 | 2021-03-19 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA10及其编码基因与应用 |
| CN113150090A (zh) * | 2021-02-05 | 2021-07-23 | 南京农业大学 | 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA7及其编码基因与应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| UNKNOWN: "GenBank: EAY83674.1，hypothetical protein OsI_38898 [Oryza sativa Indica Group]", 《GENBANK》 * |
| UNKNOWN: "NCBI Reference Sequence: XP_015620639.1, CSC1-like protein HYP1 [Oryza sativa Japonica Group]", 《GENBANK》 * |
| YULONG REN等: "GPA5 Encodes a Rab5a Effector Required for Post-Golgi Trafficking of Rice Storage Proteins", 《THE PLANT CELL》, vol. 32, no. 3, pages 758 - 777 * |
| 朱建平: "水稻谷蛋白转运关键基因GPA6和GPA8的图位克隆和功能分析", 《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》, no. 04, pages 047 - 7 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN120025417A (zh) * | 2025-04-16 | 2025-05-23 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA15及其编码基因与应用 |
Also Published As
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| GR01 | Patent grant | ||
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