CN116715733A - 一种有效抑制柑橘黄龙病病原菌增殖的抗菌肽stj-2及其应用 - Google Patents
一种有效抑制柑橘黄龙病病原菌增殖的抗菌肽stj-2及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116715733A CN116715733A CN202211275187.7A CN202211275187A CN116715733A CN 116715733 A CN116715733 A CN 116715733A CN 202211275187 A CN202211275187 A CN 202211275187A CN 116715733 A CN116715733 A CN 116715733A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stj
- antibacterial peptide
- citrus
- pathogenic bacteria
- bacteria
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 43
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 43
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 title claims abstract description 42
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 title claims abstract description 27
- LLLILZLFKGJCCV-UHFFFAOYSA-M n-methyl-n-[(1-methylpyridin-1-ium-4-yl)methylideneamino]aniline;methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C=1C=CC=CC=1N(C)\N=C\C1=CC=[N+](C)C=C1 LLLILZLFKGJCCV-UHFFFAOYSA-M 0.000 title claims abstract description 26
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 14
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 2
- CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 2,4-Hexadienoic acid, potassium salt (1:1), (2E,4E)- Chemical compound [K+].CC=CC=CC([O-])=O CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 2
- 229940069338 potassium sorbate Drugs 0.000 claims description 2
- 235000010241 potassium sorbate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004302 potassium sorbate Substances 0.000 claims description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 2
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 claims 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 claims 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 abstract description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 17
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 abstract description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 abstract description 3
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 abstract description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 28
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 28
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 241000526125 Diaphorina citri Species 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 240000002319 Citrus sinensis Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 2
- 241001633102 Rhizobiaceae Species 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 241001135756 Alphaproteobacteria Species 0.000 description 1
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241001478315 Candidatus Liberibacter asiaticus Species 0.000 description 1
- 241001448411 Dracaena draco Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241001478324 Liberibacter Species 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000589157 Rhizobiales Species 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 244000000005 bacterial plant pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000004665 defense response Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- FPAFDBFIGPHWGO-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxomagnesium;hydrate Chemical compound O.[Mg]=O.[Mg]=O.[Mg]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O FPAFDBFIGPHWGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000000447 pesticide residue Substances 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004063 propylene glycol Drugs 0.000 description 1
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
- A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
- A01N43/50—1,3-Diazoles; Hydrogenated 1,3-diazoles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
- A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
- A01P21/00—Plant growth regulators
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种有效抑制柑橘黄龙病病原菌增殖的抗菌肽STJ‑2及其应用。本发明提供的抗菌肽STJ‑2具有广谱抗菌活性、低毒性且可用于抑制柑橘黄龙病菌，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的抗菌肽STJ‑2对柑橘黄龙病病原菌(革兰氏阴性细菌‑韧皮部杆菌)具有良好的抑制效果；药后罹病柑橘植株病原菌减少、整体长势良好。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种有效抑制柑橘黄龙病病原菌增殖的抗菌肽STJ-2及其应用。
背景技术
柑橘黄龙病Huanglongbing,HLB是柑橘产业最严重的毁灭性病害。最早在18世纪，印度中部和东北部就有疑似黄龙病症状的记载，称为“梢枯病”。目前在中国的11个省区已经发现柑橘黄龙病。因其具有难发现，传播快，无法根治，毁灭性强等特点，严重地威胁着柑橘产业的发展。目前，针对柑橘黄龙病的防治主要是采取“三板斧”综合防控技术，即砍除病株，种植无毒苗，防治亚洲柑橘木虱。
柑橘黄龙病菌是一种限于韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌，属于变形菌门(Proteobacteria)，α-变形菌纲(Alpha proteobacteria)，根瘤菌目(Rhizobiales)，根瘤菌科(Rhizobiaceae)，候选的韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter)。可分为亚洲菌株C.Liberibacter asiatium(CLas)、非洲菌株C.Liberibacter africanus(CLaf，包含一个新变种)、美洲菌株C.Liberibacter amercanus。其中亚洲种在全球分布最广、为害最大。中国发生的柑橘黄龙病亦该种引起。
目前的管理策略包括应用杀虫剂控制传播载体亚洲柑橘木虱(ACP)和抗生素治疗抑制CLas，但两者都不能有效控制HLB。因此，迫切需要创新的治疗和预防策略来对抗这种致命的柑橘疾病，以确保柑橘产业的生存。一种新的抗菌肽(AMP)，不仅具有抗菌活性，而且具有启动活性，并可以诱导柑橘的系统防御反应。这种双功能抗菌肽(AMP)可以降低HLB阳性树，抑制HLB阳性树的疾病症状激活植物对新感染的系统防御反应。
发明内容
针对现有技术普遍具有的缺陷，本发明提供了一种可以有效抑制柑橘黄龙病病原菌增殖的抗菌肽STJ-2及其应用。本发明提供的抗菌肽STJ-2对柑橘黄龙病病原菌(革兰氏阴性细菌-韧皮部杆菌)具有良好的抑制效果；此外药后罹病柑橘植株病原菌减少、整体长势良好。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种抑制柑橘黄龙病病原菌增殖的抗菌肽STJ-2，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SHVEYANLFLANLEKVLVIDEK(SEQ ID NO.1)；
本发明还提供了一种编码所述抗菌肽STJ-2的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
TCACACGTCGAATACGCTAACCTGTTTCTGGCTAACCTGGAAAAGGTCTTGGTGATTGATTACAAG(SEQ ID NO.2)。
本发明还提供了一种所述的抗菌肽STJ-2在制备抑制黄龙病菌产品中的应用。
优选地，所述抗菌肽STJ-2对黄龙病菌的最低抑菌浓度为10mM。
本发明还提供了一种重组表达载体，包含编码所述氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明还提供了一种所述抗菌肽STJ-2在制备治疗黄龙病药物组合物中的应用。
优选地，所述药物组合物还包括生理盐水及药学上可接受的辅料。
优选地，所述辅料包括羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁、滑石粉、丙二醇、甘油、透明质酸、山梨酸钾中的一种或几种。
由于柑橘黄龙病的病原菌寄生于韧皮部无法进行离体培养，筛选对其有效杀菌功能的药物造成困难。使用抗生素防治植物的细菌病害被认为是一种有效的防治手段，最早在50多年前就有相关报道。研究至今已经有如下几种化学药剂被证明对柑橘黄龙病病菌有较强的杀伤性：(1)四环素，在中国，南非，菲律宾等地曾经将四环素通过躯干注射的方式运输到感病柑橘植株体内，数据表明四环素能够有效地减轻柑橘黄龙病的症状，有一定的防治效果。但是四环素杀菌效率较低，在一定时期可以有效抑制病原菌生长，并不能彻底杀死细菌。且其病菌耐药性高，若通过每年反复的长期注射，抗生素会对被处理的柑橘植株产生一定的危害。(2)青霉素，青霉素是一种具有广谱杀菌效果的抗生素。其应用于柑橘黄龙病的进一步研究表明，单独使用氨苄青霉素、羧苄青霉素、青霉素或者与链霉素共用可以抑制或者消灭黄龙病病菌。目前已经有相关国家和地区尝试使用抗生素进行柑橘黄龙病的紧急防治，但是抗生素的大量使用对环境和人体的安全问题具有很大的危害，不利于推进环境友好型、经济效益型的农业新发展。纯天然的抗菌肽STJ-2应用于防治柑橘黄龙病对环境影响小，会减少农药残留等“3R”问题。
至今没有关于STJ-2作为药剂防治柑橘黄龙病的相关报道，因此STJ-2为一种新颖的具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，尤其是对某些耐药性病原菌有灭杀作用的天然多肽药剂。本发明通过柑橘黄龙病防治对比实验表明，STJ-2是一种对柑橘黄龙病菌有较强的抑制作用的抗菌肽，抑制黄龙病菌繁殖增长具有突出效果。因此STJ-2是一种具有潜力推广于田间的柑橘黄龙病防控新型药剂。
本发明提供的具有广谱抗菌活性、低毒性且用于抑制柑橘黄龙病菌的具有抗菌活性的抗菌肽STJ-2，通过树干注射抗菌试验和叶面喷施试验中和表明，抗菌肽STJ-2对柑橘黄龙病病原菌(革兰氏阴性细菌-韧皮部杆菌)具有良好的抑制效果；此外药后罹病柑橘植株病原菌减少、整体长势良好。
与现有技术相比，本发明提供的抗菌肽STJ-2具有如下优势：本发明首次将抗菌肽STJ用于柑橘黄龙病的防治，有效抑制了黄龙病菌的增殖，低毒性低，且抗菌性广，经本发明抗菌肽治疗后，柑橘可正常生长。
附图说明
图1为抗菌肽STJ-2药剂直制加压注射过程图；
图2为注射组A、C、E药后植株长势情况图；
图3为不同处理HLB组植株平均黄龙病菌含量动态对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本发明中涉及的序列信息均于生工生物合成。
抗菌肽STJ-2输液注射法对柑橘黄龙病的防治步骤：
步骤1：制备抗菌肽STJ-2稀释注射药剂：
将抗菌肽STJ-2经化学合成后用二甲亚砜(DMSO)进行溶解，配制浓度为10mM，使用时先用1×PBS(pH7.3)稀释1000倍，即10μM，再进行枝干注射。
步骤2：制备注射装置，气动输液注射方法将STJ-2AMP溶液递送到柑橘黄龙病树中每30d-45d进行一次，每次注射5mL；
步骤3：施肥管理及其他病虫害防治
步骤4：在输液完成后利用实时荧光定量PCR检测(引物对CLas-4G/HLBr，探针HLBp)植株内每纳克DNA的黄龙病病原菌含量(个)。
试验例：
1.设置对比试验分组：对网棚已有的1-2年生种植于营养杯中的黄龙病甜橙植株进行实时荧光定量PCR检测(引物对CLas-4G/HLBr，探针HLBp)，筛选出黄龙病菌滴度和病症相似的甜橙植株30株。
每种抗菌肽设置两种使用方法：枝干加压注射和叶面喷施，每种使用方法处理6株树，另设置对照2组(加压注射和叶片喷施)，每组3株树。(6株加压注射抗菌肽STJ-1+，6株叶片喷施抗菌肽STJ-1+，6株加压注射抗菌肽STJ-2+，6株叶片喷施抗菌肽STJ-2+，3株加压注射清水CK+，3株叶片喷施清水CK)。每次枝干注射剂量为5mL，叶面喷施剂量为50mL(由于柑橘树叶片较多，需全部覆盖)。
STJ-1的氨基酸序列信息为CCNRGKNVSIGFTHIFESTFESTEGVAEYVSHPSH。
2.合成后制备抗菌肽STJ-2药剂，具体分组情况如下表1所示。
表1抗菌肽防治试验黄龙病材料分组
化学合成的STJ-1和STJ-2分别用二甲亚砜(DMSO)进行溶解，配制浓度为10mM，使用时先用1×PBS(pH7.3)稀释1000倍，即10μM，再进行枝干注射。用于叶面喷施时，还需在配制的10μM抗菌肽溶液里加入甲基化籽油表面活性剂(MSO)，并使MSO终浓度为0.5％。最终进行叶面喷施时，确保叶面完全喷透至往下滴水为止。树干注射的清水对照也需用DMSO配制和1×PBS(pH7.3)稀释，用于叶面喷施的清水对照也同样需加入MSO(终浓度0.5％)。
3.气动装置树干注射与叶面喷施用药
3.1加压注射和叶面喷施均为30d进行1次，从首次处理起，30d，60d，90d，120d，各处理1次，即共处理5次。每次处理前，每树采用叶片中脉打孔取样法采集叶片样品，每树采集固定的16张叶片上的样品，用娄兵海等报道的方法提取DNA后，进行黄龙病菌实时荧光定量PCR检测(引物对CLas-4G/HLBr，探针HLBp)。并分别拍摄记录每株植株生长情况。药剂直接加压注射过程如图1所示。
3.2枝干加压注射：注射孔为固定孔，孔深2-3mm，孔位点为根部以上5-10cm，注射头固定于注射孔上并对四周进行密封处理(类似于滞留针)，注射器为自动空气加压注射器。每次枝干注射剂量为5mL，叶面喷施剂量为50mL。
4.植株病原菌含量检测及长势情况记录
在输液完成后利用实时荧光定量PCR检测(引物对CLas-4G/HLBr，探针HLBp)植株内每纳克DNA的黄龙病病原菌含量(个)。同时定期记录其株高与长势情况调查。
实时荧光定量PCR检测体系为25μL：2×AceQ qPCR Probe Master Mix 12.5μL；5μmol/L的上游引物CLas-4G和下游引物HLBr各2μL，5μmol/L的HLBp探针1.5μL,ddH2O 5μL，模板DNA 2μL。反应条件：95℃5min；95℃30s，59℃45s，72℃90s(采荧光)，30个循环；72℃7min；序列信息如下：
CLas-4G:AGTCGAGCGCGTATGCGAAT
HLBr:GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG
HLBp:AGACGGGTGAGTAACGCG
5.试验结果：
1.施药后测量不同组植株株高
如表2所示其中注射A组STJ-1长肽的平均株高为53.4cm，B组为55.9cm，C组为注射STJ-2C为69.88cm，D组为57.5，对照组C为53.2，F组为57.1cm。注射组A、C、E药后植株长势情况如图2所示。注射STJ-1的A组HLB植株整体长势较弱植株矮小，注射STJ-2C组枝叶较多株高最高。对照组注射清水E组叶片多于A组少于C组。但是不同处理组均仍有典型的HLB黄绿斑驳型叶片，而注射STJ-2组的黄绿斑驳叶片相对变少。不同处理HLB组植株平均黄龙病菌含量动态对比如图3所示，图3中，A：注射STJ-1，B：喷施STJ-1，C：注射STJ-2，D：喷施STJ-2，E：注射清水对照，F：喷施清水对照。
表2不同处理药后平均株高
| 组别 | A | B | C | D | E | F |
| 1 | 47.4 | 57.3 | 76.3 | 37.6 | 63.3 | 56.3 |
| 2 | 54.7 | 66.2 | 76.4 | 42.5 | 53.6 | 61.8 |
| 3 | 68.3 | 69.6 | 62.5 | 55.2 | 42.7 | 53.1 |
| 4 | 37.4 | 52.9 | 89.1 | 51.9 | -- | -- |
| 5 | 54.8 | 36.8 | 46.7 | 74.3 | -- | -- |
| 6 | 57.8 | 52.6 | 68.3 | 83.4 | -- | -- |
| 平均 | 53.4 | 55.9 | 69.9 | 57.5 | 53.2 | 57.1 |
2.分子检测病原菌含量
通过荧光定量PCR检测结果显示注射抗菌肽STJ-1的A组与注射清水E组4次试验后HLB波动菌增加，注射短肽STJ-2B组则表现出病原菌持续减少趋势。因每次样品检测提取的DNA浓度不一致，通过标准曲线与函数公式计算每纳克DNA的黄龙病病原菌含量(个)。以达到矫正误差。各组中病原菌的具体含量如表2所示。
表2不同处理药后病原菌含量(copies/ng DNA)
| 组别 | 药后1M | 药后2M | 药后3M | 药后4M |
| A | 6858.37 | 4885.22 | 7977.38 | 10032.23 |
| B | 12047.66 | 6658.36 | 7635.4 | 14269.51 |
| C | 14082.39 | 7596.20 | 7071.89 | 6713.82 |
| D | 10365.06 | 9057.56 | 8936.10 | 9156.9 |
| E | 9783.45 | 3260.11 | 5868.68 | 7384.25 |
| F | 12351.52 | 7649.69 | 8846.33 | 13241.36 |
热防治曾是一种治疗柑橘黄龙病的手段，且有一定的效果，所以不同季节温差变化会改变植株黄龙病的整体病菌含量。同时柑橘黄龙病是系统性病害不同部位病原菌含量差异较大。本实验注射STJ-2AMP药剂的试验C组在不同时期不同部位叶片表现出病原菌持续减少趋势。疑似对柑橘HLB病原菌具有一定抑制作用，抑制病原菌增殖。
最后，需要说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理、性能及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种抑制柑橘黄龙病病原菌增殖的抗菌肽STJ-2，其特征在于，所述抗菌肽STJ-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码如权利要求1所述抗菌肽STJ-2的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种如权利要求1所述的抗菌肽STJ-2在制备抑制黄龙病菌产品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽STJ-2对黄龙病菌的最低抑菌浓度为10mM。
5.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的核苷酸序列。
6.一种如权利要求1所述的抗菌肽STJ-2在制备治疗黄龙病药物组合物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括生理盐水及药学上可接受的辅料。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述辅料包括羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁、滑石粉、丙二醇、甘油、透明质酸、山梨酸钾中的一种或几种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211275187.7A CN116715733A (zh) | 2022-10-18 | 2022-10-18 | 一种有效抑制柑橘黄龙病病原菌增殖的抗菌肽stj-2及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211275187.7A CN116715733A (zh) | 2022-10-18 | 2022-10-18 | 一种有效抑制柑橘黄龙病病原菌增殖的抗菌肽stj-2及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116715733A true CN116715733A (zh) | 2023-09-08 |
Family
ID=87866609
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211275187.7A Pending CN116715733A (zh) | 2022-10-18 | 2022-10-18 | 一种有效抑制柑橘黄龙病病原菌增殖的抗菌肽stj-2及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116715733A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106337059A (zh) * | 2016-09-12 | 2017-01-18 | 西南大学 | 一种改良柑桔黄龙病抗性的方法 |
| CN111246875A (zh) * | 2017-10-23 | 2020-06-05 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于治疗韧皮杆菌属病害和其它细菌性病害的组合物和方法 |
| CN112280699A (zh) * | 2020-09-28 | 2021-01-29 | 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司 | 生产戊基二羟基苯酸的方法 |
| CN113164513A (zh) * | 2018-10-01 | 2021-07-23 | 因内特免疫有限公司 | 用于治疗植物中病原性感染的组合物和方法 |
-
2022
- 2022-10-18 CN CN202211275187.7A patent/CN116715733A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106337059A (zh) * | 2016-09-12 | 2017-01-18 | 西南大学 | 一种改良柑桔黄龙病抗性的方法 |
| CN111246875A (zh) * | 2017-10-23 | 2020-06-05 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于治疗韧皮杆菌属病害和其它细菌性病害的组合物和方法 |
| CN113164513A (zh) * | 2018-10-01 | 2021-07-23 | 因内特免疫有限公司 | 用于治疗植物中病原性感染的组合物和方法 |
| CN112280699A (zh) * | 2020-09-28 | 2021-01-29 | 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司 | 生产戊基二羟基苯酸的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CHENKAI LI: "AMPlify: attentive deep learning model for discovery of novel antimicrobial peptides effective against WHO priority pathogens", BMC GENOMICS, vol. 23, pages 77 * |
| GMITTER F等: "KDO72075.1", pages 56 - 74, Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/KDO72075.1?report=genbank&log$=protalign&blast_rank=1&RID=MGB9B78D013> * |
| MINLI BAO等: "Enhancing PCR Capacity To Detect ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ Utilizing Whole Genome Sequence Information", PLANT DISEASE, vol. 104, no. 2, pages 527 - 532 * |
| 章慧璇等: "广西特有柑橘种质资源响应黄龙病菌侵染后的动态含量变化", 分子植物育种, pages 1 - 12 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ghosh et al. | Biological control of Alternaria alternata causing leaf spot disease of Aloe vera using two strains of rhizobacteria | |
| CN102405938B (zh) | 极细链格孢激活蛋白-井冈霉素可湿性粉剂及应用 | |
| EP0254419B1 (en) | An agent for preventing plant virus diseases | |
| CN111543441A (zh) | 一种生物消毒剂 | |
| CN101731220B (zh) | 壳聚糖在防治植物青枯病中的应用 | |
| CN103314980A (zh) | 一种果树枝干保护剂 | |
| KR100738647B1 (ko) | 오배자 추출물 함유하는 식물바이러스 방제제 | |
| CN114287431B (zh) | 一种含复合糖和复合氨基酸的植物免疫诱抗剂的农业用途 | |
| KR101627829B1 (ko) | 식선충 진균의 분아포자를 함유하는 소나무 재선충 방제용 조성물 | |
| CN113015432B (zh) | 包含硫酸化半乳糖的组合物及其实施方式 | |
| CN114451425A (zh) | 连翘提取物在防治猕猴桃溃疡病上的用途 | |
| CN107232238B (zh) | 一种山苍子精油在控制辣椒疫病上的应用 | |
| CN102273454A (zh) | ε-多聚赖氨酸在防治作物霉菌病害方面的应用 | |
| CN116715733A (zh) | 一种有效抑制柑橘黄龙病病原菌增殖的抗菌肽stj-2及其应用 | |
| CN111011378A (zh) | 一种利用丁子香酚和多酚铜防控植物病害方法 | |
| CN108770850A (zh) | 一种抑制水稻稻瘟病的组合物及其应用 | |
| CN108849901A (zh) | 一种用于防治马铃薯晚疫病的生物农药制剂及其制备和使用方法 | |
| CN114403146B (zh) | 普鲁兰多糖制备植物诱抗剂的应用、植物诱抗剂及方法 | |
| CN113475529B (zh) | 一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂及其制备方法和应用 | |
| CN115462386A (zh) | 一种杀菌组合物及其应用 | |
| CN1056407C (zh) | 含有枯草芽胞杆菌的活菌制剂及其在烧伤治疗中的应用 | |
| AU2020103248A4 (en) | The preparation and application of antifungal extracts from Oxytropis falcate Bunge | |
| CN1985898A (zh) | 植物中的蒽醌类衍生物在抗流感及禽流感病毒(h5n1)中的应用 | |
| Pitisom et al. | Efficacy of mangosteen peel extract and phosphonic acid on durian root rot caused by Phytophthora palmivora in vitro | |
| CN113861088B (zh) | 一种防治植物细菌性病害的化合物及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20230908 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |