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CN116694575B - 悬浮培养Marc145细胞的方法 - Google Patents

悬浮培养Marc145细胞的方法 Download PDF

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CN116694575B
CN116694575B CN202310961691.0A CN202310961691A CN116694575B CN 116694575 B CN116694575 B CN 116694575B CN 202310961691 A CN202310961691 A CN 202310961691A CN 116694575 B CN116694575 B CN 116694575B
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Shanghai Aosikang Biopharmaceutical Co ltd
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Abstract

本申请提供了一种将贴壁Marc145细胞驯化成悬浮细胞的方法，通过潮霉素抗性基因加压筛选得到稳定表达Siat7e基因的抗性细胞株，并在无血清培养基中经过单细胞的驯化实现了全悬浮细胞的增殖，经过有限稀释挑选获得了高产并且可持续性稳定传代生长的全悬浮Marc145单克隆细胞系。本申请的Marc145悬浮细胞在无血清培养基中通过优化谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸及天冬酰胺等关键成分，可以有效提高细胞生长细胞密度，悬浮培养可实现最高细胞密度达6.0×106 cells/mL~8.0×106cells/mL，本申请的方法为Marc145细胞的悬浮培养以及工业化生产疫苗奠定了基础，也为猪蓝耳灭活疫苗的工业化大生产提供了新的途径。

Description

悬浮培养Marc145细胞的方法
技术领域
本申请属于生物技术领域，具体涉及一种悬浮培养Marc145细胞的方法。
背景技术
Marc145细胞即猴胚胎肾上皮细胞，来源于猴肾细胞，是母细胞(MA104细胞)的克隆株，贴壁依赖性生长，可连续传代培养，无致瘤性，该细胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)特别敏感，目前广泛用于猪蓝耳病疫苗的生产。
常规Marc145细胞的培养采用二维单细胞层贴壁生产的方法，然而，在工业放大生产的过程中，受到了其贴壁性能的限制，以及消化过程也会增加工艺的复杂性、生产时间和成本，且质量不稳定，有批间差，所以有必要将Marc145细胞贴壁生长驯化成悬浮生长。虽然现有技术CN102453700A记载了将siat7e基因的表达载体转染MDCK细胞但并未记载将siat7e基因转入Marc145细胞并用于驯化Marc145细胞的悬浮培养，并且对于培养的细胞密度也没有进行改进。
而现有技术CN102453699A中记载了利用含有siat7e基因的表达载体稳定转染Marc145细胞或MA104细胞，但并未记载具体如何将贴壁Marc145细胞驯化成悬浮细胞。同时现有技术在培养过程中还存在细胞生长密度低以及后续用于制备疫苗效价低等技术问题。所以，目前存在的悬浮培养Marc145细胞的方法无论是在生产成本、生产效率还是满足市场需求方面都具有较大局限性，尤其是在密度上无法满足扩大化工业生产。
发明内容
基于此，本申请提供一种悬浮培养Marc145细胞的方法，以解决在工业生产中悬浮培养Marc145细胞的过程中，生产成本高以及悬浮细胞生长密度低的技术问题。
本申请的技术方案是，提供一种悬浮培养Marc145细胞的方法，包括以下步骤：
构建稳定表达Siat7e基因的贴壁型Marc145细胞株，以及将所述稳定转染siat7e基因的贴壁型Marc145细胞株驯化培养，将贴壁型Marc145细胞株驯化成成悬浮型Marc145细胞株。
驯化培养包括依次进行的用含血清培养基进行悬浮驯化的阶段以及用无血清培养基进行悬浮驯化的阶段。
在其中一个实施例中，所述无血清培养基为CDMarc145培养基。
在其中一个实施例中，驯化培养包括以下步骤：
步骤S1、将所述稳定转染siat7e基因的贴壁型Marc145细胞株在含有抗性筛选药物的完全培养基中贴壁培养。
步骤S2、将步骤S1传代后的贴壁型细胞株消化离心后接种在含有抗性筛选药物和1.5v/v%~2.5v/v%的新生牛血清的无血清培养基中悬浮培养。
步骤S3、将步骤S2培养后的细胞接种在含有抗性筛选药物和0.5v/v%~1v/v%的新生牛血清的无血清培养基中悬浮培养。
步骤S4、将步骤S3培养后的细胞接种在含有抗性筛选药物的无血清培养基中悬浮培养。
步骤S5、将步骤S4培养后的细胞接种在无血清培养基中悬浮培养。
在其中一个实施例中，所述无血清培养基包含谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述谷氨酰胺含量为0.5mM~1.5mM；所述谷氨酸含量为4mM~6mM；所述天冬氨酸含量为4mM~6mM；所述天冬酰胺含量为1.5mM~2.5mM。
在其中一个实施例中，步骤S2中细胞接种密度为0.5×106cells/mL~1.0×106cells/mL；或/和，步骤S3中细胞接种密度为0.8×106cells/mL~1.2×106cells/mL；或/和，步骤S4中细胞接种密度为1.0×106cells/mL~1.5×106cells/mL；或/和，步骤S5中细胞接种密度为1.4×106cells/mL~1.7×106cells/mL。
在其中一个实施例中，所述悬浮培养为摇晃培养。
可选地，所述摇晃培养为摇床培养，其转速为180rpm/min~220rpm/min。
在其中一个实施例中，步骤S1~S4培养过程中连续传代培养5~10次，传代间隔3~4天。
在其中一个实施例中，所述抗性筛选药物包含潮霉素-B磷酸转移酶、氨基葡萄糖苷磷酸转移酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和嘌呤霉素中的一种或多种。
在其中一个实施例中，稳定转染siat7e基因的方法包含电转染法、化学转染法，显微注射法，病毒介导法中的一种或多种。
本申请提供了一种将贴壁Marc145细胞驯化成悬浮细胞的方法，通过抗性筛选基因筛选得到稳定表达Siat7e基因的抗性细胞株，并通过依次进行的用含血清培养基进行悬浮驯化的阶段以及用无血清培养基驯化实现了全悬浮细胞的增殖，经过有限稀释挑选获得了高产并且可持续性稳定传代生长的全悬浮Marc145单克隆细胞系。本申请的Marc145悬浮细胞在无血清培养基中通过优化谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸及天冬酰胺等关键成分，可以有效提高细胞生长细胞密度，单克隆悬浮细胞培养可实现最高细胞密度达6.0×106cells/mL~8.0×106cells/mL，本申请的Marc145悬浮细胞在猪蓝耳病毒 (PRRSV)上感染后其病毒效价达到109~1010/mL TCID50，相比贴壁工艺和高谷氨酰胺培养基其病毒效价提高10~20倍。本申请的方法为Marc145细胞的悬浮培养以及工业化生产疫苗奠定了基础，也为猪蓝耳灭活疫苗的工业化大生产提供了新的途径。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请Marc145细胞转染后筛选抗性克隆eGFP荧光；
图2为本申请Marc145细胞驯化悬浮后eGFP荧光；
图3为本申请经完全驯化后的Marc145细胞状态；
图4为本申请Marc145细胞驯化生长图谱。
具体实施方式
下面结合实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
术语
本申请中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本申请中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。
本申请中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。
本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。
本申请中，涉及到数值区间（也即数值范围），如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点（即最小值及最大值），以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1-10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个的整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请的技术方案是，提供一种将贴壁Marc145细胞驯化成悬浮细胞的方法，包括以下步骤：
构建稳定表达Siat7e基因的贴壁型Marc145细胞株，以及将所述稳定转染siat7e基因的贴壁型Marc145细胞株驯化培养，将贴壁型Marc145细胞株驯化成成悬浮型Marc145细胞株。
驯化培养包括依次进行的用含血清培养基进行悬浮驯化的阶段以及用无血清培养基进行悬浮驯化的阶段。
在一个具体的示例中，所述无血清培养基为CD Marc145培养基。
在一个具体的示例中，由含血清培养基培养转为无血清培养基进行培养具体包括以下步骤：
步骤S1、将所述稳定转染siat7e基因的贴壁型Marc145细胞株在含有抗性筛选药物的完全培养基中贴壁培养。具体为将所述稳定转染siat7e基因的Marc145细胞株在含有250μg/mL~500μg/mL潮霉素的10v/v%血清DMEM培养基中连续传代培养5次。
步骤S2、将步骤S1传代后的贴壁型细胞株消化离心后接种在含有抗性筛选药物和1.5v/v%~2.5v/v%的新生牛血清的无血清培养基中悬浮培养。具体为：将步骤S1传代后的细胞消化离心后接种在含有450μg/mL~500μg/mL潮霉素的无血清培养基中加入1.5v/v%~2.5v/v%的新生牛血清至悬浮培养容器中摇床培养，培养4~8天间隔传代，连续传代培养5~10次。
步骤S3、将步骤S2培养后的细胞接种在含有抗性筛选药物和0.5v/v%~1v/v%的新生牛血清的无血清培养基中悬浮培养。具体为：将步骤S2培养后的细胞接种在含有450μg/mL~500μg/mL潮霉素的无血清培养基中加入0.5v/v%~1v/v%的新生牛血清重悬至悬浮培养容器中摇床培养，培养3~4天间隔传代，连续传代培养5~10次。
步骤S4、将步骤S3培养后的细胞接种在含有抗性筛选药物的无血清培养基中悬浮培养。具体为：将步骤S3培养后的细胞接种在含有450μg/mL~500μg/mL潮霉素的无血清培养基中摇床培养，培养3~4天间隔传代，连续传代培养5~10次。具体为：将步骤S4培养后的细胞接种在无血清培养基中摇床培养，培养2~3天间隔传代，连续传代培养5~10次。
步骤S5、将步骤S4培养后的细胞接种在无血清培养基中悬浮培养。
进一步可选地，所述无血清培养基还包含谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺中的一种或多种。
在一个具体的示例中，所述谷氨酰胺含量为0.5mM~1.5mM；所述谷氨酸含量为4mM~6mM；所述天冬氨酸含量为4mM~6mM；所述天冬酰胺含量为1.5mM~2.5mM。
进一步可选地，步骤S2中接种密度为0.5×106cells/mL~1.0×106cells/mL。例如可以是0.5×106cells/mL、0.6×106cells/mL、0.7×106cells/mL、0.8×106cells/mL、0.9×106cells/mL、1.0×106cells/mL。
在一个具体的示例中，步骤S3中接种密度为0.8×106cells/mL~1.2×106cells/mL。例如可以是是0.8×106cells/mL、0.9×106cells/mL、1.0×106cells/mL、1.1×106cells/mL、1.2×106cells/mL。
在一个具体的示例中，步骤S4中接种密度为1.0×106cells/mL~1.5×106cells/mL。例如可以是1.0×106cells/mL、1.1×106cells/mL、1.2×106cells/mL、1.3×106cells/mL、1.4×106cells/mL、1.5×106cells/mL。
在一个具体的示例中，步骤S5中接种密度为1.4×106cells/mL~1.7×106cells/mL。例如可以是1.4×106cells/mL、1.5×106cells/mL、1.6×106cells/mL、1.7×106cells/mL。
可选地，所述悬浮培养为摇晃培养，使细胞处于非静置状态；例如可以是摇床培养，所述摇床培养的转速为180rpm/min~220rpm/min。180rpm/min~220rpm/min。例如转速为180rpm/min、190rpm/min、200rpm/min、210rpm/min、220rpm/min。
在其中一个实施例中，步骤S1~S4培养过程中连续传代培养5~10次，传代间隔3~4天。
在其中一个实施例中，所述抗性筛选药物包含潮霉素-B磷酸转移酶、氨基葡萄糖苷磷酸转移酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和嘌呤霉素中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述转染的方法包含电转染法、化学转染法，显微注射法，病毒介导法中的一种或多种。
其中，Marc145细胞化学转染方法为：Marc145贴壁细胞使用胰酶消化，按照1.0~2.0×105cells/孔的密度接种于24孔培养板中，培养基为含有10%血清的DMEM，培养条件为37℃，5%的CO2，待Marc145细胞铺板24h后，生长单层汇合度达到80%~90%时用于转染；用不含血清DMEM培养基分别稀释DNA和脂质体，DNA量为1μg~3μg，DNA与脂质体配比包括1:1、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:5，孵育10~15分钟后得到转染复合物；将转染复合物加入24孔板细胞培养，转染4~6小时后更换为含10%血清的DMEM恢复培养基，培养条件为37℃，5%的CO2。
Marc145细胞电转方法为：使用胰酶消化Marc145细胞、低速离心，得到的细胞用转染培养基DMEM稀释至6.0~8.0×106cells/0.4 mL后加入电转杯，设置电转程序电转结束后将细胞转移至T75~T175方瓶培养，培养条件为37℃，5%的CO2。
在一个具体的示例中，还包括驯化后的Marc145悬浮细胞株稳定性传代与冻存，当驯化后的细胞传代第3天密度达到4.0×106cells/mL~6.0×106cells/mL，活率在95%以上，分散性良好切无较大团块，即获得悬浮Marc145细胞株并进行冻存。
可选地，冻存时的细胞密度为20.0×106cells/mL~30.0×106cells/mL。例如可以是20×106cells/mL、21×106cells/mL、22×106cells/mL、23×106cells/mL、24×106cells/mL、25×106cells/mL、26×106cells/mL、27×106cells/mL、28×106cells/mL、29×106cells/mL、30×106cells/mL。
进一步可选地，冻存为使用程序降温盒于-80℃冰箱中22h~26h，再转移冻存管至液氮罐中长期保存。例如可以是22h、23h、24h、25h或26h。
可选地，获得冻存的Marc145悬浮细胞株后还进行有限稀释挑选单克隆，具体方法为：一轮细胞密度0.5~1.0的有限稀释，加上直接的细胞图像证据，将挑选出的单克隆细胞依次转板扩增，最终转至摇瓶中培养，选择稳定增殖且生长较佳的单克隆冻存。
可选地，具体步骤为：
（1）Marc145细胞基因改造：将真核表达载体Siat7e基因质粒转入Marc145贴壁细胞中，用含有抗性筛选药物的培养基筛选得耐药细胞株。具体为将真核表达载体Siat7e基因(ST6GALNAC5 cDNA ORF Clone，Human，C-GFPSpark1)质粒转入Marc145贴壁细胞中，同时用250μg/m~500μg/mL的潮霉素筛选获得耐药细胞株。
（2）稳定表达Siat7e基因的Marc145细胞株筛选及建立：继续在所述含有抗性筛选药物的培养基中筛选得具有药物抗性的Marc145细胞克隆，传代后得稳定表达Siat7e基因的Marc145细胞株。具体为将质粒ST6GALNAC5 cDNA ORF Clone，Human,C-GFPSpark1转染Marc145细胞，经抗性基因潮霉素浓度为250μ~500 μg/mL的10 %血清DMEM培养基持续性加压筛选，获得具有潮霉素抗性的Marc145细胞克隆；用胰酶消化阳性克隆，置于T25~T75细胞培养方瓶中，阳性克隆在持续加药下继续增殖；加压培养细胞连续性传5~10个代次，在荧光倒置显微镜下观察可见明显的eGFP绿色荧光，细胞用胰酶消化后扩大培养并采用常规方法冻存细胞。
（3）Marc145细胞的驯化培养：将稳定转染siat7e基因的Marc145细胞株由含血清培养基培养转为无血清培养基进行培养。
（4）驯化悬浮细胞株稳定性传代与建库，取生长状态稳定，高密度生长，分散性好，完全适应在无血清培养基中悬浮生长的细胞，以20.0×106cells/mL~30.0×106cells/mL细胞密度冻存，使用程序降温盒于-80℃冰箱中24h，然后转移至液氮罐中长期保存。
（5）有限稀释挑选单克隆。在一个具体的示例中，所述抗性筛选药物为250μg/mL~500μg/mL的潮霉素。
具体筛选过程为：将Marc145贴壁细胞使用胰酶消化，按照1.0~2.0×105cells/孔的密度接种于24孔培养板中，铺板24h时，换液成采用含有10%血清的DMEM培养基稀释潮霉素终浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、750μg/mL，5个浓度梯度培养，7~14天以内能杀死所有细胞的最小浓度250μg/mL~500μg/mL配制细胞株筛选培养基。
通过化学转染或电转Marc145细胞转染24h~48h后，换含有250μg/mL~500μg/mL潮霉素的10%血清DMEM筛选培养基，每3~4天换一次筛选培养基，荧光显微镜下观察，持续筛选2~3个星期后，可见有抗性细胞生长，无抗性细胞死亡，直至带荧光的抗性克隆细胞形成，获得耐药细胞株。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
本申请中所述的无血清培养基CD Marc145（DP848）来自甘肃健顺生物科技有限公司自主研发。Marc145贴壁细胞，来源：ATCC，编号为CRL-12231。
其中，CD Marc145的具体配方如下表1所示：
表1-1
表1-2
本申请的细胞经在甘肃健顺生物科技有限公司扩增培养后建立了细胞库，细胞库的编号为:JSB-0479-031。
本申请经培养适应无血清全悬浮培养的Marc145细胞株命名为Marc145.s株。
实施例1
Marc145贴壁细胞使用胰酶消化，按照1.5×105cells/孔的密度接种于24孔培养板中，培养基为含有10%血清的DMEM，培养条件为37℃，5%的CO2，待Marc145细胞铺板24h后，生长单层汇合度达到80%~90%时用于转染。
用不含血清DMEM培养基分别稀释DNA和脂质体，DNA量为2μg，DNA与脂质体配比为1:2.5，孵育15分钟后得到转染复合物；将转染复合物加入24孔板细胞培养，转染4~6小时后更换为含10%血清的DMEM培养基，培养条件为37℃，5%CO2。
Marc145细胞转染24h~48h后，换含有250μg/mL~500μg/mL潮霉素的10% 血清DMEM筛选培养基，每3~4天换一次筛选培养基，荧光显微镜下观察，持续筛选2~3个星期后，可见有抗性细胞生长，无抗性细胞死亡，直至带荧光的抗性克隆细胞形成，获得耐药细胞阳性克隆。
使用胰酶消化阳性克隆，置于T25~T75细胞培养方瓶中，阳性克隆在持续加药下继续增殖，加压培养细胞经抗性基因潮霉素浓度为250μg/mL~500μg/mL的10%血清。
DMEM筛选培养基中连续性传5~10个代次，在荧光倒置显微镜下观察可见明显的如图1所示的eGFP荧光。
使用胰酶消化稳定表达siat7e基因的Marc145细胞株、低速离心，得到的细胞用潮霉素浓度为500μg/mL的无血清培养基CD Marc145（健顺生物）并加入2 %的新生牛血清重悬至悬浮培养容器TPP中，轻柔吹散细胞使得细胞呈单个细胞分散状态，接种密度为0.5×106cells/mL~1.0×106cells/mL，工作体积为TPP的1/2~1/3体积比，培养条件为37℃、5%CO2、RH≥80%、摇床转速为200rpm/min，培养4~8天间隔传代,连续传代培养5~10次。
含500 ug/mL潮霉素浓度的CD Marc145（健顺生物）并加入1%的新生牛血清以转速为200 rpm/min进行TPP培养，接种密度以0.8×106cells/mL~1.2×106cells/mL连续传代培养5~10次，传代间隔时间为5~6天。
含500μg/mL潮霉素浓度的 CD Marc145（健顺生物）以转速为200rpm/min进行TPP培养，接种密度以1.0×106cells/mL~1.5×106cells/mL连续传代培养5~10次，传代间隔时间为3~4天。
无血清培养基CD Marc145（健顺生物）以转速为200 rpm/min进行TPP培养，接种密度以1.5×106cells/mL连续传代培养5~10次，传代间隔时间为3天。
细胞按照上述步骤完成驯化后，得到全悬浮Marc145细胞培养72h可达到6.0×106cells/ml左右，活率在95%以上，并分散性良好切无较大团块，即可连续传代稳定。可见，本申请培养得到的无血清全悬浮培养Marc145细胞性能优异。
取经过上述步骤驯化得到悬浮Marc145细胞，置于摇瓶扩大培养，培养72h后，待细胞密度达到5.0×106cells/mL~6.0×106cells/mL左右时，以20.0×106cells/mL~30.0×106cells/mL细胞密度冻存，使用程序降温盒于-80℃冰箱中24h，然后转移冻存管至液氮罐中长期保存。
实施例2
使用胰酶消化Marc145细胞、低速离心，得到的细胞用转染培养基DMEM稀释至6.0×106cells/0.4 mL~8.0×106cells/0.4 mL后加入电转杯，设置电转程序：指数波、电压300V、电容950µF，电转后将细胞转移至T75~T175方瓶培养，培养条件为37℃，5%的CO2。
Marc145细胞转染24h~48h后，换含有250μg/mL~500μg/mL潮霉素的10 %血清DMEM筛选培养基，每3~4天换一次筛选培养基，荧光显微镜下观察，持续筛选2~3个星期后，可见有抗性细胞生长，无抗性细胞死亡，直至带荧光的抗性克隆细胞形成，获得耐药细胞阳性克隆。
使用胰酶消化阳性克隆，置于T25~T75 细胞培养方瓶中，阳性克隆在持续加药下继续增殖，加压培养细胞经抗性基因潮霉素浓度为250μg/mL~500μg/mL的10%血清DMEM筛选培养基中连续性传5个~10个代次，在荧光倒置显微镜下观察可见明显如图2所示的eGFP绿色荧光。
使用胰酶消化稳定表达siat7e基因的Marc145细胞株、低速离心，得到的细胞用潮霉素浓度为500μg/mL的无血清培养基CD Marc145（健顺生物）并加入2%的新生牛血清重悬至悬浮培养容器TPP中，轻柔吹散细胞使得细胞呈单个细胞分散状态，接种密度为0.5×106cells/mL~1.0×106cells/mL，工作体积为TPP的1/2~1/3体积比，培养条件为37℃、5%的CO2、RH≥80%、摇床转速为200 rpm/min，培养4~8天间隔传代，连续传代培养5~10次。
含500μg/mL潮霉素浓度的无血清培养基CD Marc145（健顺生物）并加入1%的新生牛血清以转速为200rpm/min进行TPP培养，接种密度以0.8×106cells/mL~1.2×106cells/mL连续传代培养5~10次，传代间隔时间为5-6天。
含500μg/mL潮霉素浓度的无血清培养基CD Marc145（健顺生物）以转速为200rpm/min进行TPP培养，接种密度以1.0×106cells/mL~1.5×106cells/mL连续传代培养5~10次，传代间隔时间为3~4天。
无血清培养基CD Marc145（健顺生物）以转速为200 rpm/min进行TPP培养，接种密度以1.5×106cells/mL连续传代培养5~10次，传代间隔时间为3天。
细胞按照上述步骤完成驯化后，得到全悬浮Marc145细胞培养72h可达到6.0×106cells /ml左右，活率在95%以上，并分散性良好切无较大团块，即可连续传代稳定。可见，本发明培养得到的无血清全悬浮培养Marc145细胞性能优异。
取经过上述步骤驯化得到悬浮Marc145细胞，置于摇瓶扩大培养，培养72h后，如图3所示，待细胞密度达到5.0×106cells/mL~6.0×106cells/mL左右时，以20.0×106cells/mL~30.0×106cells/mL细胞密度冻存，使用程序降温盒于-80℃冰箱中24h，然后转移冻存管至液氮罐中长期保存，如图4所示为本申请Marc145细胞驯化生长图谱。
实施例3
悬浮Marc145.s细胞生长第一天，通过离心收集上清培养液，上清液使用3000rpm、5min离心后，无菌移取上清液，并使用0.22μm的针头过滤器过滤上清液，标记为Conditioned Medium+细胞名称。
使用对数生长期悬浮Marc145.s细胞进行连续稀释，最后一次使用有限稀释铺板细胞培养基Conditioned Medium+Cloning Midium+ACF将细胞最终稀释至5cells/mL ~10cells/mL，加入到无菌加样槽中，轻晃混匀。使用8通道排枪吸取100μL细胞混合液加入96孔板中，边加边轻柔吹打混匀，重复8次加样操作，共铺8块96孔板，即100μL/well（1cell/well），每块板设置对焦观察孔。
第0天~第3天每天使用CSI（CloneSelect Imager 细胞生长分析系统）进行拍照，之后从第7天开始，每隔7天进行一次拍照，在第3、7、14、21天分别补加50μL~100μL的新鲜培养基；细胞经96孔板、24孔板、12孔板培养后筛选生长良好的细胞转至6孔板培养，在96孔板转至24孔板、24孔板转至12孔板，按照3倍稀释的比例而进行扩增，从12孔板转至6孔板，按照2倍稀释的比例进行扩增；细胞在6孔板中培养5天-7天后，取样测定细胞密度、活率，挑选生长良好、倍增时间快的细胞转移至摇瓶或TPP容器中传代筛选、扩增。
传代时克隆细胞接种密度为0.3×106cells/mL~1.0×106cells/mL，每3天进行一次传代，最高细胞密度6.0×106cells/mL~8.0×106cells/mL，倍增时间20小时~25小时，相比原始细胞密度提高1~2倍。
实施例4
使用克隆Marc145.s悬浮细胞在无血清培养基中传代培养，接种密度0.8×106cells/mL~1.2×106cells/mL，培养容器为摇瓶，培养条件为37℃、5%的CO2、125rpm/min~140rpm/min。
培养至72h时，细胞密度为6.0×106cells/mL~8.0×106cells/mL，在摇瓶中通过单因素和DOE实验设计优化配方中关键性成分谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸及天冬酰胺。
实验结果显示谷氨酰胺降低到1mM，谷氨酸提高到5mM，天冬氨酸提高到5mM，天冬酰胺在2mM时，细胞密度可提高至10.0cells/mL~12.0×106cells/mL。
实施例5
使用克隆Marc145.s悬浮细胞在含1mM谷氨酰胺、5mM谷氨酸、5mM天冬氨酸及2mM天冬酰胺的无血清培养基中传代培养，接种密度0.8×106cells/mL~1.2×106cells/mL，培养容器为摇瓶，培养条件为37℃、5%的CO2、125rpm/min~140rpm/min。
将连续传代至48小时~72小时的克隆Marc145.s悬浮细胞，取细胞液检测活细胞密度(×106cells/mL)及细胞活率(％)，按照二阶工艺稀释细胞密度至2.0×106cells/mL~5.0×106cells/mL。
按照MOI感染复数0.005~0.05直接接入猪蓝耳(PRRSV)种毒，所述猪蓝耳(PRRSV)疫苗，每毫升病毒含量≥106.0TCID50，培养至48~96小时收获病毒液，即得。
将按照上述方法制备的病毒液进行病毒效价检测，测毒方法如下：
将各待检样品分别做10倍系列稀释，从10-1稀释至10-9，将不同稀释度分别接种于长成单层的Marc145细胞96孔细胞培养板中，每个稀释度接种6孔，每孔100μL，另设6孔只接种稀释液作为阴性对照，每孔100μL。吸附1小时后各孔再加100μL维持液，置于37℃、5％的CO2培养箱中培养6天，每天观察并记录各孔细胞病变情况，按Reed-Muench法计算TCID50，结果病毒效价为
109~1010/mL TCID50，相比贴壁工艺和高谷氨酰胺培养基其病毒效价提高10~20倍，具体如表2所示。
表2
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (8)

1.一种悬浮培养Marc145细胞株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
构建稳定表达Siat7e基因的贴壁型Marc145细胞株，以及，
将所述稳定表达siat7e基因的贴壁型Marc145细胞株驯化培养，将贴壁型Marc145细胞株驯化成悬浮型Marc145细胞株；
其中，驯化培养包括以下步骤：
步骤S1、将所述稳定表达siat7e基因的贴壁型Marc145细胞株在含有抗性筛选药物的完全培养基中贴壁培养；
步骤S2、将步骤S1传代后的贴壁型细胞株消化离心后接种在含有抗性筛选药物和1.5v/v%~2.5v/v%的新生牛血清的无血清培养基中悬浮培养；
步骤S3、将步骤S2培养后的细胞接种在含有抗性筛选药物和0.5v/v%~1v/v%的新生牛血清的无血清培养基中悬浮培养；
步骤S4、将步骤S3培养后的细胞接种在含有抗性筛选药物的无血清培养基中悬浮培养；
步骤S5、将步骤S4培养后的细胞接种在无血清培养基中悬浮培养。
2.根据权利要求1所述的悬浮培养Marc145细胞株的方法，其特征在于，所述无血清培养基包含谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺。
3.根据权利要求2所述的悬浮培养Marc145细胞株的方法，其特征在于，所述谷氨酰胺含量为0.5mM~1.5mM；所述谷氨酸含量为4mM~6mM；所述天冬氨酸含量为4mM~6mM；所述天冬酰胺含量为1.5mM~2.5mM。
4.根据权利要求1所述的悬浮培养Marc145细胞株的方法，其特征在于，
步骤S2中细胞接种密度为0.5×106cells/mL~1.0×106 cells/mL；或/和，
步骤S3中细胞接种密度为0.8×106cells/mL~1.2×106cells/mL；或/和，
步骤S4中细胞接种密度为1.0×106cells/mL~1.5×106cells/mL；或/和，
步骤S5中细胞接种密度为1.4×106cells/mL~1.7×106cells/mL。
5.根据权利要求1所述的悬浮培养Marc145细胞株的方法，其特征在于，所述悬浮培养为摇晃培养；
所述摇晃培养为摇床培养，其转速为180rpm/min~220rpm/min。
6.根据权利要求1所述的悬浮培养Marc145细胞株的方法，其特征在于，步骤S1~S4培养过程中连续传代培养5~10次，传代间隔3~4天。
7.根据权利要求1所述的悬浮培养Marc145细胞株的方法，其特征在于，所述抗性筛选药物包含潮霉素-B磷酸转移酶、氨基葡萄糖苷磷酸转移酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和嘌呤霉素中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的悬浮培养Marc145细胞株的方法，其特征在于，稳定表达siat7e基因的方法包含电转染法、化学转染法，显微注射法，病毒介导法中的一种或多种。
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