CN116688108A - 全新流感病毒疫苗治疗肿瘤的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种全新流感病毒疫苗治疗肿瘤的方法及其应用，将流感病毒H1N1血凝素糖蛋白引入治疗实体肿瘤，将流感病毒血凝素HA基因与C3d功能序列连接，构建成C3d‑HA融合蛋白，通过携带流感病毒血凝素基因的重组溶瘤腺病毒感染肿瘤细胞，选择性的在肿瘤中复制，同时表达流感病毒C3d与HA融合蛋白，并将HA锚定在肿瘤细胞表面使其成为人工异源肿瘤抗原。利用体内已获得的抗HA抗体或预先给机体注射流感病毒HA蛋白疫苗，当机体存在抗HA抗体时，然后注射携带流感病毒血凝素基因的重组溶瘤腺病毒，一旦血凝素蛋白在肿瘤中表达，便引起机体免疫系统对癌细胞准确的识别及完全清除肿瘤细胞。

Description

全新流感病毒疫苗治疗肿瘤的方法及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗技术领域，具体是指一种全新流感病毒疫苗治疗肿瘤的方法及其应用。

背景技术

全球每年新增约2000万癌症患者，死亡约1000万人。截至目前，虽然不断有抗癌新药或新方法问市，如单克隆抗体，小分子，CART免疫细胞治疗技术和溶瘤病毒等，然而，治疗癌症，尤其是治疗实体瘤仍未取得满意的效果。癌症仍然严重威胁人类的健康，研发抗癌新药及寻找治疗癌症的新方法仍是科学家面临的挑战。

由于实体瘤微环境的特殊性，使得免疫细胞进入实体瘤的数量有限。免疫检测点的发现，使科学家认识到了某些癌细胞上的PD-L1与T细胞表面PD-1结合，使T细胞“致盲”。CD47与巨噬细胞表面上的蛋白SIRPα相结合，抑制巨噬细胞杀死癌细胞的能力，被广泛认为是一种“不要吃我”的信号。这些细胞进入实体瘤后不仅没有消灭癌细胞，反而成为了实体瘤的组成成分。肿瘤微环境的抑制作用及免疫细胞无法有效浸润使免疫细胞，包括CART细胞治疗实体瘤仍然面临挑战。抗原呈递细胞(Antigen-presentingcells,APC)是指能够摄取、加工处理抗原，并将处理过的抗原呈递给T细胞的一类免疫细胞。APC主要包括树突状细胞、单核吞噬细胞、B细胞及朗格汉斯细胞等，其中树突状细胞的抗原呈递能力最强。目前已有越来越多的科学家将注意力集中在肿瘤特异性抗原上，以期采用肿瘤特异性抗原作为肿瘤疫苗治疗肿瘤。然而，缺乏肿瘤特异性抗原及其免疫原性低使得肿瘤疫苗治疗实体瘤同样面临挑战。面对治疗实体瘤的难题，促使发明人思考通过引入病毒糖蛋白在癌细胞表面人工制造特异性抗原治疗实体瘤的策略，从而实现治疗实体瘤的目的。发明人还认为，抗体在治疗实体瘤中可能是不可或缺的，因为抗体在抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用、补体依赖的细胞毒性作用、改变癌组织的信号转导和免疫调节中起关键性作用。当抗体与癌细胞结合后，会使癌细胞更容易被人体免疫系统识别，从而引导免疫系统杀死癌细胞。

目前，全球已有四款溶瘤病毒药品上市，如溶瘤腺病毒H101治疗鼻咽癌，溶瘤疱症病毒I型Imlygic(T-Vec)治疗黑色素瘤和Delytact治疗脑胶质瘤，这些溶瘤病毒产品在临床上取得了一定的治疗效果，但仍有很大的提高空间。各国科学家正在采用不同的技术路线构建新的溶瘤病毒，以期进一步提高溶瘤病毒治疗实体瘤的效果。虽然溶瘤病毒可以通过诱导趋化因子使“冷”肿瘤变成“热”肿瘤，从而激发局部和系统的抗肿瘤免疫反应，然而，不同的溶瘤病毒因各自的特点在溶瘤中表现各异，如腺病毒没有囊膜糖蛋白，不以出芽的方式释放病毒。腺病毒E3A(gp19K)糖蛋白主要与细胞内质网上的MHC-1结合。腺病毒具有嗜上皮细胞性，而人类的大多数肿瘤来源于上皮细胞，因此，将腺病毒改造成溶瘤病毒具有广谱治疗肿瘤的潜力。

发明内容

本发明要解决上述技术问题，提供一种全新流感病毒疫苗治疗肿瘤的方法及其应用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

一种全新的流感病毒疫苗在肿瘤治疗中的应用，包括流感病毒血凝素糖蛋白基因和流感病毒，所述的流感病毒血凝素糖蛋白基因包括HA1和HA2和跨膜区,与C3d或辅助蛋白及多肽核苷酸连接，中间用2A或Linker连接，末产生HA融合蛋白；

所述的流感病毒为WHO推荐的疫苗毒株NYMCX-179A血凝素糖蛋白作为抗原，包括所有流感病毒亚型的HA或神经氨酸酶、麻疹病毒血凝素、冠状病毒表面糖蛋白和其他可用于疫苗的病毒糖蛋白。

优选地，所述的流感病毒血凝素糖蛋白基因限制性人类TERT启动子控制HA融合蛋白基因，以实现HA融合蛋白在肿瘤中选择性表达并锚定在肿瘤细胞表面。

一种人流感病毒HA基因，CMV启动子控制HA融合蛋白基因，以实现HA融合蛋白的过表达并锚定在肿瘤细胞表面。

优选地，限制性仓鼠TERT启动子控制E1A基因，以实现溶瘤腺病毒在肿瘤中选择性复制及流感病毒HA糖蛋白局限在肿瘤中表达并锚定在肿瘤细胞表面。

一种全新的流感病毒疫苗治疗肿瘤的方法，包括以下步骤：利用机体内已存在抗HA抗体和记忆免疫细胞或在治疗前预先给机体接种HA蛋白疫苗，待机体产生抗HA抗体后，注射携带HA基因的重组溶瘤病毒，以实现免疫系统对癌细胞准确的识别和杀死及清除肿瘤细胞。

优选地，可直接向肿瘤中注射携带HA基因的重组溶瘤病毒。

采用以上方案后，本发明具有如下优点：

上述概述仅仅是为了说明书的目的，并不意图以任何方式进行限制。除上述描述的示意性的方面、实施方式和特征之外，通过参考附图和以下的详细描述，本发明进一步的方面、实施方式和特征将会是容易明白的。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

附图说明

图1为重组腺病毒载体Ad-JYT-hTERT-HA、Ad-JYT-CMV-HA、Ad-JYT-hamsterTERT-E1A构建示意图。

图2为Marker(1)。重组溶瘤腺病毒Ad-JYT-hamsterTERT-E1A(2)，Ad-JYT-CMV-HA(3)，Ad-JYT-hTERT-HA(4)分别感染DDT细胞，48小时收集细胞，Westernblot检测结果。

图3为CsCl超速离心纯化病毒后，Westernblot检测结果，(1)Ad-JYT-hamsterTERT-E1A，(2)Ad-JYT-CMV-HA，(3)Ad-JYT-hTERT-HA和(4)血凝素(HA)纯化糖蛋白。

图4为重组溶瘤腺病毒Ad-JYT-CMV-HA(A、B)和Ad-JYT-hTERT-HA(C、D)注入DDT实体瘤后分离DDT瘤细胞，流式细胞检测结图。

图5为血凝素(HA)糖蛋白疫苗免疫仓鼠血清，ELISA检测IgG结果图

图6为接种血凝素(HA)蛋白疫苗的仓鼠杀瘤实验结果，重组溶瘤腺病毒Ad-JYT-hTERT-HA、Ad-JYT-CMV-HA、对照重组腺病毒Ad-JYT-hamsterTERT-E1A(1X108pfu)和PBS注射叙利亚仓鼠平滑肌肉瘤后，仓鼠的存活率图。

图7为未接种血凝素(HA)蛋白疫苗的仓鼠杀瘤实验结果，重组溶瘤腺病毒Ad-JYT-hTERT-HA、Ad-JYT-CMV-HA、对照重组腺病毒Ad-JYT-hamsterTERT-E1A(1X108pfu)及PBS注射叙利亚仓鼠平滑肌肉瘤后，仓鼠的存活率图。

图8为接种血凝素(HA)蛋白疫苗的仓鼠杀瘤实验，重组溶瘤腺病毒Ad-JYT-hTERT-HA、Ad-JYT-CMV-HA、对照重组腺病毒Ad-JYT-hamsterTERT-E1A(1X108pfu)及PBS注射叙利亚仓鼠平滑肌肉瘤后，肿瘤生长大小比较图。

图9为经重组溶瘤腺病毒Ad-JYT-hTERT-HA、Ad-JYT-CMV-HA治愈后的仓鼠，再接种DDT细胞后(设PBS对照)，仓鼠的存活率图。

具体实施方式

现在将详细提及本发明的具体实施方案。尽管结合这些具体的实施方案描述本发明，但应认识到不打算限制本发明到这些具体实施方案。相反，这些实施方案意欲覆盖可包括在由权利要求限定的发明精神和范围内的替代、改变或等价实施方案。在下面的描述中，阐述了大量具体细节以便提供对本发明的全面理解。本发明可在没有部分或全部这些具体细节的情况下被实施。在其它情况下，为了不使本发明不必要地模糊，没有详细描述熟知的工艺操作。

当与本说明书和附加权利要求中的“包括”、“方法包括”、或类似语言联合使用时，单数形式“某”、“某个”、“该”包括复数引用，除非上下文另外清楚指明。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

下面结合全文对本发明做进一步的详细说明。

结合附图1-图9，一种全新的流感病毒疫苗在肿瘤治疗中的应用，包括流感病毒血凝素糖蛋白基因和流感病毒，所述的流感病毒血凝素糖蛋白基因包括HA1和HA2和跨膜区,与C3d或辅助蛋白及多肽核苷酸连接，中间用2A或Linker连接，末产生HA融合蛋白；

流感病毒为WHO推荐的疫苗毒株NYMCX-179A(H1N1))血凝素糖蛋白(HA)作为抗原，包括所有流感病毒亚型的HA或神经氨酸酶(N)，还包括麻疹病毒血凝素(HA)，以及冠状病毒表面糖蛋白(Spikeglycoprotein)和其他可用于疫苗的病毒糖蛋白。

所述的流感病毒血凝素糖蛋白基因限制性人类TERT启动子控制HA融合蛋白基因，以实现HA融合蛋白在肿瘤中选择性表达并锚定在肿瘤细胞表面。

一种人流感病毒HA基因，CMV启动子控制HA融合蛋白基因，以实现HA融合蛋白的过表达并锚定在肿瘤细胞表面。

限制性仓鼠TERT启动子控制E1A基因，以实现溶瘤腺病毒在肿瘤中选择性复制及流感病毒HA糖蛋白局限在肿瘤中表达并锚定在肿瘤细胞表面。

本发明采用人类TERT启动子控制HA糖蛋白，以实现在肿瘤中选择性的表达，包括在肿瘤中选择性表达的其他启动子，如：仓鼠TERT、Survivin、E2F、酪氨酸酶、前列腺特异性抗原、甲胎蛋白和COX-2等启动子，及启动子下游IRES控制HA,以实现在肿瘤中选择性表达。

本发明采用仓鼠TERT控制E1A，以实现溶瘤腺病毒在肿瘤中选择性的复制，采用CMV控制HA融合蛋白基因，以实现病毒在肿瘤中选择性复制，将HA局限在肿瘤中过表达。包括其他技术路线改造的溶瘤病毒实现在肿瘤中选择性复制，如HSV溶瘤病毒缺失ICP34.5和ICP47时，采用其他启动子，以实现HA局限在肿瘤中表达，如：EF1a启动子，TK启动子，SV40启动子等，尤其是CMV启动子。

一种全新的流感病毒疫苗治疗肿瘤的方法，包括以下步骤：利用机体内已存在抗HA抗体和记忆免疫细胞或在治疗前预先给机体接种HA蛋白疫苗，待机体产生抗HA抗体后，注射携带HA基因的重组溶瘤病毒，以实现免疫系统对癌细胞准确的识别和杀死及清除肿瘤细胞。

可直接向肿瘤中注射携带HA基因的重组溶瘤病毒。

本发明治疗效果显著的核心是在肿瘤中表达流感病毒表面糖蛋白，及在治疗前预先给机体接种HA蛋白疫苗，使机体产生相对应的抗体的治疗方法。因此，适用于任何病毒糖蛋白疫苗治疗肿瘤，包括mRNA、DNA，质粒载体或其他溶瘤病毒载体携带病毒糖蛋白基因，以及在治疗前给机体接种相同的抗原疫苗。

为了实现在肿瘤细胞表面人工制造肿瘤特异性抗原，从而实现治疗实体瘤的目的，发明人选择世界卫生组织推荐的甲型流感病毒NYMCX-179A疫苗毒株H1N1血凝素(HA)糖蛋白作为肿瘤异源抗原，引入肿瘤的治疗。依据抗体依赖细胞介导的细胞毒作用原理，本发明将流感病毒血凝素(HA)疫苗用于提高实体瘤的治疗效果。利用体内已获得的抗HA抗体或提前给机体注射H1N1流感病毒血凝素(HA)疫苗，让机体产生特异性抗体。待肌体存在抗体后，注射携带流感病毒血凝素(HA)基因的重组溶瘤腺病毒，溶瘤腺病毒在癌细胞中复制时表达HA蛋白，并锚定在癌细胞表面，使之成为肿瘤人工特异性抗原。由于体内已存在特异性抗体，一旦血凝素蛋白在肿瘤中表达，便引起机体免疫系统对肿瘤的识别并杀死肿瘤细胞。动物杀瘤实验显示，只需注射两针携带HA基因的重组溶瘤腺病毒，一周内便可使350mm3肿瘤完全消失，实现了100％的治愈。

选择流感病毒H1N1血凝素(HA)蛋白作为抗原疫苗，一是流感病毒疫苗容易获得；二是其安全性和有效性已在长期的应用中得到了证实；三是甲型流感病毒H1N1曾多次在全球广泛的流行或人类普遍接种过流感病毒H1N1疫苗，人体内普遍存在抗H1N1血凝素(HA)的抗体。在治疗前根据患者体内的抗体水平决定是否需要注射流感病毒H1N1疫苗。根据动物杀瘤实验显示，在体内不存在抗HA抗体时，针对350mm3肿瘤，注射两次重组溶瘤腺病毒Ad-JYT-hTERT-HA或Ad-JYT-CMV-HA,杀瘤率为50％至60％，当预先给动物接种HA蛋白疫苗，待动物体内抗体内抗体水平达到4000EU后，同样的条件，杀瘤率达到了100％。从第一次注射溶瘤腺病毒到肿瘤完全治愈约10天，第10天检测治愈动物体内的抗体，抗体水平提高了约一倍，分别为8000EU或10000EU,说明接种HA蛋白疫苗的动物体内已存在记忆B细胞，经重组溶瘤腺病毒在体内表达HA蛋白诱导，起到了加强免疫的作用，在短时间内提高了动物体内抗HAIgG水平，这一过程有利于免疫系统杀死瘤细胞。

由于流感病毒HA蛋白跨膜区疏水氨基酸富集而导致全长HA蛋白不能人工表达，本发明采用C3d蛋白与HA蛋白融合，实现了HA蛋白在体内和体外有效表达，并锚定在细胞表面。C3d蛋白除了能帮助HA蛋白表达外，还有增强HA蛋白免疫原性的作用，其效果比化学佐剂更好。经动物体内肿瘤流式细胞检测，HA蛋白成功的锚定在了细胞表面，并在体内显示出较强的免疫原性，有效的刺激动物机体产生免疫反应，实现了免疫系统对癌细胞准确的识别及完全清除肿瘤细胞。

根据核苷酸序列优化提高蛋白质表达量的原理，本发明对NYMCX-179A疫苗毒株H1N1血凝素(HA)核苷酸序列进行了优化，优化后的核苷酸序列与流感病毒野生型HA序列的相似性为75.8％。

本发明采用人类TERT启动子控制HA融合蛋白基因，以实现HA融合蛋白在肺癌、乳腺癌、结直肠癌和子宫肌瘤等肿瘤中选择性表达。采用CMV启动子控制HA融合蛋白基因，以实现HA融合蛋白在肿瘤中过表达。

本发明采用仓鼠TERT启动子控制E1A基因，以实现溶瘤腺病毒在肿瘤中选择性复制。由于仓鼠TERT启动子与人TERT启动子核苷酸序列不同，相似性低，两个启动子之间发生重组的概率极低，不影响重组溶瘤腺病毒在体内和体外正常复制。

根据本发明可以推定，多数疫苗蛋白都可以用于肿瘤治疗，尤其是病毒表面糖蛋白，如流感病毒神经氨酸酶(N)，麻疹病毒血凝素(HA)，冠状病毒刺突蛋白(S)等。人类绝大多数通过病毒自然感染获得了相应的抗体，或通过接种疫苗而获得相应的抗体，只是体内抗体水平因人而异，在治疗前根据评估体内抗体水平，决定是否增加接种蛋白疫苗。当患者体内已存在适量的抗体，采用基因工程技术，将携带有对应的基因载体注射到肿瘤中，或通过静脉注射，使载体到达肿瘤区域，如通过脂质，纳米材料包裹mRNA、DNA、质粒、病毒载体等将目的基因运送到肿瘤区域，一旦目的基因在肿瘤中表达，糖蛋白出现在肿瘤细胞表面，机体的免疫系统便可以识别癌细胞，并将癌细胞杀死。腺病毒缺乏在属主细胞表面制造病毒蛋白抗原的作用，从而降低了诱导机体免疫系统的杀瘤作用。利用腺病毒能感染多数肿瘤细胞的特点，通过溶瘤腺病毒携带HA糖蛋白基因，弥补了溶瘤腺病毒不能在肿瘤表面制造糖蛋白的缺陷。由于HA糖蛋白作为外源蛋白不存在于溶瘤腺病毒的结构中，不会增强机体对溶瘤腺病毒的排斥，从而提高了溶瘤腺病毒的杀瘤效果。

实施例一，载体构建：

(1)合成hamsterEnhancerTERTDNA片段，其5'端和3'端分别带酶切位点Xbal和EcoRI。把穿梭载体pDC316和hamsterEnhancerTERTDNA分别用Xbal和EcoRI双酶切并回收，将合成的hamsterEnhancerTERTDNA片段插入Xbal和EcoRI位点酶连，构建载体命名为pDC316-hamsterTERT。

(2)合成EIA基因，其5'端和3'端分别带酶切位点EcoRI和BglII。把载体pDC316-hamsterTERT和基因E1A分别用EcoRI和BglII双酶切并回收连接，构建载体命名为pDC316-hamsterTERT-E1A。

(3)分别合成hTERT-C3d-2A-HA、CMV-C3d-linker-HADNA，用包含BgIII和SalI的引物分别进行PCR克隆hTERT-C3d-2A-HA、CMV-C3d-linker-HA。分别回收PCR产物，BgIII和SalI双酶切回收DNA片段，把载体pDC316-hamsterTERT-E1A用BgIII和SalI双酶切，回收并分别与上述DNA片段连接，构建载体分别命名为pDC-E1A-hTERT-C3d-HA、pDC-E1A-CMV-C3d-HA。用测序鉴定插入重组载体的DNA正确性。

(4)把上述重组载体分别和骨架质粒(pBHGloxdeltaE1,3Cre)共转染293细胞，获得重组腺病毒，重组腺病毒分别命名为Ad-JYT-hTERT-HA、Ad-JYT-CMV-HA、Ad-JYT-hamsterTERT-E1A。如图1所示。

实施例二，空斑纯化：

用10cm细胞培养皿培养293细胞，当细胞生长至70％密度时加入重组腺病毒液。在离心管中将重组腺病毒液作连续10倍稀释，从10-1至10-7，分别取200μl10-5至10-7的病毒液，加入到盛有5ml新鲜培养基的细胞培养皿中，轻轻混匀后置37℃,5％CO2培养箱中1小时，移去病毒液，用PBS洗涤细胞，加入1％低熔点琼脂糖(seaplaquelow-melting-pointagarose，Lonza)与2XDMEM培养基按1：1混合后的培养基，含10％FBS，1％青霉素和链霉素。置37℃,5％CO2培养箱中培养10天挑空斑，每次挑10个空斑，用Westernblot筛选1个HA表达量最高的重组腺病毒用于下一步实验。

实施例三，病毒纯化：

用75cm的培养瓶培养293细胞，当细胞生长至70％密度时加入重组腺病毒液。72小时后收集50ml培养液和细胞，2000rpm离心10钟，取上清液备用。向细胞离心管中加入5mlPBS缓冲液，超声波破碎细胞，低速离心去细胞碎片。取上清液与细胞上清混合，采用BeckmanOptimaXPN-100超速离心机，SW28转子的超离管，4℃，25000rpm

离心1小时，弃上清，向沉淀中加入1mlPBS制成病毒样品悬浮液。采用SW41转子的离心管，分别铺设3ml的4.0MCsCl与7ml的2.2MCsCl的梯度液,将1ml病毒样品液加在氯化铯密度梯度液上层，，4℃，35000rpm离心48小时。用1毫升注射器刺穿离心管吸出病毒带，将病毒样品放入透析袋，在PBS+10％甘油中透析过液。纯化的重组腺病毒置-80C冰箱保存备用。

腺病毒滴度测定：

采用深圳莱伯克生物有限公司(LabKit)生产的免疫法快速检测试剂盒测定腺病毒滴度，通过抗腺病毒抗体与感染了腺病毒的细胞结合，再用辣根过氧化物酶标记的二抗与一抗结合，经显色液显色，被感染的细胞显示出明显的棕色，通过记数及如下公式计算，测定腺病毒滴度。

计算每孔感染单位(ifu)/ml:

(平均阳性细胞数/视野)×(视野数/孔)/{病毒体积(ml)×稀释倍数}

实施例五，Westernblot：

1，样品制备：293细胞按1:3的比例传代，第二天分别用病毒Ad-JYT-hamsterTERT-E1A，Ad-JYT-hTERT-HA，Ad-JYT-CMV-HA感染细胞，48小时后收集细胞，加裂解液RIPA在冰上裂解10到20分钟后，加loadingbuffer沸水浴5分钟，12000g离心5分钟，取上清。

2，SDS-PAGE凝胶电泳。

3，转膜：把蛋白印迹到PVDF膜上。

4，封闭：用3％BSA37℃温育1小时。

5，孵育一抗：去封闭液，按每平方厘米0.2-0.3ml的量加入适量的一抗反应液(HA一抗溶于1％BSA-TBST)；在平缓摇动的摇床上室温孵育1小时。

6，孵育二抗：移去一抗反应液，用TBST洗涤PVDF膜3次去除未结合抗体，每次10分钟；按膜面积加入0.1ml/cm2第二抗体反应液(HRP标记的二抗溶于1％BSA–TBST)，平放摇床上室温摇动孵育1小时。

7，显影：用TBST漂洗PVDF膜3次去除未结合抗体，每次10分钟；浸于刚配制ECL化学发光试剂中，在化学发光分析仪上显影拍照。结果如图2和图3所示。

实施例六，流式细胞检测：

待瘤生长至600mm3时注射重组腺病毒，第二次注射重组腺病毒后24小时取瘤组织，用无菌手术剪刀将肿瘤剪碎，采用肿瘤消化液PBS含1mg/ml胶原酶B(CollagenaseB,Roche)，0.1mg/ml透明质酸酶(Hyaluronidase,Sigma)和0.02mg/mlDNA酶(DNAseI,Roche)处理肿瘤，收集荷瘤仓鼠肿瘤细胞，将细胞悬浮于100μlPBS缓冲液。采用FcReceptorBlocker(INNOVEXBiosciencesInc.California,USA)封闭Fc，用PBS缓冲液洗涤细胞后用兔抗HA抗体FACS(PBS含1％BSA)液反应2小时，二抗用FITC标记的抗兔抗体反应30分钟。用未注射病毒的瘤细胞作阴性对照。LX分析型流式细胞仪(CytoFLEXLX)检测。结果如图4所示。

实施例七、实验动物接种血凝素蛋白疫苗：

采用杆状病毒表达载体生产的甲型流感病毒NYMCX-157(H1N1))株血凝素(HA)糖蛋白(来源于北京义翘神州公司)免疫4龄叙利亚仓鼠。

第一次将配制好的抗原与等体积弗氏完全佐剂充分混匀制成注射液，每只仓鼠腹腔注射200μl(含10μg血凝素蛋白)注射液，注射完后停留数秒以防止抗原外流。间隔两周后，以相同抗原加等体积的弗氏不完全佐剂乳化后加强免疫第二针，共注射两次。第28天取眼眶血，制备血清，检测抗体浓度。结果如图5所示。

实施例八，动物杀瘤实验：

选择接种了H1N1血凝素(HA)蛋白疫苗，ELISA检测抗HA抗体阳性的仓鼠(8周龄)，疫苗后第28天进行动物杀瘤实验。同时用8周龄未接种疫苗的仓鼠做对照杀瘤实验。在叙利亚仓鼠背右侧接种100μl含5X106DDT细胞(仓鼠平滑肌肉瘤细胞)，将接种过疫苗仓鼠分成四组，未接种疫苗的仓鼠分为四组，每组10只仓鼠。待肿瘤生长至350mm³，瘤内分别注射100μl含1X108pfu重组腺病毒，空白对照组荷瘤仓鼠注射100μlPBS缓冲液，按第0、2天注射两次。重组腺病毒样品为Ad-JYT-hTERT-HA、Ad-JYT-CMV-HA和Ad-JYT-hamsterTERT-E1A。每天观察实验仓鼠健康状态，记录肿瘤生长大小及成活数量，结果如图6至图8所示。

实施例九，治愈后动物再接种瘤细胞实验：

对治愈后动物再接种瘤细胞实验，继续喂养经重组溶瘤腺病毒Ad-JYT-hTERT-HA或Ad-JYT-CMV-HA治愈后的仓鼠，各选择其中8只，70天后再在仓鼠背右侧接种100μl含1X107DDT细胞。对照组选择8只15周龄健康叙利亚仓鼠，在背右侧接种100μl含1X107DDT细胞。观察各组肿瘤生长情况及成活数量。结果如图9所示。

以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，全文中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种全新的流感病毒疫苗在肿瘤治疗中的应用，其特征在于：包括流感病毒血凝素糖蛋白基因和流感病毒，所述的流感病毒血凝素糖蛋白基因包括HA1和HA2和跨膜区,与C3d或辅助蛋白及多肽核苷酸连接，中间用2A或Linker连接，末产生HA融合蛋白；

所述的流感病毒为WHO推荐的疫苗毒株NYMCX-179A血凝素糖蛋白作为抗原，包括所有流感病毒亚型的HA或神经氨酸酶、麻疹病毒血凝素、冠状病毒表面糖蛋白和其他可用于疫苗的病毒糖蛋白。

2.根据权利要求1所述的全新的流感病毒疫苗在肿瘤治疗中的应用，其特征在于：所述的流感病毒血凝素糖蛋白基因限制性人类TERT启动子控制HA融合蛋白基因，以实现HA融合蛋白在肿瘤中选择性表达并锚定在肿瘤细胞表面。

3.一种人流感病毒HA基因，其特征在于：CMV启动子控制HA融合蛋白基因，以实现HA融合蛋白的过表达并锚定在肿瘤细胞表面。

4.根据权利要求3所述的一种人流感病毒HA基因，其特征在于：限制性仓鼠TERT启动子控制E1A基因，以实现溶瘤腺病毒在肿瘤中选择性复制及流感病毒HA糖蛋白局限在肿瘤中表达并锚定在肿瘤细胞表面。

5.一种全新的流感病毒疫苗治疗肿瘤的方法，其特征在于：包括以下步骤：利用机体内已存在抗HA抗体和记忆免疫细胞或在治疗前预先给机体接种HA蛋白疫苗，待机体产生抗HA抗体后，注射携带HA基因的重组溶瘤病毒，以实现免疫系统对癌细胞准确的识别和杀死及清除肿瘤细胞。

6.根据权利要求5所述的一种全新的流感病毒疫苗治疗肿瘤的方法，其特征在于：可直接向肿瘤中注射携带HA基因的重组溶瘤病毒。