CN116675731A

CN116675731A - 靶向细胞周期蛋白依赖性激酶12/13的小分子缀合物及其应用

Info

Publication number: CN116675731A
Application number: CN202310479552.4A
Authority: CN
Inventors: 曹戟; 朱成梁; 杨波; 何俏军; 应美丹; 邵雪晶; 蒋莉; 陈丹妮
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2023-04-28
Filing date: 2023-04-28
Publication date: 2023-09-01
Also published as: WO2024222726A1

Abstract

本发明公开了一种本文提供了一种降解CDK12/13的小分子缀合物及其制备方法和应用，其结构为：T‑L‑E，式Ⅰ中，T表示母核分子CDK12/13蛋白的配体，L表示T和E的连接部分，又称Linker，E表示E3连接酶的配体。式Ⅰ所示化合物可通过T部分衍生物与E3酶配体及其衍生物和之间的酰胺缩合反应、取代反应或点击反应等合成。该化合物在多种细胞系上表现出高效的CDK12/13降解活性，高度特异性的肿瘤细胞增殖抑制活性，及合用其他抗肿瘤药物时的高效治疗效果。在生物学意义和治疗方面，可用于多种癌症及其他CDK12/13异常性疾病治疗的先导化合物。

Description

靶向细胞周期蛋白依赖性激酶12/13的小分子缀合物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体的涉及一类靶向细胞周期蛋白依赖性激酶12/13(CDK12/13)的小分子缀合物及其应用。

背景技术

细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)是多种细胞周期进程的主要调节因子，它们被分为两大类：一类与细胞周期相关，如CDK1，2，4，6，这些激酶直接调控细胞周期进程；另一类与基因转录相关，如CDK7，8，9，11，12，13，主要调控基因的转录过程。研究发现，肿瘤细胞中CDKs功能常常失调，因此对于这些肿瘤而言，CDKs是很有前景的治疗靶标。

其中，CDK12和CDK13是与转录相关的CDK，它们与细胞周期蛋白K(Cyclin K)形成复合物，通过介导RNA聚合酶II C末端结构域(RNAPII CTD)丝氨酸的磷酸化，参与调节转录延伸、mRNA剪接、转录终止等基因转录过程的多个阶段。近年来的研究发现，CDK12/13作为DNA损伤同源重组修复基因的特异性转录调节因子，促进内含子多聚腺苷化过程，在维持细胞的基因组稳定性方面具有重要作用。CDK12/13的大部分激酶功能存在相互代偿，若两者同时抑制或沉默会导致细胞内DNA损伤的积累，并最终导致细胞死亡。

肿瘤细胞在快速扩增的过程中需要进行大量的DNA复制，造成DNA损伤和基因组的不稳定性增加，因而比正常细胞更加依赖CDK12/13的功能，CDK12/13在多种肿瘤细胞中均存在明显的基因扩增，已经被明确是乳腺癌、淋巴瘤等疾病的有效治疗靶标。针对CDK12/13的药物开发不仅有助于深入研究其生物调控机制，还会是肿瘤治疗的有力策略。但目前，CDK12/13抑制剂尚处于临床前研究阶段。由于同源蛋白CDK具有高度类似的激酶活性域，所开发的小分子抑制剂均会无差别地抑制多个CDK活性，同时由于小分子抑制剂缺乏组织及细胞靶向性，对正常细胞的毒副作用较大。

PROTAC是一种先进的蛋白质降解技术，能够利用机体内天然存在的蛋白降解系统，降低蛋白水平而非抑制蛋白的功能，发挥治疗疾病的目的。其原理是通过拉近靶标蛋白与E3泛素连接酶之间的距离，实现靶标蛋白的泛素化，特异性诱导靶标蛋白的降解，达到治疗疾病的目的。经过20年的不断完善和发展，PROTAC已经成为药物开发的一种有力手段。由于不同细胞系之间细胞内环境的微妙差异性，PROTAC所介导的靶蛋白-PROTAC-E3连接酶三元复合体形成的复杂性等原因，PROTAC发挥功能常常伴随着细胞系选择性的降解或增殖抑制活性。因此，合理设计并开发新型的CDK12/13降解剂，实现组织或细胞的选择性作用，用于相关疾病的治疗和药理机制的研究仍需进一步探索。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种可以高效降解CDK12/13，选择性抑制肿瘤细胞增殖的小分子缀合物。与常规靶向CDK12/13的抑制剂和降解剂不同，本文所提供的小分子缀合物高效降解目标蛋白的同时，具有高度特异性的肿瘤细胞系增殖抑制活性，在分子和细胞层面都展现出明显不同于原母核分子(下式中的母核分子T，下文中亦是指代此项)的性质和优势。

本发明所提供的降解CDK12/13的小分子缀合物的结构式如式I所示或其药学上可接受的盐、共晶体、互变异构体、立体异构体、溶剂化物、水合物、多晶型物、同位素富集的衍生物或前药：

T-L-E

式I

式I中，T表示CDK12/13蛋白的配体，又称母核分子，E表示E3连接酶的配体，L表示T和E的连接部分或链接链，又称Linker。

具体地，所述T选自于一个CDK12/13抑制剂及其衍生物，其结构基团如式II所示。

或其药学上可接受的盐、共晶体、互变异构体、立体异构体、溶剂化物、水合物、多晶型物、同位素富集的衍生物或前药，其中：

式Ⅱ中的R¹可以为一个(n不为0)，也可以为两个(n为0)；每个R¹各自独立地是氢、任选取代的酰基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或氮保护基团；或者任选地，当存在两个R¹时，两个R¹与其中间原子(N)一起形成取代或未取代的杂环基或取代或未取代的杂芳基；

优选的，R¹的具体结构为乙基、或氮保护基团；

R^1-a可以存在多个或者一个(w为0时，R^1-a不存在)，每个R^1-a各自独立地是卤素、任选取代的酰基、任选取代的烷基；

w是0、1、2、3、4、5或6。

式Ⅱ中的R²是卤素、任选取代的酰基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、-CN、-OR^D1、-N(R^D1a)₂或-SR^D1；其中R^D1是氢、任选取代的酰基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、当连接到氧原子上时的氧保护基团、或当连接到硫原子上时的硫保护基团；

其中每个R^D1a各自独立的是氢、任选取代的酰基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或氮保护基团；或者任选地，两个R^D1a与其中间原子(C)一起形成取代或未取代的杂环或取代或未取代的杂芳基环；

R¹、R²中；所述酰基优选为C1～C6酰基；所述烷基优选为C1～C6烷基；所述烷基优选为C1～C6烯基；所述优选为C1～C6炔基；所述碳环基为3～8元碳环基；所述杂环基为3～8元杂环基；所述芳基为5～10元芳基；所述杂芳基为5～10元杂芳基；

所述氮保护基团包括叔丁氧羰基、苄氧羰基、烯丙氧羰基、对甲氧基苄基。所述氧保护基团包括二氢吡喃、甲氧基甲基、苄基、甲氧基苄基、三甲基硅基、叔丁基二甲基硅基。所述硫保护基团包括乙酰氨甲基、苯乙酰氨甲基、叔丁基硫基。

所述碳环基可以是3～8元烷环基或者带有一个或者两个双键、三键的3～8元碳环基。

所述任选取代包括不存在取代或者存在取代的情况，存在取代时，取代基可以是一个或者多个，多个取代基各自独立的选自羟基、氰基、卤素、硝基、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、3～6元环烷基、3～8元杂环基、芳基、杂芳基等中的一种或多种。

作为优选，R²为-CN。

式Ⅱ中的Rx和Ry各自独立的为CH或N；

式Ⅱ中的n是0、1、2、3、4或5；n为0时，A环为开环的链结构，即变为：

式(Ⅱ-0-2)中两个R¹相互独立，可以相同，也可以不相同。

进一步的，所述T的具体结构可为下述任一所示基团：

具体的E可以选自3-氨基-N-(2,6-二氧代-3-哌啶基)邻苯二甲酰亚胺基团(Pomalidomide基团)、3-(7-氨基-3-氧代-1H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮基团(Lenalidomide基团)、沙利度胺基团(Thalidomide基团)、(2S,4R)-1-((S)-2-(3-氨基丙酰胺基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺基团(VH032基团)、[(4R,5S)-4,5-双(4-氯苯基)-2-[4-(1,1-二甲基乙基)-2-乙氧基苯基]-4,5-二氢-4,5-二甲基-1H-咪唑-1-基][4-[3-(甲磺酰基)丙基]-1-哌嗪基]甲酮基团(RG-7112基团)、苯基戊二酰亚胺等；

针对E，其所述某基团，是指该基团对应的化合物中去掉其中的可离去H或者其他可以离去的基团形成的基团结构。比如，以3-氨基-N-(2,6-二氧代-3-哌啶基)邻苯二甲酰亚胺基团为例，其指代化合物3-氨基-N-(2,6-二氧代-3-哌啶基)邻苯二甲酰亚胺中去掉可离去H或者其他可以离去的基团剩下的基团结构。

作为一种可实施方案，E可以选自如下基团中的一种：

式III-a～III-d、III-a-0～III-d-0中，R₁为NH或O或CH₂；

所述式Ⅲ-e中，R₁＝H或OH，R₂＝H或CH₃；所述式Ⅲ-f中，其中R₃＝-CN，-F，-COCH₃，R₂＝H或CH₃；所述式Ⅲ-g中，R₁＝H，CN，F，Cl，Br，或式：所述式Ⅲ-h中，其中R₃＝-CN，-F，-COCH₃；R₂为H或CH₃；所述式Ⅲ-i中，其中R₃＝-CN，-F，-COCH₃；R₂为H或CH₃；所述式Ⅲ-l中，X＝N或CH。

具体的，所述L为1～30个原子长度、任意类型的单元；

更具体的，所述L包括但不限于如下结构，或由如下结构所组成的任意结构团体：

如乙二醇结构组成的单元：或脂肪链组成的单元：或不饱和链组成的单元：或非芳香杂环组成的单元：或芳香化合物组成的单元：-CH₂-、-(C＝O)-、或含杂原子的基团，所述杂原子为硫，氮或膦，包括但不限于如下片段单元：所述含杂原子的单元中R独立的为：烷基、烷氧基或氢；优选的，所述烷基具体为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基；所述烷氧基为-OEt、-OMe。

作为优选，所述L选自如下结构：

上述结构式中，所述X、Y、Z、V、W各自独立的选自N、CH。作为进一步优选，X、Y、Z不同时为CH。

作为优选，m₁为0，1,2,3,4,5,6，m₂为0,1,2,3,4,5,6。

具体地，所述小分子缀合物的结构式如式IV-式X任一所示：

式IV中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，A为CH₂、NH、O或CO，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO，B为CO或CH₂，X、Y、Z各自独立的为CH或N，R¹、n的定义同式II；作为一种实施方案，G为O；

式V中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，A为CH₂、NH、O或CO，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO，B为CO或CH₂，X、Y各自独立的为CH或N，R¹、n的定义同式II；作为一种实施方案，Y为N时G不存在；Y为CH时，G为杂原子(NH或O等)；

式VI中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，A为CH₂、NH、O或CO，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO，B为CO或CH₂，X、Y、Z各自独立的为CH或N，V、W独立的为CH或N，R¹、n的定义同式II；作为一种实施方案，W为N时G不存在；W为CH时，G为杂原子(NH或O等)；

式VII中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO；Rx为H或CH₃，X、Y、Z各自独立的为CH或N，R¹、n的定义同式II；作为一种实施方案，G为O；

式VIII中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO，Rx为H或CH₃，X、Y独立的为CH或N，R¹、n的定义同式II；作为一种实施方案，Y为N时G不存在；Y为CH时，G为杂原子(NH或O等)；

式IX中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO；Rx为H或CH₃，X、Y、Z独立的为CH或N，V、W各自独立的为CH或N，R¹、n的定义同式II；作为一种实施方案，W为N时G不存在；W为CH时，G为杂原子(NH或O等)；

式X中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO；A为CH₂或CO，X、Y、Z各自独立的为CH或N，

R¹、n的定义同式II；作为一种实施方案，G为O；

式XI中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO；A为CH₂或CO，X、Y各自独立的为CH或N；R¹、n的定义同式II；作为一种实施方案，Y为N时G不存在；Y为CH时，G为杂原子(NH或O等)；

式XII中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO；A为CH₂或CO，X、Y、Z各自独立的为CH或N，V、W各自独立的为CH或N，R¹、n的定义同式II；作为一种实施方案，W为N时G不存在；W为CH时，G为杂原子(NH或O等)。

作为一种具体的实施方案，所述小分子缀合物具有如式IX所示的结构，其中，n＝0；R¹为苄基；X为CH；Y和Z中至少一个为N，不全为N时，另外一个为CH；G不存在；m₁为0；m₂为0,1,2，Rx为甲基。

更具体地，所述小分子缀合物如下述式1～式138所示的化合物：

本发明的另一个目的是提供上述任一技术方案所述(优选式I、式IV-式XII、式1～86任一结构)所示小分子缀合物的制备方法。

以式I所示结构为例，本发明所提供的式I(或者式IV-式XII、式1～86任一结构)所示化合物可通过对应的E3连接酶的配体(如Pomalidomide类衍生物、VHL配体类衍生物及MDM2配体类衍生物)和对应的T部分衍生物之间通过酰胺缩合反应、取代反应、点击反应或交叉偶联反应等而合成。

具体的，所述式IV所示的小分子缀合物(以G为O、A为NH、X为CH、Y为N、Z为CH为例)的制备方法，包括下述步骤：通过CDK12/13配体端衍生物(式a所示)和Pomalidomide端衍生物(式b所示)之间的亲核取代反应，得到式IV所述的小分子缀合物；

其中，式a中R¹、m₁、m₂、n的定义同式IV，式b中B的定义同式IV；

所述式V所示的小分子缀合物(G为CH₂、A为NH、X为N、Y为N)的制备方法，包括下述步骤：通过CDK12/13配体端衍生物(式c所示)与Pomalidomide端衍生物(式b所示)之间进行亲核取代反应，得到式V所述的小分子缀合物；

其中，式c中R¹、m₁、m₂、n的定义同式V；

所述式VI所示的小分子缀合物(G为CH₂、A为NH、X为CH、Y为N、Z为CH、V为N、W为N)的制备方法，包括下述步骤：通过CDK12/13配体端衍生物(式d所示)与Pomalidomide端衍生物(式b所示)之间进行亲核取代反应，得到式VI所述的小分子缀合物；

其中，式d中R¹、m₁、m₂、n的定义同式VI；

式VII所示的小分子缀合物(G为O、X为CH、Y为N、Z为CH)的制备方法，包括下述步骤：通过CDK12/13配体端衍生物(式e所示)与VHL配体衍生物(式f所示)之间进行缩合反应，得到式VII所述的小分子缀合物；

其中，式e中R¹、m₁、m₂、n的定义同式VII；

所述式VIII所示的小分子缀合物(G为CH₂、X为N、Y为N)的制备方法，包括下述步骤：通过CDK12/13配体端衍生物(式g所示)与VHL配体衍生物(式f所示)之间进行缩合反应，得到式VIII所述的小分子缀合物；

其中，式g中R¹、m₁、m₂、n的定义同式VIII，式f中Rx的定义同式VIII；

所述式IX所示的小分子缀合物(G为空、X为CH、Y为N、Z为CH、V为N、W为N)的制备方法，包括下述步骤：通过CDK12/13配体端衍生物(式h所示)与VHL配体衍生物(式f所示)之间进行缩合反应，得到式X所述的小分子缀合物；

其中，式h中R¹、m₁、m₂、n的定义同式IX，式f中Rx的定义同式IX；

所述式X所示的小分子缀合物(G为O、X为CH、Y为N、Z为CH、A为CO)的制备方法，包括下述步骤：通过CDK12/13配体端衍生物(式e所示)与MDM2配体衍生物(式j所示)之间进行缩合反应，得到式X所述的小分子缀合物；

其中，所述式X所述的小分子缀合物中，式e中R¹、m₁、m₂、n的定义同式X；

所述式XI所示的小分子缀合物(G为CH₂、X为N、Y为N、A为CO)的制备方法，包括下述步骤：通过CDK12/13配体端衍生物(式g所示)与MDM2配体衍生物(式j所示)之间进行缩合反应，得到式XI所述的小分子缀合物；

其中，式g中R¹、m₁、m₂、n的定义同式XI。

所述式XII所示的小分子缀合物(G为CH₂、X为CH、Y为N、Z为CH、V为N、W为N、A为CO)的制备方法，包括下述步骤：通过CDK12/13配体端衍生物(式h所示)与MDM2配体衍生物(式j所示)之间进行缩合反应，得到式XII所述的小分子缀合物；

其中，式h中R¹、m₁、m₂、n的定义同式XII。

上述CDK12/13配体端衍生物(式a、式c、式d、式e、式g、式h所示)也属于本发明的保护范围。CDK12/13配体端衍生物(式a、式c、式d、式e、式g、式h所示)的合成具体过程如下：

当式II中n为0时：式a、式c、式d、式e、式g、式h对应的化合物为式a0、式c0、式d0、式e0、式g0、式h0所示的结构：

1)CDK12/13配体端衍生物(式a0所示):将式1a所示与联硼酸频那醇酯偶联得到式2a所示化合物；将5-溴-2-氟吡啶(式3a)与4a所示化合物发生亲核反应得到式5a所示化合物；将式2a所示与式5a所示化合物通过偶联反应后脱去保护基团，得到式a0所示化合物；

其中，式1a所示化合物的制备方法为：将1-溴-4-碘苯(式1aa)与trans-(4-氨基环己基)氨基甲酸叔丁酯(式2aa)通过偶联反应得到((1r,4r)-4-((4-溴苯基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(式3aa)，将式3aa所示化合物与异氰酸苄酯(式4aa)发生亲核反应得到后脱保护得到1-((1r,4r)-4-氨基环己基)-3-苄基-1-(4-溴苯基)脲(式5aa)，再将式5aa所示化合物与6-氟烟腈(式6aa)通过亲核反应得到式1a所示化合物；

2)CDK12/13配体端衍生物(式c0所示):将式1a与1-哌嗪羧酸叔丁酯(式1c)发生偶联反应并脱保护得到式3c；将式2c所示与式3c所示化合物通过亲核取代反应并脱去保护基团，得到式c0所示化合物；

3)CDK12/13配体端衍生物(式d0所示)：将式3a所示与1c所示化合物通过亲核取代反应得到式1d所示化合物，式1d与式2a化合物通过偶联反应并脱去保护基团得到式2d化合物；将式2c所示与式2d所示化合物通过亲核取代反应并脱去保护基团，得到式d0所示化合物；

4)CDK12/13配体端衍生物(式e0所示)：将式e1所示与式3a所示通过亲核取代反应得到e2；将式e2所示与式2a化合物通过偶联反应并脱去保护基团得到式e0所示化合物；

5)CDK12/13配体端衍生物(式g0所示)：将式3c所示与式g1所示化合物通过亲核取代反应并脱去保护基团得到式g0所示化合物。

6)CDK12/13配体端衍生物(式h0所示)：将式2d所示与式g1所示化合物通过亲核取代反应并脱去保护基团得到式h0所示化合物。

当式II中n不为0时(以n为1为例)：式a、式c、式d、式e、式g、式h对应的化合物为式ab1、式cb1、式db1、式eb1、式gb1、式hb1所示的结构：

1)将式1b-1所示化合物与联硼酸频那醇酯偶联得到式2b-1所示化合物

其中，以R1为苄基为例，式1b-1所示化合物的制备方法为：将式1bb所示化合物经选择性还原氰基得到式2bb所示化合物，将式2bb所示化合物与式3bb所示化合物通过还原胺化反应得到式4bb所示化合物，再将式4bb所示化合物还原得到式5bb所示化合物，式5bb所示化合物经分子内成脲得到式6bb所示化合物，式6bb所示化合物与式7bb所示化合物经亲核取代反应后脱保护后得到式8bb所示化合物，式8bb所示化合物与式6aa所示化合物通过亲核反应得到式1b-1所示化合物；

2)式3cb-1所示化合物的合成，由式1b-1所示化合物与式1c所示化合物发生偶联反应并脱保护得到；式2db-1所示化合物的合成，由式2b-1所示化合物与式1d所示化合物通过偶联反应并脱去保护基团得到；

3)式ab1所示化合物的合成，参照式a0，由式2b-1所示化合物与式5a所示化合物通过偶联反应后脱去保护基团得到；

式cb1所示化合物的合成，参照式c0，由式3cb-1所示化合物与式2c所示化合物通过亲核取代反应并脱去保护基团得到；

式db1所示化合物的合成，参照式d0，由式2db-1所示化合物与式2c所示化合物通过亲核取代反应并脱去保护基团得到；

式eb1所示化合物的合成，参照式e0，由式2b-1所示化合物与式e2所示化合物通过偶联反应后脱去保护基团得到；

式gb1所示化合物的合成，参照式g0，由式3cb-1所示化合物与式g1所示化合物通过亲核取代反应并脱去保护基团得到；

式hb1所示化合物的合成，参照式h0，由式2db-1所示化合物与式g1所示化合物通过亲核取代反应并脱去保护基团得到。

本发明的再一个目的是提供上述小分子缀合物的应用。

进一步，一种上述任一技术方案所述小分子缀合物在下述1)-3)中的至少一方面：

1)在制备CDK12/13降解剂中的应用；

2)在制备癌细胞增殖抑制剂中的应用；

3)在制备预防和/或治疗CDK12/13异常性疾病药物中的应用。

所述CDK12/13降解剂可选择性降解包括但不限于下述细胞中的CDK12/13：结直肠癌细胞(如HCT116)、乳腺癌细胞(如MDA-MB-231)和脑胶质细胞瘤细胞(如U251)、急性髓细胞性白血病细胞(如U937、Kasumi-1、MV-4-11、NB4)、T淋巴细胞白血病细胞(如Jurkat、MOLT-4)、骨髓瘤细胞(如MM.1s)。

所述癌细胞包括但不限于下述细胞骨髓瘤细胞、乳腺癌细胞、白血病细胞和脑胶质细胞瘤细胞。

所述CDK12/13异常性疾病包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、胃癌、尤文肉瘤、白血病。

所述产品包括：1)CDK12/13蛋白降解剂；2)肿瘤细胞增殖抑制剂；3)预防和/或治疗CDK12/13异常性疾病的药物。

所述降解剂药物、癌细胞增殖抑制剂药物或CDK12/13异常性疾病药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

上述药物可以制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂、注射液等多种形式；上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明还提供一种含有上述任一技术方案所述的小分子缀合物的药物组合物(组合药物)。

本发明提供的小分子缀合物(CDK12/13降解剂)不仅可独立的用于肿瘤的治疗，亦可联合用药，更高效的用于疾病的治疗。

作为一种实施方式，联合用药时，本发明所提供的联合用药药物组合物(或组合药物)，包括式I所示的小分子缀合物(CDK12/13降解剂)和下述至少一种药物：PARP抑制剂、BET抑制剂、CDK4&6抑制剂、PI3K抑制剂和全反式维甲酸(ATRA)。

所述PARP抑制剂包括Olaparib，Rucaparib,Niraparib,Talazoparib。BET抑制剂包括ABBV-075，JQ1，dBET-1，ARV-825。所述CDK4&6抑制剂包括YX-2-107，Palbociclib。所述PI3K抑制剂包括Copanlisib。

所述联合用药药物组合物具体可为式I所示的小分子缀合物(CDK12/13降解剂)和如上所有抑制剂按照摩尔比1:1-10:1的比例组成的组合物。

目前缺乏具有细胞类型选择性的CDK12/13抑制剂和降解剂。本发明利用PROTAC技术获得了高活性的CDK12/13降解剂，具有高度特异性抑制癌细胞增殖的能力。其中针对CDK12和CDK13的半数降解浓度(Degradation concentration 50％，简称DC₅₀)约为30nM和21nM，针对肿瘤细胞KASUMI-1和MV4-11的半数抑制浓度(Inhibition concentration rate50％，简称IC₅₀)分别约为170nM和90nM，但在正常细胞L-02和HK-2中的IC₅₀均约为1000nM。本发明所述降解剂在多种细胞系上均展现出对CDK12/13的强降解能力，且对肿瘤细胞系表现出高度选择性的增殖抑制活性，联合用药方案下，也表现出了对肿瘤细胞的高效治疗效果。

该化合物在多种细胞系上表现出高效的CDK12/13降解活性，高度特异性的肿瘤细胞增殖抑制活性，及合用其他抗肿瘤药物时的高效治疗效果。在生物学意义和治疗方面，可用于多种癌症及其他CDK12/13异常性疾病治疗的先导化合物。

附图说明

图1为PROTACs技术机制图。

图2为浓度为3μM的IN-2(母核分子)、式46、式47、式48、式49、式60、式61、式59、式32、式33、式34、式38处理Jurkat细胞24h后，CDK12、CDK13的降解情况。

图3为浓度为3μM的IN-2、式57、式58、式59、式1、式2、式3、式4、式6、式7、式8处理Jurkat细胞24h后，CDK12、CDK13的降解情况。

图4为浓度为2μM的式40、式39、式18、式13、式11、式12、式48、式45、式1处理MV4-11细胞24h后，CDK12、CDK13的降解情况。

图5为浓度为0.125μM的式18、式54、式53、式55、式21、式22、式17、式15、式71、式40、式38、式45、式23、式44、式37、式30分别处理KASUMI-1和MV4-11细胞24h后，CDK12、CDK13的降解情况。

图6为不同浓度下，式18和式45在MDA-MB-231细胞系上处理24小时，CDK12、CDK13的降解情况。

图7为浓度为0.3μM式18、式45处理MDA-MB-231细胞，CDK12、CDK13蛋白丰度随作用时间变化情况。

图8为不同浓度下，式18和式45在MDA-MB-231细胞系上处理24小时，CDK12、CDK13、CDK9、CDK2的降解情况。

图9为式18和式45在MDA-MB-231细胞系上处理24小时，收样前12h加入蛋白酶体抑制剂MG132，式18和式45对CDK12、CDK13的降解被逆回，说明小分子缀合物通过泛素-蛋白酶体通路降解CDK12、CDK13。

图10为浓度梯度的THZ-531(经典CDK12/13抑制剂)、IN-2、式18作用下72小时后，肿瘤细胞MDA-MB-231、MV4-11、KASUMI-1和正常细胞L-02、HK-2的存活情况。

图11为式18与Olaparib联用在不同浓度下的对MDA-MB-231细胞的增殖抑制效果。

图12为式18、式45在四种不同种属人、大鼠、小鼠、狗、猴的肝微粒体下的稳定性测试结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中使用的IN-2(母核分子)，结构如下：

该化合物的合成路线为：式1a所示化合物与1-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基l-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)吡啶-2(1H)-酮(式N1)发生偶联反应得到。

CDK12/13配体端衍生物(式a0所示)合成的具体过程(以a0-1为例(R¹为苄基，n＝0，m₁＝1，m₂＝0))是：将1-溴-4-碘苯(1aa)与反式-叔丁基(4-氨基环己基)氨基甲酸酯(2aa)通过偶联反应得到叔丁基叔丁基((1r,4r)-4-((4-溴苯基)氨基)环己基)氨基甲酸酯(3aa)，再将式((1r,4r)-4-((4-溴苯基)氨基)环己基)氨基甲酸酯与异氰酸苄酯(4aa)发生亲核反应并用盐酸脱去Boc保护基团得到1-((1r,4r)-4-氨基环己基)-3-苯基-1-(4-溴苯基)尿(5aa)，再将1-((1r,4r)-4-氨基环己基)-3-苄基-1-(4-溴苯基)脲与6-氟烟腈(6aa)通过亲核反应得到3-苄基-1-(4-溴苯基)-1-((1r,4r)-4-((5-氰基吡啶-2-yl)氨基)环己基)脲(式1a所示)；将3-苄基-1-(4-溴苯基)-1-((1r,4r)-4-((5-氰基吡啶-2-yl)氨基)环己基)脲与联硼酸频那醇酯偶联得到3-苄基-1-((1r,4r)-4-((5-氰基吡啶-2-yl)氨基)环己基)-1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)脲(式2a所示)；将5-溴-2-氟吡啶(3a)与4a所示化合物发生亲核反应得到式5a所示化合物；将式2a所示与式5a所示化合物通过偶联反应，最后酸性环境下脱去保护基团，得到式a0-1所示化合物；

具体讲，当n为0时，具体制备过程(以a0-1为例(R¹为苄基，n＝0，m₁＝1，m₂＝0))如下：

(1)中间体3aa的制备：

在250ml圆底烧瓶中加入5g 1-溴-4-碘苯(1aa)，3.2g反式-(4-氨基环己基)氨基甲酸叔丁酯(2aa)，2.2g叔丁醇钠，856mg Xantphos(4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基氧杂蒽)，溶于40ml甲苯溶剂中。氮气置换三次后加入542mg Pd₂(dba)₃，再次氮气置换三次，加热至70℃，搅拌2小时后，TLC检测原料反应完全后，用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，滤液减压浓缩，旋转干燥。硅胶柱分离纯2.8g化合物3aa，产率67％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₁₇H₂₆BrN₂O₂ ⁺＝369.1；found 369.2。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.15(d,J＝8.8Hz,2H),6.79(d,J＝7.9Hz,1H),6.49(d,J＝8.9Hz,2H),5.62(d,J＝8.0Hz,1H),3.25–3.15(m,1H),3.13–2.99(m,1H),1.93(d,J＝11.5Hz,2H),1.78(d,J＝11.0Hz,2H),1.37(s,9H),1.30–1.19(m,2H),1.18–1.07(m,2H).

(2)中间体5aa的制备：

在125ml圆底烧瓶中加入2.8g中间体3aa，溶于30ml无水四氢呋喃，加入2.4g无水三乙胺。氮气置换三次后，室温搅拌5分钟，向反应液中滴加异氰酸苄酯(4aa)4.0g，升温至60℃，搅拌8小时后，TLC检测原料反应完全后，用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，滤液减压浓缩，旋转干燥。硅胶柱分离纯化后，用2N的氯化氢-乙酸乙酯溶液处理，TLC检测原料反应完全后，将反应溶剂减压蒸馏得3.4g化合物5aa，产率90％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₂₀H₂₅BrN₃O⁺＝402.1；found 402.1。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.61(d,J＝8.5Hz,2H),7.25(t,J＝7.4Hz,2H),7.15(t,J＝8.9Hz,3H),7.09(d,J＝8.5Hz,2H),6.67(d,J＝7.9Hz,1H),5.99(t,J＝5.9Hz,1H),4.19–4.09(m,3H),2.99–2.87(m,1H),1.71(d,J＝9.6Hz,4H),1.32(s,9H),1.25–1.17(m,2H),1.03–0.94(m,2H).

(3)中间体1a的制备：

在100ml圆底烧瓶中加入3.4g中间体5aa和1.8g 6-氟烟腈(6aa)溶于无水N-甲基吡咯烷酮溶液，将反应体系降至0℃，向反应液中滴加5.3g DIPEA(N,N-二异丙基乙基胺)，后升温至100℃，搅拌8小时后，TLC检测原料反应完全后，反应液倒入100ml水中，用60ml二氯甲烷萃取三次，有机相减压浓缩，将所得固体混悬于乙酸乙酯中，室温下搅拌15分钟，混悬液通过通过抽滤漏斗抽滤，滤饼用50％乙酸乙酯/石油醚洗涤，所得滤饼固体经真空干燥，得到2.2g产物1a，产率64％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₂₆H₂₇BrN₅O₁ ⁺＝504.1；found 504.1。

1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.27(s,1H),7.56(d,J＝8.5Hz,2H),7.40(dd,J＝8.8,2.1Hz,1H),7.29(t,J＝7.2Hz,2H),7.23(d,J＝7.1Hz,1H),7.16(d,J＝7.1Hz,2H),7.06(d,J＝8.5Hz,2H),6.26(d,J＝8.8Hz,1H),5.19(d,J＝8.0Hz,1H),4.64–4.49(m,1H),4.36(d,J＝5.8Hz,2H),4.27(t,J＝5.8Hz,1H),3.53(s,1H),2.10(d,J＝11.8Hz,2H),1.95(d,J＝11.5Hz,2H),1.41(q,J＝13.4Hz,2H),1.25(q,J＝15.1,13.8Hz,2H).

(4)中间体2a的制备：

在100ml圆底烧瓶中加入1.0g中间体1a，1.3g联硼酸频那醇酯，779mg醋酸钾，溶于无水二氧六环溶液，氮气置换三次后加入325mg Pd(dppf)₂Cl₂，再次氮气置换三次，加热至80℃，搅拌1.5小时后，TLC检测原料反应完全，后用饱和盐水洗涤两次，分离有机相，有机相减压浓缩，旋转干燥。硅胶柱分离纯1.0g化合物2a，产率91％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₃₂H₃₉BrN₅O₃ ⁺＝552.3；found 552.3。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.28(d,J＝2.4Hz,1H),7.75(d,J＝8.1Hz,2H),7.60(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.48(d,J＝7.7Hz,1H),7.27(t,J＝7.5Hz,2H),7.23–7.12(m,4H),6.46(d,J＝8.9Hz,1H),5.83(t,J＝6.1Hz,1H),5.76(s,1H),4.34–4.21(m,1H),4.13(d,J＝6.0Hz,2H),3.45(m,J＝26.2Hz,1H),1.90(d,J＝12.1Hz,2H),1.83–1.75(d,2H),1.30(s,12H),1.17–1.07(m,J＝35.8Hz,4H).

(5)中间体4a的制备(以4a-1为例(m₁＝1，m₂＝0))：

在100ml圆底烧瓶中加入2.0g 2-(2-氨基乙氧基)乙醇和2.8g三乙胺，溶于二氯甲烷中，将反应体系降至0℃，向反应液中滴加Boc酸酐，后缓慢升至室温，搅拌3小时，TLC检测原料反应完全后，用饱和盐水浴洗涤两次，分离有机相，有机相减压浓缩，真空干燥，所得反应液直接进行下一步反应。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₉H₂₀NO₄ ⁺＝205.1；found205.2。

1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ5.29(s,1H),4.22(t,2H),3.71(t,2H),3.48(t,2H),3.21-3.26(m,2H),2.26(s,1H),1.41(s,9H).

其他中间体(4a-0、4a-2、4a-3、4a-4、4a-5)的制备参考4a-1：

4a-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料为N-Boc-乙醇胺；

4a-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料为2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇；

4a-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料为2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙醇；

4a-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料为14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-醇；

4a-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料为17-氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷醇。

(6)中间体5a-1的制备(以5a-1为例(m₁＝1，m₂＝0))：

在100ml圆底烧瓶中加入1g 2-(2-Boc-氨基乙氧基)乙醇(4a-1)，1.1g 2-氟-5-溴吡啶和4.8g碳酸铯，溶于无水二甲基亚砜中，将反应体系升至100℃，向反应液中滴加Boc酸酐，后缓慢升至室温，搅拌6小时，TLC检测原料反应完全后，反应液倒入100ml饱和食盐水中，用60ml乙酸乙酯萃取三次，有机相减压浓缩，旋转干燥。硅胶柱分离纯1.42g化合物5a-1，产率82％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₁₄H₂₂BrN₂O₄ ⁺＝361.1；found 361.1。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.48(d,J＝2.7Hz,1H),7.38(dd,J＝9.7,2.8Hz,1H),6.50(d,J＝10.2Hz,1H),4.99(s,1H),4.28(t,2H),3.75(t,2H),3.50(t,2H),3.22-3.25(m,2H),1.40(s,9H).

其他中间体(5a-0、5a-2、5a-3、5a-4、5a-5)的制备参考5a-1：

5a-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以4a-0代替4a-1；

5a-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以4a-2代替4a-1；

5a-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以4a-3代替4a-1；

5a-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以4a-4代替4a-1；

5a-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以4a-5代替4a-1。

(7)式a0-1所示化合物的制备：

在25ml圆底烧瓶中加入80mg中间体2a，63mg中间体5a-1和142mg碳酸铯，溶于甲苯：乙醇：水＝4：4：1的混合溶剂中，氮气置换三次后加入16mg Pd(PPh₃)₄，再次氮气置换三次，加热至100℃，搅拌3小时后，TLC检测原料反应完全，用20ml二氯甲烷萃取三次，有机相减压浓缩，旋转干燥。硅胶柱分离纯46mg，经2N的氯化氢-乙酸乙酯溶液处理，得化合物a0-1，产率47％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₃₅H₄₀N₇O₃ ⁺＝606.3；found 606.4。

其他中间体(a-0、a-2、a-3、a-4、a-5)的制备参考a-1：

a0-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以5a-0代替5a-1；

a0-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以5a-2代替5a-1；

a0-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以5a-3代替5a-1；

a0-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以5a-4代替5a-1；

a0-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以5a-5代替5a-1。

当n不为0时(以ab1-1为例(R¹为苄基，n＝1，m₁＝1，m₂＝0))，具体制备过程如下：

(1)中间体2bb的制备

在100ml圆底烧瓶中加入2.0g 2-硝基-5-溴苯腈(1bb)，氮气置换三次后，冰浴下缓慢滴加18ml硼烷四氢呋喃络合物(1M)，再次氮气置换三次，搅拌过夜，TLC检测原料反应完全后，用20ml乙酸乙酯萃取三次，滤液减压浓缩，旋转干燥。硅胶柱分离纯1.1g化合物2bb，产率54％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₇H₈BrN₂O2+＝230.9；found 230.9。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.84–7.77(m,1H),7.54(t,J＝1.8Hz,1H),7.49(dd,J＝8.7,2.2Hz,1H),3.02(s,2H),1.53(s,2H).

(2)中间体4bb的制备

在100ml圆底烧瓶中加入460mg苯甲醛(3bb)，溶于无水四氢呋喃中，将1.0g中间体2bb溶于无水四氢呋喃溶液中，冰浴下滴加入圆底烧瓶，氮气置换三次后，室温下搅拌1h，加入545mg氰基硼氢化钠，搅拌过夜，TLC检测原料反应完全后，加入20ml冰水淬灭反应，用20ml乙酸乙酯萃取三次，滤液减压浓缩，旋转干燥。硅胶柱分离纯1.2g化合物4bb，产率92％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₁₄H₁₄BrN₂O₂ ⁺＝321.0；found 321.0。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.55(d,J＝2.1Hz,1H),7.49(dd,J＝8.7,2.2Hz,1H),7.35–7.28(m,4H),7.25(d,J＝4.8Hz,1H),3.81(s,2H),3.09(t,J＝7.1Hz,2H),1.49(m,1H).

(3)中间体5bb的制备

在100ml圆底烧瓶中加入1.2g中间体4bb，溶于无水乙酸乙酯中，加入2.4g氯化亚锡二水合物，氮气置换三次后，加热至80℃搅拌3h，TLC检测原料反应完全后，加入20ml冰水，用20ml乙酸乙酯萃取三次，滤液减压浓缩，旋转干燥。硅胶柱分离纯840mg化合物5bb，产率77％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₁₄H₁₆BrN₂ ⁺＝291.0；found 291.1。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.57–7.50(m,2H),7.47–7.42(m,3H),7.15–7.08(m,2H),6.63(d,J＝9.2Hz,1H),4.15(s,2H),3.04(dd,J＝9.8,6.1Hz,2H),1.32–1.16(m,1H).

(4)中间体6bb的制备

在100ml圆底烧瓶中加入840mg中间体5bb，溶于无水四氢呋喃溶液中，加入447mgCDI(1,1′-羰基二咪唑)，室温搅拌3h后，加热至60℃继续搅拌12h，TLC检测原料反应完全后，用20ml乙酸乙酯萃取三次，滤液减压浓缩，旋转干燥。硅胶柱分离纯706mg化合物6bb，产率76％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₁₅H₁₄BrN₂O⁺＝317.0；found 317.0。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.46(s,1H),7.40–7.20(m,7H),6.75(d,J＝8.2Hz,1H),4.52(s,2H),4.35(s,2H).

(5)中间体8bb的制备

在100ml圆底烧瓶中加入700mg中间体6bb，溶于无水二氧六环溶液中，冰浴下分批加入97mg氢化钠，0℃搅拌0.5h后，将1.2g顺-4-((叔丁氧基羰基)氨基)环己基4-甲基苯磺酸盐(7bb)溶于无水二氧六环中缓慢滴加进入反应体系，加热至60℃继续搅拌8h，TLC检测原料反应完全后，加入20ml冰水淬灭反应，用20ml乙酸乙酯萃取三次，滤液减压浓缩，旋转干燥。硅胶柱分离纯化后，用2N的氯化氢-乙酸乙酯溶液处理，TLC检测原料反应完全后，将反应溶剂减压蒸馏得572mg化合物8bb，产率63％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₂₁H₂₅BrN₃O⁺＝414.1；found 414.1。

(6)中间体1b-1的制备参照式1a的制备，原料为中间体8bb和6-氟烟腈。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₂₇H₂₇BrN₅O⁺＝516.1；found 516.1。

(7)中间体2b-1的制备参照式2a的制备，原料为中间体1b和硼酸频哪醇酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₃₃H₃₉BrN₅O₃ ⁺＝564.3；found 564.3。

(8)式ab1-1所示化合物的制备：参照式a0-1的制备，原料为式2b所示化合物与

式5a-1所示化合物；

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₃₆H₄₀BrN₇O₃ ⁺＝618.3；found 618.3。

其他中间体(ab1-0、ab1-2、ab1-3、ab1-4、ab1-5)的制备参考ab1-1：

ab1-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以5a-0代替5a-1；

ab1-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以5a-2代替5a-1；

ab1-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以5a-3代替5a-1；

ab1-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以5a-4代替5a-1；

ab1-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以5a-5代替5a-1。

CDK12/13配体端衍生物(式c所示)合成的具体过程(以c0-1为例(R¹为苄基，n＝0，m₁＝1，m₂＝0))是：

将3-苄基-1-(4-溴苯基)-1-((1r,4r)-4-((5-氰基吡啶-2-yl)氨基)环己基)脲(式1a所示)与哌嗪-1-羧酸叔丁酯(式1c所示)得到4-(4-{[(苄基氨基)羰基]{4-[(5-氰基吡啶-2-基)氨基]环己基}氨基}苯基)哌嗪-1-甲酸-2-甲基丙-2-基酯，脱去Boc保护基团得到1-(苄基氨基)-N-{4-[(5-氰基吡啶-2-基)氨基]环己基}-N-[4-(哌嗪-1-基)苯基]甲烷酰胺(式3c所示)；将2-(2-Boc-氨基乙氧基)乙醇(式4a-1所示)与对甲基苯基磺酰氯发生取代反应得到2-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)乙基4-甲基苯磺酸酯(式2c-1所示)；将1-(苄基氨基)-N-{4-[(5-氰基吡啶-2-基)氨基]环己基}-N-[4-(哌嗪-1-基)苯基]甲烷酰胺与2-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)乙基4-甲基苯磺酸酯发生亲核反应，最后酸性环境下脱去保护基团，得到式c0-1所示化合物；

当n为0时(以c0-1为例(R¹为苄基，n＝0，m₁＝1，m₂＝0))具体制备过程如下：

(1)中间体3c的制备：

在25ml圆底烧瓶中加入200mg中间体1a，110mg哌嗪-1-羧酸叔丁酯，150mg叔丁醇钠，23mg Xantphos，溶于5ml甲苯溶剂。氮气置换三次后加入22mg Pd₂(dba)₃，再次氮气置换三次，加热至80℃，搅拌2小时后，TLC检测原料反应完全后，滤液减压浓缩，旋转干燥。硅胶柱分离纯化后15mg，经2N的氯化氢-乙酸乙酯溶液处理，得化合物1c，产率48％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₃₀H₃₆N₇O⁺＝510.3；found 510.3。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.25(s,1H),7.30–7.13(m,6H),7.03(d,J＝8.8Hz,2H),6.89(d,J＝8.9Hz,2H),6.23(d,J＝8.8Hz,1H),5.21(d,J＝8.0Hz,1H),4.59–4.48(m,1H),4.41–4.32(m,3H),3.57(t,J＝5.2Hz,4H),3.48(m,J＝19.3Hz,1H),3.16(t,J＝5.1Hz,4H),2.05(d,J＝12.5Hz,2H),1.92(d,J＝12.1Hz,2H),1.44–1.28(m,4H).

(2)中间体2c的制备(以2c-1为例(m₁＝1，m₂＝0))：

在100ml圆底烧瓶中加入1.0g 4a-1和743mg三乙胺，1g 4-甲苯磺酰氯，溶于二氯甲烷中，在室温下搅拌3小时，TLC检测原料反应完全后，用饱和盐水浴洗涤两次，分离有机相，有机相减压浓缩，真空干燥，旋转干燥。硅胶柱分离纯化后1.7g化合物2c-1，产率98％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₁₆H₂₆NO₆S⁺＝360.2；found 360.3。

1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ＝7.80(d,J＝8.7Hz,2H),7.36(d,J＝8.7Hz,2H),4.18–4.15(m,2H),3.63(t,J＝4.6Hz,2H),3.45(t,J＝5.0Hz,2H),3.24(q,J＝5.0Hz,2H),2.45(s,3H),1.45(s,9H).13C NMR(100MHz,Chloroform-d)δ＝156.24,144.98,133.09,129.91,128.01,79.36,70.40,69.18,68.41,40.29,28.46,21.68

其他中间体(2c-0、2c-2、2c-3、2c-4、2c-5)的制备参考2c-1：

2c-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以4a-0代替4a-1；

2c-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以4a-2代替4a-1；

2c-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以4a-3代替4a-1；

2c-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以4a-4代替4a-1；

2c-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以4a-5代替4a-1。

(3)式c0-1所示化合物的制备：

在25mg圆底烧瓶中加入100mg中间体1c，141mg中间体2c-1和30mg三乙胺，溶于无水乙腈溶剂中，加热至60℃搅拌8小时，TLC检测原料反应完全后，用饱和盐水浴洗涤两次，分离有机相，有机相减压浓缩，真空干燥，旋转干燥。硅胶柱分离纯化后86mg，经2N的氯化氢-乙酸乙酯溶液处理化合物c0-1，产率63％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₃₄H₄₅N₈O₂ ⁺＝597.4；found 597.5。

其他中间体(c0-0、c0-2、c0-3、c0-4、c0-5)的制备参考c0-1：

c0-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以2c-0代替4a-1；

c0-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以2c-2代替4a-1；

c0-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以2c-3代替4a-1；

c0-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以2c-4代替4a-1；

c0-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以2c-5代替4a-1。

当n不为0时(以cb1-1为例(R¹为苄基，n＝1，m₁＝1，m₂＝0))，具体制备过程如下：

(1)式c-1所示化合物的制备：中间体3cb的制备参照式3c的制备，原料为式1b所示化合物与哌嗪-1-羧酸叔丁酯(式1c所示)；

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₃₁H₃₆N₇O⁺＝522.3；found 522.3。

(2)式cb1-1所示化合物的制备：参照式c0-1的制备，原料为式3cb所示化合物与式2c-1所示化合物；

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₃₅H₄₅N₈O₂ ⁺＝609.4；found 609.4。

其他中间体(cb1-0、cb1-2、cb1-3、cb1-4、cb1-5)的制备参考cb1-1：

cb1-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以2c-0代替2c-1；

cb1-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以2c-2代替2c-1；

cb1-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以2c-3代替2c-1；

cb1-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以2c-4代替2c-1；

cb1-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以2c-5代替2c-1。

CDK12/13配体端衍生物(式d所示)合成的具体过程(以d0-1为例(R¹为苄基，n＝0，m₁＝1，m₂＝0))是：将哌嗪-1-羧酸叔丁酯(式1c所示)与5-溴-2-氟吡啶(式3a所示)发生亲和取代反应后得到4-(5-溴吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酸-2-甲基丙-2-基酯(式1d所示)；将4-(5-溴吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酸-2-甲基丙-2-基酯与中间体2a发生偶联反应，酸性环境下脱去保护基团，得到1-(苄基氨基)-N-{4-[(5-氰基吡啶-2-基)氨基]环己基}-N-{4-[6-(哌嗪-1-基)吡啶-3-基]苯基}甲烷酰胺(式2d所示)，将1-(苄基氨基)-N-{4-[(5-氰基吡啶-2-基)氨基]环己基}-N-{4-[6-(哌嗪-1-基)吡啶-3-基]苯基}甲烷酰胺与2-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)乙基4-甲基苯磺酸酯(式2c-1所示)发生亲核反应，得到式d0-1所示化合物。

当n为0时，具体制备过程(以d0-1为例(R¹为苄基，n＝0，m₁＝1，m₂＝0))如下：

(1)中间体1d的制备：

在50ml圆底烧瓶中加入200mg哌嗪-1-羧酸叔丁酯、227mg 2-氟-5-溴吡啶和416mgDIPEA，溶于无水二甲基亚砜溶液中，升温至120℃搅拌3小时，TLC检测原料反应完全后，用饱和盐水浴洗涤两次，分离有机相，有机相减压浓缩，真空干燥，旋转干燥。硅胶柱分离纯化后得347mg化合物1d，产率94％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₁₄H₂₁BrN₃O₂ ⁺＝342.1；found 342.1。

1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ＝8.21(d,J＝2.4Hz,1H),7.56(dd,J＝9.2,2.8Hz,1H),6.56(d,J＝4.0Hz,1H),3.51-3.56(m,8H),1.64(s,9H).

(2)中间体2d的制备：

在25ml圆底烧瓶中加入80mg中间体2a，60mg中间体1d和142mg碳酸铯，溶于甲苯：乙醇：水＝4：4：1的混合溶剂中，氮气置换三次后加入16mg Pd(PPh₃)₄，再次氮气置换三次，加热至100℃，搅拌3小时后，TLC检测原料反应完全，用20ml二氯甲烷萃取三次，有机相减压浓缩，旋转干燥。硅胶柱分离纯77mg，经2N的氯化氢-乙酸乙酯溶液处理，得化合物2d，产率78％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₃₅H₃₉N₈O⁺＝586.3；found 586.3。

(3)式d0-1所示化合物的制备：

在25mg圆底烧瓶中加入60mg中间体2d，44mg中间体2c-1和31mg三乙胺，溶于无水乙腈溶剂中，加热至60℃搅拌8小时，TLC检测原料反应完全后，用饱和盐水浴洗涤两次，分离有机相，有机相减压浓缩，真空干燥，旋转干燥。硅胶柱分离纯化后50mg，经2N的氯化氢-乙酸乙酯溶液处理化合物d0-1，产率63％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)+called for C₃₉H₄₈N₉O₂ ⁺＝674.4；found 674.5。

其他中间体(d0-0、d0-2、d0-3、d0-4、d0-5)的制备参考d0-1：

d0-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以2c-0代替2c-1；

d0-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以2c-2代替2c-1；

d0-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以2c-3代替2c-1；

d0-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以2c-4代替2c-1；

d0-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以2c-5代替2c-1。

当n不为0时(以db1-1为例(R¹为苄基，n＝1，m1＝1，m2＝0))，具体制备过程如下：

(1)式2db所示化合物的制备：中间体2db的制备参照式2d的制备，原料为式2b所示化合物与哌嗪-1-羧酸叔丁酯(式1c所示)；

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₃₆H₃₉N₈O⁺＝599.3；found 599.3。

(2)式db1-1所示化合物的制备：参照式d0-1的制备，原料为式2db所示化合物与

式2c-1所示化合物；

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₄₀H₄₈N₉O₂ ⁺＝686.4；found 686.5。

其他中间体(db1-0、db1-2、db1-3、db1-4、db1-5)的制备参考db1-1：

db1-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以2c-0代替2c-1；

db1-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以2c-2代替2c-1；

db1-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以2c-3代替2c-1；

db1-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以2c-4代替2c-1；

db1-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以2c-5代替2c-1。

CDK12/13配体端衍生物(式e所示)合成的具体过程(以e0-1为例(R¹为苄基，n＝0，m₁＝1，m₂＝0))是：将2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯与5-溴-2-氟吡啶发生亲和取代反应后得到({2-[(5-溴吡啶-2-基)氧基]乙基}氧基)乙酸-2-甲基丙-2-基酯(式1e-1所示)；再将({2-[(5-溴吡啶-2-基)氧基]乙基}氧基)乙酸-2-甲基丙-2-基酯与中间体2a发生偶联反应，最后酸性环境下脱去保护基团，得到化合物e0-1所示化合物。

当n为0时，具体制备过程(以e0-1为例(R¹为苄基，n＝0，m₁＝1，m₂＝0))如下：

(1)中间体1e的制备(以1e-1为例(m₁＝1，m₂＝0))：

在100ml圆底烧瓶中加入860mg中间体2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯，1.1g 2-氟-5-溴吡啶和4.8g碳酸铯，溶于无水二甲基亚砜中，将反应体系升至100℃，搅拌6小时，TLC检测原料反应完全后，反应液倒入100ml饱和食盐水中，用60ml乙酸乙酯萃取三次，有机相减压浓缩，旋转干燥。硅胶柱分离纯1.41g化合物1e-1，产率87％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₁₃H₁₉BrNO₄ ⁺＝332.1；found 332.1。

其他中间体(1e-0、1e-2、1e-3、1e-4、1e-5)的制备参考1e-1：

1e-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以2-乙醇酸叔丁酯代替2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯；

1e-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯代替2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯；

1e-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯代替2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯；

1e-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以14-羟基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-羧酸叔丁酯代替2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯；

1e-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以17-羟基-3,6,9,12,15-五氧杂-1-十七烷酸叔丁酯代替2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯1。

(2)式e0-1所示化合物的制备：

在25ml圆底烧瓶中加入80mg中间体2a，58mg中间体1e-1和142mg碳酸铯，溶于甲苯：乙醇：水＝4：4：1的混合溶剂中，氮气置换三次后加入16mg Pd(PPh₃)₄，再次氮气置换三次，加热至100℃，搅拌3小时后，TLC检测原料反应完全，用20ml二氯甲烷萃取三次，有机相减压浓缩，旋转干燥。硅胶柱分离纯61mg，经50％TFA的二氯甲烷溶液处理，得化合物e0-1，产率62％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₃₅H₃₇N₆O₅ ⁺＝621.3；found 621.4。

其他中间体(e0-0、e0-2、e0-3、e0-4、e0-5)的制备参考e0-1：

e0-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以1e-0代替1e-1；

e0-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以1e-2代替1e-1；

e0-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以1e-3代替1e-1；

e0-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以1e-4代替1e-1；

e0-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以1e-5代替1e-1。

当n不为0时(以eb-1为例(R¹为苄基，n＝1，m₁＝1，m₂＝0))，具体制备过程如下：

式eb1-1所示化合物的制备：参照式e0-1的制备，原料为式2b所示化合物与式1e-1所示化合物；

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₃₆H₃₇N₆O₅ ⁺＝632.3；found 632.3。

其他中间体(eb1-0、eb1-2、eb1-3、eb1-4、eb1-5)的制备参考eb1-1：

eb1-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以1e-0代替1e-1；

eb1-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以1e-2代替1e-1；

eb1-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以1e-3代替1e-1；

eb1-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以1e-4代替1e-1；

eb1-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以1e-5代替1e-1。

CDK12/13配体端衍生物(式g所示)合成的具体过程(以g0-1为例(R¹为苄基，n＝0，m₁＝1，m₂＝0))是：将2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯与4-甲苯磺酰氯发生取代反应得到2-(2-(对甲苯磺酰氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯(式1g-1所示)；再将2-(2-(对甲苯磺酰氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯与中间体3c发生亲核反应，并将其在酸性环境下脱去保护基团，得到化合物g0-1所示化合物。

当n为0时，具体制备过程(以g0-1为例(R¹为苄基，n＝0，m₁＝1，m₂＝0))如下：

(1)中间体1g的制备(以1g-1为例(m₁＝1，m₂＝0))：

在100ml圆底烧瓶中加入1.0g 2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯和861mg三乙胺，1.1g4-甲苯磺酰氯，溶于二氯甲烷中，在室温下搅拌3小时，TLC检测原料反应完全后，用饱和盐水浴洗涤两次，分离有机相，有机相减压浓缩，真空干燥，旋转干燥。硅胶柱分离纯化后1.8g化合物1g-1，产率96％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₁₅H₂₃O₆ ⁺＝331.1；found 331.2。

1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ＝7.77-7.83(m,2H),7.44(d,J＝7.83Hz,2H),4.14-4.19(m,2H),3.93(s,2H),3.68-3.74(m,2H),2.46(s,3H),1.46(s,9H)。

其他中间体(1g-0、1g-2、1g-3、1g-4、1g-5…)的制备参考1g-1：

1g-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以2-乙醇酸叔丁酯代替2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯；

1g-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯代替2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯；

1g-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯代替2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯；

1g-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以14-羟基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-羧酸叔丁酯代替2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯；

1g-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以17-羟基-3,6,9,12,15-五氧杂-1-十七烷酸叔丁酯代替2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯1…

(2)式g0-1所示化合物的制备：

在25mg圆底烧瓶中加入100mg中间体3c，78mg中间体1g-1和30mg三乙胺，溶于无水乙腈溶剂中，加热至60℃搅拌8小时，TLC检测原料反应完全后，用饱和盐水浴洗涤两次，分离有机相，有机相减压浓缩，真空干燥，旋转干燥。硅胶柱分离纯化后76mg，经50％TFA的二氯甲烷溶液处理，得化合物g0-1，产率57％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₃₄H₄₁N₇O₄ ⁺＝612.3；found 612.3。

其他中间体(g0-0、g0-2、g0-3、g0-4、g0-5)的制备参考g0-1：

g0-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以1g-0代替1g-1；

g0-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以1g-2代替1g-1；

g0-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以1g-3代替1g-1；

g0-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以1g-4代替1g-1；

g0-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以1g-5代替1g-1。

当n不为0时(以gb1-1为例(R¹为苄基，n＝1，m₁＝1，m₂＝0))，具体制备过程如下：

(1)式gb1-1所示化合物的制备：参照式g0-1的制备，原料为式3cb所示化合物与式1g-1所示化合物；

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₃₅H₄₂N₇O₄ ⁺＝624.3；found 624.3。

其他中间体(gb1-0、gb1-2、gb1-3、gb1-4、gb1-5)的制备参考gb1-1：

gb1-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以1g-0代替1g-1；

gb1-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以1g-2代替1g-1；

gb1-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以1g-3代替1g-1；

gb1-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以1g-4代替1g-1；

gb1-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以1g-5代替1g-1。

CDK12/13配体端衍生物(式h所示)合成的具体过程(以h0-1为例(R¹为苄基，n＝0，m＝1))是：4-(5-溴吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酸-2-甲基丙-2-基酯(式1d所示)与2-(2-(对甲苯磺酰氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯(式1g-1所示)发生取代反应得到({2-[4-(5-溴吡啶-2-基)哌嗪-1-基]乙基}氧基)乙酸-2-甲基丙-2-基酯(式1h-1所示)；再将({2-[4-(5-溴吡啶-2-基)哌嗪-1-基]乙基}氧基)乙酸-2-甲基丙-2-基酯与中间体2a发生偶联反应，最后将其在酸性环境下脱去保护基团，得到化合物h0-1所示化合物。

当n为0时，具体制备过程(以h0-1为例(R¹为苄基，n＝0，m₁＝1，m₂＝0))如下：

(1)中间体1h的制备(以1h-1为例(n＝0,m＝1))：

在50ml圆底烧瓶中加入200mg 1d经2N的氯化氢-乙酸乙酯溶液处理，真空干燥后，加入325mg 1g-1和125mg无水三乙胺，溶于无水乙腈溶液中，升温至60℃搅拌8小时，TLC检测原料反应完全后，用饱和盐水浴洗涤两次，分离有机相，有机相减压浓缩，真空干燥，旋转干燥。硅胶柱分离纯化后268mg化合物1h-1，产率81％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₁₇H₂₆BrN₃O₃ ⁺＝400.1；found 400.2。

其他中间体(1h-0、1h-2、1h-3、1h-4、1h-5)的制备参考1h-1：

1h-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以1g-0代替1g-1；

1h-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以1g-2代替1g-1；

1h-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以1g-3代替1g-1；

1h-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以1g-4代替1g-1；

1h-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以1g-5代替1g-1。

(2)式h0-1所示化合物的制备：

在25ml圆底烧瓶中加入80mg中间体2a，70mg中间体1h-1和142mg碳酸铯，溶于甲苯：乙醇：水＝4：4：1的混合溶剂中，氮气置换三次后加入16mg Pd(PPh₃)₄，再次氮气置换三次，加热至100℃，搅拌3小时后，TLC检测原料反应完全，用20ml二氯甲烷萃取三次，有机相减压浓缩，旋转干燥。硅胶柱分离纯72mg，经50％TFA的二氯甲烷溶液处理，得化合物h0-1，产率67％。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₃₉H₄₄N₈O₄ ⁺＝689.4；found 689.5。

其他中间体(h0-0、h0-2、h0-3、h0-4、h0-5)的制备参考h0-1：

h0-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以1h-0代替1h-1；

h0-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以1h-2代替1h-1；

h0-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以1h-3代替1h-1；

h0-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以1h-4代替1h-1；

h0-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以1h-5代替1h-1。

当n不为0时(以hb1-1为例(R¹为苄基，n＝1，m₁＝1，m₂＝0))，具体制备过程如下：

(1)式hb1-1所示化合物的制备：参照式h0-1的制备，原料为式2b-1所示化合物与式1h-1所示化合物；

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₄₀H₄₅N₈O₄ ⁺＝701.4；found 701.4。

其他中间体(hb1-0、hb1-2、hb1-3、hb1-4、hb1-5)的制备参考hb1-1：

hb1-0(m₁＝0，m₂＝0)：原料以1h-0代替1h-1；

hb1-2(m₁＝2，m₂＝0)：原料以1h-2代替1h-1；

hb1-3(m₁＝3，m₂＝0)：原料以1h-3代替1h-1；

hb1-4(m₁＝4，m₂＝0)：原料以1h-4代替1h-1；

hb1-5(m₁＝5，m₂＝0)：原料以1h-5代替1h-1。

实施例1：式1至式86所示化合物的制备

在10ml圆底烧瓶中加入40mg中间体e0-1，29mg中间体V、37mg HATU、25mg DIPEA，3ml DMF。室温搅拌20分钟，TLC检测原料反应完全，水洗、乙酸乙酯萃取。有机相减压浓缩，旋转干燥。用二氯甲烷：甲醇＝20：1(v/v)过硅胶柱得到式1所示化合物，产率为68％。

(2S,4R)-1-((S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(式V)的制备方法可以参考文献：Proc Natl AcadSci U S A.2016Jun 28；113(26):7124-9.

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₈H₆₇N₁₀O₇S⁺＝1047.5；found 1047.5。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.63(s,1H),8.34(d,J＝1.8Hz,1H),8.26(dd,J＝2.0Hz,1H),7.75(dd,J＝8.6,2.6Hz,1H),7.53(d,J＝8.4Hz,2H),7.50(d,J＝7.7Hz,2H),7.42(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.39–7.34(m,5H),7.29–7.17(m,6H),6.92(dd,J＝8.6,0.7Hz,1H),6.27(dd,J＝8.8,0.8Hz,1H),5.16–5.04(m,1H),4.66–4.50(m,5H),4.38(d,J＝5.8Hz,2H),4.10(d,J＝2.5Hz,2H),3.93(t,J＝4.2Hz,2H),2.49(m,4H),2.10(d,J＝13.9Hz,2H),2.00(d,J＝8.4Hz,2H),1.89(s,3H),1.48(d,J＝6.9Hz,3H),1.45-1.41(m,2H),1.34–1.29(m,2H),1.25-1.24(m,5H),1.07(s,9H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ170.5,169.1,168.5,162.7,159.3,156.5,153.1,151.5,147.8,144.7,141.3,138.4,137.6,137.4,136.4,131.8,131.1,129.7,128.9,128.7,128.0,127.2,126.8,126.4,126.3,126.3,119.2,111.1,109.0,94.0,69.5,68.8,64.8,59.8,58.6,56.6,55.7,53.3,48.6,47.8,43.5,37.8,35.9,31.3,30.3,26.3,22.5,16.0.

参照式1制备方法，使用中间体e0-2代替中间体e0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₀H₇₁N₁₀O₈S⁺＝1091.5；found 1091.6。

参照式1制备方法，使用中间体e0-3代替中间体e0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₂H₇₅N₁₀O₉S⁺＝1135.5；found 1135.6。

参照式1制备方法，使用中间体e0-4代替中间体e0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₄H₇₉N₁₀O₁₀S⁺＝1179.6；found 1179.6。

参照式1制备方法，使用中间体e0-5代替中间体e0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₆H₈₃N₁₀O₁₁S⁺＝1223.6；found 1223.6。

参照式1制备方法，使用中间体e0-0代替中间体e0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₆H₆₃N₁₀O₆S⁺＝1003.5；found 1003.5。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.65(s,1H),8.36(d,J＝2.5Hz,1H),8.26(d,J＝2.2Hz,1H),7.82(dd,J＝8.6,2.6Hz,1H),7.58–7.51(m,2H),7.45–7.33(m,6H),7.31–7.16(m,6H),7.09(dd,J＝8.8,7.0Hz,1H),6.94(d,J＝8.6Hz,1H),6.27(d,J＝8.8Hz,1H),5.14–5.05(m,2H),4.99(d,J＝15.6Hz,1H),4.82–4.64(m,3H),4.54(s,1H),4.39(m,2H),4.09(m,J＝16.7,9.3Hz,1H),3.65(dd,J＝11.3,3.8Hz,1H),3.51(m,J＝24.5Hz,1H),2.50(s,3H),2.10(d,J＝12.2Hz,2H),2.00(d,J＝8.9Hz,2H),1.86(m,J＝14.3,7.2Hz,4H),1.48(d,J＝6.9Hz,3H),1.39(m,J＝21.1Hz,4H),1.01(s,9H).

参照式1制备方法，使用中间体g0-1代替中间体e0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₇H₇₂N₁₁O₆S⁺＝1038.5；found 1038.6。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.67(s,1H),8.26(d,J＝2.3Hz,1H),7.50(d,J＝5.7,3.3Hz,1H),7.46(dd,J＝8.8,2.3Hz,1H),7.35(m,J＝7.6,6.8,4.2Hz,6H),7.22–7.16(m,3H),7.03–7.00(m,2H),6.88(d,J＝8.7Hz,2H),6.27(d,J＝8.8Hz,1H),5.21(d,J＝8.1Hz,1H),5.08(t,J＝7.0Hz,1H),4.73(t,J＝7.8Hz,1H),4.57(d,J＝8.6Hz,1H),4.56–4.44(m,3H),4.36(d,J＝5.9Hz,2H),4.11–4.00(m,3H),3.68–3.59(m,4H),3.46(s,1H),3.25–3.21(m,4H),2.68(m,J＝6.7Hz,4H),2.51(s,3H),2.50–2.44(m,1H),2.09(d,J＝11.7Hz,2H),1.95(d,J＝12.0Hz,2H),1.47(d,J＝7.0Hz,3H),1.43–1.34(m,4H),1.07(s,9H).

参照式1制备方法，使用中间体g0-2代替中间体e0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₉H₇₆N₁₁O₇S⁺＝1082.6；found 1082.6。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.66(s,1H),8.26(d,J＝2.2Hz,1H),7.45(d,J＝7.9Hz,1H),7.37(q,J＝8.1Hz,6H),7.25–7.14(m,4H),7.00(d,J＝8.6Hz,2H),6.86(d,J＝8.6Hz,2H),6.25(d,J＝8.9Hz,1H),5.18(d,J＝8.1Hz,1H),5.07(t,J＝7.0Hz,1H),4.73(t,J＝7.8Hz,1H),4.57(d,J＝8.6Hz,1H),4.54–4.42(m,3H),4.34(d,J＝5.9Hz,2H),4.11–4.00(m,3H),3.73–3.57(m,8H),3.47(s,1H),3.25–3.21(m,4H),2.68(m,J＝6.7Hz,4H),2.51(s,3H),2.50–2.44(m,1H),2.09–1.97(m,4H),1.96–1.89(d,2H),1.47(d,J＝7.0Hz,3H),1.43–1.34(m,4H),1.09(s,9H).

参照式1制备方法，使用中间体g0-3代替中间体e0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₁H₈₀N₁₁O₈S⁺＝1126.6；found 1126.6。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.67(s,1H),8.27(d,J＝2.3Hz,1H),7.53(dd,J＝5.7,3.3Hz,1H),7.46(dd,J＝8.8,2.3Hz,1H),7.37(qd,J＝7.6,6.8,4.2Hz,6H),7.22–7.16(m,3H),7.03–7.00(m,2H),6.88(d,J＝8.7Hz,2H),6.27(d,J＝8.8Hz,1H),5.34(t,J＝3.4Hz,1H),5.07(m,J＝17.4,15.9,8.8Hz,2H),4.76(t,J＝8.0Hz,1H),4.57(d,J＝8.6Hz,1H),4.52–4.42(m,2H),4.34(d,J＝5.9Hz,2H),4.21(t,J＝6.0Hz,1H),4.11–4.02(m,3H),3.72–3.64(m,8H),3.28(m,2H),2.80(m,4H),2.52(s,3H),2.46(m,1H),2.30(t,J＝7.4Hz,2H),2.21(t,J＝7.7Hz,2H),2.08(d,J＝11.7Hz,2H),1.93(d,J＝12.0Hz,2H),1.66(m,J＝21.9,14.5,7.6,7.0Hz,4H),1.48(d,J＝6.9Hz,3H),1.44–1.37(m,4H),1.04(s,9H).

参照式1制备方法，使用中间体g0-0代替中间体e0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₅H₆₈N₁₁O₅S⁺＝994.5；found 994.5。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.67(s,1H),8.32(d,J＝2.2Hz,1H),7.50(dd,J＝5.7,3.2Hz,1H),7.45(dd,J＝8.6,2.5Hz,1H),7.39(m,6H),7.20–7.14(m,3H),7.03–7.00(m,2H),6.92(d,J＝8.7Hz,2H),6.44(d,J＝8.0Hz,1H),6.27(d,J＝8.6Hz,1H),5.23(d,J＝7.8Hz,1H),5.11–5.05(m,1H),4.76(t,J＝7.9Hz,1H),4.69–4.56(m,1H),4.54(d,J＝8.5Hz,2H),4.48–4.42(m,1H),4.40(d,J＝5.7Hz,2H),4.20–4.08(m,2H),3.76–3.50(m,7H),3.08(d,J＝3.3Hz,2H),2.68(t,J＝5.6Hz,4H),2.52(s,3H),2.12(d,J＝9.0Hz,2H),1.99(d,J＝10.8Hz,2H),1.50(d,J＝7.1Hz,3H),1.38–1.30(m,4H),1.08(s,9H).

参照式1制备方法，使用中间体e0-a代替中间体e0-1。其中，中间体e0-a的制备方法参考式e0-1，用中间体1e-a代替中间体1e-1；中间体1e-a的制备方法参考式1e-1，用2-(4-羟基哌啶-1-基)乙酸叔丁酯代替。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₁H₇₂N₁₁O₆S⁺＝1086.5；found 1086.6。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.64(s,1H),8.32(d,J＝2.5Hz,1H),8.25(d,J＝2.2Hz,1H),7.76(dd,J＝8.6,2.6Hz,1H),7.54(d,J＝8.3Hz,2H),7.50(d,J＝8.2Hz,1H),7.41(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.39–7.33(m,4H),7.30–7.15(m,7H),6.80(d,J＝8.6Hz,1H),6.26(d,J＝8.8Hz,1H),5.19(s,1H),5.14(d,J＝8.1Hz,1H),5.06(p,J＝7.0Hz,1H),4.75(t,J＝8.0Hz,1H),4.61(tt,J＝11.6,3.6Hz,1H),4.48(d,J＝7.8Hz,2H),4.41–4.35(m,3H),4.12(d,J＝11.5Hz,1H),3.59(dd,J＝11.4,3.5Hz,1H),3.55(s,1H),3.23(s,1H),2.96(d,J＝16.4Hz,2H),2.63(m,J＝21.9Hz,2H),2.50(s,3H),2.46(m,J＝6.9Hz,1H),2.14(m,2H),2.09(d,J＝14.3Hz,2H),1.99(d,J＝11.6Hz,2H),1.47(d,J＝6.9Hz,3H),1.41(m,5H),1.37–1.27(m,4H),1.06(s,9H).

参照式1制备方法，使用中间体e0-b代替中间体e0-1。其中，中间体e0-b的制备方法参考式e0-1，用中间体1e-b代替中间体1e-1；中间体1e-b的制备方法参考式1e-1，用2-(4-(羟基甲基)哌啶-1-基)乙酸叔丁酯代替2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₂H₇₄N₁₁O₆S⁺＝1100.6；found 1100.6。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.65(s,1H),8.36(dd,J＝2.5,0.8Hz,1H),8.27(dd,J＝2.3,0.7Hz,1H),7.78(dd,J＝8.6,2.6Hz,1H),7.55(d,J＝8.5Hz,2H),7.46(dd,J＝8.9,2.2Hz,2H),7.42–7.34(m,5H),7.33–7.26(m,2H),7.24–7.16(m,4H),6.83(dd,J＝8.6,0.7Hz,1H),6.28(dd,J＝8.9,0.8Hz,1H),5.07(p,J＝7.0Hz,1H),4.93(d,J＝7.9Hz,1H),4.77(t,J＝8.0Hz,1H),4.67–4.57(m,1H),4.51(s,1H),4.45(d,J＝8.3Hz,1H),4.38(s,3H),4.22(d,J＝6.4Hz,3H),4.16–4.07(m,2H),3.59(dd,J＝11.4,3.5Hz,1H),3.09(d,J＝11.4Hz,1H),2.97(d,J＝10.8Hz,3H),2.52(s,4H),2.33(dd,J＝18.0,7.5Hz,2H),2.11(d,J＝11.5Hz,3H),2.00(d,J＝11.0Hz,1H),1.91(d,J＝8.9Hz,2H),1.74(m,7H),1.47(d,J＝7.0Hz,3H),1.43–1.36(m,4H),1.07(s,9H).

参照式1制备方法，使用中间体e0-c代替中间体e0-1。其中，中间体e0-c的制备方法参考式e0-1，用中间体1e-c代替中间体1e-1；中间体1e-c的制备方法参考式1e-1，用6-羟基-3-炔己酸叔丁酯代替2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₁H₆₈N₉O₆S⁺＝1054.5；found 1054.5。

参照式1制备方法，使用中间体e0-d代替中间体e0-1。其中，中间体e0-d的制备方法参考式e0-1，用中间体1e-d代替中间体1e-1；中间体1e-d的制备方法参考式1e-1，用(3-羟基氮杂环丁-1-基)乙酸叔丁酯代替2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₉H₆₈N₁₁O₆S⁺＝1058.5；found 1058.5。

参照式1制备方法，使用中间体e0-e代替中间体e0-1。其中，中间体e0-e的制备方法参考式e0-1，用中间体1e-e代替中间体1e-1；中间体1e-e的制备方法为中间体1a与丁-3-炔酸叔丁酯发生薗头偶联反应，具体条件可参考文献：Chemistry Letters,2005,vol.34,issue 9,1294–1295。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₈H₆₃N₁₀O₅S⁺＝1011.5；found 1011.6。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.74–8.69(d,1H),8.65(s,1H),8.25(d,J＝2.2Hz,1H),7.80(dd,J＝8.1,2.4Hz,1H),7.62–7.56(d,2H),7.46(d,J＝8.1Hz,1H),7.44–7.39(m,2H),7.37(m,J＝5.8Hz,4H),7.30–7.16(m,6H),6.59(d,J＝8.8Hz,1H),6.27(d,J＝8.8Hz,1H),5.14–5.03(m,2H),4.73(t,J＝8.0Hz,1H),4.68(d,J＝8.9Hz,1H),4.61(m,1H),4.53(s,1H),4.37(s,3H),3.62(dd,J＝11.3,3.6Hz,1H),3.53(m,1H),2.88–2.69(m,2H),2.62–2.51(m,3H),2.50(s,3H)2.11(d,J＝6.1Hz,2H),2.04(m,5H),1.99(d,J＝13.2Hz,2H),1.47(d,J＝6.9Hz,3H),1.36(m,J＝39.3,2.9Hz,5H),1.05(s,9H).

参照式1制备方法，使用中间体e0-f代替中间体e0-1。其中，中间体e0-f的制备方法参考式e0-1，用中间体1e-f代替中间体1e-1；中间体1e-f的制备方法参考式1e-1，用5-羟基戊-3-异氰酸叔丁酯代替2-(2-羟基乙氧基)乙酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₉H₆₅N₁₀O₆S⁺＝1041.5；found 1041.6。

参照式1制备方法，使用中间体h0-a代替中间体e0-1。其中，中间体h0-a的制备方法参考式h0-1，用中间体1h-a代替中间体1h-1；中间体1h-a的制备方法参考式1d，用哌啶-4-羧酸叔丁酯代替哌嗪-1-羧酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₀H₇₀N₁₁O₅S⁺＝1056.5；found 1056.6。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.66(s,1H),8.40(d,J＝2.6Hz,1H),8.24(d,J＝2.3Hz,1H),7.68(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),7.53(d,J＝8.4Hz,2H),7.42–7.34(m,5H),7.27(d,J＝5.5Hz,3H),7.24–7.16(m,4H),6.73(d,J＝9.0Hz,1H),6.35(d,J＝8.7Hz,1H),6.26(d,J＝8.8Hz,1H),5.38(d,J＝8.0Hz,1H),5.14–5.02(m,1H),4.71(t,J＝7.8Hz,1H),4.59(m,J＝8.7Hz,2H),4.53–4.49(m,1H),4.46(t,J＝5.9Hz,1H),4.37(m,J＝6.0Hz,4H),4.04(d,J＝11.3Hz,1H),3.66–3.58(dd,1H),3.54(s,1H),2.99–2.86(m,2H),2.51(s,3H),2.49–2.36(m,2H),2.06(m,J＝15.1,9.3Hz,3H),2.02–1.87(m,4H),1.79(m,J＝4.0Hz,2H),1.49(d,3H),1.41(m,J＝3.1Hz,2H),1.39–1.32(m,2H),1.25(m,2H),1.05(s,9H).

参照式1制备方法，使用中间体h0-0代替中间体e0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₀H₇₁N₁₂O₅S⁺＝1071.5；found 1071.6。

1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.64(s,1H),8.43(d,J＝2.5Hz,1H),8.25(dd,J＝2.3,0.7Hz,1H),7.93(d,J＝8.5Hz,1H),7.71(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),7.54(d,J＝8.4Hz,2H),7.49(d,J＝7.7Hz,1H),7.44–7.34(m,4H),7.31–7.14(m,7H),6.75(d,J＝8.8Hz,1H),6.27(dd,J＝8.9,0.8Hz,1H),5.23(d,J＝8.0Hz,1H),5.13–5.02(m,1H),4.76(t,J＝7.9Hz,1H),4.67–4.56(m,1H),4.51(d,J＝8.6Hz,2H),4.48–4.42(m,1H),4.38(d,J＝5.8Hz,2H),4.18–4.06(m,2H),3.73–3.59(m,7H),3.11(d,J＝3.5Hz,2H),2.70(t,J＝5.4Hz,4H),2.50(s,3H),2.10(d,J＝8.7Hz,2H),1.99(d,J＝11.2Hz,2H),1.47(d,J＝6.9Hz,3H),1.42–1.29(m,4H),1.08(s,9H).

参照式1制备方法，使用中间体h0-b代替中间体e0-1。其中，中间体h0-b的制备方法参考式h0-1，用中间体1h-b代替中间体1h-1；中间体1h-b的制备方法参考式1d，用4-(六氢吡啶-4-基)丁-3-炔酸-2-甲基丙-2-基酯代替哌嗪-1-羧酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₃H₇₂N₁₁O₅S⁺＝1094.5；found 1094.6。

参照式1制备方法，使用中间体g0-a代替中间体e0-1。其中，中间体g0-a的制备方法参考式1c，用4-(六氢吡啶-4-基)丁-3-炔酸-2-甲基丙-2-基酯代替哌嗪-1-羧酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₈H₆₉N₁₀O₅S⁺＝1017.5；found 1017.5。

参照式1制备方法，使用中间体h0-c代替中间体e0-1。其中，中间体h0-c的制备方法参考式h0-1，用中间体1h-c代替中间体1h-1；中间体1h-c的制备方法参考式1d，用1-(哌啶-4-羰基)哌啶-4-羧酸叔丁酯代替哌嗪-1-羧酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₆H₇₉N₁₂O₆S⁺＝1167.6；found 1167.7。

参照式1制备方法，使用中间体g0-b代替中间体e0-1。其中，中间体g0-b的制备方法参考式1c，用1-(哌啶-4-羰基)哌啶-4-羧酸叔丁酯代替哌嗪-1-羧酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₁H₇₆N₁₁O₆S⁺＝1090.6；found 1090.7。

参照式1制备方法，使用中间体h0-d代替中间体e0-1。其中，中间体h0-d的制备方法参考式h0-1，用中间体1h-d代替中间体1h-1；中间体1h-d的制备方法参考式1d，用4-(氮杂环丁-3-基)丁-3-炔酸叔丁酯代替哌嗪-1-羧酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₁H₆₈N₁₁O₅S⁺＝1066.5；found 1066.5。

参照式1制备方法，使用中间体g0-c代替中间体e0-1。其中，中间体g0-c的制备方法参考式1c，用4-(氮杂环丁-3-基)丁-3-炔酸叔丁酯代替哌嗪-1-羧酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₆H₆₅N₁₀O₅S⁺＝989.5；found 989.5。

参照式1制备方法，使用中间体g0-d代替中间体e0-1。其中，中间体g0-d的制备方法为：中间体1a与叔丁基2-(4-乙炔基-1-哌啶)乙酸叔丁酯发生薗头偶联反应得到，具体条件可参考文献：Chemistry Letters,2005,vol.34,issue 9,1294–1295。

参照式1制备方法，使用中间体g0-e代替中间体e0-1。其中，中间体g0-e的制备方法为：中间体1a与叔丁基2-(4-乙炔基-1-哌啶)乙酸叔丁酯发生薗头偶联反应得到，具体条件可参考文献：Chemistry Letters,2005,vol.34,issue 9,1294–1295。

参照式1制备方法，使用中间体g0-f代替中间体e0-1。其中，中间体g0-f的制备方法参考式1c，用2-氨基螺[3.3]庚烷-6-甲酸叔丁酯代替哌嗪-1-羧酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₇H₆₉N₁₀O₅S⁺＝1005.5；found 1005.6。

参照式1制备方法，使用中间体h0-e代替中间体e0-1。其中，中间体h0-e的制备方法参考式h0-1，用中间体1h-e代替中间体1h-1；中间体1h-e的制备方法参考式1d，用2-氨基螺[3.3]庚烷-6-甲酸叔丁酯代替哌嗪-1-羧酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₂H₇₂N₁₁O₅S⁺＝1082.5；found 1082.6。

参照式1制备方法，使用中间体h0-f代替中间体e0-1。其中，中间体h0-f的制备方法参考式h0-1，用中间体1h-f代替中间体1h-1；中间体1h-f的制备方法参考式1d，用2-(氮杂环丁烷-3-基)乙酸叔丁酯代替哌嗪-1-羧酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₉H₆₈N₁₁O₅S⁺＝1042.5；found 1042.5。

参照式1制备方法，使用中间体h0-g代替中间体e0-1。其中，中间体h0-g的制备方法参考式h0-1，用中间体1h-g代替中间体1h-1；中间体1h-g的制备方法参考式1d，用吡咯烷-3-乙酸叔丁酯代替哌嗪-1-羧酸叔丁酯。

参照式1制备方法，使用中间体h0-h代替中间体e0-1。其中，中间体h0-h的制备方法参考式h0-1，用中间体1h-h代替中间体1h-1；中间体1h-h的制备方法参考式1h-1，原料为4-(4-溴-1H-吡唑-1-基)哌啶与溴乙酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₉H₇₁N₁₂O₅S⁺＝1059.5；found 1059.6。

在10ml圆底烧瓶中加入70mg中间体a0-1和35mg中间体P并溶于4ml无水DMSO中。室温搅拌下向体系中缓慢滴加DIPEA95mg，后升温至100℃，反应8h。TLC监测反应完全后，水洗、乙酸乙酯萃取。有机相减压浓缩，旋转干燥。用二氯甲烷：甲醇＝20：1(v/v)过硅胶柱得到式32所示化合物，产率为36％。

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(式P)的制备可以参考文献：Organic Letters 22,10,3838-3841(2019)。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₄₈H₄₈N₉O₇S⁺＝862.36；found 862.4。

参照式32制备方法，使用中间体a0-2代替中间体a0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₀H₅₂N₉O₈ ⁺＝906.39；found 906.4。

参照式32制备方法，使用中间体a0-3代替中间体a0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₂H₅₆N₉O₉ ⁺＝950.4；found 950.5。

参照式32制备方法，使用中间体a0-4代替中间体a0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₄H₆₀N₉O₁₀ ⁺＝994.4；found 994.5。

参照式32制备方法，使用中间体a0-5代替中间体a0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₆H₆₄N₉O₁₁ ⁺＝1038.5；found 1038.6。

参照式32制备方法，使用中间体a0-0代替中间体a0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₄₆H₄₄N₉O₆ ⁺＝818.3；found 818.4。

参照式32制备方法，使用中间体c0-1代替中间体a0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₄₇H₅₃N₁₀O₆ ⁺＝853.4；found 853.4。

参照式32制备方法，使用中间体c0-2代替中间体a0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₄₉H₅₇N₁₀O₇ ⁺＝897.4；found 897.5。

参照式32制备方法，使用中间体c0-3代替中间体a0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₁H₆₁N₁₀O₈ ⁺＝941.5；found 941.6。

参照式32制备方法，使用中间体c0-4代替中间体a0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₃H₆₅N₁₀O₉ ⁺＝985.5；found 985.6。

参照式32制备方法，使用中间体c0-0代替中间体a0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₄₅H₄₉N₁₀O₅ ⁺＝809.4；found 809.4。

参照式32制备方法，使用中间体a0-3-Et代替中间体a0-1。其中，中间体a0-3-Et的制备方法参照式a0-3，使用中间体5aa-Et代替中间体5aa，其中，中间体5aa-Et的制备方法参照式5aa，使用异氰酸乙酯代替中间体4aa。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₄₇H₅₄N₉O₉ ⁺＝888.4；found 888.4。

参照式32制备方法，使用中间体h0-0-Et代替中间体e0-1。其中，中间体h0-0-Et的制备方法参照式h0-0，使用中间体5aa-Et代替中间体5aa，其中，中间体5aa-Et的制备方法参照式5aa，使用异氰酸乙酯代替中间体4aa。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₅H₆₉N₁₂O₅S⁺＝1009.5；found 1009.5。

参照式32制备方法，使用中间体h0-0-N代替中间体e0-1。其中，中间体h0-0-N的制备方法参照式h0-0，使用中间体1d-N代替中间体1d，其中，中间体1d-N的制备方法参照式1d，使用5-溴-2-氟嘧啶代替2-氟-5-溴吡啶。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₉H₇₀N₁₃O₅S⁺＝1072.5；found 1072.6。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.66(s,1H),8.55(s,2H),8.27(d,J＝2.2Hz,1H),7.92(d,J＝8.4Hz,1H),7.54–7.35(m,8H),7.32–7.17(m,6H),6.27(d,J＝8.7Hz,1H),5.06(dt,J＝14.4,7.5Hz,2H),4.77(t,J＝7.8Hz,1H),4.62(s,1H),4.53(s,1H),4.49(d,J＝8.4Hz,1H),4.38(s,3H),4.17(d,J＝11.5Hz,1H),3.94(s,4H),3.61(dd,J＝11.4,3.7Hz,1H),3.11(d,J＝2.7Hz,2H),2.66(t,J＝5.1Hz,4H),2.58(ddd,J＝13.5,7.5,4.7Hz,1H),2.52(s,3H),2.10(d,J＝12.3Hz,2H),2.00(d,J＝11.7Hz,2H),1.78(s,2H),1.48(d,J＝6.9Hz,3H),1.45–1.41(m,2H),1.38–1.27(m,4H),1.09(s,9H).

参照式32制备方法，使用中间体a0-1-N代替中间体a0-1。其中，中间体a0-1-N的制备方法参照式a0-1，使用中间体5a-1-N代替中间体5a-1，其中，中间体5a-1-N的制备方法为2c-1和5-溴-2-羟基吡啶发生亲核反应得到。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)+called for C₄₈H₄₈N₉O₇ ⁺＝862.4；found 862.4。

参照式32制备方法，使用中间体a0-2-N代替中间体a0-1。其中，中间体a0-2-N的制备方法参照式a0-1，使用中间体5a-2-N代替中间体5a-1，其中，中间体5a-2-N的制备方法为2c-2和5-溴-2-羟基吡啶发生亲核反应得到。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₀H₅₂N₉O₈ ⁺＝906.3；found 906.4。

参照式32制备方法，使用中间体a0-3-N代替中间体a0-1。其中，中间体a0-3-N的制备方法参照式a0-1，使用中间体5a-3-N代替中间体5a-1，其中，中间体5a-3-N的制备方法为2c-3和5-溴-2-羟基吡啶发生亲核反应得到。

参照式32制备方法，使用中间体a0-4-N代替中间体a0-1。其中，中间体a0-4-N的制备方法参照式a0-1，使用中间体5a-4-N代替中间体5a-1，其中，中间体5a-4-N的制备方法为2c-4和5-溴-2-羟基吡啶发生亲核反应得到。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₆H₆₄N₉O₁₁ ⁺＝1038.4；found 1038.5。

在10ml圆底烧瓶中加入18mg中间体V，6mg CDI并溶于2ml无水二氯甲烷中。室温搅拌下搅拌1小时，后加入18mg中间体g0-h，反应18h。TLC监测反应完全后，水洗、乙酸乙酯萃取。有机相减压浓缩，旋转干燥。用二氯甲烷：甲醇＝20：1(v/v)过硅胶柱得到式51所示化合物，产率为47％。

其中，中间体g0-h的制备方法参考式1c，用,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯代替哌嗪-1-羧酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₉H₇₄N₁₁O₅S⁺＝1048.5；found 1048.6。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.67(s,1H),7.63(d,J＝7.9Hz,1H),7.46(dd,J＝8.8,2.3Hz,1H),7.43–7.36(m,4H),7.29–7.15(m,4H),7.04–6.98(m,2H),6.92–6.86(m,2H),6.26(dd,J＝8.8,0.8Hz,1H),5.08(p,J＝7.1Hz,1H),4.99(d,J＝8.9Hz,1H),4.92(d,J＝8.0Hz,1H),4.80(t,J＝8.2Hz,1H),4.60–4.50(m,1H),4.46(s,1H),4.42–4.30(m,5H),3.68(s,1H),3.54–3.47(m,2H),3.43–3.30(m,4H),3.20(t,J＝5.7Hz,4H),2.59(ddd,J＝13.1,8.0,4.3Hz,1H),2.53(s,3H),2.09(m,J＝13.8,9.0Hz,3H),1.94(d,J＝12.0Hz,2H),1.53(t,J＝5.8Hz,4H),1.46(d,J＝7.0Hz,2H),1.41–1.28(m,4H),1.07(s,9H).

参照式51制备方法，使用中间体h0-i代替中间体g0-h。其中，中间体h0-i的制备方法参考式h0-1，用中间体1h-i代替中间体1h-1；中间体1h-g的制备方法参考式1d，用3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯代替哌嗪-1-羧酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₄H₇₇N₁₂O₅S⁺＝1125.6；found 1125.6。

参照式51制备方法，使用中间体g0-j代替中间体g0-h。其中，中间体g0-j的制备方法参考式1c，用叔丁基哌嗪-1-甲酸酯代替哌嗪-1-羧酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₄H₆₆N₁₁O₅ ⁺＝980.5；found 980.5。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.66(s,1H),8.43(d,J＝2.5Hz,1H),8.26(dd,J＝2.3,0.7Hz,1H),7.72(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),7.60(d,J＝7.9Hz,1H),7.57–7.52(m,2H),7.43–7.36(m,5H),7.31–7.26(m,2H),7.24–7.17(m,5H),6.70(d,J＝8.8Hz,1H),6.26(dd,J＝8.9,0.8Hz,1H),5.10(dt,J＝14.5,7.3Hz,2H),4.78(t,J＝8.1Hz,1H),4.62(td,J＝11.8,6.0Hz,1H),4.49(s,1H),4.45–4.35(m,4H),4.25(d,J＝11.6Hz,1H),3.71–3.61(m,4H),3.60–3.50(m,4H),2.57(m,J＝8.3,4.9Hz,1H),2.52(s,3H),2.15–2.07(d,2H),2.03–1.96(d,2H),1.89(m,2H),1.47(d,J＝6.9Hz,3H),1.43–1.22(m,6H),1.08(s,9H).

参照式51制备方法，使用中间体g0-k代替中间体g0-h。其中，中间体g0-k的制备方法参考式1c，用2,7-二氮杂螺[3.5]壬烷-7-甲酸叔丁酯代替哌嗪-1-羧酸叔丁酯。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₇H₇₀N₁₁O₅S⁺＝1020.5；found 1020.6。

参照式51制备方法，使用中间体g0-l代替中间体g0-h。其中，中间体g0-l的制备方法参考式1c，用2-叔丁氧羰基-2,7-二氮杂螺[3.5]壬烷代替哌嗪-1-羧酸叔丁酯。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.67(s,1H),8.27(d,J＝2.2Hz,1H),7.56(d,J＝7.9Hz,1H),7.45(dd,J＝8.9,2.3Hz,2H),7.38(dd,J＝8.7,6.3Hz,4H),7.27(s,1H),7.01(d,J＝8.5Hz,2H),6.89(d,J＝8.8Hz,2H),6.26(d,J＝8.8Hz,1H),5.08(p,J＝7.1Hz,1H),4.97(d,J＝7.9Hz,1H),4.77(t,J＝8.0Hz,1H),4.70(d,J＝9.3Hz,1H),4.58–4.50(m,1H),4.48(d,J＝4.8Hz,1H),4.37(dt,J＝14.1,4.0Hz,4H),4.23(d,J＝11.6Hz,1H),3.74–3.64(m,5H),3.57–3.46(m,2H),3.16(t,J＝5.4Hz,4H),2.53(s,3H),2.12–1.83(m,10H),1.47(d,J＝6.9Hz,3H),1.27(d,J＝12.3Hz,12H),1.05(s,9H).

参照式1制备方法，使用中间体e0-1-N代替中间体a0-1。其中，中间体e0-1-N的制备方法参照式e0-1，使用中间体1e-1-N代替中间体1e-1，其中，中间体1e-1-N的制备方法为1g-1和5-溴-2-羟基吡啶发生亲核反应得到。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.98(s,1H),8.43(d,J＝7.8Hz,1H),8.28(d,J＝2.4Hz,1H),8.18(d,J＝2.9Hz,1H),7.89(dd,J＝9.5,2.6Hz,1H),7.69(d,J＝8.5Hz,2H),7.59(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),7.53–7.46(m,1H),7.45–7.40(m,2H),7.38–7.31(m,3H),7.29–7.21(m,4H),7.20–7.16(m,3H),6.52(d,J＝9.5Hz,1H),6.46(d,J＝8.9Hz,1H),5.84(t,J＝6.2Hz,1H),5.14(d,J＝3.5Hz,1H),4.95–4.84(m,1H),4.49(d,J＝9.5Hz,1H),4.43(t,J＝8.2Hz,1H),4.36–4.19(m,4H),4.17(d,J＝5.9Hz,2H),4.05–3.94(m,2H),3.88–3.76(m,2H),3.56(s,2H),2.45(s,3H),2.10–2.00(m,1H),1.95–1.73(m,5H),1.35(d,J＝7.0Hz,3H),1.32–1.10(m,5H),0.84(s,9H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ170.5,169.0,168.1,160.8,159.3,156.5,153.1,151.5,147.8,144.7,141.3,139.0,138.4,137.3,136.7,135.5,131.6,131.1,129.7,128.9,128.1,126.8,126.3,126.3,126.2,119.7,119.1,117.0,108.9,94.0,69.4,68.8,68.3,58.6,56.5,55.8,53.3,48.6,48.5,47.8,43.5,37.7,35.6,31.3,30.3,26.2,22.5,16.0.

参照式1制备方法，使用中间体e0-2-N代替中间体a0-1。其中，中间体e0-2-N的制备方法参照式e0-1，使用中间体1e-2-N代替中间体1e-2，其中，中间体1e-2-N的制备方法参照式1e-1-N，使用中间体1g-2代替中间体1g-1。

参照式1制备方法，使用中间体e0-3-N代替中间体a0-1。其中，中间体e0-3-N的制备方法参照式e0-1，使用中间体1e-3-N代替中间体1e-1，其中，中间体1e-3-N的制备方法参照式1e-1-N，使用中间体1g-3代替中间体1g-1。

参照式1制备方法，使用中间体e0-4-N代替中间体a0-1。其中，中间体e0-4-N的制备方法参照式e0-1，使用中间体1e-4-N代替中间体1e-1，其中，中间体1e-4-N的制备方法参照式1e-1-N，使用中间体1g-4代替中间体1g-1。

参照式1制备方法，使用中间体e0-5-N代替中间体a0-1。其中，中间体e0-5-N的制备方法参照式e0-1，使用中间体1e-5-N代替中间体1e-1，其中，中间体1e-5-N的制备方法参照式1e-1-N，使用中间体1g-5代替中间体1g-1。

参照式1制备方法，使用中间体e0-0-N代替中间体a0-1。其中，中间体e0-0-N的制备方法参照式e0-1，使用中间体1e-0-N代替中间体1e-1，其中，中间体1e-0-N的制备方法参照式1e-1-N，使用中间体1g-0代替中间体1g-1。

参照式1制备方法，使用中间体eb1-1代替中间体a0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₉H₆₇N₁₀O₇S⁺＝1059.5；found 1059.6。

参照式1制备方法，使用中间体eb2-1代替中间体e0-1，其中，式eb2-1的制备方法参考式eb1-1，使用中间体6bb-2代替中间体6bb，其中，式6bb-2的制备参考式6bb，使用2-(5-溴-2-硝基苯基)乙腈代替2-硝基-5-溴苯腈(式1bb)。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₀H₆₉N₁₀O₇S⁺＝1073.5；found 1073.6。

参照式1制备方法，使用中间体eb3-1代替中间体e0-1，其中，式eb3-1的制备方法参考式eb1-1，使用中间体6bb-3代替中间体6bb，其中，式6bb-3的制备参考式6bb，使用2-(5-溴-2-硝基苯基)丙腈代替2-硝基-5-溴苯腈(式1bb)。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₁H₇₁N₁₀O₇S⁺＝1087.5；found 1087.6。

参照式32制备方法，使用中间体ab1-2代替中间体a0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₁H₅₂N₉O₈ ⁺＝918.4；found 918.4。

参照式32制备方法，使用中间体ab2-2代替中间体a0-1，其中，式ab2-2的制备方法参考式ab1-2，使用中间体6bb-2代替中间体6bb，其中，式6bb-2的制备参考式6bb，使用2-(5-溴-2-硝基苯基)乙腈代替2-硝基-5-溴苯腈(式1bb)。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₂H₅₄N₉O₈ ⁺＝932.4；found 932.4。

参照式32制备方法，使用中间体ab3-2代替中间体a0-1，其中，式ab3-2的制备方法参考式ab1-2，使用中间体6bb-3代替中间体6bb，其中，式6bb-3的制备参考式6bb，使用2-(5-溴-2-硝基苯基)丙腈代替2-硝基-5-溴苯腈(式1bb)。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₅₃H₅₆N₉O₈ ⁺＝946.4；found 946.4。

参照式1制备方法，使用中间体ab1-0代替中间体e0-1。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₁H₇₁N₁₂O₅S⁺＝1083.5；found 1083.6。

参照式1制备方法，使用中间体hb2-0代替中间体e0-1，其中，式hb2-0的制备方法参考式hb1-0，使用中间体6bb-2代替中间体6bb，其中，式6bb-2的制备参考式6bb，使用2-(5-溴-2-硝基苯基)乙腈代替2-硝基-5-溴苯腈(式1bb)。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₂H₇₃N₁₂O₅S⁺＝1097.6；found 1097.6。

参照式1制备方法，使用中间体hb3-0代替中间体e0-1，其中，式hb3-0的制备方法参考式hb1-0，使用中间体6bb-3代替中间体6bb，其中，式6bb-3的制备参考式6bb，使用2-(5-溴-2-硝基苯基)丙腈代替2-硝基-5-溴苯腈(式1bb)。

LC-MS(ESI)m/z(M+H)⁺called for C₆₃H₇₅N₁₂O₅S⁺＝1111.6；found 1111.6。

将640mg式18所示化合物和800mg L-苹果酸溶于5mL无水乙醇中，常温反应过夜，有白色固体析出，抽滤得到699mg式71所示化合物，收率97％。

参照式71制备方法，原料为式18所示化合物与D-苹果酸。

参照式71制备方法，原料为式18所示化合物与(±)-苹果酸。

参照式71制备方法，原料为式18所示化合物与L-酒石酸。

参照式71制备方法，原料为式18所示化合物与D-酒石酸。

参照式71制备方法，原料为式18所示化合物与甲磺酸。

参照式71制备方法，原料为式18所示化合物与对甲苯磺酸。

参照式71制备方法，原料为式18所示化合物与枸橼酸。

参照式71制备方法，原料为式45所示化合物与L-苹果酸。

参照式71制备方法，原料为式45所示化合物与D-苹果酸。

参照式71制备方法，原料为式45所示化合物与(±)-苹果酸。

参照式71制备方法，原料为式45所示化合物与L-酒石酸。

参照式71制备方法，原料为式45所示化合物与D-酒石酸。

参照式71制备方法，原料为式45所示化合物与甲磺酸。

参照式71制备方法，原料为式45所示化合物与对甲苯磺酸。

参照式71制备方法，原料为式45所示化合物与枸橼酸。

实施例2：式1至式86所示小分子缀合物的生物活性测试

一、通过Western blot验证降解CDK12/13效果及其它相关蛋白降解效果

采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)测定化合物对白血病细胞KASUMI-1，MV4-11与Jurkat上CDK12/13蛋白的降解情况，其中降解效果最佳的两个化合物验证其在乳腺癌细胞MDA-MB-231上以浓度梯度验证降解CDK12/13蛋白的能力。

实验材料：

细胞株：KASUMI-1，MV4-11，Jurkat或MDA-MB-231

培养基：DMEM/RIPM-1640+10％ Hyclone血清

化合物溶解方法：将化合物溶于DMSO中制成50mM的储备液，并按一定比例稀释得到相应浓度。

1.细胞株(KASUMI-1或MV4-11或MDA-MB-231或Jurkat或HCT116)体外培养及给药

(1)细胞株体外培养：

将所选取的细胞(KASUMI-1或MV4-11或MDA-MB-231或Jurkat或HCT116)于含5％CO₂的37℃恒温培养箱培养，待细胞密度长到70～90％时传代，用于以后实验所需。

(2)细胞种板：消化细胞并把细胞悬液加入1.5mL Eppendorf管中，1,000rpm离心5min，用2mL培液重悬细胞并计数，将细胞悬液种于24孔板中，每孔20万细胞，放置8-12h待细胞全部贴壁。

(3)化合物作用：用细胞培养基稀释50mM的化合物，使其终浓度为0.01μM-3μM，于37℃、含5％ CO₂细胞培养箱中孵育3h-48h，以DMSO组为阴性对照。

2.细胞裂解

作用时间终点时将细胞收下，用PBS洗一遍；根据细胞量加入相应体积4％ SDS裂解细胞，超声至细胞不再粘稠；12,000rpm室温离心30min；取上清转移至新的EP管进行蛋白定量。

3.蛋白定量

取2mg/mL BSA标准品倍半稀释成标准曲线所用浓度，依次为2mg/mL，1mg/mL，0.5mg/mL，0.25mg/mL，0.125mg/mL，0.0625mg/mL；按每个样本需200μL BCA定量试剂盒中的A液和4μL B液计算，取相应体积的A液和B液(体积比为50:1)混匀；取10μL不同浓度的BSA及步骤2得到的ep管中样本分别加入96孔板中，然后加入200μL混匀的A液和B液，轻轻拍匀后置于37℃避光反应30min；反映结束后，于562nm处测定吸光度值，利用标准曲线计算样本蛋白浓度。

4.Western Blot

(1)蛋白样本制备

从步骤2得到的样本中取总量为20μg蛋白的样本于新EP管中，加入的10μL的6×Loading Buffer，再补加蒸馏水使新EP管中液体总体积为30μL；95℃加热变性10min，待冷却后离心混匀进行Western Blot实验，剩余样本冻存在-80℃。

(2)制胶

a.分离胶：根据目标蛋白分子量选择要制备的分离胶浓度，先搭制胶夹：将厚薄两块玻璃夹紧并保持地面平整；依次添加分离胶试剂到离心管中，涡旋混匀；混匀后将分离胶加至两块玻璃之间，再加入适量的异丙醇在胶面的上层，等待凝固。

b.浓缩胶：弃去分离胶上层异丙醇并用三蒸水洗净遗留的残液，配制浓缩胶并涡旋混匀，混匀后将浓缩胶加至两块玻璃之间，插入制胶梳子，等待凝固。

(3)电泳

a.准备：将制备好的胶架安装到电泳槽并放入电泳仪，把稀释好的1×Tricine缓冲液加入中间的电泳槽，并在外槽中加入1×Running缓冲液，静置数分钟。

b.上样：将步骤4(1)所得样本涡旋混匀，吸取一定量的样本(5-10μL)上样，上样结束之后，打开电泳仪，先调恒压模式，电压70V电泳10min，并确认电流正常，待样本进入分离胶后，将电压调为130V，等样本跑到合适位置，停止电泳。

(4)转膜及封闭

a.转膜：在转膜夹中依次加海绵，厚滤纸，薄滤纸；取胶：用剥胶铲除去边缘的浓缩胶块，并将分离胶小心取下，置于滤纸中央；贴膜：将提前用甲醇活化好的PVDF膜从一侧贴到胶上，并赶出气泡；再依次加薄滤纸，厚滤纸，海绵并将转膜夹夹好，依次组装好转膜夹。在转膜槽内加入适量的转膜液，转膜槽外层加入适量的水并放入冰袋，使转膜槽处于冰水中防止转膜过程中放出大量的热量影响转膜效果。

b.封闭：转膜结束后，打开转膜夹，去除胶和PVDF膜(若转膜成功可以看到蛋白Marker已经全部转移到PVDF膜上)，随后根据目标蛋白分子量剪开PVDF膜，并将膜置于5％脱脂牛奶，室温封闭60min。

(5)孵育抗体

a.孵育一抗：封闭结束后，弃去牛奶并用TBST清洗3次PVDF膜(15min，5min，5min)，再加入适量的一抗(一般按一抗：抗体稀释液＝1：1000稀释)，置于4℃摇床孵育过夜。

b.孵育二抗：回收一抗，并用TBST清洗3次(15min，5min，5min)，并加入二抗(一般按二抗：5％脱脂牛奶＝1：5000配制)，于水平摇床室温孵育60min。

(6)曝光

a.洗膜：弃去二抗，并用TBST清洗3次(15min，5min，5min)，

b.曝光：准备ECL发光液：A液：B液＝1：1。先用滤纸吸干条带上残留的TBST，并用镊子把条带夹取到曝光板上，在条带上滴加ECL显色液使条带覆盖，静止1min左右。将曝光板放入AI800曝光机内，选择合适的时间进行曝光。

其中降解率计算方法为：通过Image J软件对曝光结果进行定量分析，即先通过Image J软件对曝光条带进行灰度值的计算，再把目的蛋白的灰度值除以内参蛋白的灰度值，进行归一化处理，计算公式为D实验组＝{1-[(A_{实验组，目的蛋白}/A_{实验组，内参蛋白})÷(A_{阴性对照组，目的蛋白}/A_{阴性对照组，内参蛋白})]}×100％(A为灰度值，D为降解率)。

本发明小分子缀合物对CDK12、CDK13的降解活性见图3-图10；图中所示CDK12、CDK13为研究的目的蛋白，β-Actin、GAPDH为内参蛋白，内参蛋白用于指征实验中各个组别的总蛋白量，以便进行定量分析。

由图3-图9中的测试结果可以看出，大部分缀合物都能在一定的浓度下降解CDK12/13，其中，式45所示化合物降解作用最强。

表1

细胞名称	细胞类型	CDK12 DC₅₀	CDK13 DC₅₀
				MDA-MB-231	乳腺癌细胞	29nM	18nM
HCT116	结直肠癌细胞	34nM	24nM
				KASUMI-1	白血病细胞	28nM	17nM
MV4-11	白血病细胞	30nM	21nM

实施例分子列表、别名及活性见下表2(+代表降解能力强度，-代表未观察到降解，N.D.代表未做该实验)。

表2

+代表针对该蛋白的降解效果，+越多降解越明显。-代表不降解该蛋白。具体的：

+++++代表DC₅₀<100nM

++++代表100nM<DC₅₀<0.5μM

+++代表0.5μM<DC₅₀<1μM

++代表1μM<DC₅₀<3μM

+代表3μM<DC₅₀<10μM

-代表无降解活性

二、染色检测化合物对肿瘤细胞的增殖抑制效果

分采用CCK8染色测定化合物对白血病细胞系MV4-11、KASUMI-1的增殖抑制情况；采用磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色测定化合物对实体瘤细胞系MDA-MB-231的增殖抑制情况。

CCK8染色:首先在96孔板中以5000每孔的密度分别种下MV4-11、KASUMI-1细胞，随后给予梯度浓度(0.03μM-10μM)的化合物作用72h，同时给予溶剂DMSO作为阴性对照。作用时间终点时，每孔加入10ul CCK8试剂，避光，37℃孵育4小时，混匀后测定450nm处吸光度值。

SRB染色：首先在96孔板中以3000每孔的密度分别种下MDA-MB-231、L-02、HK-2细胞，待8-12h细胞贴壁后，给予梯度浓度(62.5nM-10μM)的化合物作用72h，同时给予溶剂DMSO作为阴性对照。作用时间终点时，加入70μL PBS清洗一遍，然后加入70μL 10％三氯乙酸将细胞于4℃固定1h；自来水将三氯乙酸冲洗干净后置于烘箱烘干；然后加入70μL SRB染色液室温染色20min；弃去染色液，并用1％冰醋酸清洗干净，置于烘箱烘干；加入150μL10mM Tris-base溶解液，摇床溶解15min后于540nm测定吸光度值。

药物合用方法学：在6孔板中以2000每孔的密度种下MD-MB-231细胞，待24h细胞贴壁后，分别给予特定浓度(0.5μM、1μM)的PARP抑制剂olaparib与特定浓度(0.5μM、1μM)式18化合物作用10天，同时给予溶剂DMSO作为阴性对照。作用时间终点时，加入100μL PBS清洗一遍，然后加入700μL 10％三氯乙酸将细胞于4℃固定1h；自来水将三氯乙酸冲洗干净后置于烘箱烘干；然后加入70μL SRB染色液室温染色20min；弃去染色液，并用1％冰醋酸清洗干净，置于烘箱烘干；随后对孔板进行拍照，并用Image J软件对各个组别的细胞克隆数进行计数。

CCK8染色、SRB染色细胞增殖抑制计算公式为：R实验组＝(1-OD实验组/OD阴性对照组)×100％(OD为吸光度值，R为细胞增殖抑制率)。

药物合用的细胞增殖抑制计算公式为：R实验组＝(1-K实验组/K阴性对照组)×100％(K为细胞克隆数，R为细胞增殖抑制率)。

结果见图10和图11。

由图10可知，本专利申请所提供的小分子缀合物选择性抑制肿瘤细胞KASUMI-1，MV4-11的增殖，而THZ-531(经典CDK12/13抑制剂)和IN-2(母核分子)对正常细胞和肿瘤细胞表现出无差别的增殖抑制活性。

由图11可知，本专利申请所述小分子缀合物与PARP抑制剂联合用药方案，可有效协同增强对乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖抑制活性，与现有的临床药物实现明显的叠加和互补。

三、化合物肝微粒体稳定性测试

实验材料：

化合物：酮色林，式18，式45

肝微粒体：人肝微粒体(购买自BioreclamationIVT)；狗、小鼠、大鼠、猴肝微粒(购买自Xenotech)

预热PBS，并使其pH为7.4。

配制浓度为500μM的化合物溶液：ep管中加入5μL浓度为10mM的化合物溶液和95μLof DMSO。

配制含有0.75mg/mL肝微粒体，浓度为1.5μM化合物溶液：ep管中加入1.5μL500μM的化合物溶液，18.75μL浓度为20mg/mL肝微粒溶液和479.75μL的PBS溶液。

配制浓度为6mM的NADPH溶液：将5mg NADPH，溶于1mL PBS溶液中。

在96孔板中加入30μL含有0.75mg/mL肝微粒体和浓度梯度的化合物溶液，加入15μL浓度为6mM NADPH溶液，150μL含有IS的乙腈:甲醇(1:1)溶液，涡旋混匀，6,000rpm离心10min。各个浓度的样品取80μL上清加入140μL纯水，用于LC/MS检测(进样量10μM)，根据化合物终浓度和对应的质谱峰面积，绘制标准曲线。

在96孔板上分别加入30μL含有0.75mg/mL肝微粒体，浓度为1.5μM化合物溶液用于不同时间点(0、5、15、30、45分钟，各两组)的检测。

对于0分钟组，向孔中加入150μL含有IS的乙腈:甲醇(1:1)溶液，再添加15μL浓度为6mM NADPH溶液，涡旋混匀，6,000rpm离心10min。

对于5、15、30、45分钟组，向孔中加入15μL浓度为6mM NADPH溶液启动反应。在5、15、30、45分钟后，分别在对应组别加入50μL含有IS的乙腈:甲醇(1:1)溶液终止反应。涡旋混匀，6,000rpm离心10min。

每个孔取80μL上清，加入含有140μL纯水的96孔板，用于LC/MS检测(进样量10μM)，化合物相应质谱峰面积与标准曲线对照，得到化合物浓度值。

计算公式：

消除速率K＝(Inc₁-Inc₂)/(t₂-t₁)(t₁，t₂为时间点，c₁，c₂分别为时间为t₁，t₂时的药物浓度)

半衰期t_1/2＝0.693/K

结果见图12。

由图12可知，式18和式45对四种种属人、大鼠、狗、猴的肝微粒体共孵育，半衰期皆大于45min，肝微粒体稳定性良好。

Claims

1.小分子缀合物，其特征在于，具有式Ⅰ所示的结构，或其药学上可接受的盐、共晶体、互变异构体、立体异构体、溶剂化物、水合物、多晶型物、同位素富集的衍生物或前药：

T-L-E

式Ⅰ

式Ⅰ中，T表示CDK12/13蛋白的配体，E表示E3连接酶的配体，L表示T和E的链接链。

2.根据权利要求1所述的小分子缀合物，其特征在于：所述T选自式Ⅱ所示的基团：

式Ⅱ中的R¹选自氢、N-取代酰胺、C1～C4的烷基取代酰基、C1～C6的烷基、C1～C6的烯基、C1～C6的炔基、3～8元的碳环基、3～8元的杂环基、5～10元的芳基、5～10元的杂芳基或氮保护基团；或者任选地，当R¹为两个时，两个R1与其中间原子(N)一起形成取代或未取代的杂环基或取代或未取代的杂芳基；所述氮保护基团包括叔丁氧羰基、苄氧羰基、烯丙氧羰基、对甲氧基苄基。

式Ⅱ中的R²选自氢、N-取代酰胺、C1～C4的烷基取代酰基、C1～C6的烷基、C1～C6的烯基、C1～C6的炔基、3～8元的碳环基、3～8元的杂环基、5～10元的芳基、5～10元的杂芳基、-CN、-OR^D1、-N(R^D1a)₂或-SR^D1；其中R^D1是氢、N-取代酰胺、C1～C4的烷基取代酰基、C1～C6的烷基、C1～C6的烯基、C1～C6的炔基、3～8元的碳环基、3～8元的杂环基、5～10元的芳基、5～10元的杂芳基，当连接到氧原子上时的氧保护基团、或当连接到硫原子上时的硫保护基团；其中，氧保护基团选自二氢吡喃、甲氧基甲基、苄基、甲氧基苄基、三甲基硅基、叔丁基二甲基硅基，硫保护基团选自乙酰氨甲基、苯乙酰氨甲基、叔丁基硫基。

其中两个R^D1a各自相互独立的选自氢、N-取代酰胺、C1～C4的烷基取代酰基、C1～C6的烷基、C1～C6的烯基、C1～C6的炔基、3～8元的碳环基、3～8元的杂环基、5～10元的芳基、5～10元的杂芳基或氮保护基团；或者任选地，两个R^D1a与其中间原子一起形成取代或未取代的杂环或取代或未取代的杂芳基环；

式Ⅱ中的Rx和Ry各自相互独立的选自CH或N；

式Ⅱ中的n是0、1、2、3、4或5；

与表示所连接的两个N相对于所连的六元环为反式结构。

3.根据权利要求2所述的小分子缀合物，其特征在于：R¹选自乙基、

或氮保护基团；w是0、1、2、3、4、5或6；R^1-a为一个或者多个时，一个或多个R^1-a各自相互独立选自卤素、N-取代酰胺、C1～C4的烷基取代酰基、C1～C6的烷基；R²选自卤素、氰基、三氟甲基；所述氮保护基团包括叔丁氧羰基、苄氧羰基、烯丙氧羰基、对甲氧基苄基。

4.根据权利要求2所述的小分子缀合物，其特征在于：所述T具有下式任一所示结构：

5.根据权利要求1或2所述的小分子缀合物，其特征在于：

所述E选自下述任一所述基团：3-氨基-N-(2,6-二氧代-3-哌啶基)邻苯二甲酰亚胺基团、3-(7-氨基-3-氧代-1H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮基团、沙利度胺基团、(2S,4R)-1-((S)-2-(3-氨基丙酰胺基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺基团、[(4R,5S)-4,5-双(4-氯苯基)-2-[4-(1,1-二甲基乙基)-2-乙氧基苯基]-4,5-二氢-4,5-二甲基-1H-咪唑-1-基][4-[3-(甲磺酰基)丙基]-1-哌嗪基]甲酮基团、苯基戊二酰亚胺。

6.根据权利要求1或2所述的小分子缀合物，其特征在于：

所述E选自如下结构之一：

式III-a～III-d、III-a-0～III-d-0中，R₁为NH或O或CH₂；

所述式Ⅲ-e中，R₁为H或OH，R₂为H或CH₃；

所述式Ⅲ-f、Ⅲ-h、Ⅲ-i中，R₁为其中R₃为-CN，-F，-COCH₃，R₂为H或CH₃；

所述式Ⅲ-g中，R₁为H，CN，F，Cl，Br，或式：

所述式Ⅲ-l中，X＝N或CH。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的小分子缀合物，其特征在于：所述L为如下结构单元中的一种，或者，

由如下结构单元所组成的任意结构团体：

-CH₂-、-(C＝O)-、

所述含杂原子的单元中R分别独立的选自烷基、烷氧基或氢；

所述烷基具体为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基；所述烷氧基为-OEt、-OMe。

8.根据权利要求1或2所述的小分子缀合物，其特征在于：所述L选自如下结构：

9.根据权利要求2或3所述的小分子缀合物，其特征在于：

所述小分子缀合物的结构式如式IV-式XII任一所示：

式IV中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，A为CH₂、NH、O或CO，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO，B为CO或CH₂，X、Y、Z各自独立的为CH或N，R¹、n的定义同式II；

式V中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，A为CH₂、NH、O或CO，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO，B为CO或CH₂，X、Y各自独立的为CH或N，R¹、n的定义同式II；

式VI中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，A为CH₂、NH、O或CO，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO，B为CO或CH₂，X、Y、Z各自独立的为CH或N，V、W独立的为CH或N，R¹、n的定义同式II；

式VII中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO；Rx为H或CH₃，X、Y、Z各自独立的为CH或N，R¹、n的定义同式II；

式VIII中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO，Rx为H或CH₃，X、Y独立的为CH或N，R¹、n的定义同式II；

式IX中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO；Rx为H或CH₃，X、Y、Z独立的为CH或N，V、W各自独立的为CH或N，R¹、n的定义同式II；

式X中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO；A为CH₂或CO，X、Y、Z各自独立的为CH或N，R¹、n的定义同式II；

式XI中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO；A为CH₂或CO，X、Y各自独立的为CH或N，R¹、n的定义同式II；

式XII中，m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，G为不存在、CH₂、NH、O、CONH或NHCO；A为CH₂或CO，X、Y、Z各自独立的为CH或N，V、W各自独立的为CH或N，R¹、n的定义同式II。

10.根据权利要求9所述的小分子缀合物，其特征在于：所述小分子缀合物具有如式IX所示的结构，其中，n＝0；R¹为苄基；X为CH；Y和Z中至少一个为N，不全为N时，另外一个为CH；G不存在；m₁为0；m₂为0,1,2，Rx为甲基。

11.根据权利要求1所述的小分子缀合物，其特征在于：所述小分子缀合物为如下述式1～70所示的化合物：

式1

式2

式3

式4

式5

式6

式7

式8

式9

式10

式11

式12

式13

式14

式15

式16

式17

式18

式19

式20

式21

式22

式23

式24

式25

式26

式27

式28

式29

式30

式31

式32

式33

式34

式35

式36

式37

式38

式39

式40

式41

式42

式43

式44

式45

式46

式47

式48

式49

式50

式51

式52

式53

式54

式55

式56

式57

式58

式59

式60

式61

式62

式63

式64

式65

式66

式67

式68

式69

式70

12.根据权利要求1-11任一项所述的小分子缀合物，其特征在于，所述药学上可接受的盐，是与下列酸所形成的盐：枸橼酸、富马酸、乙酸、草酸、酒石酸、苹果酸、马来酸、乳酸、樟脑磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、苯磺酸、琥珀酸、柠檬酸、氢卤酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、谷氨酸、天冬氨酸。

13.根据根据权利要求12所述的小分子缀合物，其特征在于：所述小分子缀合物为如下述式71～86所示的化合物：

式71

式72

式73

式74

式75

式76

式77

式78

式79

式80

式81

式82

式83

式84

式85

式86

14.一种权利要求1-12任一项所述的小分子缀合物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：E3连接酶的配体前体化合物与链接链前体化合物与T部分CDK12/13蛋白的配体前体化合物分别通过酰胺缩合反应、取代反应、点击反应或交叉偶联反应，得到所述式I所示小分子缀合物。

15.根据权利要求14所述小分子缀合物的制备方法，其特征在于，分别如下：

式IV所述的小分子缀合物的制备方法：通过式a所示的CDK12/13配体端衍生物和式b所示Pomalidomide端衍生物之间的亲核取代反应，得到式IV所述的小分子缀合物；

其中，所述式IV所述的小分子缀合物中，G为O、A为NH、X为CH、Y为N、Z为CH；式a中R¹、m₁、m₂、n的定义同式IV，式b中B的定义同式IV；

或，所述式V所示的小分子缀合物的制备方法，包括下述步骤：通过式c所示的CDK12/13配体端衍生物与式b所示的Pomalidomide端衍生物之间进行亲核取代反应，得到式V所述的小分子缀合物；

其中，所述式V所述的小分子缀合物中，G为CH₂、A为NH、X为N、Y为N；式c中R¹、m₁、m₂、n的定义同式V，式b中B的定义同式V；

或，所述式VI所示的小分子缀合物的制备方法，包括下述步骤：通过式d所示的CDK12/13配体端衍生物与式b所示的Pomalidomide端衍生物之间进行亲核取代反应，得到式VI所述的小分子缀合物；

其中，所述式VI所述的小分子缀合物中，G为CH₂、A为NH、X为CH、Y为N、Z为CH、V为N、W为N；式d中R¹、m₁、m₂、n的定义同式VI，式b中B的定义同式VI；

或，所述式VII所示的小分子缀合物的制备方法，包括下述步骤：通过式e所示的CDK12/13配体端衍生物与式f所示的VHL配体衍生物之间进行缩合反应，得到式VII所述的小分子缀合物；

其中，所述式VII所述的小分子缀合物中，G为O、X为CH、Y为N、Z为CH；式e中R¹、m₁、m₂、n的定义同式VII，式f中，R_x定义同式VII；

或，所述式VIII所示的小分子缀合物的制备方法，包括下述步骤：通过式g所示的CDK12/13配体端衍生物与式f所示的VHL配体衍生物之间进行缩合反应，得到式VIII所述的小分子缀合物；

其中，所述式VIII所述的小分子缀合物中，G为CH₂、X为N、Y为N；式g中R¹、m₁、m₂、n的定义同式VIII，式f中，R_x定义同式VIII；

或，所述式IX所示的小分子缀合物的制备方法，包括下述步骤：通过式h所示的CDK12/13配体端衍生物与式f所示的VHL配体衍生物之间进行缩合反应，得到式X所述的小分子缀合物；

其中，所述式IX所述的小分子缀合物中，G为CH₂、X为CH、Y为N、Z为CH、V为N、W为N；式h中R¹、m₁、m₂、n的定义同式IX，式f中，R_x定义同式IX；

或，所述式X所示的小分子缀合物的制备方法，包括下述步骤：通过式e所示的CDK12/13配体端衍生物与式j所示的MDM2配体衍生物之间进行缩合反应，得到式X所述的小分子缀合物；

其中，所述式X所述的小分子缀合物中，G为O、X为CH、Y为N、Z为CH，A为CO；式e中R¹、m₁、m₂、n的定义同式X；

或，所述式XI所示的小分子缀合物的制备方法，包括下述步骤：通过式g所示的CDK12/13配体端衍生物与式j所示的MDM2配体衍生物之间进行缩合反应，得到式XI所述的小分子缀合物；

其中，所述式XI所述的小分子缀合物中，G为CH₂、X为N、Y为N，A为CO；式g中R¹、m₁、m₂、n的定义同式XI；

或，所述式XII所示的小分子缀合物的制备方法，包括下述步骤：通过式h所示的CDK12配体端衍生物与式j所示的MDM2配体衍生物之间进行缩合反应，得到式XII所述的小分子缀合物；

其中，所述式XII所述的小分子缀合物中，G为CH₂、X为CH、Y为N、Z为CH、V为N、W为N、A为CO；式h中R¹、m₁、m₂、n的定义同式XII。

16.一种制备权利要求2所示化合物的中间体，其特征在于，结构如式a、式c、式d、式e、式g、式h所示：

上面各式中：m₁为0～6之间的整数，m₂为0～15之间的整数，R¹选自氢、任选取代的酰基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或氮保护基团；或者任选地，当R¹为两个时，两个R¹与其中间原子一起形成取代或未取代的杂环或取代或未取代的杂芳基环；n是0、1、2、3、4或5。

17.一种权利要求15所述式a所示的化合物或所述式c所示的化合物或所述式d所示的化合物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

当式II中n为0时：

1)将式1a所示化合物与联硼酸频那醇酯偶联得到式2a所示化合物

2)将式3a所示与4a所示化合物发生亲核反应得到式5a所示化合物；将式1a与式1c发生偶联反应并脱保护得到式3c；将式3a所示与1c所示化合物通过亲核取代反应得到式1d所示化合物，式1d与式2a化合物通过偶联反应并脱去保护基团得到2d；

3)将式2a所示与式5a所示化合物通过偶联反应并脱去保护基团，得到式a0所示化合物；

将式2c所示与式3c所示化合物通过亲核取代反应并脱去保护基团，得到式c0所示化合物；

将式2c所示与式2d所示化合物通过亲核取代反应并脱去保护基团，得到式d0所示化合物；

所述式a0、式c0、式d0所示的化合物分别对应式a、式c、式d所示的化合物在n＝0时对应的化合物；

当式II中n不为0时：

1)将式1b所示化合物与联硼酸频那醇酯偶联得到式2b所示化合物

2)式3cb所示化合物的合成，由式1b所示化合物与式1c所示化合物发生偶联反应并脱保护得到；式2db所示化合物的合成，由式2b所示化合物与式1d所示化合物通过偶联反应并脱去保护基团得到；

3)式ab所示化合物的合成，由式2b所示化合物与式5a所示化合物通过偶联反应后脱去保护基团得到；

式cb所示化合物的合成，由式3cb所示化合物与式2c所示化合物通过亲核取代反应并脱去保护基团得到；

式db所示化合物的合成，由式2db所示化合物与式2c所示化合物通过亲核取代反应并脱去保护基团得到；

所述式ab、式cb、式db所示的化合物分别对应式a、式c、式d所示的化合物在n不等于0时对应的化合物；

18.一种权利要求15中所述式e示的化合物或式g示的化合物或式h示的化合物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

当式II中n为0时：

1)将式e1所示与式3a所示通过亲核取代反应得到e2；

2)将式e2所示与式2a化合物通过偶联反应并脱去保护基团得到式e0所示化合物；将式3c所示与式g1所示化合物通过亲核取代反应并脱去保护基团得到式g0所示化合物；将式2d所示与式g1所示化合物通过亲核取代反应并脱去保护基团得到式h0所示化合物；所述式e0、式g0、式h0所示的化合物分别对应式e、式g、式h所示的化合物在n＝0时对应的化合物；

当式II中n不为0时：

式eb所示化合物的合成，参照式e，原料为式2b所示化合物与式e2所示化合物；

式gb所示化合物的合成，参照式c，原料为式3cb所示化合物与式g1所示化合物；

式hb所示化合物的合成，参照式d，原料为式2db所示化合物与式g1所示化合物；所述式eb、式gb、式hb所示的化合物分别对应式e、式g、式h所示的化合物在n不等于0时对应的化合物；

19.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1-13任一项所述小分子缀合物以及一种或多种药学上可接受的载体。

20.根据权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂中的一种或多种。

21.一种由权利要求19或20所述组合物得到的制剂，包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂、注射液。

22.一种权利要求1-13任一项所述小分子缀合物在下述1)-3)中的至少一方面的应用：

1)在制备CDK12/13降解剂中的应用；

2)在制备癌细胞增殖抑制剂中的应用；

3)在制备预防和/或治疗CDK12/13异常性疾病药物中的应用。

23.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，所述CDK12/13降解剂可选择性降解下述细胞中的CDK12/13：结直肠癌细胞、乳腺癌细胞和脑胶质细胞瘤细胞、急性髓细胞性白血病细胞、T淋巴细胞白血病细胞、骨髓瘤细胞；

所述癌细胞包括细胞骨髓瘤细胞、乳腺癌细胞、白血病细胞和脑胶质细胞瘤细胞；

所述CDK12/13异常性疾病包括乳腺癌、前列腺癌、胃癌、尤文肉瘤、白血病。