CN1166634C - 15n－l－脯氨酸的分离提纯方法 - Google Patents

Abstract

一种¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法，采用强酸性树脂除去发酵液中的色素和杂质，强碱性树脂将脯氨酸和其它的氨基酸杂酸分离，然后再用无水乙醇进行精制，得到的¹⁵N-L-脯氨酸产品纯度高，色泽雪白，长期贮存不发黄。本发明的方法工艺简单，操作方便，总提取得率达80%以上。

Description

15N-L-脯氨酸的分离提纯方法

技术领域

本发明涉及一种氨基酸的分离提纯方法，更确切地说是涉及一种¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法。

背景技术

L-脯氨酸是人体蛋白质的重要组成之一，属杂环族氨基酸，在医药、农业、化工及食品等行业有着重要的用途。¹⁵N-L-脯氨酸由于其结构的特殊性，在医学、药物学、农业科学、生命科学等研究领域作为示踪剂而广泛应用。¹⁵N-L-脯氨酸的制备一般采用有机合成法和微生物发酵法，但不管采用哪种方法都会遇到产品的分离纯化问题。由于脯氨酸是唯一溶解于醇的氨基酸，并且在水中溶解度极大，为162.30g/100mL水(25℃)，因此，纯化困难较大。

现有L-脯氨酸的纯化方法，包括亚硝化法〔《食品科学》，1998(10)，26-29〕，氧化铝层析法，五氯酚成盐沉淀法〔《医药工业》，1981(4)，8-9〕，乙醇-乙醚法，用水和低碳醇的混合物纯化法(申请日1991年1月17日，申请号911003703，公开号CN1063280A)以及离子交换树脂法等。亚硝化法存在操作步骤多，预处理周期长等问题；氧化铝层析法存在费时多、不宜扩大规模等问题；五氯酚成盐沉淀法虽然具有专属性好的特点，但是五氯酚剧毒，劳动保护成问题；乙醇-乙醚法分离纯化不彻底，且易使脯氨酸结晶氧化发黄，另外乙醚的沸点低，易燃易爆，不易回收利用；而专利所述的用水和低碳醇的混合物纯化法，是以甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇联合用作提纯溶剂，但是¹⁵N-L-脯氨酸作为医药、食品等行业用的示踪剂，不宜采用甲醇、异丙醇、正丁醇作为提纯溶剂；而一般的离子交换树脂法，在上柱前都要加入絮凝剂对发酵液进行预处理〔《华东化工学院学报》，1989(4)，456-460〕，或者用脱色剂脱色〔《微生物学报》，1993(2)，87-90〕，在精制前还要对洗脱液进行脱色。

发明内容

针对上述分离纯化方法的不足，本发明提供一种分离效果好、操作步骤少的从生物发酵液分离提纯¹⁵N-L-脯氨酸的方法。

本发明是一种用离子交换树脂分离提纯¹⁵N-L-脯氨酸的改良法，分别采用强酸性树脂和强碱性树脂从发酵液中提取分离¹⁵N-L-脯氨酸，然后再将得到的¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品用无水乙醇精制，最终得到纯度大于98％的¹⁵N-L-脯氨酸产品。

本发明的¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法包括如下操作步骤：

(1)离心除去发酵液中的菌丝体，离心清液用草酸调节pH＝3～5，用强酸性树脂吸附，用0.1～0.2M氨水解吸，解吸液真空浓缩干燥，得到¹⁵N-L-脯氨酸粗品，

(2)步骤(1)得到的¹⁵N-L-脯氨酸粗品用水溶解，用氨水调节pH＝9～11，用强碱性树脂吸附，用0.1M盐酸解吸，将含¹⁵N-L-脯氨酸单斑解吸液真空浓缩干燥，得到¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品，

(3)步骤(2)得到的¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品用无水乙醇在60～80℃下溶解，趁热过滤，滤液经冷却，结晶，过滤，真空干燥后即得到提纯的¹⁵N-L-脯氨酸产品。

本发明的¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法，所述的强酸性树脂是凝胶强酸苯乙烯系树脂，空柱流速SV＝0.1～1.0％，所述的强碱性树脂是苯乙烯系阴离子交换树脂，空柱流速SV＝0.1～1.0％。

本发明的¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法，所述的干燥温度是50～60℃。

本发明的¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法，所述用无水乙醇溶解¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品时，无水乙醇的加量是¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品∶无水乙醇＝1∶(4～15)(重量)。

本发明的¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法，步骤(2)得到的¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品在用无水乙醇溶解前还可先用无水乙醇带水，带水后真空干燥。

本发明的¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法，冷却结晶的温度控制在室温至-18℃。

本发明的¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法与现有技术相比具有以下优点：

1.本发明的方法采用强酸性树脂能够除去大量的色素和杂质，发酵液不必进行絮凝或脱色等预处理，精制前也无需进行脱色，采用强碱性树脂能够使¹⁵N-L-脯氨酸与谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等杂酸基本完全分离，¹⁵N-L-脯氨酸单斑得率＞95％，故工艺简单，操作方便。

2.用乙醚-乙醇法精制的L-脯氨酸产品易氧化发黄，而本发明的方法以无水乙醇作为精制溶剂，可将色素都流在精制母液中，制得的产品纯度高，色泽雪白，长期贮存不会发黄，纯度＞98％，总提取得率达80％以上。

具体实施方式

下面通过对本发明的分离提纯方法的具体实施例的详细描述进一步阐述本发明，但实施例不是对本发明的限制。

实施例1

发酵后得到的¹⁵N-L-脯氨酸高丰度发酵液用草酸调节pH＝3.2，用离心机离心得上清液，取上清液350mL，该上清液含¹⁵N-L-脯氨酸2.11％(重量)，上凝胶强酸苯乙烯系树脂(Amberjet 1500H强酸性树脂)柱，空柱流速SV＝0.2％，之后用蒸馏水清洗树脂柱至中性，然后用0.1M氨水解吸吸附在树脂柱上的¹⁵N-L-脯氨酸，解吸液在50℃下真空浓缩干燥，得到含杂酸的¹⁵N-L-脯氨酸粗品9.24g。

加入蒸馏水350mL溶解¹⁵N-L-脯氨酸粗品，用氨水调节其pH＝9.9，上苯乙烯系阴离子交换树脂(201×4OH型强碱性树脂)柱，空柱流速SV＝0.15％，之后用蒸馏水清洗树脂柱至中性，然后用0.1MHCl解吸吸附在树脂柱上的¹⁵N-L-脯氨酸，收集¹⁵N-L-脯氨酸单斑解吸液，在50℃下真空浓缩干燥，用无水乙醇带水一次，再在真空干燥箱中完全干燥，得到¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品7.53g。

用140mL无水乙醇于70℃水浴下溶解¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品，趁热过滤，滤液冷却至室温，静置使¹⁵N-L-脯氨酸结晶析出，过滤，用无水乙醇洗涤一次，再过滤，在50℃下真空干燥，得到5.97g¹⁵N-L-脯氨酸产品，产品色泽雪白，纯度为98.41％，¹⁵N丰度为96.14％，总提取得率为80.8％。

实施例2

发酵后得到的¹⁵N-L-脯氨酸低丰度发酵液用草酸调节pH＝5.0，用离心机离心得上清液，取上清液150mL，该上清液含¹⁵N-L-脯氨酸2.50％(重量)，上凝胶强酸苯乙烯系树脂(001×7H型强酸性树脂)柱，空柱流速SV＝1.0％，之后用蒸馏水清洗树脂柱至中性，然后用0.1M氨水解吸，得到含¹⁵N-L-脯氨酸的解吸液，解吸液在55℃下真空浓缩干燥，得到含杂酸的¹⁵N-L-脯氨酸粗品4.65g。

加入蒸馏水150mL溶解¹⁵N-L-脯氨酸粗品，用氨水调节其pH＝10.2，上苯乙烯系阴离子交换树脂(201×7OH型强碱性树脂)柱，空柱流速SV＝1.0％，之后用蒸馏水清洗树脂柱至中性，然后用0.1MHCl解吸，收集¹⁵N-L-脯氨酸单斑解吸液，在55℃下真空浓缩干燥，用无水乙醇带水一次，再在真空干燥箱中完全干燥，得到¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品3.58g。

用20mL无水乙醇于85℃水浴下溶解¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品，趁热过滤，滤液冷却至室温，静置过夜，过滤，抽干，用无水乙醇洗涤一次，再抽干，在55℃下真空干燥，得到3.01g¹⁵N-L-脯氨酸产品，产品色泽雪白，纯度为98.36％，¹⁵N丰度为10.14％，总提取得率为80.2％。

实施例3

发酵后得到的¹⁵N-L-脯氨酸高丰度发酵液用草酸调节pH＝4.1，用离心机离心得上清液，取上清液400mL，该上清液含¹⁵N-L-脯氨酸2.11％(重量)，上凝胶强酸苯乙烯系树脂(Amberjet 1500H强酸性树脂)柱，空柱流速SV＝0.6％，之后用蒸馏水清洗树脂柱至中性，然后用0.2M氨水解吸，得到含¹⁵N-L-脯氨酸解吸液，于60℃下真空浓缩干燥，得到含杂酸的¹⁵N-L-脯氨酸粗品10.59g。

加入蒸馏水400mL溶解¹⁵N-L-脯氨酸粗品，用氨水调节其pH＝10.8，上苯乙烯系阴离子交换树脂(201×4OH型强碱性树脂)柱，空柱流速SV＝0.6％，之后用蒸馏水清洗树脂柱至中性，然后用0.1MHCl解吸，收集¹⁵N-L-脯氨酸单斑解吸液，在60℃下真空浓缩干燥，用无水乙醇带水一次，再在真空干燥箱中完全干燥，得到¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品8.32g。

用85mL无水乙醇于80℃水浴下溶解¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品，趁热过滤，滤液冷却至室温，冰冻过夜，温度是-18℃，过滤，抽干，用无水乙醇洗涤一次，再抽干，于60℃下真空干燥，得到7.02g¹⁵N-L-脯氨酸产品，产品色泽雪白，纯度为98.36％，¹⁵N丰度为96.11％，总提取得率为83.2％。

Claims (9)

1、一种¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法，其特征在于该方法包括如下操作步骤：

(1)离心除去发酵液中的菌丝体，离心清液用草酸调节pH＝3～5，用强酸性树脂吸附，用0.1～0.2M氨水解吸，解吸液真空浓缩干燥，得到¹⁵N-L-脯氨酸粗品，

(2)步骤(1)得到的¹⁵N-L-脯氨酸粗品用水溶解，用氨水调节pH＝9～11，用强碱性树脂吸附，用0.1M盐酸解吸，将含¹⁵N-L-脯氨酸单斑解吸液真空浓缩干燥，得到¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品，

(3)步骤(2)得到的¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品用无水乙醇在60～80℃下溶解，趁热过滤，滤液经冷却，结晶，过滤，真空干燥后即得到提纯的¹⁵N-L-脯氨酸产品。

2、如权利要求1所述的¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法，其特征在于所述的强酸性树脂是凝胶强酸苯乙烯系树脂。

3、如权利要求1所述的¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法，其特征在于所述的强碱性树脂是苯乙烯系阴离子交换树脂。

4、如权利要求1或2所述的¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法，其特征在于用树脂吸附时，离心清液的空柱流速SV＝0.1～1.0％。

5、如权利要求1或3所述的¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法，其特征在于用树脂吸附时，¹⁵N-L-脯氨酸粗品溶解液的空柱流速SV＝0.1～1.0％。

6、如权利要求1所述的¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法，其特征在于所述用无水乙醇溶解¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品时，¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品与无水乙醇重量比为1∶(4～15)。

7、如权利要求1所述的¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法，其特征在于所述的¹⁵N-L-脯氨酸单斑粗品在用无水乙醇溶解前先用无水乙醇带水，带水后真空干燥。

8、如权利要求1所述的¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法，其特征在于冷却结晶的温度是室温至-18℃。

9、如权利要求1或7所述的¹⁵N-L-脯氨酸的分离提纯方法，其特征在于所述干燥温度是50～60℃。