CN116656787A - 一种核酸序列扩增和标记的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸序列扩增和标记方法，其中，核酸序列扩增标记方法包括以下步骤：将模板核酸序列、核苷酸单体混合物、和/或引物、核酸聚合酶和包含多个核酸条形码分子的载体共同分配至分区，利用具有链置换活性的核酸聚合酶和连接在载体上的核酸条形码分子序列对模板核酸序列进行扩增与标记，从而为测序文库的构建提供原材料。对于来自单个或多个细胞的基因组DNA，本发明的方法可以实现单细胞的全基因组扩增与条形码化标记，减少实验操作步骤，适于大规模的核酸测序，提高测序效率以及基因组的测序覆盖率，而一锅法扩增加标记的反应过程大大降低反应物交叉污染的风险，提高了测序的准确性。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种核酸序列扩增和标记的方法。
背景技术
基因组测序可以用来获得各种各样的生物医学背景的信息，包括诊断学、预后、生物技术和法医生物学。对于单细胞测序技术而言，其主要过程包括：单细胞的分离、单细胞的裂解、核酸序列的扩增、单个细胞核酸序列的条形码化、高通量测序、数据处理与分析。近年来，针对单细胞的研究通常利用微流控技术完成，其中包括单细胞的分离、单细胞的裂解、核酸序列的扩增以及单个细胞核酸序列的条形码化。多个步骤的微流控操作增加了实验流程的复杂度和细胞间核酸序列丢失或交叉污染的风险。
因此，对于提高测序效率以及基因组的测序覆盖率，需要有高质量的核酸扩增技术以及在扩增的同时实现核酸序列的条形码化标记，以减少实验操作步骤和降低反应物交叉污染的风险。
发明内容
本发明提供了一种用于扩增和标记核酸序列的方法，以及使用这些方法制备的文库。本发明提供的扩增和标记核酸序列的方法能够实现在扩增的同时完成核酸序列的条形码化标记，减少实验操作步骤，适于大规模的核酸测序，提高测序效率以及基因组的测序覆盖率，减少了测试时间；同时，一锅法的反应过程大大降低反应物交叉污染的风险，提高了测序的准确性。
本公发明提供了一种对核酸序列进行扩增和标记的方法。所述方法包括：
步骤1：将核酸序列、扩增反应混合物与载体共同分配至分区；
其中，扩增反应混合物包含核苷酸单体混合物、核酸聚合酶、和/或引物；载体包含与之连接的多个核酸条形码分子；
步骤2：将核酸条形码分子从载体上释放至分区内；
步骤3：在温控程序下对核酸序列进行扩增，并将核酸条形码分子附接至分区内核酸序列的扩增子序列上以进行核酸标记。
在一些实施方案中，扩增反应混合物包含：核苷酸单体混合物、核酸聚合酶和第一引物，第一引物包括通用序列和可变序列，核酸聚合酶可用于PCR反应且具有链置换活性；
核酸条形码分子的3'端包含通用序列作为扩增标记核酸序列的第二引物；
温控程序包括两段，在第一温度循环程序下，使得第一引物的可变序列与核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增产物1，其中核酸扩增产物的5'端包含通用序列，3'端包含通用序列的互补序列；在第二温度循环程序下，使得所述核酸条形码分子上的第二引物退火至核酸扩增产物的3'端并通过聚合酶进行延伸，得到扩大的核酸扩增产物2，其中扩大的核酸扩增产物2被所述核酸条形码分子的条形码序列所标记。
在一些实施方案中，扩增反应混合物包含核苷酸单体混合物和核酸聚合酶，核酸聚合酶具有链置换活性；核酸条形码分子的3'端包含可变序列作为扩增标记核酸序列的引物；
温控程序选自温度循环程序和恒温扩增程序；
其中，在温度循环程序下，使得所述核酸条形码分子上的引物与模板核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增标记产物，其中核酸扩增标记产物的5'端包含核酸条形码分子序列，3'端包括核酸条形码分子序列的互补序列；
在恒温扩增程序下，使得所述核酸条形码分子上的引物与模板核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增标记产物，所述核酸扩增标记产物的5'端包含核酸条形码分子序列。
在一些实施方案中，所述核酸序列可以是单个细胞或多个细胞或非细胞材料的基因组DNA。
在一些实施方案中，所述核酸序列包含在细胞中，在进行核酸序列扩增前，其包括先将单个细胞或多个细胞和细胞裂解试剂共同分配至分区进行核酸序列的提取，优选地，所述分区可以是液滴。
在一些实施方案中，所述细胞为微生物细胞，所述裂解细胞的方法可为酶裂解法或碱裂解法或物理裂解法。
在一些实施方案中，在所述步骤1之前还包括将包含细胞与细胞裂解试剂的分区置于裂解循环程序，使得所述细胞裂解并释放出所述基因组DNA。
在一些实施方案中，所述酶裂解法的试剂可包括溶葡球菌酶(lysostaphin,Sigma)、溶酶菌(lysozyme,prepGEM Bacteria)、Green+buffer(prepGEM Bacteria)和prepGEM(prepGEM Bacteria)。
所述酶裂解程序为37℃，30min；75℃，10min，95℃5min；4℃，+∞。
在一些实施方案中，所述包含通用序列和可变序列的第一引物选自5'-GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNNNN-3'(N8 primer)、5'-GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG-3'(N5G3 primer)或5'-GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT-3'(N5T3 primer)，并且所述连接在核酸条形码分子3'端的第二引物具有5'-GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG-3'的序列，其中N为任意的可与天然核酸进行碱基配对的核苷酸。
在一些实施方案中，所述核酸聚合酶具有链置换活性。
在一些实施方案中，所述核酸聚合酶选自Bst DNA聚合酶(全长)、Bst DNA聚合酶(大片段)、Bst DNA 2.0聚合酶、Bst 3.0DNA聚合酶、Bst(exo-)DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、Deep Vent(exo-)DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、KlenowFragment DNA聚合酶Ⅰ，及其任意组合。
在一些实施方案中，所述扩增反应混合物进一步包含一种或多种选自下组的成分：(NH4)+、SO4 2-、K+、Cl-、Mg2+、Triton X-100、和BSA。
在一些实施方案中，所述扩增反应混合物进一步包括pH值调节剂，使得所述反应混合物的pH值维持在7.5-9.0之间。
在一些实施方案中，所述扩增反应混合物包括20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、3.5mM MgSO4、0.1％Triton X-100、0.3mM dNTPs mix、0.17uMN5G3 primer、0.13uM N5T3 primer、0.14U/ul Deep Vent(exo-)DNA聚合酶和0.5mg/ml BSA。
在一些实施方案中，所述分区可以是液滴。
在一些实施方案中，所述将核酸序列、扩增反应混合物与载体共同分配至分区可包括使包含单个细胞裂解物(单细胞基因组DNA)的多个液滴与包含载体和扩增反应混合物的多个液滴按照一定比例融合。并且，可通过紫外光照将核酸条形码分子从载体释放至液滴。
本公开内容的另一方面提供了对扩增标记后的核酸序列进行测序的方法。所述方法包括：1)从分区内回收纯化扩增标记后的核酸序列；2)PCR富集上述纯化后的核酸扩增和标记产物；3)对上述PCR富集后的核酸扩增和标记产物进行片段化；4)对上述片段化后的核酸分子进行文库标签扩增；5)对上述文库标签扩增后的核酸分子进行片段纯化；6)对上述片段纯化后的文库分子进行质检并测序。
在一些实施方案中，所述分区是液滴，从分区内回收核酸扩增和标记产物包括打破液滴，打破液滴的试剂可以是含1％全氟辛醇的氟化油HFE-7500。
在一些实施方案中，所述核酸扩增和标记产物纯化的方法为磁珠法，磁珠可以是SPRⅠ磁珠(Beckman)。
在一些实施方案中，所述从分区内回收纯化的核酸扩增和标记产物可以直接进行建库测序。
在一些实施方案中，所述对核酸扩增和标记产物进行片段化为酶切法，所述酶切法采用的酶选自dsDNAFragmentase或转座酶。
在一些实施方案中，使用含有index标签的P7和P5扩增引物，进行所述文库标签扩增。
在一些实施方案中，使用安捷伦2100生物分析仪或Bioptic Qsep100生物分析仪对文库分子进行质检。
本发明提供的对核酸序列进行扩增和标记的方法，与现有技术相比，能够实现在扩增的同时完成核酸序列的条形码化标记，减少实验操作步骤，适于大规模的核酸测序，提高测序效率以及基因组的测序覆盖率，减少了扩增时间；同时，一锅法的反应过程大大降低反应物交叉污染的风险，提高了测序的准确性。
附图说明
通过附图说明，将会更加充分地描述本申请内容的上述和其他特征。这些附图仅描绘了本申请内容的若干实施方式，因此不应认为是对本申请内容范围的限定。通过采用附图，本申请将会得到更加明确和详细地说明。
图1是本公开中一种核酸序列扩增和标记方法的原理。
图2是本公开中另一种核酸序列扩增和标记方法的原理。
图3是本公开中另一种核酸序列扩增和标记方法的原理。
图4是实施例1中对大肠杆菌基因组DNA进行扩增和标记的DNA产物的Qsep100电泳图。
图5是一种包封细胞和细胞裂解液的微流控装置图。
图6是一种包封细胞裂解后产物、扩增反应混合物和载体的液滴融合微流控装置图。
图7是实施例3中对单个大肠杆菌和枯草芽孢杆菌基因组DNA进行扩增和条形码化标记的产物的Qsep100电泳图。
图8是实施例3中单个大肠杆菌和枯草芽孢杆菌基因组DNA扩增和条形码化标记产物的PCR富集产物的Qsep100电泳图。
图9是实施例3中条形码化标记产物的建库后文库分子的bioanalyzer 2100分析图。
图10是实施例4中4个液滴微流控操作步骤用到的微流控装置图。
图11是实施例4中未经磁珠分选的文库的bioanalyzer 2100分析图。
图12是实施例4中经磁珠分选后的文库的bioanalyzer 2100分析图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本公开内容提供了扩增和标记核酸序列的方法。在很多情况下，该方法通常用于核酸分析应用，特别是核酸测序应用。
图1示出了一种对核酸序列进行扩增和标记的原理图。该方法可将模板核酸序列的预扩增步骤和指数扩增步骤在同一分区内进行，同时反应过程中不存在添加试剂的步骤，为一锅法反应。首先，配制扩增反应混合物，其包括由通用序列和可变序列组成的第一引物、核苷酸单体混合物、可用于PCR反应且具有链置换活性的聚合酶；然后将连接有多个核酸条形码分子的载体、扩增反应混合物和核酸序列置于同一分区内，进行温控程序。所述温控程序包括两段，在第一温度循环程序下，使得第一引物的可变序列与模板核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增产物1，其中核酸扩增产物的5'端包含所述通用序列，3'端包含所述通用序列的互补序列；在第二温度循环程序下，使得所述核酸条形码分子上的第二引物退火至核酸扩增产物的3'端并通过聚合酶进行延伸，得到扩大的核酸扩增产物2，其中扩大的核酸扩增产物2被所述核酸条形码分子的条形码序列所标记。
图2和图3分别示出了另外两种对核酸序列进行扩增和标记的原理图。首先，配制扩增反应混合物，其包括核苷酸单体混合物和具有链置换活性的聚合酶；然后将连接有多个核酸条形码分子的载体、扩增反应混合物和核酸序列置于同一分区内，将所述分区置于温度循环程序或恒温扩增程序，在温度循环程序下，使得所述核酸条形码分子上的引物与模板核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增标记产物，其中核酸扩增标记产物的5'端包含核酸条形码分子序列，3'端包括核酸条形码分子序列的互补序列；在所述恒温扩增程序下，使得所述核酸条形码分子上的引物与模板核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增标记产物，所述核酸扩增标记产物的5'端包含核酸条形码分子序列。
实施例1对大肠杆菌基因组DNA进行扩增和标记
连接在载体上的核酸条形码分子结构组成为【5'-PCRhandle-barcode-UMI-Universal sequence-3'】，5'端序列为PCR handle，文库扩增时给分子序列加上测序需要的P5接头，barcode和UMI为标记模板核酸序列的条形码序列和独特分子标识符，3'端Universal sequence为通用序列(5'-GTGAGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG-3')。本实施例中，实验者通过紫外光照的方式预先将连接在载体上的核酸条形码分子切割释放出来，并回收定量作为bulk实验测试的第二引物。
1、准备扩增反应底物
将LB液体培养基培养后的单克隆大肠杆菌取1mL，涡旋混匀，，10000g，4℃离心5min。离心完成后，弃900μL上清，加入900μLPBS缓冲液清洗细菌，并轻轻用枪头将细菌吹打混匀，再次10000g，4℃离心5min。重复上述清洗步骤2次，结束后弃900μL上清，加入900μLPBS缓冲液重新悬浮细菌，并轻轻用枪头将细菌吹打混匀。通过在显微镜下手动细胞计数测定细胞浓度，并稀释至合适浓度以进行单细胞裂解。按照表1所示配制微生物细胞裂解液，然后加入10μLPBS缓冲液清洗后的大肠杆菌悬浮液(细胞数量为1x10^4)，涡旋混匀，短暂离心后置于PCR仪上执行裂解程序。具体裂解反应程序如表2所示。裂解产物在进行下一步反应前在4℃保存，作为实验组A。
表1微生物裂解试剂配方
表2裂解程序
对照实验：向扩增反应体系中加入与上述样本上样量等量的无核酶水，作为对照试验组B。
2、执行扩增反应
按照表3所示在PCR管中配制扩增反应混合物，向两份配制好的扩增反应混合物中分别加入15μL上述实验组A和实验组B的样本，涡旋混匀并瞬时离心，将PCR管放入PCR仪中，执行表4所示的扩增反应程序。
表3扩增反应混合物体系
其中，N5G3 primer序列为
5'-GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG-3'，N5T3 primer序列为5'-GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT-3'。
表4扩增反应程序
3、扩增产物验证
扩增反应结束后，使用磁珠(Beckman，AMPure XP，A63881)对扩增产物进行1×XP磁珠纯化处理。使用DNA elutionbuffer进行洗脱。纯化完成后通过Qubit记录产物浓度。浓度检测结果如表5所示。
表5纯化后扩增反应的浓度
用无核酶水将纯化前的产物稀释到合适浓度，通过Qsep100全自动核酸蛋白分析系统检测扩增产物片段分布。片段分布检测结果如图4所示。其中图4-A是实验组A扩增产物的片段分布图，图4-B是实验组B扩增产物的片段分布图。
实施例2对单个大肠杆菌和枯草杆菌细胞基因组进行扩增和标记
本实施例利用液滴微流控装置将单个细胞封装在液滴内进行生物反应，实现微生物单细胞的高通量分离。
微流控装置的制备
为了制造微流体装置，将聚(二甲基硅氧烷)(道康宁，Sylgard 184)倾倒在使用UV光刻在硅晶片(UniversityWafer)上图案化的负光致抗蚀剂(MicroChem，SU-83025)上。将PDMS装置在烘箱中固化4小时，用金属刮刀萃取，并用0.7mm打孔器打孔以产生微流道入口和出口。使用氧等离子体清洁剂(HarrickPlasma)处理PDMS装置后将装置粘合到玻璃载片上，并在60℃下烘烤至少4h使得装置紧密键合在玻璃片上。用Aquapel(PPG Industries)处理通道，并在60℃下烘烤10分钟以使其疏水。
细胞悬液的制备
将LB液体培养基培养后的单克隆大肠杆菌及枯草芽孢杆菌各取500μL，1:1混匀，10000g，4℃离心5min。离心完成后，弃900μL上清，加入900μL PBS缓冲液清洗细菌，并轻轻用枪头将细菌吹打混匀，再次10000g，4℃离心5min。重复上述清洗步骤2次，结束后弃900μL上清，加入900μLPBS缓冲液重新悬浮细菌，并轻轻用枪头将细菌吹打混匀。通过在显微镜下手动细胞计数测定细胞浓度，并稀释至合适浓度以进行单细胞封装。细胞悬液在进行下一步反应前在4℃或者冰盒上保存。
单细胞的裂解
细胞悬浮液：将细胞计数后计算的细胞溶液体积转移至1.5mL离心管(生工生物)中，并在总的细胞悬液体积中加入15％的微生物悬浮液添加剂(optiprep)，涡旋混匀，得到细胞悬浮液。配制完成的细胞悬浮液在进行下一步反应前在4℃或者冰盒上保存。
细胞裂解液：按照表1所示的微生物裂解试剂配方，在1.5mL离心管中配制320μL细胞裂解液，涡旋混匀。配制完成的细胞裂解液在进行下一步反应前在4℃或者冰盒上保存。
微流体包封细胞与裂解液：将配制完成的细胞悬浮液、细胞裂解液和具有表面活性剂的HFE-7500氟化油(3M)装入单独的3mL注射器(BD)中，并分别以60、240、400μL/hr的流速注入微流体装置(图5)中。将乳液收集在提前放有约50μL矿物油的PCR管中，并通过移液枪去除乳液下部的氟化油，加入具有更高浓度的表面活性剂的HFE-7500氟化油，在4℃孵育5min后通过移液枪去除部分氟化油使得乳液和氟化油的总体积在50μL及以下。将PCR管放入PCR仪中，按照表2所示的裂解程序对细菌细胞进行裂解。裂解后的乳液在进行下一步反应前在4℃保存。
单细胞基因组DNA的扩增与标记
细胞裂解后乳液：去除PCR管中乳液顶部的矿物油以及乳液底部的氟化油，用移液枪和低吸附枪头将乳液小心转移至放有含表面活性剂的氟化油的3mL注射器中。
载体：4℃取出连接有多个核酸条形码分子的载体，用DNAbuffer清洗3次后，5000g离心1min，去除上清。使用注射器将载体转移至PE2管中备用。
扩增反应混合物：按照表6所示的MALBAC扩增反应混合物体系，在1.5mL离心管中配制120μL扩增反应混合物，涡旋混匀。配制完成的扩增反应混合物在进行下一步反应前在4℃或者冰盒上保存。
表6扩增反应混合物体系
其中，N5G3 primer序列为
5'-GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG-3'，N5T3 primer序列为5'-GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT-3'。
微流体包封细胞裂解物、载体和扩增反应混合物：将配制完成的扩增反应混合物、和具有表面活性剂的HFE-7500氟化油(3M)装入单独的3mL注射器(BD)中，在微流控装置(图6)中，首先形成油包封扩增反应混合物和至多一个载体的液滴，然后通过电极使得包含细胞裂解物的液滴与包封有载体和扩增反应混合物的液滴按照一定比例进行融合。将乳液收集在提前放有约50μL矿物油的PCR管中，并通过移液枪去除乳液下部的氟化油，加入具有更高浓度的表面活性剂的HFE-7500氟化油，在4℃孵育5min后通过移液枪去除部分氟化油使得乳液和氟化油的总体积在50μL及以下。将PCR管放入PCR仪中，按照表4所示的扩增程序对细胞裂解物进行扩增和条形码化标记。扩增后的乳液在进行下一步反应前在4℃保存。
实施例3对单个大肠杆菌和枯草芽孢杆菌基因组DNA进行文库构建和测序
单细胞基因组DNA扩增标记产物的回收与纯化
基因组扩增标记产物的回收：用移液枪小心去除PCR管(含有实施例2中扩增标记后的乳液)顶部的矿物油和底部的氟化油，然后向PCR管中加入100μL回收剂(含1％PFO的HFE-7500)，涡旋30s，掌上离心机离心1min，可明显看到液滴被打破，溶液被分为上层内容物和下层氟化油两层。用移液枪小心去除底部的氟化油，然后将上层内容物转移至带有滤芯的离心管中，10000xg离心5min，通过滤膜去除内容物中的载体，回收DNA产物。
基因组扩增标记产物的纯化：向上述回收的DNA产物中加入1X磁珠，涡旋混匀，室温孵育5min使DNA结合到磁珠上；瞬时离心后，置于磁力架上，静置3min左右使溶液变澄清后，小心移除上清；保持样品始终处于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇溶液漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清；重复漂洗步骤一次，共计两次；保持样品始终处于磁力架上，室温开盖干燥磁珠约3-5min；将样品从磁力架上取出，加入适量DNA elutionbuffer，涡旋振荡或使用移液枪充分吹打混匀，室温静置2min；将样品放回磁力架上静置3min待溶液澄清后，小心吸取上清至一个新的无核酸酶离心管中。使用Qubit仪定量纯化后的DNA浓度。使用Qsep100全自动核酸蛋白分析系统(Bioptic)定量纯化后MALBAC产物，如图7所示，条形码化标记的DNA片段具有约2000bp的平均长度。
回收后扩增标记产物的PCR富集
通过PCR反应在溶液中扩增以富集上述纯化后的条形码化的DNA产物，所述溶液包含1X KAPAHiFi高保真热启动DNA聚合酶预混液和0.8μM富集引物(5'-CTACACGACGCTCTTCCGATCT-3')。扩增程序为：98℃30s，6-8个循环98℃15s，60℃30s，72℃2min，之后在72℃下最后5min延伸，4℃保持。使用0.8X磁珠对上述PCR产物进行片段纯化以去除引物。使用Qubit仪定量纯化后的DNA浓度。使用Qsep100全自动核酸蛋白分析系统(Bioptic)定量PCR富集产物，如图8所示，富集后的条形码化标记DNA片段具有约2000bp的平均长度。
富集后扩增标记产物的片段化
根据制造商方案，使用TruePrep Tagment Enzyme(Vazyme,S601)对上述DNA分子进行片段化，以得到符合测序需求的DNA分子长度。
片段化后产物的文库标签扩增与测序
向片段化产物中分别加入0.4μM含有index标签的P5和P7扩增引物(P5:5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT[8nt i5 index]CTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'；P7:5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[8nt i7 index]GTCTCGTGGGCTCGG-3')和1X KAPAHiFi高保真热启动DNA聚合酶预混液以进行文库标签扩增得到有效文库分子。扩增程序为：72℃4min，98℃30s，8个循环98℃15s，60℃30s，72℃3min，之后在72℃下最后5min延伸，4℃保持。
使用0.8X磁珠对上述文库进行片段纯化以去除引物或引物二聚体。使用Qubit仪定量纯化后的DNA浓度。使用安捷伦2100生物分析仪和高灵敏度DNA芯片定量文库分子，如图9所示，文库DNA分子具有约364bp的平均长度。将文库送二代测序。
本实施例中从上机实验到建库送测所需总的时长为28.5小时，其中单细胞的高通量分离与裂解反应时长1.5h，扩增标记反应时长3h，建库时长24小时。
实施例4使用已有方法对单个大肠杆菌和枯草芽孢杆菌基因组DNA进行文库构建和测序
本实施例利用液滴微流控装置将单个细胞封装在液滴内进行生物反应，实现微生物单细胞的高通量分离与裂解、基因组扩增、基因组打断、打断产物的预扩增与标记。
本实施例使用已有方法对单个大肠杆菌和枯草芽孢杆菌基因组DNA进行文库构建和测序，一共需要4个步骤的液滴微流控操作。对比本专利发明方法，如实施例2和实施例3所述，仅需2个步骤的液滴微流控操作，即可实现对单细胞基因组DNA的文库构建和测序，简化实验操作步骤的同时减少了实验操作时间。
如图10所示，是本实施例中4个液滴微流控操作步骤用到的微流控装置图，其中A)是对单个大肠杆菌或枯草芽孢杆菌细胞进行单细胞包裹和裂解的微流控装置图，B)是将裂解后带有单细胞基因组的液滴与MDA反应混合液形成的液滴通过电极合并，进行单细胞全基因组扩增的微流控装置图，C)是将MDA扩增后的液滴与片段化反应混合液形成的液滴通过电极合并，进行基因组片段化的微流控装置图，D)是将片段化后液滴与载体和PCR扩增混合液形成的液滴通过电极合并，进行单细胞基因组条形码化标记的微流控装置图。
经过上述4个步骤的微流控操作后，将液滴打破回收反应产物，使用带有测序接头和分子标签的引物进行文库标签扩增，并进行文库纯化或分选以得到最终用于测序的文库分子。如图11是未经磁珠分选的文库分子的bioanalyzer2100分析图。图12是经磁珠分选后的文库分子的bioanalyzer2100分析图。
本实施例中从上机实验到建库送测所需总的时长为40.5小时，其中单细胞的高通量分离与裂解反应时长1.5h，扩增反应时长10h，片段化反应时长2h，条形码化标记时长3h，建库时长24小时。
综上所述，本发明提供的对核酸序列进行扩增和标记的方法(实施例1-3)与现有技术相比(实施例4)，能够实现在扩增的同时完成核酸序列的条形码化标记，在实验操作过程中不仅仅减少实验操作步骤，适于大规模的核酸测序，提高测序效率以及基因组的测序覆盖率，时间由40.5小时缩减为28.5小时，时间成本缩减了近30％；同时，一锅法的反应过程大大降低反应物交叉污染的风险，提高了测序的准确性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。
Claims (25)
1.一种核酸序列扩增和标记的方法，包括：
步骤1：将核酸序列、扩增反应混合物与载体共同分配至分区；
其中，扩增反应混合物包含核苷酸单体混合物、核酸聚合酶、和/或引物；载体包含与之连接的多个核酸条形码分子；
步骤2：将核酸条形码分子从载体上释放至分区内；
步骤3：在温控程序下对核酸序列进行扩增，并将核酸条形码分子附接至分区内核酸序列的扩增子序列上以进行核酸条形码化标记。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述扩增反应混合物包含：核苷酸单体混合物、核酸聚合酶和第一引物，第一引物包括通用序列和可变序列，核酸聚合酶可用于PCR反应且具有链置换活性；
所述核酸条形码分子的3'端包含所述通用序列作为扩增标记核酸序列的第二引物；
所述温控程序包括两段，在第一温度循环程序下，使得第一引物的可变序列与模板核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增产物1，其中核酸扩增产物的5'端包含所述通用序列，3'端包含所述通用序列的互补序列；在第二温度循环程序下，使得所述核酸条形码分子上的第二引物退火至核酸扩增产物的3'端并通过聚合酶进行延伸，得到扩大的核酸扩增产物2，其中扩大的核酸扩增产物2被所述核酸条形码分子的条形码序列所标记。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述扩增反应混合物包含核苷酸单体混合物和核酸聚合酶，核酸聚合酶具有链置换活性；
所述核酸条形码分子的3'端包含可变序列作为扩增标记核酸序列的引物；
所述温控程序选自温度循环程序和恒温扩增程序；
其中，在温度循环程序下，使得所述核酸条形码分子上的引物与模板核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增标记产物，其中核酸扩增标记产物的5'端包含核酸条形码分子序列，3'端包括核酸条形码分子序列的互补序列；
在所述恒温扩增程序下，使得所述核酸条形码分子上的引物与模板核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增标记产物，所述核酸扩增标记产物的5'端包含核酸条形码分子序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述分区内的核酸序列的扩增标记反应为一锅法反应，在所述分区内使反应物连续进行一步或多步反应。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述核酸序列作为扩增反应的底物，包括基因组脱氧核糖核酸，所述脱氧核糖核酸可选自以下一种或多种：质粒、经过降解得到的病毒的基因组、经过裂解得到的单细胞或多个细胞的全基因组、RNA逆转录得到的cDNA。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞选自真核生物细胞或微生物细胞。
7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述聚合酶选自BstDNA聚合酶(全长)、BstDNA聚合酶(大片段)、BstDNA2.0聚合酶、Bst3.0DNA聚合酶、Bst(exo-)DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、DeepVent(exo-)DNA聚合酶、DeepVentDNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、VentDNA聚合酶、KlenowFragmentDNA聚合酶Ⅰ中的一种或多种。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一引物和第二引物包含的通用序列是一段特定序列，其被选择使得基本上不会与模板核酸序列结合产生扩增。
9.根据权利要求2-3任一项所述的方法，其中所述可变序列选自(N)n、(N)nGGG和(N)nTTT中的至少一种，其中N为任意可与天然核酸进行碱基配对的随机核苷酸，n为选自3-17的正整数。
10.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述载体上连接有至少1000个核酸条形码分子，所述同一载体上的核酸条形码分子具有相同的碱基序列或者相同的包含非N的简并碱基符号的碱基序列作为条形码(barcode)序列，其中N为任意可与天然核酸进行碱基配对的随机核苷酸。
11.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述从载体上释放核酸条形码分子为切割载体与核酸条形码分子之间的连接，所述切割方式选自化学切割和光切割。
12.根据权利要求2所述的方法，其中所述连接在载体上的核酸条形码分子序列结构包括5'端用于构建测序文库的PCRhandle序列、条形码(barcode)序列、或独特分子标识符(UMI)序列、3'端用于扩增的通用序列，其中所述独特分子标识符(UMI)序列是可选的。
13.根据权利要求3所述的方法，其中所述连接在载体上的核酸条形码分子序列结构包括5'端用于构建测序文库的PCRhandle序列、条形码(barcode)序列、或独特分子标识符(UMI)序列、通用序列、3'端用于核酸序列扩增的可变序列，其中所述独特分子标识符(UMI)序列是可选的。
14.根据权利要求12-13任一项所述的方法，其中所述每个载体上连接有独特的barcode序列，其通过复制的方式使得扩增后的核酸序列上携带barcode信息，用于标记区分不同的模板核酸序列或者提供模板核酸序列的不同单细胞。
15.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述载体选自磁性载体、树脂材质的载体、凝胶载体中的一种或多种。
16.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述分区选自微孔板、凝胶载体、液滴中的一种或多种。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述分区包括将包含核酸序列的分区与包含载体和扩增反应混合物的分区按照一定比例组合而来的分区。
18.根据权利要求17所述的方法，对单细胞基因组进行扩增和标记，其中步骤1包括：
1)使用微流控装置将单个细胞与细胞裂解试剂封装液滴内，以得到包含有单个细胞基因组DNA的多个液滴；
2)使用微流控装置将包含单个细胞基因组DNA的多个液滴与包含扩增反应混合物和至多一个载体的多个液滴按照一定比例进行融合。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述微流控装置是液滴发生器。
20.根据权利要求19所述的方法，优选地，其中包含单个细胞基因组DNA的液滴与包含扩增反应混合物和至多一个载体的液滴的融合比例为1:1。
21.一种对核酸序列进行测序的方法，包括：
(1)对核酸序列进行扩增和标记；
(2)回收纯化核酸扩增和标记产物；
(3)对核酸扩增和标记产物进行文库构建和测序；
其中，使用权利要求1-20任一项所述的方法对核酸序列进行扩增和标记。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，步骤(2)后还包括对纯化后的核酸扩增和标记产物进行PCR富集的步骤。
23.根据权利要求22所述的方法，其中步骤(2)的纯化的方法选自磁珠纯化法、柱纯化法或切胶纯化法。
24.根据权利要求21所述的方法，所述文库构建过程可包括对核酸扩增和标记产物进行片段化反应的步骤。
25.根据权利要求24所述的方法，所述片段化反应为酶切法，所述酶切法采用的酶选自dsDNAFragmentase或转座酶。
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