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CN116648454A - 作为pH传感物的铕(III)络合物 - Google Patents

作为pH传感物的铕(III)络合物 Download PDF

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CN116648454A CN202180087659.3A CN202180087659A CN116648454A CN 116648454 A CN116648454 A CN 116648454A CN 202180087659 A CN202180087659 A CN 202180087659A CN 116648454 A CN116648454 A CN 116648454A
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J·弗拉德利
M·斯塔克
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Cisbio Bioassays SAS
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Abstract

本发明涉及一种式(I)化合物，其中R1、R2、R3和R4如说明书所定义。本发明还涉及铕(III)络合物，其获得自式(I)化合物，或获得自包含所述化合物的络合剂，并且涉及这种络合物用于标记有机或生物分子的用途。

Description

作为pH传感物的铕(III)络合物
技术领域
本发明基于一系列Eu(III)络合物，所述Eu(III)络合物包含基于结构4-O-烷基-3-N,N-二烷基-芳炔基吡啶(4-O-alkyl-3-N,N-dialkyl-arylethynylpyridine)的新发色团，在酸化过程中，在330至370nm范围内激发后，新发色团发光发射开启超过两个数量级。此类络合物可以用于监测活细胞中的酸化，或者任何产生pH修饰的化学-生物学事件。
背景技术
细胞内pH(pHi)是研究生物学现象的关键参数。事实上，细胞内pH在细胞、酶促和组织活动中起着许多重要作用，包括增殖和凋亡、多药耐药性、离子转运、胞吞作用和肌肉收缩。研究活细胞内的pH变化对于研究细胞内化通路也至关重要，例如给定受体的吞噬作用、内吞作用和配体内化作用。PHi的变化也影响神经系统，影响突触传递、神经元兴奋性、经由缝隙连接和信号级联的细胞-细胞耦合。异常的PHi值与不适当的细胞功能、生长和分裂有关，并且可见于一些类型的常见疾病，如癌症和阿尔茨海默氏病。在细胞生物学中，低区室内pH可以用于使蛋白质变性或激活酶和蛋白质功能，这些在约pH 7时会太慢。例如，溶酶体的酸性环境(pH 4.5至5.5)可以促进蛋白质的降解。因此，细胞功能障碍通常与细胞区室中的异常pH值有关。
因此，如果将被内化的物种(受体或底物)用发光pH敏感染料标记，所述染料的发射强度或寿命随pH变化，则可以实时跟踪内化和内体摄取的过程。在理想情况下，观察到的变化应该尽可能大；在极限情况下，这类似于“电灯开关”的概念，尽管该术语在文献中经常被误用，而且太多较小的发射强度变化被不适当地称为“开关”传感物(Chem.Rev.1997,97,1515和Chem.Rev.2010,110,2709)。
几十年来，学者和实业者开发了pH传感物以测量pHi。Roger Tsien于1982年介绍了一种荧光素衍生物来评估细胞质pH(Cell Biol.1982,95,189)。已经通过化学修饰荧光素进行了一些改进，以靶向细胞区室或提高在生物介质中的溶解度。然而，这些荧光素pH传感物衍生物会因产生单线态氧而发生光漂白，这也可能会破坏细胞(Am.J.Physiol.1989,256,F957)。
事实上，文献中报道的大多数pH传感物都涉及对常见荧光团(有机染料，如罗丹明、BODIPYTM和各种花青染料)的分子结构的调整，以调整pKa值并允许缀合。
事实上，pHrodoTM Green和pHrodoTM Red可以从Thermofisher公司购买。这些染料属于罗丹明家族，例如一些研究人员对骨架进行了一些修饰，以靶向一些生物学应用。因此，N,N’-三氟乙基罗丹明衍生物(RH-PEF)已经被用于监测抗体内化；其核心结构的pKa约为5.1，据报道强度增加在pH 7.4至5.0之间为58倍(Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,6085)。
Goryo Chemicals提供AcidiFluorTM ORANGE，其具有Rosamine骨架。AcidiFluorTMORANGE是一种荧光成像探针，可以显著增强酸性环境(如溶酶体、晚期核内体和颗粒)中的荧光。
CypHer5现在可以从GE(Amersham)购买，属于花青染料类。相关研究使用了荧光花青染料标记，并开发了一种检测方法来追踪HER-2受体的内化(ACS Chem.Biol.2014,9,2237)，Grover检查了用花青染料标记的GPCR，在pH 5至8之间给出了5倍的较小的强度增强(Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,4838)。
可以说，迄今为止报告的最有前途的方法是使用修改后的BODIPYTM核心，Nagano报告使用这些系统的转换因子高达300倍。在这里，pKa很容易通过苯胺取代基的变化进行调整，pKa在H<Me<Et序列中从3.8增加到6.0，因为孤对共轭越来越不受欢迎，并且共轭酸通过溶剂化作用的稳定性较差。此类系统用于检查乳腺癌组织样本，通过用BODIPYTM染料标记免疫治疗剂HerceptinTM(曲妥珠单抗)，使得HER-2抗体受体的内化能够在小鼠中通过显微镜进行跟踪(Nat.Med.2009,15,104)。
这些荧光有机染料(荧光素、罗丹明、rosamine、花青和BODIPYTM)既不提供显著的寿命调制，也不提供比例响应，并且具有与自发荧光和光漂白相关的固有缺点。因此，为了避免有机染料(荧光素、罗丹明、rosamine、BODIPYTM、花青等)的光漂白、自发荧光和小的斯托克斯位移，其他人已寻求使用发光镧系元素标记，并从其公认的优势(例如，大的斯托克斯位移、长发射寿命)中受益，有时与时间分辨光谱或显微镜方法相关。
Yuan报告监测了基于三联吡啶配体的修饰无环螯合物中红/绿Eu3+至Tb3+发射强度比例的变化，获得比例比变化为7倍的系统(Anal.Chim.Acta 2013,761,149)。由于该系统基于两种络合物(铕和铽)，因此难以使用化学工具并使实验过程复杂化。此外，这些络合物未被官能化，从而排除了任何生物缀合反应。
Papkovsky等人描述了一种基于喹诺酮敏化剂的发射性相当弱的Eu(III)DTPA络合物，其中614nm处的寿命和发射强度在pH 7.5至6.5之间变化了7倍(pKa 6.5，λexc370nm)，能够以进行一系列高通量测定监测细胞外酸化(Anal.Biochem.2009,390,21和US2002/0058793)。铕络合物设计用于仅监测由糖酵解事件诱导的细胞外pH变化。因此，该系统不能用于pHi测量。
Smith描述了能够实时监测溶酶体pH值的方法，使用共聚焦显微镜，基于Eu/Tb发射强度比的分析，从pH 4.6时的1.3变化为pH 6.5时的2.9(λexc 355nm)(Chem.Commun.2012,48,8520)。从工业的角度来看，该系统与一个共同配体的两种不同络合物(基于铕和铽)一起工作，这使得该系统有些复杂。与现有的有机染料pHi传感物相比，该系统的行为方式相反，因为荧光发射在中性pH时较高，在pH降低时会降低。从显微镜的角度来看，这是一个显著的缺点。
使用基于三氮杂环壬烷的动力学稳定的大环配体系统，McMahon(Chem.Commun.2013,49,5363)设计了Eu(III)络合物，能够基于发射寿命变化监测活细胞内质网的pH；在6.5至7.5的pH范围内观察到铕寿命发生了75％的变化。与Smith等人描述的相比，作者提高了络合物的亮度。然而，该系统不允许在铕中心周围的螯合部分发生任何变化，因为悬臂之一(磺胺部分)在pH传感物中是强制性的。此外，该络合物不是设计用于生物缀合的。最后，当pH从pH 4升高到pH8时，会发生铕络合物发射，这使得系统不太适合显微镜目的。
最近，Patra等人开发了一种发光pH敏感的溶酶体靶向铕探针(New J.Chem.2020,44,3570)。吸收波长为445nm，这与大多数市售可得的激发源不兼容(闪光灯激发在300和360nm之间，或激光在337nm)。此外，该络合物在pH 7时仍具有发射性，这对于生物学和显微镜应用而言是不期望的特性。同样，该镧系元素系统不允许发射探针与靶向载体或蛋白质缀合。
Takalo研究了芳基乙炔基吡啶络合物的光物理性质(Helv.Chim.Acta 1993,76,877)，Latva等人在一篇讨论铕螯合物性质的文章(J.Lumin.1997-75-149)中收集了结果。两篇文章都没有提到此类系统的荧光对pH敏感。
因此，强烈需要基于镧系元素的荧光pH敏感探针，其与生物介质相容，能够监测涉及pH变化的生物学事件。探针的激发应该可能在320至365nm之间，这些波长广泛用于读板器(闪光灯和激光)。
因此，发明人着手创建一个新的化合物家族，这些化合物在8至4的pH范围内显示出激发态寿命的100％变化，以及两个数量级的长寿命发射强度变化。到目前为止，这些期望的特性已被证明是不可能获得的。已经发现，为了在8到4的pH范围内获得这些期望的特性，进行质子化的发射物种的pKa需要在4.5至6.5之间。根据本发明，通过设计由芳基乙炔基吡啶基部分组成的发色团，可以实现该结果，其中芳基被双取代，一个取代基为4-O-烷基，第二个取代基为3-N,N-二烷基胺部分(例如3-N,N-二烷基苯胺)。当掺入大环化合物如三氮杂环壬烷(TACN)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或相关螯合物系统时，这种发色团能够与铕(III)形成动力学稳定的络合物。
发明内容
本发明涉及一种式(I)化合物：
其中R1、R2、R3和R4在以下详细描述中限定。
本发明还涉及一种式(II)或(III)的络合剂：
其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re、Chrom1、Chrom2和Chrom3在以下详细描述中限定。
本发明还涉及一种铕络合物，其包含式(I)化合物或式(II)或(III)的络合剂和铕(III)离子。
本发明进一步涉及一种缀合物，其通过铕络合物与目标分子之间的反应获得。
附图说明
图1、图4、图7、图10、图13、图16、图19、图22和图25描述了络合物14、18、21、78a、78b、88a、88b、93和104从pH 4到10的吸收光谱。
图2、图5、图8、图11、图14、图17、图20、图23和图26描述了络合物14、18、21、78a、78b、88a、88b、93和104从pH 4到10的发射光谱。
图3、图6、图9、图12、图15、图18、图21、图24和图27描述了发射寿命随pH的变化，从而能够确定络合物14、18、21、78a、78b、88a、88b、93和104的pKa值。
图28(顶部)显示了在不同pH值(295K)下用不同时间延迟(红色＝60μs，橙色＝460μs，紫色＝1000μs)测量的络合物18的发射强度。数据在pH 4下被归一化为60μs延迟。
图28(底部)显示了在不同pH值下用不同时间窗(红色＝60-460μs，橙色＝1000-2000μs，紫色＝1500-2500μs)测量的络合物18的发射强度。数据在pH 4下被归一化为60-460μs时间窗。在NH4CH3CO2(pH 4和5)、MES(pH 5.5、6和6.5)、HEPES(pH 7)和NH4HCO3(pH 8)缓冲液(均为在0.1M NaCl中0.1M)进行测量。
图29显示了本发明络合物和对比络合物的620nm荧光强度随pH的变化。
具体实施方式
在一个方面，本发明涉及一种式(I)化合物：
其中：
R1为–CO2H、-PO(OH)R5或–CH2N(CH2CO2H)2；
R2为–CH2OH、-CH2OSO2CH3、Br、Cl或–CH2N(CH2CO2H)2；
R3为任选地被基团–L1-E或基团G取代的(C1-C6)烷基；
R4为–(CH2)m-NR6R7；
R5为(C1-C4)烷基，优选甲基；任选地被基团–SO3 -取代的苯基，所述基团–SO3 -优选在间位或对位；或苄基；
R6为H或(C1-C4)烷基；
R7为任选地被基团–L1-E取代的(C1-C6)烷基；
或者R6和R7与它们连接的氮原子一起形成哌啶、吗啉或哌嗪，所述哌嗪任选地被叔丁氧基羰基N-保护或任选地被R8 N-取代；
R8为任选地被基团–L1-E取代的(C1-C6)烷基；
L1为键、–CONH-(CH2)n-或–NHCO-(CH2)n-；
E为-SO3H、-SO2(OCH2CF3)、-N+Alk1Alk2Alk3、碳水化合物残基或磺基-甜菜碱；
G为任选地以酯的形式受保护的羧基(例如基团–CO2Me或-CO2 tBu)、任选地被叔丁氧基羰基保护的氨基、琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰氨基、肼基、异硫氰酸酯基或马来酰亚胺基；
Alk1、Alk2和Alk3各自独立地表示(C1-C6)烷基，优选(C1-C4)烷基；
m为0、1、2或3；
n为0、1、2或3。
在本公开的情况下，碳水化合物残基被理解为是指环状或直链形式的葡萄糖残基，或式–(CHOH)k-CH2OH基团，其中k为3至12的整数，优选k为3或4。
在本公开的情况下，磺基-甜菜碱被理解为是指具有下式之一的基团：
其中R表示(C1-C6)烷基，优选甲基或乙基，t为1至6的整数，优选t为1或2。在一个实施方案中，磺基-甜菜碱为式–(CH2)2N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 -基团。
在本公开的情况下，-SO3H、-CO2H和-PO(OH)2基团处于或不处于去质子化形式，取决于pH。因此，这些基团在以下描述和所附权利要求中也分别指基团-SO3 -、-CO2 -和-PO(OH)O-，反之亦然。
在本公开的情况下，本文描述的实施方案可以组合。
在一个实施方案中，R1为–CO2H或-PO(OH)R5，其中R5为(C1-C4)烷基，优选甲基，R2为–CH2OH或-CH2OSO2CH3。在另一个实施方案中，R1和R2各自为–CH2N(CH2COOH)2。
在一个实施方案中，R3为任选地被基团–L1-E或基团G取代的(C1-C4)烷基。
在一个实施方案中，R4为–NR6R7，其中R6和R7各自独立地为(C1-C4)烷基，或者R6和R7与它们连接的氮原子一起形成哌嗪，所述哌嗪任选地被叔丁氧基羰基N-保护或任选地被基团R8 N-取代。
在一个实施方案中，R8为任选地被基团–L1-E取代的(C1-C4)烷基。
在一个实施方案中，L1为键或–CONH-(CH2)n-。
在一个实施方案中，E为-SO3H或-SO2(OCH2CF3)。
在一个实施方案中，G为任选地以酯的形式受保护的羧基(例如基团–CO2Me或-CO2 tBu)或任选地被叔丁氧基羰基保护的氨基。
在一个实施方案中，m为0。在另一个实施方案中，m为1。在另一个实施方案中，m为2。在另一个实施方案中，m为3。
在一个实施方案中，n为0。在另一个实施方案中，n为1。在另一个实施方案中，n为2。在另一个实施方案中，n为3。
在另一个方面，本发明涉及一种式(II)或(III)的络合剂：
其中：
Ra不存在或为–CH2NH2；
Rb、Rc、Rd和Re中的一个(且仅一个)为式(IV)基团，其他各自独立地选自–CH2COORf和-CH2PO(OH)Rg；
Rf为H、(C1-C4)烷基、-NHCH(Rh)-(C1-C4)烷基或-NHCH(Rh)-C(O)ORj；
Rg为(C1-C4)烷基；
Rh为(C1-C4)烷基或苯基；
Rj为H或(C1-C4)烷基；
Chrom1、Chrom2和Chrom3各自独立地选自式(IV)基团和式(V)基团：
其中：
每个R1为–CO2H或-PO(OH)R5；
R3为任选地被基团–L1-E或基团G取代的(C1-C6)烷基；
R4为–(CH2)m-NR6R7；
R5为(C1-C4)烷基，优选甲基；任选地被基团–SO3 -取代的苯基，所述基团–SO3 -优选在间位或对位；或苄基；
R6为H或(C1-C4)烷基；
R7为任选地被基团–L1-E取代的(C1-C6)烷基；
或者R6和R7与它们连接的氮原子一起形成哌啶、吗啉或哌嗪，所述哌嗪任选地被叔丁氧基羰基N-保护或任选地被基团R8 N-取代；
R8为任选地被基团–L1-E取代的(C1-C6)烷基；
R9为任选地被基团–L1-E或基团G取代的(C1-C6)烷基；
L1为键、–CONH-(CH2)n-或–NHCO-(CH2)n；
E为-SO3H、-SO2(OCH2CF3)、-N+Alk1Alk2Alk3、碳水化合物残基或磺基-甜菜碱；
G为任选地以酯的形式受保护的羧基(例如基团–CO2Me或-CO2 tBu)、任选地被叔丁氧基羰基保护的氨基、琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰氨基、肼基、异硫氰酸酯基、或马来酰亚胺基；
Alk1、Alk2和Alk3各自独立地表示(C1-C6)烷基，优选(C1-C4)烷基；
m为0、1、2或3；
n为0、1、2或3；
条件是式(II)化合物包含至少一个式(IV)基团。
优选的络合剂族包括式(II)化合物。另一个优选的化合物族包括式(III)化合物。
在一个实施方案中，式(II)络合剂仅包含一个式(IV)基团，即，Chrom1、Chrom2和Chrom3中的一个为式(IV)基团，另外两个为式(V)基团，可以是相同的或不同的，优选相同的。
在一个实施方案中，式(II)络合剂包含两个式(IV)基团，即，Chrom1、Chrom2和Chrom3中的两个为式(IV)基团，可以是相同的或不同的，优选相同的，另外一个为式(V)基团。
在一个实施方案中，式(II)络合剂包含三个式(IV)基团，即，Chrom1、Chrom2和Chrom3各自为式(IV)基团，可以是相同的或不同的，优选相同的。
在一个实施方案中，每个R1为-PO(OH)R5，其中R5为(C1-C4)烷基，优选甲基。
在一个实施方案中，R3为任选地被基团–L1-E或基团G取代的(C1-C4)烷基。
在一个实施方案中，R4为–NR6R7，其中R6和R7各自独立地为(C1-C4)烷基，或者R6和R7与它们连接的氮原子一起形成哌嗪，所述哌嗪任选地被叔丁氧基羰基N-保护或任选地被基团R8 N-取代。
在一个实施方案中，R8为任选地被基团–L1-E取代的(C1-C4)烷基。
在一个实施方案中，L1为键或–CONH-(CH2)n-。
在一个实施方案中，E为-SO3H或-SO2(OCH2CF3)。
在一个实施方案中，G为任选地以酯的形式受保护的羧基(例如基团–CO2Me或-CO2 tBu)或任选地被叔丁氧基羰基保护的氨基。
在一个实施方案中，m为0。在另一个实施方案中，m为1；在另一个实施方案中，m为2。在另一个实施方案中，m为3。
在一个实施方案中，n为0。在另一个实施方案中，n为1；在另一个实施方案中，n为2。在另一个实施方案中，n为3。
在另一个方面，本发明涉及一种铕络合物，其包含铕(III)离子(Eu3+)和式(I)化合物，其中R1和R2各自为–CH2N(CH2COOH)2。
在另一个方面，本发明涉及一种铕络合物，其包含铕(III)离子和如本文所公开的式(II)或(III)化合物。
可以通过使本文公开的本发明的式(I)、(II)或(III)化合物与铕盐接触来制备本发明的铕络合物。通常，将1当量的化合物与1至5当量的铕盐(例如氯盐、乙酸盐或三氟甲磺酸盐)在溶剂(乙腈、甲醇或其他与这些盐相容的溶剂)或缓冲液的水溶液中在室温下反应几分钟，以生成相应的络合物。
本发明的代表性铕络合物具有以下结构：
本发明的另一个代表性铕络合物具有以下结构：
其中Z为：
包含基团G的本文公开的式(I)、(II)和(III)化合物(及其相应的铕络合物)特别适用于标记有机或生物分子，所述有机或生物分子包含能够与反应性基团反应以形成共价键的官能团。
因此，在一个方面，本发明涉及缀合物，所述缀合物通过(i)本文公开的铕络合物，所述络合物具有基团G，和(ii)目标分子的反应获得。任何目标有机或生物分子都可以与本文公开的铕络合物缀合，只要它具有能够与络合物所带的基团G反应的官能团。
在一个实施方案中，目标分子选自：氨基酸、肽、蛋白质、抗体、糖、碳水化合物链、核苷、核苷酸(DNA、RNA)、寡核苷酸和酶底物，尤其是自杀酶底物，如苄基鸟嘌呤或苄基胞嘧啶(以名称Snaptag和Cliptag销售的酶底物)、氯代烷(以名称Halotag销售的酶底物)或辅酶A(以名称ACPtag或MCPtag销售的酶底物)。
当进行质子化时，本发明的铕络合物显示出4.5至6.5的pKa值。通常，当一个分子具有多个质子化位点时，每个质子化位点都显示一个pKa值。出人意料地发现，本发明的络合物仅显示一个可观察到的pKa值，与固定在络合物上的发色团(即，式(I)、(IV)或(V)化合物)的数量无关。
本发明的铕络合物还可以在位点上与目标分子生物缀合，所述位点不扰乱介质pH变化时的荧光强度。本发明的铕络合物具有优异的发射亮度，这非常适合检测低浓度的生物事件。
如上所述，本发明的铕络合物可以包含1至3个发色团，并且可以被官能化，以允许引入水溶性部分和用于生物缀合的官能团。根据期望的络合物，可以选择相应的合成途径(方案1至3)。对于具有1个发色团、2个发色团或3个不相同发色团的络合物，有两种可能的选择，它们在方案1至2中进行了描述，并在实验部分进行了更详细的举例说明。对于具有3个相同发色团的络合物，合成在方案3中进行了描述。
例如，根据络合物所期望的发色团数量，将三氮杂环壬烷用发色团或吡啶部分烷基化。在Boc基团脱保护后，将最后一个发色团或吡啶部分引入二发色团或二吡啶基烷基化的大环化合物上。将次膦酸乙酯官能团水解，通过加入氯化铕(III)形成铕络合物。任选地并且如果适当的话，可以将络合物用磺酸根部分官能化以允许更好的水溶性，和用与蛋白质、抗体、肽和酶促底物缀合的官能团官能化。
具有1、2和3个发色团的络合物的一般合成方案(选项1)
方案1
具有1和2个发色团的络合物的一般合成方案(选项2)
方案2
具有3个相同发色团的络合物的一般合成方案
方案3
无环络合物的一般合成
先前已经描述了骨架合成(Helvetica Chimica Acta,1993,76,877)。该合成补充了在三键的间位引入N,N-二烷基部分和在对位引入O-烷基。方案4给出了一个示例。
方案4
基于DOTA大环化合物的络合物的一般合成
为了强调本发明的一般特征，已使用别处描述的经典合成策略将发色团引入DOTA系统(WO 2006/120444,WO 2009/010580,WO 2010/084090,Acc.Chem.Res2009,42,925)。方案5描述了所使用的策略，获得相应的带有一个发色团的铕络合物。
方案5
下面示意性地描述用于制备本文公开的络合剂和相应的铕络合物的其他途径，并且在实施例中对其进行进一步说明。
非官能化的发色团合成
方案6
将市售可得的化合物1还原成相应的苯胺，将所述苯胺在碘乙烷的存在下烷基化48小时。通过使用两个薗头反应获得化合物7来获得发色团骨架。将所得的醇转化为相应的甲磺酸酯8，并用于随后的大环烷基化。
具有1个发色团的非官能化的络合物合成
方案7
方案7描述了具有一个发色团的铕络合物的合成。将三氮杂环壬烷9用甲磺酸吡啶10烷基化。将第三个氮原子用TFA脱保护，用发色团8烷基化。将次膦酸乙酯水解，将大环化合物与铕络合，获得铕(III)络合物14。
具有2个发色团的非官能化的络合物合成
方案8
为了获得具有两个发色团的络合物，例如铕络合物18，所应用的策略与之前的策略相同，但颠倒了引入吡啶衍生物(化合物8和10)的顺序，如方案8所示。
具有3个发色团的非官能化的络合物合成
方案9
使用未受保护的三氮杂环壬烷19和发色团8合成具有3个发色团的络合物，获得相应的铕络合物21。
乙酯官能化的发色团合成
方案10
为了使发色团8官能化，将甲氧基的甲基用具有酯部分的脂肪链取代，以随后引入磺酸根或其他亲水官能团。因此，将溴硝基苯酚22烷基化，随后将硝基还原，然后用碘乙烷烷基化。进行两次薗头反应获得发色团，将其活化为甲磺酸酯衍生物30。
NHBoc官能化的发色团合成
方案11
将发色团用经典氨基甲酸酯(Boc基团)形式的受保护的胺进行官能化，而不是用乙酯形式的受保护的羧酸进行官能化。合成途径与之前使用N-Boc保护的溴丙胺的途径相同(方案11)。
乙酯官能化的发色团合成
方案12
通过选择烷基化试剂和苯胺衍生物的摩尔比来控制苯胺的烷基化。因此，将化合物36用碘乙烷进行单烷基化。将所得的仲苯胺使用还原胺化进行甲基化。合成的最后步骤与上述相同。
发色团上的环胺系统的合成
方案13
将苯胺衍生物转化为环胺(哌啶、哌嗪、吗啉)。在化合物46a-d的情况下，仲胺可用于连接可溶性部分或可用作生物缀合点。
N,N-烷基丙基磺酸酯前体发色团的合成
方案14
将苯胺的一侧用带有末端保护的磺酸酯的烷基链取代，另一侧用烷基链取代。因此，使用与先前方案相同的方法制备相应的发色团，但使用被作为保护基的三氟乙基部分取代的相应溴丙基磺酸酯。在方案14中描述了合成方案。
NHBoc官能化的吡啶合成
方案15
甲酯官能化的吡啶合成
方案16
由吡啶6合成化合物60和63。使用Heck反应进行第一个C-C键形成反应。将所得的双键以经典方式氢化。将醇官能团活化，获得相应的甲磺酸酯衍生物60和63(方案15、16)。
具有一个发色团的官能化的络合物的合成
方案17
方案17描述了掺入一个发色团的络合物65的合成。
具有一个发色团的官能化的络合物的合成
方案18
方案18描述了络合物71的合成。将磺酸根部分在合成结束时引入到吡啶杂环上。
具有一个发色团的官能化的络合物的合成
方案19
方案19阐明了络合物的合成，所述络合物可以通过仲胺上的哌嗪基部分进行官能化(化合物73b)。
具有两个发色团的官能化的络合物的合成
方案20
方案20描述了两种具有两个发色团的络合物的合成。每种络合物的pKa由取代氮原子的烷基的性质调整。合成开始于三氮杂环壬烷与甲磺酸酯发色团的烷基化。Boc基团脱保护后进行第三次烷基化，获得化合物76a-b。次膦酸盐的水解和铕络合获得络合物77a-b，将其用高牛磺酸处理以获得期望的水溶性铕(III)络合物。
具有两个发色团的官能化的络合物的合成
方案21
方案21描述了具有哌嗪基部分的络合物84的合成。它遵循与之前描述的策略相同的策略。将市售可得的二保护三氮杂环壬烷79单烷基化。在三氟乙酸的存在下进行两个Boc基团的脱保护。在此阶段引入发色团，然后水解次膦酸酯官能团，在加入氯化铕后形成铕络合物。将仲胺与丙磺内酯反应获得期望的络合物84。
具有两个发色团的官能化的络合物的合成
方案22
如前所述，将磺酸酯基团引入到苯胺官能团的烷基之一的末端部分。合成遵循使用发色团57a-b的相同策略：大环的烷基化、Boc基团的脱保护、引入最后的吡啶衍生物、次膦酸酯的水解和与铕的络合。此外，最终的碱性次膦酸酯水解能够使三氟乙基保护基脱保护，获得游离的磺酸根官能团部分(方案22)。
具有三个发色团的官能化的络合物的合成
方案23
如方案23所述制备具有三个发色团的络合物。合成途径基于与之前描述的相同的策略，获得络合物91。
方案24
方案24显示了使用与前面所述相同的策略制备不对称络合物93，所述络合物93具有两个相同的发色团(N,N-乙基丙基磺酸根)，第三个发色团为具有N,N-二乙基苯胺基团的部分。该络合物可以用于后续的生物缀合。
具有三个发色团的官能化的络合物的合成
方案25
获得具有三个发色团的络合物的另一种方法是使用具有侧臂亚甲基NHBoc的三氮杂环壬烷，先前在US9,981,967中公开。该合成简单，能够获得期望的具有三个相同发色团的络合物98。
具有两个发色团的生物缀合的络合物的合成
方案26
方案26阐明了铕络合物78a-b与苄基鸟嘌呤甲基苯甲酰胺NHS酯(BG-MB-NHS，一种熟知的酶底物(WO 2010/034931))的缀合，获得苄基鸟嘌呤络合物100a-b，或者铕络合物78a-b与马来酰亚胺的缀合，获得络合物101a-b，其可以用于抗体或蛋白质标记。
无环络合物的合成
方案27
该方案显示了无环化合物的合成。Takalo(同上)先前已经描述了吡啶乙炔基芳基衍生物的合成。使用合适的结构单元以获得铕螯合物，所述铕螯合物被官能化以允许生物缀合。以类似的方式制备相应的马来酰亚胺和苄基鸟嘌呤衍生物105和106。
实验部分
在实验部分中使用以下缩写。
9-N3 1,4,7-三氮杂环壬烷
app. 显而易见的
BG 苄基鸟嘌呤
Boc 叔丁氧基羰基
br 宽峰(NMR)
BSA 牛血清白蛋白
CPL 圆偏振光
d 天(反应时间)
d 二重峰(NMR)
DCM 二氯甲烷
dd 双二重峰(NMR)
ddq 四重峰的双二重峰(doublet of doublet of quartets)(NMR)
DIPEA 二异丙基乙胺
dm 多重峰的二重峰(doublet of multiplets)(NMR)
DMF 二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
dppf 1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁
EDTA 乙二胺四乙酸
ESI 电喷雾电离
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
equiv. 当量
FA 甲酸
GPCR G蛋白偶联受体
h 小时(反应时间)
HATU (1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐
HEPES 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸
HRMS 高分辨率质谱
ICP-MS 电感耦合等离子体质谱
ICT 分子内电荷转移
LRMS 低分辨率质谱
Ln 镧系元素
LTG LysoTracker Green
m 多重峰(NMR)
MeOH 甲醇
MES 2-(N-吗啉基)乙磺酸
M.p. 熔点
MS 质谱
NMR 核磁共振
PBS 磷酸盐缓冲液
PDA 光电二极管阵列
Pd/C 钯碳
Pd(dppf)Cl2 [1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)
q 四重峰(NMR)
quant. 定量
RT 室温
s 单峰(NMR)
Sn 第n个单重态(能级)
t 三重峰(NMR)
TEEAc 三乙胺
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TLC 薄层色谱法
TMS 三甲基甲硅烷基
UV 紫外线
Vis 可见光
化合物2
将4-碘-1-甲氧基-2-硝基苯1(1.00g,3.58mmol)、冰醋酸(5mL,87mmol)和MeOH(5mL)在氩气下合并。加入铁粉(1.02g，18.3mmol)，将混合物加热至50℃持续1小时。过滤混合物，减压去除溶剂。将所得的残余物溶解于CH2Cl2(100mL)，加入NaOH水溶液(25mL，2M)；过滤去除所得的沉淀物。将水层分离，用CH2Cl2(5×15mL)萃取。将有机层合并，经MgSO4干燥，减压去除溶剂，获得浅棕色固体2(674mg，76％)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ7.00(dd,3JH-H＝8.3,4JH-H＝2.2,1H),6.98(d,4JH-H＝2.2,1H),6.51(d,3JH-H＝8.3,1H),3.81(s,3H)；13C-NMR(176MHz,CDCl3)δ147.2,138.0,126.9,123.0,112.3,83.4,55.6；ESI-LRMS(+)m/z 250[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C7H9NO127I]+计算249.9729,实测249.9750；m.p.90℃。
化合物3
在氩气下，将化合物2(2.83g,11.4mmol)、碘乙烷(7mL,87mmol)和K2CO3(6.3g,45.6mmol)在无水CH3CN(15mL)中合并。将反应混合物加热至60℃持续48小时。此后，减压去除溶剂，将残余物溶解在CH2Cl2(30mL)中，用水(5×20mL)洗涤，经K2CO3干燥。减压去除溶剂获得淡橙色油状物(2.16g，62％)；1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ7.24(dd,3JH-H＝8.5,4JH-H＝1.9,1H),7.15(d,4JH-H＝1.9,1H),6.58(d,3JH-H＝8.5,1H),3.81(s,3H),3.12(q,3JH-H＝7.1,4H),1.02(t,3JH-H＝7.1,6H)；13C-NMR(151MHz,CDCl3)δ153.5,141.0,131.0,130.0,113.4,83.0,55.4,45.9,11.9；ESI-LRMS(+)m/z 306[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C11H17NO127I]+计算306.0355,实测306.0363。
化合物4
在氩气下，将化合物3(548mg,1.80mmol)、三甲基甲硅烷基乙炔(0.5mL,3.6mmol)、Pd(dppf)Cl2、DCM(150mg,0.184mmol)和吡咯烷(0.45mL,5.4mmol)在无水THF(3mL)中合并。将反应混合物加热至50℃持续19小时，然后减压去除溶剂。将所得的残余物溶解在CH2Cl2(30mL)中，用H2O(4×30mL)洗涤，经K2CO3干燥。减压去除溶剂获得粗产物，将其通过柱色谱法纯化(SiO2，100％己烷至6％EtOAc的己烷溶液)，获得淡橙色油状物(323mg，65％)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ7.12(d,3JH-H＝8.5,1H),7.03(s,1H),6.75(d,3JH-H＝8.5,1H),3.85(s,3H),3.14(q,3JH-H＝7.1,4H),1.01(t,3JH-H＝7.1,6H),0.24(s,9H)；13C-NMR(176MHz,CDCl3)δ154.5,139.1,127.2,125.3,115.1,111.2,105.9,91.9,55.6,46.1,12.1,0.3；29Si-NMR(139MHz,CDCl3)δ-18.3；ESI-LRMS(+)m/z 276[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C16H26NOSi]+计算276.1784,实测276.1790；Rf＝0.40(SiO2,10％EtOAc的己烷溶液)。
化合物5
在氩气下，将三乙胺三氢氟酸(0.75mL,3.28mmol)加入到化合物4(115mg,0.306mmol)的无水THF(3mL)溶液中。将溶液加热至30℃持续37小时，然后减压去除溶剂。将所得的油状物溶解在CH2Cl2(30mL)中，用水(3×40mL)洗涤。将合并的水层用CH2Cl2(5×40mL)萃取，将有机层合并，经K2CO3干燥。减压去除溶剂获得淡橙色油状物(81mg,87％)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ7.14(dd,3JH-H＝8.4,4JH-H＝2.0,1H),7.06(d,4JH-H＝2.0,1H),6.78(d,3JH-H＝8.4,1H),3.86(s,3H),3.15(q,3JH-H＝7.1,4H),2.98(s,1H),1.02(t,3JH-H＝7.1,6H)；13C-NMR(176MHz,CDCl3)δ154.6,139.2,127.1,125.3,113.9,111.3,84.4,75.3,55.7,46.1,12.1；ESI-LRMS(+)m/z 204[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C13H18NO]+计算204.1388,实测204.1401。
化合物6
按照US 2015/361116中描述的程序，从2-溴-6-甲基吡啶分九步合成化合物6。
化合物7
在氩气下，向化合物5(120mg，0.59mmol)和化合物6(175mg，0.60mmol)的无水THF(2.5mL)溶液中加入吡咯烷(0.1mL，1.22mmol)和Pd(dppf)Cl2.DCM(60mg，0.073mmol)。将反应混合物加热至50℃持续18小时，然后减压去除溶剂，将所得的残余物溶解在CH2Cl2(40mL)中，用水(3×40mL)洗涤。将有机层经K2CO3干燥，减压去除溶剂获得棕色残余物。将该粗残余物通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟,tr＝10.7min)纯化，获得淡黄色油状物(118mg,48％)；1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ8.03(d,3JH-P＝6.0,1H),7.49(s,1H),7.18(d,3JH-H＝8.5,1H),7.09(s,1H),6.82(d,3JH-H＝8.5,1H),4.80(s,2H),4.14–3.82(m,2H),3.87(s,3H),3.16(q,3JH-H＝6.9,4H),1.77(d,2JH-P＝15,3H),1.26(t,3JH-H＝7.0,3H),1.03(t,3JH-H＝6.9,6H)；13C-NMR(151MHz,CDCl3)δ160.8(d,3JC-P＝19),155.2,153.2(d,1JC-P＝155),139.5,133.3(d,3JC-P＝11),128.3(d,2JC-P＝22),127.2,125.0,124.1(d,4JC-P＝3),113.5,111.5,97.0,84.9,64.2,61.3(d,2JC-P＝6),55.7,46.0,16.5(d,3JC-P＝6),13.6(d,1JC-P＝105),12.0；31P{1H}-NMR(243MHz,CDCl3)δ+39.4；ESI-LRMS(+)m/z 417[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C22H30N2O4P]+计算417.1943,实测417.1954。
化合物8
在氩气下，将化合物7(67mg，0.161mmol)、甲磺酸酐(56mg，0.322mmol)和DIPEA(0.07mL，0.402mmol)在无水THF(1.5mL)中合并，在室温下搅拌90分钟。此后，减压去除溶剂。向所得的残余物中加入CH2Cl2(30mL)和H2O(30mL)。将有机层分离，用H2O(2×30mL)洗涤，将合并的水层用CH2Cl2(1×30mL)萃取。将合并的有机层经K2CO3干燥，减压去除溶剂获得淡橙色油状物，其不进行进一步纯化直接用于下一步(69mg，87％)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.09(dd,3JH-P＝6.0,4JH-H＝1.5,1H),7.64–7.62(m,1H),7.19(dd,3JH-H＝8.5,4JH-H＝2.1,1H),7.10(d,4JH-H＝2.1,1H),6.84(d,3JH-H＝8.5,1H),5.36(s,2H),4.19–3.81(m,5H),3.17(q,3JH-H＝7.1,4H),3.13(s,3H),1.77(d,2JH-P＝15,3H),1.27(t,3JH-H＝7.0,3H),1.04(t,3JH-H＝7.1,6H)；ESI-LRMS(+)m/z 495[M+H]+。
按照WO 2014/111661中描述的过程，分三步合成化合物9。
化合物10
按照Inorg.Chem.,2012,51,8042中描述的过程，从2-溴-6-甲基吡啶分五步合成化合物10。
化合物11
在氩气下，将1-(叔丁氧基羰基)-1,4,7-三氮杂环壬烷的二盐酸盐9(28mg,0.0926mmol)、化合物10(64mg,0.218mmol)和K2CO3(40mg,0.289mmol)在无水CH3CN(2mL)中合并，加热至65℃持续18小时。此后，将溶液与无机盐分离，通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟,tr＝11.8min)纯化，获得淡黄色油状物(33mg,57％)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ7.92–7.88(m,2H),7.78–7.72(m,2H),7.62(d,3JH-H＝7.9,1H),7.55(d,3JH-H＝7.9,1H),4.11–4.03&3.87–3.79(m,4H),3.95–3.90m,4H),3.40–3.29(m,4H),3.11–2.96(m,4H),2.72–2.59(m,4H),1.75(d,2JH-P＝15,3H),1.74(d,2JH-P＝15,3H),1.44(s,9H),1.25–1.21(2×t,3JH-H＝7.1,6H)；13C-NMR(176MHz,CDCl3)δ161.3(br s),155.7,153.9(d,1JC-P＝160),153.7(d,1JC-P＝160),136.5(d,3JC-P＝10),136.4(d,3JC-P＝10),125.9(2×d,2JC-P＝20),125.5,125.3,79.5,63.4,63.1,61.0(2×d,2JC-P＝6),56.4),55.3,54.8,54.2,50.1,49.7,28.7,16.6,16.5,13.5(d,1JC-P＝104),13.4(d,1JC-P＝104)；31P{1H}-NMR(162MHz,CDCl3)δ+40.3,+40.2；ESI-LRMS(+)m/z 624[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C29H48N5O6P2]+计算624.3080,实测624.3105。
化合物12
制备化合物11(33mg,0.053mmol)在三氟乙酸和CH2Cl2(20％v/v,总共4mL)中的溶液。将溶液在室温下搅拌25分钟，然后减压去除溶剂，获得橙色残余物。向该残余物中加入CH2Cl2(30mL)，然后再次减压去除溶剂。将该过程重复五次，获得淡橙色油状物(28mg,定量)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ7.84–7.79(m,4H),7.48–7.43(m,2H),4.30(s,4H),4.14–3.87(m,4H),3.57–3.38(m,8H),3.30–3.17(m,4H),1.73(d,2JH-P＝15,6H),1.28(t,3JH-H＝7.0,6H)；13C-NMR(176MHz,CDCl3)δ156.8(d,3JC-P＝20),153.2(d,1JC-P＝160),137.6(d,3JC-P＝10),126.2(d,2JC-P＝21),62.0(d,2JC-P＝6),59.9,51.6,49.4,44.5(2×s),16.3(d,3JC-P＝6),13.6(d,1JC-P＝102)；31P{1H}-NMR(162MHz,CDCl3)δ+40.8,+40.7；ESI-LRMS(+)m/z 524[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C24H40N5O4P2]+计算524.2556,实测524.2563。
化合物13
在氩气下，将化合物12(8.5mg,16.2μmol)、化合物8(16mg,32.4μmol)和K2CO3(5mg,35.4μmol)在无水CH3CN(1mL)中合并，加热至60℃持续18小时。此后，通过过滤将粗混合物与无机盐分离。将所得的溶液直接进行反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝11.0min)，获得淡黄色油状物化合物13(7.4mg,50％)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.01(d,3JH-P＝6.0,1H),7.94–7.87(m,2H),7.82–7.74(m,2H),7.67–7.61(m,3H),7.18(d,3JH-H＝8.4,1H),7.09(s,1H),6.84(d,3JH-H＝8.4,1H),4.18–3.76(m,15H),3.17(q,3JH-H＝6.9,4H),2.97–2.80(m,12H),1.76(d,2JH-P＝15,3H),1.75(d,2JH-P＝15,3H),1.29–1.20(m,9H),1.04(t,3JH-H＝6.9,6H)；13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ161.5(d+d,3JC-P＝12),155.0,153.6(d+d,1JC-P＝159),139.4,136.4(d,3JC-P＝9),133.3(d,3JC-P＝16),127.8(d,2JC-P＝22),127.0,126.4(d,4JC-P＝4),125.9,125.6(d,2JC-P＝20),124.8,113.4,111.3,96.4,85.1,64.4(2×s),60.9(d+d,2JC-P＝6),55.6,45.9,16.5(d+d,3JC-P＝6.0),13.4(d+d,1JC-P＝104),11.9；31P{1H}-NMR(162MHz,CDCl3)δ+40.2(2P),+40.0(1P)；ESI-LRMS(+)m/z 922[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C46H67N7O7P3]+计算922.4315,实测922.4355。
络合物14
将配体13(2mg,2μmol)溶解在CH3OH/H2O混合物(1:1,总计2mL)中，使用NaOH水溶液将pH调节至12。将溶液加热至60℃持续14小时。在冷却并使用稀盐酸(0.1M)将pH调节至7后，加入EuCl3.6H2O(3mg，8μmol)，将反应混合物加热至60℃持续15小时。将反应混合物通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝8.5min)纯化，获得黄色固体(2mg，93％)；ESI-LRMS(+)m/z986[M+H]+,495[M+2H]2+；ESI-HRMS(+)[C40H52N7O7P3 151Eu]+计算986.2340,实测986.2327；τH2O(ms)＝0.50(pH 9),0.53(pH 8),0.74(pH 7),1.06(pH 6),1.15(pH 5),1.16(pH 4)；ε331nm＝11450M-1cm-1；ФpH 8＝0.5％,ФpH 4＝16.8％(λexc＝331nm)。
化合物15
在氩气下，将1-(叔丁氧基羰基)-1,4,7-三氮杂环壬烷二盐酸盐9(31mg,0.10mmol)、甲磺酸酯8(122mg,0.26mmol)和K2CO3(60mg,0.43mmol)在无水CH3CN(2mL)中合并。将所得的混合物加热至60℃持续14小时，然后将粗溶液与无机盐分离，减压去除溶剂，获得橙色油状物，将其通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝15.6min)纯化，获得淡黄色油状物(66mg，62％)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.03–7.96(m,2H),7.66(s,1H),7.58(s,1H),7.17(d,2H),7.08(s,2H),6.82(d,2H),4.15–4.02&3.91–3.78(m,10H),3.94(2×s,4H),3.44–3.29(m,4H),3.20–3.04(m,12H),2.76–2.61(m,4H),1.76(2×d,6H),1.48(s,9H),1.24(2×t,6H),1.02(t,12H)；13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ161.7(d,3JC-P＝21),161.5(d,3JC-P＝21),155.7,155.1,155.0,153.8(d,1JC-P＝157),153.6(d,1JC-P＝157),139.9(2×s),132.8(d,3JC-P＝12),132.7(d,3JC-P＝12),128.0(d,2JC-P＝22),127.9(d,2JC-P＝22),127.1,126.4(d,4JC-P＝3),126.1(d,4JC-P＝3),125.0(2×s),113.7,113.6,111.4(2×s),96.5,96.2,85.3(d,4JC-P＝2),85.1(d,4JC-P＝2),79.5,62.9,62.6,61.1(2×d,2JC-P＝6),56.1,55.7,55.0,54.6,54.0,50.0,49.7,46.0,28.8,16.6(d),13.5(d,1JC-P＝1.5),13.4(d,1JC-P＝1.5),12.0；31P{1H}-NMR(162MHz,CDCl3)δ+40.2(1P),+40.1(1P)；ESI-LRMS(+)m/z 1027[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C55H78N7O8P2]+计算1026.539,实测1026.543。
化合物16
制备化合物15(66mg,0.0643mmol)在三氟乙酸和CH2Cl2(10％v/v，总共3mL)中的溶液。将溶液在室温下搅拌1小时，然后减压去除溶剂，获得橙色残余物。向该残余物中加入CH2Cl2(30mL)，然后再次减压去除溶剂。将该过程重复五次，获得淡橙色油状物(67mg，定量)；1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ7.97(s,2H),7.95(dd,3JH-P＝6,4JH-H＝1.0,2H),7.79(dd,3JH-H＝8.7,4JH-H＝1.9,2H),7.72–7.70(m,2H),7.41(d,3JH-H＝8.7,2H),4.24(s,4H),4.17–4.10&4.01–3.95(m,4H),4.07(s,6H),3.70(q,3JH-H＝7.2,8H),3.42–3.35(m,4H),3.29–3.23(m,4H),3.06–2.99(m,4H),1.82(d,2JH-P＝15,6H),1.30(t,3JH-H＝7.0,6H),1.12(t,3JH-H＝7.2,12H)；13C-NMR(151MHz,CD3OD)δ160.8(d,3JC-P＝20),155.6,155.2(d,1JC-P＝159),136.8,133.8(d,3JC-P＝12),128.6,128.5(d,2JC-P＝24),127.5,126.2,116.9,114.9,94.6,87.3(d,4JC-P＝2),63.1(d,2JC-P＝7),60.6,57.7,55.0,52.3,49.9,45.5,16.8(d,3JC-P＝6.2),13.6(d,1JC-P＝103),10.4,31P{1H}-NMR(162MHz,CD3OD)δ+40.8；ESI-LRMS(+)m/z 926[M+H]+,464[M+2H]2+,309[M+3H]3+；ESI-HRMS(+)[C50H70N7O6P2]+计算926.4863,实测926.4865。
化合物17
在氩气下，将化合物16(39mg,0.0375mmol)、甲磺酸酯10(36mg,0.123mmol)和K2CO3(30mg,0.217mmol)在无水CH3CN(2mL)中合并，加热至60℃持续18小时。此后，通过离心将粗混合物与无机盐分离，将所得的溶液直接进行反相HPLC(10至100％CH3CN在25mM碳酸氢铵缓冲液中的溶液，10分钟，tr＝11.8min)，获得淡黄色油状物(23mg,55％)；1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ8.00(dd,3JH-P＝6.0,4JH-H＝1.3,2H),7.93–7.88(m,1H),7.83–7.76(m,1H),7.73–7.67(m,1H),7.65(s,2H),7.18(dd,3JH-H＝8.5,4JH-H＝1.8,2H),7.09(d,4JH-H＝1.8,2H),6.83(d,3JH-H＝8.5,2H),4.14–4.04&3.90–3.82(m,12H),4.01–3.91(m,4H),3.16(q,3JH-H＝7.1,8H),3.07–2.83(m,12H),1.76(d,2JH-P＝15,6H),1.75(d,2JH-P＝15,3H),1.25(t,3JH-H＝7.0,6H),1.23(t,3JH-H＝7.0,3H),1.03(t,3JH-H＝7.1,12H)；ESI-LRMS(+)m/z 1124[M+H]+,563[M+2H]2+,375[M+3H]3+；ESI-HRMS(+)[C59H82N8O8P3]+计算1123.547,实测1123.548。
络合物18
将配体17(11.5mg,0.01024mmol)溶解在CH3OH/H2O混合物(1:1,总计4mL)中，使用1M NaOH水溶液将pH调节至12。将溶液加热至60℃持续15小时。在冷却并使用稀盐酸(0.1M)将pH调节至6后，加入EuCl3.6H2O(6mg,0.0164mmol)，将反应混合物加热至60℃持续17小时。此后，通过离心将溶液与无机盐分离，通过反相HPLC(10至100％CH3OH的H2O溶液，10分钟，tr＝13.6min)纯化，获得黄色固体(7mg，58％)；ESI-LRMS(+)m/z 1189[M+H]+,595[M+2H]2+,397[M+3H]3+；ESI-HRMS(+)[C53H68N8O8P3 151Eu]2+计算595.1796,实测595.1741；τH2O(ms)＝0.34(pH 9),0.34(pH 8),0.47(pH 7),0.78(pH 6),0.96(pH 5),1.00(pH 4)。
化合物19为市售可得的。
化合物20
在氩气下，将1,4,7-三氮杂环壬烷三盐酸盐19(4.5mg,0.0189mmol)、化合物8(33mg,0.067mmol)和K2CO3(20mg,0.145mmol)在无水CH3CN(1.5mL)中合并，加热至60℃持续17小时。此后，通过过滤将粗混合物与无机盐分离。将所得的溶液直接进行反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝16.5min)，获得淡黄色油状物(8mg,32％)；1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ8.01(d,3JH-P＝5.0,3H),7.68(s,3H),7.18(dd,3JH-H＝8.5,4JH-H＝1.9,3H),7.09(d,4JH-H＝1.9,3H),6.82(d,3JH-H＝8.5,3H),4.13–4.05&3.87–3.81(m,6H),3.92(s,6H),3.88(s,9H),3.16(q,3JH-H＝7.2,12H),2.94(br s,12H),1.76(d,2JH-P＝15,9H),1.24(t,3JH-H＝7.0,9H),1.03(t,3JH-H＝7.2,18H)；13C-NMR(151MHz,CDCl3)δ161.9(d,3JC-P＝20),155.4,154.0(d,1JC-P＝157),139.8,133.0(d,3JC-P＝12),128.0(d,2JC-P＝23),127.3,126.8,125.2,113.9,111.7,96.6,85.5,64.2,61.3(d,2JC-P＝7),56.1,55.9,46.3,16.8(d,3JC-P＝6),13.7(d,1JC-P＝104),12.3；31P{1H}-NMR(162MHz,CDCl3)δ+40.1；ESI-LRMS(+)m/z1325[M+H]+,663[M+2H]2+,443{M+3H]3+；ESI-HRMS(+)[C72H98N9O9P3]2+计算662.8350,实测662.8334。
络合物21
将配体20(8mg,6μmol)溶解在CH3OH/H2O混合物(1:1，总计2mL)中，使用NaOH水溶液(1.0M)将pH调节至12。将溶液加热至60℃持续4小时。在冷却并使用盐酸(1.0M)将pH调节至7后，加入EuCl3.6H2O(3mg,8μmol)，将反应混合物加热至60℃持续19小时。将反应混合物通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝12.4min)纯化，获得黄色固体(4mg,48％)；ESI-LRMS(+)m/z 1390[M+H]+,696[M+2H]2+,464[M+3H]3+；ESI-HRMS(+)[C66H82N9O9P3 151Eu]+计算1390.467,实测1390.470；τH2O(ms)＝0.24(pH 9),0.25(pH8),0.32(pH 7),0.59(pH 6),0.83(pH 5),0.84(pH 4)；ε331nm＝45000L M-1cm-1。
在氩气下，向4-溴-2-硝基苯酚22(2.49g,11.4mmol)和K2CO3(2.31g,16.7mmol)在无水CH3CN(40mL)中的混合物中加入4-溴丁酸乙酯23(2.3mL,17.2mmol)。将混合物加热至70℃持续64小时，然后减压去除溶剂。将CH2Cl2(50mL)加入到残余物中，将所得的混悬液用H2O(5×50mL)洗涤。将有机层经K2CO3干燥，然后减压去除溶剂，获得粗残余物，将其通过柱色谱法纯化(SiO2，1:1己烷/CH2Cl2至100％CH2Cl2)，获得淡黄色油状物(3.38g,98％)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ7.95(d,4JH-H＝2.5,1H),7.60(dd,3JH-H＝8.9,4JH-H＝2.5,1H),6.97(d,3JH-H＝8.9,1H),4.17–4.12(m,4H),2.55(t,3JH-H＝7.0,2H),2.18–2.12(m,2H),1.25(t,3JH-H＝7.1)；13C-NMR(176MHz,CDCl3)δ173.1,151.6,140.4,137.0,128.5,116.3,112.1,68.9,60.8,30.3,24.3,14.4；ESI-LRMS(+)m/z 332[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C12H15NO5Br]+计算332.0134,实测332.0146；Rf＝0.47(SiO2,100％CH2Cl2)。
化合物25
在氩气下，将化合物24(4.30g，12.95mmol)、铁粉(3.60g，64.5mmol)和冰醋酸(3.7mL，64.6mmol)在EtOH(20mL)中合并，加热至50℃持续6小时。将混合物冷却，然后过滤，减压去除溶剂。将DCM(50mL)加入到所得的混合物中，将所得的溶液用饱和Na4EDTA水溶液(3×40mL)和H2O(2×40mL)洗涤。将合并的水层用CH2Cl2(6×40mL)萃取。将合并的有机层经K2CO3干燥，减压去除溶剂，获得淡金色油状物(3.5g，90％)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ6.75(d,4JH-H＝2.4,1H),6.70(dd,3JH-H＝8.4,4JH-H＝2.4,1H),6.55(d,3JH-H＝8.4,1H),4.11(q,3JH-H＝7.2,2H),3.93(t,3JH-H＝6.1,2H),3.89(br s,2H),2.46(t,3JH-H＝7.1,1H),2.11–2.06(m,2H),1.22(t,3JH-H＝7.2,3H)；13C-NMR(176MHz,CDCl3)δ173.1,145.3,138.0,120.3,117.2,113.3,112.6,67.4,60.5,31.0,24.6,14.2；ESI-LRMS(+)m/z 302[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C12H17NO3Br]+计算302.0392,实测302.0402。
在氩气下，向化合物25(3.19g，10.6mmol)和K2CO3(3.73g，27.0mmol)的无水CH3CN(10mL)溶液中加入碘乙烷(4mL，50mmol)。将混合物加热至70℃持续65小时，然后减压去除溶剂。将所得的残余物溶解在CH2Cl2(50mL)中，用H2O(4×50mL)洗涤，然后经K2CO3干燥。减压去除溶剂，获得粗残余物，将其通过柱色谱法纯化(SiO2，纯CH2Cl2至1％CH3OH的CH2Cl2溶液)，获得浅红色油状物(2.51g,66％)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ6.99–6.96(m,2H),6.69(d,3JH-H＝8.4,1H),4.13(q,3JH-H＝7.2,2H),3.99(t,3JH-H＝6.3,2H),3.13(q,3JH-H＝7.0,4H),2.51(t,3JH-H＝7.4,2H),2.15–2.10(m,2H),1.25(t,3JH-H＝7.0,3H),1.04(t,3JH-H＝7.0,6H)；13C-NMR(176MHz,CDCl3)δ173.2,151.8,141.8,124.4,124.1,114.8,113.4,67.8,60.6,45.7,31.0,24.9,14.4,12.5；ESI-LRMS(+)m/z 358[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C16H25NO3Br]+计算358.1018,实测358.1020；Rf＝0.04(SiO2,纯CH2Cl2),0.3(1％CH3OH的CH2Cl2溶液)。
化合物27
将化合物26(3.03g,8.46mmol)和Pd2Cl2(烯丙基)2(310mg,0.85mmol)合并在容器中，将所述容器脱气然后回充氩气，进行三个循环，然后加入无水CH3CN(15mL)。向该混合物中依次加入P(t-Bu)3(0.31mL,1.28mmol)、三甲基甲硅烷基乙炔(2.4mL,17.3mmol)和哌啶(2.1mL,21.3mmol)。将反应混合物在34℃搅拌30小时。然后，减压去除溶剂，将残余物溶解在CH2Cl2(50mL)中。将溶液用H2O(4×50mL)洗涤，然后经K2CO3干燥。减压去除溶剂，获得棕色油状物，将其通过柱色谱法纯化(SiO2，100％己烷至6％EtOAc己烷溶液)，获得黄色油状物(2.29mg,75％)；1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ7.06(dd,3JH-H＝8.4,4JH-H＝2.0,1H),7.01(d,4JH-H＝2.0,1H),6.74(d,3JH-H＝8.4,1H),4.14(q,3JH-H＝7.1,2H),4.03(t,3JH-H＝6.1,2H),3.13(q,3JH-H＝7.2,4H),2.52(t,3JH-H＝7.3,2H),2.17–2.11(m,2H),1.27(t,3JH-H＝7.1,3H),1.03(t,3JH-H＝7.2,6H),0.24(s,9H)；13C-NMR(151MHz,CDCl3)δ173.1,153.3,139.7,126.6,125.0,115.2,112.6,105.8,91.7,67.3,60.4,45.6,30.9,24.6,14.2,12.3,0.10；29Si NMR(139MHz,CDCl3)δ-16.0；ESI-LRMS(+)m/z 376[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C21H34NO3Si]+计算376.2308,实测376.2299；Rf＝0.3(SiO2,10％EtOAc己烷溶液)。
化合物28
在氩气下，将三乙胺三氢氟酸(6.25mL，38mmol)加入到化合物27(960mg，2.56mmol)的无水THF(8mL)溶液中。将溶液在30℃搅拌24小时，然后减压去除溶剂。然后，将残余物溶解在CH2Cl2(30mL)中，用水(6×30mL)洗涤。将合并的水层用CH2Cl2(2×30mL)萃取，经K2CO3干燥，获得黄色油状物(749mg,97％)。将产物不经进一步纯化用于下一步；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ7.07(dd,3JH-H＝8.3,4JH-H＝2.0,1H),7.03(d,4JH-H＝2.0,1H),6.75(d,3JH-H＝8.3,1H),4.13(q,3JH-H＝7.2,2H),4.03(t,3JH-H＝6.3,2H),3.13(q,3JH-H＝7.2,4H),2.97(s,1H),2.52(t,3JH-H＝7.4,2H),2.17–2.12(m,2H),1.25(t,3JH-H＝7.2,3H),1.03(t,3JH-H＝7.1,6H)；13C-NMR(176MHz,CDCl3)δ173.1,153.4,139.8,126.4,125.0,114.0,112.7,84.3,75.2,67.3,60.4,45.6,30.9,24.6,14.2,12.3；ESI-LRMS(+)m/z 304[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C18H26NO3]+计算304.1913,实测304.1924。
化合物29
在氩气下，将化合物28(528mg,1.74mmol)和(6-(羟甲基)-4-(溴吡啶-2-基)(甲基)次膦酸乙酯19(486mg,1.65mmol)在无水CH3CN(10mL)中合并。向该溶液中依次加入Pd2Cl2(烯丙基)2(70mg,0.191mmol)、P(tBu)3(0.06mL,0.25mmol)和哌啶(0.43mL,4.70mmol)。在氩气下，将所得的混合物在40℃搅拌36小时，然后减压去除溶剂。将残余物溶解在CH2Cl2(40mL)中，用H2O(3×40mL)洗涤，经K2CO3干燥，然后减压去除溶剂。将粗产物通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝12.2min)纯化，获得浅橙色油状物(359mg,40％)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.04(d,3JH-P＝6.0,1H),7.47(s,1H),7.13(d,3JH-H＝8.4,1H),7.07(s,1H),6.82(d,3JH-H＝8.4,1H),4.81(s,2H),4.22–3.78(m,6H),3.17(q,3JH-H＝6.9,4H),2.53(t,3JH-H＝7.2,2H),2.22–2.11(m,2H),1.78(d,2JH-P＝15,3H),1.31–1.22(m,6H),1.06(t,3JH-H＝6.9,6H)；13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ173.0,160.4(d,3JC-P＝19),153.9,153.1(d,1JC-P＝155),140.0,133.2(d,3JC-P＝11),128.3(d,2JC-P＝22),126.5,124.8,124.0(d,4JC-P＝3),113.6,112.8,97.1,84.7,67.4,64.0,61.2(d,2JC-P＝6.2),60.5,45.6,30.8,24.6,16.5(d,3JC-P＝6.0),14.2,13.5(d,1JC-P＝105),12.3；31P{1H}-NMR(162MHz,CDCl3)δ+39.4；ESI-LRMS(+)m/z 517[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C27H38N2O6P]+计算517.2468,实测517.2451。
化合物30
在氩气下，将化合物29(250mg,0.484mmol)、甲磺酸酐(126mg,0.72mmol)和DIPEA(0.25mL,1.44mmol)在无水THF(2mL)中合并。将反应混合物在室温搅拌1小时，通过TLC监测反应进程。完全转化后，减压去除溶剂，将所得的粗残余物溶解在CH2Cl2(40mL)中，用水(3×40mL)洗涤，将有机层经K2CO3干燥。减压去除溶剂获得橙色油状物(288mg，定量)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.10(d,3JH-P＝6.0,1H),7.64(s,1H),7.15(d,3JH-H＝8.4,1H),7.09(s,1H),6.83(d,3JH-H＝8.4,1H),5.37(s,2H),4.19–3.82(m,6H),3.18(q,3JH-H＝7.0,4H),3.14(s,3H),2.54(t,3JH-H＝7.2,2H),2.22–2.13(m,2H),1.78(d,2JH-P＝15,3H),1.32–1.24(m,6H),1.07(t,3JH-H＝6.9,6H)；ESI-LRMS(+)m/z 595[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C28H40N2O8SP]+计算595.2242,实测595.2236；Rf＝0.4(SiO2,5％CH3OH的CH2Cl2溶液)。
化合物32
在惰性气氛下，向4-溴-2-硝基苯酚22(10g,45mmol)的无水CH3CN(240mL)溶液中加入3-(Boc-氨基)丙基溴31(14.1g,58.4mmol)、Cs2CO3(22.2g,67.4mmol)和Nal(1.7g,11.2mmol)。将反应混合物在70℃搅拌16小时，过滤，用CH3CN洗涤。减压浓缩母液。通过硅胶色谱法纯化(环己烷/EtOAc 8/2，然后7/3，然后6/4)，获得化合物32(15.9g，94％)，为黄色油状物，放置后固化；1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)7.98(d,J＝2.5Hz,1H),7.62(dd,J＝8.9Hz,J＝2.5Hz,1H),6.98(d,J＝8.9Hz,1H),4.95(br s,1H),4.15(t,J＝5.9Hz,2H),3.36-3.32(m,2H),2.06-2.01(m,2H),1.43(s,9H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ(ppm)156.3,151.6,140.2,137.1,128.6,116.2,112.2,79.4,68.3,38.0,29.3,28.5。
化合物33
向化合物32(15.9g,42.4mmol)在二氧六环(133mL)和H2O(26mL)中的溶液中加入锌(14.1g,211mmol)，在0℃加入NH4Cl(11.4g,211mmol)。在0℃ 15分钟后，将反应混合物在50℃搅拌20小时。然后将其经过滤，用EtOAc洗涤。将有机层依次用H2O和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，获得粗的化合物33(14.4g，99％)，为棕色油状物；1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)6.84-6.81(d,J＝2.3Hz,1H),6.79-6.76(dd,J＝2.3Hz,J＝8.5Hz,1H),6.62(d,J＝8.5Hz,1H),4.69(br s,1H),4.02(t,J＝6.0Hz,2H),3.70(br s,2H),3.34-3.31(m,2H),2.01-1.96(m,2H),1.44(s,9H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ(ppm)156.1,145.2,138.1,120.7,117.6,113.6,113.0,79.5,66.3,37.9,29.8,28.5；ESI-LRMS(+)m/z(M)+344.49。
化合物34
在密封的烧瓶中，向化合物33(7.3g,21.1mmol)的CH3CN(23mL)溶液中加入K2CO3(7.38g,52.9mmol)和Etl(8.11mL,99.4mmol)。将反应混合物在70℃搅拌16小时，经Büchner过滤，用EtOAc洗涤。将母液用水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化(环己烷/EtOAc 8:2)，获得化合物34(7.04g,83％)，为浅黄色油状物；1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)7.07-7.03(m,2H),6.70(d,J＝8.9Hz,1H),5.7(br s,1H),4.03(t,J＝5.8Hz,2H),3.37-3.33(m,2H),3.13(q,J＝7.1Hz,4H),2.00-1.95(m,2H),1.45(s,9H),1.01(t,J＝7.1Hz,6H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ(ppm)156.3,152.7,141.4,125.4,125.0,114.6,113.4,79.0,68.5,46.2,39.2,29.6,28.6,12.0；ESI-LRMS(+)m/z(M+H)+403.0。
化合物35
在密封的烧瓶中，将化合物34(5.4g,13.5mmol)的无水THF(18.9mL)溶液用氩气脱气。然后，加入三乙胺(18.9mL,135mmol)、三甲基甲硅烷基乙炔(12.2mL,85.4mmol)、Cul(1.09g,5.73mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(2g,2.85mmol)，将混合物用氩气脱气，然后在65℃搅拌16小时。将反应混合物经过滤，用EtOAc洗涤并减压浓缩。将残余物溶解在EtOAc中，将有机层依次用H2O和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过硅胶快速色谱法纯化(环己烷/EtOAc 10:0至8:2)，获得纯度为80％的化合物35(6.4g)。通过硅胶快速色谱法(CH2Cl2/EtOAc100:0至95:5)进行第二次纯化，获得化合物35(3.5g,61％)，为橙色油状物；1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)7.12(d,J＝8.3Hz,1H),7.08(s,1H),6.74(d,J＝8.3Hz,1H),5.96(br s,1H),4.08-4.03(t,J＝5.7Hz,2H),3.37-3.32(m,2H),3.15-3.08(q,J＝7.0Hz,4H),2.01-1.96(m,2H),1.45(s,9H),0.99(t,J＝7.1Hz,6H),0.24(s,9H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ(ppm)156.4,154.4,139.6,127.6,125.9,115.6,112.7,105.8,92.1,79.0,68.4,46.4,39.3,29.7,28.7,12.1,0.2；ESI-LRMS(+)m/z(M+H)+419.15。
化合物36
在氩气下，将三乙胺三氢氟酸(1.1mL,6.75mmol)加入到化合物35(185mg,0.442mmol)的无水THF(5mL)溶液中。将溶液在30℃搅拌38小时，然后减压去除溶剂。然后，将残余物溶解在CH2Cl2(30mL)中，用水(3×30mL)洗涤。将合并的水层用CH2Cl2(2×30mL)萃取，将合并的有机层经K2CO3干燥，获得浅黄色油状物(74mg,48％)。将产物不经进一步纯化用于下一步；1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ7.13(d,3JH-H＝8.2,1H),7.10(s,1H),6.76(d,3JH-H＝8.2,1H),4.06(t,3JH-H＝5.7,2H),3.40–3.31(m,2H),3.12(q,3JH-H＝7.0,4H),2.98(s,1H),2.02–1.95(m,2H),1.45(s,9H),0.99(t,3JH-H＝7.0,6H)；13C-NMR(151MHz,CDCl3)δ156.4,154.5,139.6,127.5,125.9,114.4,112.7,84.3,79.0,75.5,68.4,46.3,39.3,29.7,28.6,12.0；ESI-LRMS(+)m/z 347[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C20H31N2O3]+计算347.2353,实测347.2350。
化合物37
在氩气下，将化合物36(172mg,0.496mmol)和(6-(羟甲基)-4-(溴吡啶-2-基)(甲基)次膦酸乙酯6(139mg,0.473mmol)在无水CH3CN(3mL)中合并。向该溶液中依次加入Pd2Cl2(烯丙基)2(20mg,0.055mmol)、P(tBu)3(0.02mL,0.082mmol)和哌啶(0.12mL,1.22mmol)。在氩气下，将所得的混合物在35℃搅拌24小时，然后减压去除溶剂。将残余物溶解在CH2Cl2(40mL)中，用H2O(3×40mL)洗涤，经K2CO3干燥。减压去除溶剂，获得棕色油状物，将其通过反相HPLC(10至100％CH3CN，10分钟，tr＝11.7min)纯化，获得浅黄色油状物(64mg,24％)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ8.03(d,3JH-P＝6.0,1H),7.50(s,1H),7.17(d,3JH-H＝8.2,1H),7.12(s,1H),6.81(d,3JH-H＝8.2,1H),5.83(br s,1H),4.80(s,2H),4.14–4.06&3.89–3.82(m,2H),4.08(t,3JH-H＝5.8,2H),3.38–3.32(m,2H),3.15(q,3JH-H＝7.0,4H),2.03–1.97(m,2H),1.77(d,2JH-P＝15,3H),1.44(s,9H),1.26(t,3JH-H＝7.1,3H),1.01(t,3JH-H＝7.0,6H)；13C-NMR(176MHz,CDCl3)δ160.8(d,3JC-P＝19),156.4,155.0,153.3(d,1JC-P＝155),139.8,133.2(d,3JC-P＝11),128.3(d,2JC-P＝22),127.5,125.7,124.1(d,4JC-P＝3),113.9,112.8,96.9,85.0(d,4JC-P＝2),79.1,68.4,64.2,61.3(d,2JC-P＝7),46.2,39.2,29.6,28.6,16.5(d,3JC-P＝6),13.5(d,1JC-P＝105),12.1；31P{1H}-NMR(162MHz,CDCl3)δ+39.5；ESI-LRMS(+)m/z 560[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C29H43N3O6P]+计算560.2889,实测560.2879。
化合物38
在氩气下，将化合物37(40mg,0.072mmol)、甲磺酸酐(25mg,0.143mmol)和DIPEA(0.025mL,0.025mmol)在无水THF(2mL)中合并。将反应混合物在室温搅拌90分钟，然后减压去除溶剂。将所得的残余物溶解在CH2Cl2(40mL)中，用水(3×40mL)洗涤，将合并的水层用CH2Cl2(2×40mL)萃取。将合并的有机层经K2CO3干燥，减压去除溶剂，获得黄色油状物(45mg,100％)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.09(dd,3JH-P＝6.0,4JH-H＝1.4,1H),7.63(s,1H),7.19(dd,3JH-H＝8.2,4JH-H＝1.6,1H),7.14(d,4JH-H＝1.6,1H),6.82(d,3JH-P＝8.2,1H),5.86(br s,1H),5.36(s,2H),4.18–4.02&3.94–3.80(m,4H),3.40–3.31(m,2H),3.19–3.12(m,7H),2.03–1.99(m,2H),1.77(d,2JH-P＝15,3H),1.44(s,9H),1.27(t,3JH-H＝7.1,3H),1.04–1.00(m,6H)；ESI-LRMS(+)m/z 638[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C30H45N3O8SP]+计算638.2665,实测638.2676。
化合物39
在氩气下，向化合物24(3.50g，11.6mmol)和K2CO3(4.8g，34.5mmol)的无水CH3CN(3mL)溶液中加入碘乙烷(1.21mL，15.0mmol)。将该混合物加热至55℃持续70小时，过滤去除无机盐，然后减压去除溶剂。将所得的油状物通过柱色谱法纯化(SiO2，100％CH2Cl2)，获得淡黄色油状物(1.65g，43％)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ6.70(dd,3JH-H＝8.3,1H),6.67(s,1H),6.57(d,3JH-H＝8.3,1H),4.15(q,3JH-H＝7.1,2H),4.00(t,3JH-H＝6.1,2H),3.13(q,3JH-H＝7.2,2H),2.49(t,3JH-H＝7.1,2H),2.18–2.11(m,2H),1.29(t,3JH-H＝7.2,3H),1.25(t,3JH-H＝7.1,3H)；13C-NMR(176MHz,CDCl3)δ173.3,145.0,139.8,118.4,114.3,112.7,111.6,67.6,60.7,38.2,31.3,24.7,14.7,14.4；ESI-LRMS(+)m/z 331[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C14H21NO3Br]+计算330.0705,实测330.0714；Rf＝0.4(SiO2,纯CH2Cl2)。
化合物40
将化合物39(939mg，2.84mmol)、多聚甲醛(415mg，4.61mmol)和几滴乙酸在无水EtOH(25mL)中合并。在氩气下，将混合物在室温搅拌20分钟，此时加入NaBH3CN(640mg，10mmol)，将反应再搅拌48小时。减压去除溶剂，然后将所得的残余物溶解在CH2Cl2(30mL)中，用NaHCO3溶液(1×30mL)和水(3×30mL)洗涤。将有机层经K2CO3干燥，减压去除溶剂，获得淡黄色油状物(833mg，85％)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.00(dd,3JH-H＝8.3,4JH-H＝2.3,1H),6.98(d,4JH-H＝2.3,1H),6.70(d,3JH-H＝8.3,1H),4.16(q,3JH-H＝7.1,2H),4.02(t,3JH-H＝6.3,2H),3.13(q,3JH-H＝7.2,2H),2.76(s,2H),2.54(t,3JH-H＝7.3,2H),2.17–2.10(m,2H),1.27(t,3JH-H＝7.1,3H),1.12(t,3JH-H＝7.2,3H)；13C-NMR(176MHz,CDCl3)δ172.9,150.6,143.3,123.9,118.0,113.8,113.3,67.4,60.5,49.2,39.0,30.8,24.7,14.2,12.2；ESI-LRMS(+)m/z 344[M+H]+。ESI-HRMS(+)[C15H23NO3Br]+计算344.0861，实测344.0872。
化合物41
将化合物40(1.47g,4.27mmol)和Pd2Cl2(烯丙基)2(160mg,0.44mmol)合并在容器中，将所述容器脱气然后回充氩气，进行三个循环，然后加入无水CH3CN(8mL)。向该混合物中依次加入P(t-Bu)3(0.16mL,0.66mmol)、三甲基甲硅烷基乙炔(1.2mL,8.66mmol)和哌啶(1.0mL,10.1mmol)。将反应混合物在35℃搅拌19小时。然后，减压去除溶剂，将残余物溶解在CH2Cl2(50mL)中。将溶液用H2O(2×50mL)洗涤，经K2CO3干燥。减压去除溶剂，获得棕色油状物，将其通过柱色谱法纯化(SiO2，100％己烷至7％EtOAc己烷溶液)，获得期望的化合物，为淡橙色油状物(1.19g,77％)；1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ7.05(d,3JH-H＝8.2,1H),7.00(s,1H),6.73(d,3JH-H＝8.2,1H),4.14(q,3JH-H＝7.1,2H),4.04(t,3JH-H＝6.2,2H),3.09(d,3JH-H＝7.0,2H),2.75(s,3H),2.53(t,3JH-H＝7.3,2H),2.20–2.13(m,2H),1.25(t,3JH-H＝7.1,3H),1.09(t,3JH-H＝7.0,3H),0.24(s,9H)；13C-NMR(151MHz,CDCl3)δ173.2,152.3,141.7,126.4,122.7,115.4,112.1,105.9,92.0,67.3,60.6,49.5,39.3,31.0,24.8,14.4,12.3,0.2；29Si-NMR(139MHz,CDCl3)δ-18.3；ESI-LRMS(+)m/z 362[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C20H32NO3Si]+计算362.2151,实测362.2162；Rf＝0.2(SiO2,10％EtOAc己烷溶液)。
化合物42
在氩气下，将三乙胺三氢氟酸(3.6mL,22.0mmol)加入到化合物41(530mg,1.47mmol)的无水THF(5mL)溶液中。将溶液在30℃搅拌17小时，然后减压去除溶剂。然后，将残余物溶解在CH2Cl2(30mL)中，用水(3×30mL)洗涤。将合并的水层用CH2Cl2(2×30mL)萃取，将合并的有机层经K2CO3干燥，获得黄色油状物(410mg,97％)。将产物不经进一步纯化用于下一步；1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ7.07(dd,3JH-H＝8.3,4JH-H＝2.0,1H),7.02(d,4JH-H＝2.0,1H),6.75(d,3JH-H＝8.3,1H),4.14(q,3JH-H＝7.1,2H),4.04(t,3JH-H＝6.3,2H),3.10(q,3JH-H＝7.2,2H),2.97(s,1H),2.75(s,3H),2.53(t,3JH-H＝7.3,2H),2.21–2.14(m,2H),1.25(t,3JH-H＝7.1,3H),1.10(t,3JH-H＝7.2,3H)；13C-NMR(151MHz,CDCl3)δ173.2,152.5,141.8,126.3,122.8,114.3,112.2,84.4,75.4,67.3,60.6,49.4,39.2,31.0,24.8,14.4,12.4；ESI-LRMS(+)m/z 290[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C17H24NO3]+计算290.1756,实测290.1752。
化合物43
在氩气下，将化合物42(396mg,1.37mmol)和(6-(羟甲基)-4-(溴吡啶-2-基)(甲基)次膦酸乙酯19(362mg,1.23mmol)在无水CH3CN(10mL)中合并。向该溶液中依次加入Pd2Cl2(烯丙基)2(50mg,0.137mmol)、P(tBu)3(0.05mL,0.21mmol)和哌啶(0.4mL,4.37mmol)。在氩气下，将所得的混合物在40℃搅拌36小时，然后减压去除溶剂。将残余物溶解在CH2Cl2(40mL)中，用H2O(3×40mL)洗涤，经K2CO3干燥，减压去除溶剂，获得橙色油状物，将其通过反相HPLC(10至100％CH3CN，10分钟,tr＝13.2min)纯化，获得浅橙色油状物(185mg,30％)；1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ8.02(d,3JH-P＝6.0,1H),7.47(s,1H),7.12(dd,3JH-H＝8.3,4JH-H＝2.0,1H),7.05(d,4JH-H＝2.0,1H),6.80(d,3JH-H＝8.3,1H),4.80(s,2H),4.14(q,3JH-H＝7.2,2H),4.12–4.08&3.90–3.83(m,2H),4.07(t,3JH-H＝6.4,2H),3.12(q,3JH-H＝7.0,2H),2.78(s,3H),2.53(t,3JH-H＝7.3,2H),2.21–2.15(m,2H),1.77(d,2JH-P＝15,3H),1.27(t,3JH-H＝7.0,3H),1.25(t,3JH-H＝7.2,3H),1.12(t,3JH-H＝7.0,3H)；13C-NMR(151MHz,CDCl3)δ173.1,160.7(d,3JC-P＝19),153.3(d,1JC-P＝155),153.1,142.1,133.3(d,3JC-P＝11),128.3(d,2JC-P＝22),126.4,124.1(d,4JC-P＝3),122.6,113.9,112.3,97.1,84.9,67.4,64.2,61.3(d,2JC-P＝6),60.6,49.4,39.2,31.0,24.7,16.6(d,3JC-P＝6),14.3,13.6(d,1JC-P＝104),12.4；31P{1H}-NMR(162MHz,CDCl3)δ+39.5；ESI-LRMS(+)m/z 503[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C26H36N2O6P]+计算503.2311,实测503.2297。
化合物44
在氩气下，将化合物43(160mg,0.318mmol)、甲磺酸酐(111mg,0.637mmol)和DIPEA(0.11mL,0.632mmol)在无水THF(4mL)中合并。将反应混合物在室温搅拌1小时，此时减压去除溶剂。将所得的粗残余物溶解在CH2Cl2(40mL)中，用水(3×40mL)洗涤，将合并的水层用CH2Cl2(3×40mL)萃取。将合并的有机层经K2CO3干燥，减压去除溶剂，获得橙色油状物(167mg,90％)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.10(d,3JH-P＝6.0,1H),7.64(s,1H),7.15(d,3JH-H＝8.4,1H),7.09(s,1H),6.83(d,3JH-H＝8.4,1H),5.37(s,2H),4.19–3.82(m,6H),3.18(q,3JH-H＝7.0,4H),3.14(s,3H),2.54(t,3JH-H＝7.2,2H),2.22–2.13(m,2H),1.78(d,2JH-P＝15,3H),1.32–1.24(m,6H),1.07(t,3JH-H＝6.9,6H)；ESI-LRMS(+)m/z 595[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C27H38N2O8SP]+计算581.2087,实测581.2099；Rf＝0.4(SiO2,5％CH3OH的CH2Cl2溶液)。
化合物45a-d为市售可得的。
根据Angew Chem Int Ed 2018,57 5110(参见补充材料)中描述的用于形成N-Boc哌嗪衍生物的过程制备化合物46a。
根据WO 2005/075410中描述的用于形成N-甲基哌嗪衍生物的过程(参见实施例5)制备化合物46b。
根据Journal Heterocyclic chemistry 2013,50,995中描述的过程制备化合物46c。
根据Organic Biomolecular&Chemistry 2010,8,4077(参见补充材料)中描述的过程制备化合物46d。
如化合物4所述制备化合物47a-d。
如化合物5所述制备化合物48a-d。
如化合物7所述制备化合物49a-d。
如化合物8所述制备化合物50a-d。
化合物51
在氩气下，将草酰氯(0.75mL,8.75mmol)滴加到冷却至0℃的3-溴丙磺酸钠盐(1g,4.44mmol)、无水CH3CN(4mL)和无水DMF(0.1mL)的混合物中。混合物在0℃搅拌2小时，然后减压去除溶剂(浴温<20℃)。将所得的残余物在高真空下干燥。在氩气下，向该残余物中加入无水CH3CN(4mL)和2,2,2-三氟乙醇(9mL,125mmol)。在冷却至0℃的同时滴加三乙胺(3mL，21.5mmol)。将混合物在0℃搅拌5小时，然后减压去除溶剂。将乙酸乙酯(40mL)和H2O(40mL)加入到粗的残余物中，然后用H2O(3×40mL)洗涤有机层。将有机层经Na2SO4干燥，减压去除溶剂，获得淡橙色油状物(1.1g,87％)；1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ4.53(q,2H,3JH-F＝8.0),3.54(t,2H,3JH-H＝6.2),3.45–3.41(m,2H),2.47–2.42(m,2H)；13C-NMR(151MHz,CDCl3)δ122.0(q,1JC-F＝280),64.0(q,2JC-F＝40),49.9,30.1,26.7；19F-NMR(151MHz,CDCl3)δ-74.0。
化合物52
在氩气下，将5-碘-o-茴香胺(245mg,0.984mmol)、化合物51(1.1g,3.86mmol)、K2CO3(425mg,3.08mmol)和NaI(40mg,0.27mmol)在无水CH3CN(5mL)中合并。将所得的混合物加热至78℃持续72小时，然后减压去除溶剂。将DCM(40mL)和H2O(40mL)加入到粗的残余物中，然后用H2O(2×40mL)洗涤有机层。将有机层经K2CO3干燥，减压去除溶剂，获得粗产物，为淡棕色残余物，将其通过柱色谱法纯化(SiO2，100％己烷至20％EtOAc的己烷溶液)，获得淡黄色油状物(283mg,63％)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ6.99(dd,3JH-H＝8.3,4JH-H＝2.0,1H),6.82(d,4JH-H＝2.0,1H),6.50(d,3JH-H＝8.3,1H),4.53(q,3JH-F＝8.0,2H),3.86(s,3H),3.39–3.29(m,4H),2.26–2.17(m,2H)；13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ146.9,138.9,126.0,122.2(q,1JC-F＝280),118.3,111.5,84.1,63.9(q,2JC-F＝40),55.7,49.1,41.4,23.5；19F-NMR(376MHz,CDCl3)δ-73.9；ESI-LRMS(+)m/z 454[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C12H16NO4SF3I]+计算453.9797,实测453.9792；Rf(SiO2,20％EtOAc己烷溶液)＝0.3。
化合物53a
在氩气下，将化合物52(310mg,0.684mmol)、乙醛(0.46mL,8.16mmol)和两滴冰醋酸在无水EtOH(3mL)中合并。将所得的混合物在室温搅拌15分钟，然后加入NaBH3CN(170mg,2.71mmol)。在氩气下，将混合物在室温再搅拌16小时，然后减压去除溶剂，获得黄色残余物。将DCM(40mL)和H2O(40mL)加入到该残余物中，然后用H2O(3×40mL)洗涤有机层。将合并的水层用DCM(1×40mL)萃取，将合并的有机层经K2CO3干燥。减压去除溶剂获得淡黄色油状物(247mg,75％)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.29(dd,3JH-H＝8.4,4JH-H＝2.1,1H),7.18(d,4JH-H＝2.1,1H),6.60(d,3JH-H＝8.4,1H),4.46(q,3JH-F＝8.0,2H),3.79(s,3H),3.37–3.30(m,2H),3.15(t,3JH-H＝6.6,2H),3.07(q,3JH-H＝7.1,2H),2.06–1.97(m,2H),1.00(t,3JH-H＝7.1,3H)；13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ154.1,140.2,132.3,130.9,122.0(q,1JC-F＝280),113.7,82.9,63.7(q,2JC-F＝40),55.4,49.8,49.0,46.6,21.5,12.1；19F-NMR(376MHz,CDCl3)δ-74.0；ESI-LRMS(+)m/z 482[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C14H20NO4SF3I]+计算482.0110,实测482.0106。
在氩气下，将化合物52(269mg,0.594mmol)、多聚甲醛(800mg,8.89mmol)和两滴冰醋酸在无水EtOH(8mL)中合并。将所得的混合物在室温搅拌15分钟，然后加入NaBH3CN(300mg,4.77mmol)。在氩气下，将混合物在室温再搅拌18小时，然后减压去除溶剂，获得黄色残余物。将DCM(40mL)和H2O(40mL)加入到该残余物中，然后用H2O(3×40mL)洗涤有机层。将合并的水层用DCM(2×40mL)萃取，将合并的有机层经K2CO3干燥。减压去除溶剂获得淡黄色油状物(249mg,90％)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.27(dd,3JH-H＝8.3,4JH-H＝2.0,1H),7.17(d,4JH-H＝2.0,1H),6.59(d,3JH-H＝8.3,1H),4.50(q,3JH-F＝8.0,2H),3.81(s,3H),3.44–3.37(m,2H),3.11(t,3JH-H＝6.7,2H),2.72(s,3H),2.18–2.07(m,2H)；13C-NMR(176MHz,CDCl3)δ152.6,143.0,131.8,128.4,122.2(q,1JC-F＝280),113.5,83.4,63.8(q,2JC-F＝40),55.5,53.1,49.1,39.5,21.6；19F-NMR(376MHz,CDCl3)δ-73.9；ESI-LRMS(+)m/z 468[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C13H18NO4SF3I]+计算467.9953,实测467.9952。
化合物54a
在氩气下，将化合物53a(176mg,0.366mmol)和三甲基甲硅烷基乙炔(0.1mL,0.72mmol)在无水CH3CN(3mL)中合并。向该溶液中依次加入Pd2Cl2(烯丙基)2(14mg,0.038mmol)、P(tBu)3(0.015mL,0.062mmol)和哌啶(0.09mL,0.91mmol)。在氩气下，将所得的混合物在35℃搅拌20小时，然后减压去除溶剂，获得粗产物，为棕色残余物，将其通过柱色谱法纯化(SiO2，100％己烷至20％EtOAc的己烷溶液)，获得淡橙色油状物(151mg,91％)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.16(dd,3JH-H＝8.4,4JH-H＝2.0,1H),7.06(d,4JH-H＝2.0,1H),6.77(d,3JH-H＝8.4,1H),4.45(q,3JH-F＝8.0,2H),3.83(s,3H),3.38–3.30(m,2H),3.16(t,3JH-H＝6.5,2H),3.08(q,3JH-H＝7.2,2H),2.06–1.94(m,2H),0.99(t,3JH-H＝7.2,3H),0.24(s,9H)；13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ154.9,138.2,128.3,126.1,122.0(q,1JC-F＝280),115.3,111.5,105.3,92.4,63.8(q,2JC-F＝40),55.5,49.9,49.1,46.9,21.6,12.2,0.2；19F-NMR(376MHz,CDCl3)δ-74.0；ESI-LRMS(+)m/z 452[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C19H29NO4F3SSi]+计算452.1539,实测452.1545；Rf(SiO2,20％EtOAc的己烷溶液)＝0.3。
化合物54b
在氩气下，将化合物53b(240mg,0.514mmol)和三甲基甲硅烷基乙炔(0.14mL,1.01mmol)在无水CH3CN(2.5mL)中合并。向该溶液中依次加入Pd2Cl2(烯丙基)2(20mg,0.055mmol)、P(tBu)3(0.013mL,0.054mmol)和哌啶(0.13mL,1.32mmol)。在氩气下，将所得的混合物在35℃搅拌16小时，然后减压去除溶剂，获得粗产物，为棕色残余物，将其通过柱色谱法纯化(SiO2，100％己烷至20％EtOAc的己烷溶液)，获得淡橙色油状物(157mg,70％)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ7.13(dd,3JH-H＝8.3,4JH-H＝1.8,1H),7.05(d,4JH-H＝1.8,1H),6.76(d,3JH-H＝8.3,1H),4.49(q,3JH-F＝8.0,2H),3.84(s,3H),3.42–3.38(m,2H),3.10(t,3JH-H＝6.7,2H),2.73(s,3H),2.14–2.08(m,2H),0.24(s,9H)；13C-NMR(151MHz,CDCl3)δ153.2,141.0,127.5,123.3,122.2(q,1JC-F＝280),115.6,111.2,105.4,92.4,63.8(q,2JC-F＝40),55.5,53.1,49.1,39.6,21.5,0.2；19F-NMR(376MHz,CDCl3)δ-74.0；ESI-LRMS(+)m/z 438[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C18H27NO4F3SSi]+计算438.1382,实测438.1377；Rf(SiO2,20％EtOAc的己烷溶液)＝0.3。
化合物55a
在氩气下，将三乙胺三氢氟酸(3mL,6.75mmol)加入到化合物54a(341mg,0.755mmol)的无水THF(5mL)溶液中。将溶液在30℃搅拌72小时，然后减压去除溶剂。然后，将残余物溶解在CH2Cl2(30mL)中，用水(4×30mL)洗涤。将合并的水层用CH2Cl2(1×30mL)萃取，将合并的有机层经K2CO3干燥，蒸发溶剂，然后获得浅棕色油状物(207mg,72％)。将该产物不经进一步纯化用于下一步；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.18(dd,3JH-H＝8.4,4JH-H＝2.0,1H),7.08(d,4JH-H＝2.0,1H),6.80(d,3JH-H＝8.4,1H),4.46(q,3JH-F＝8,2H),3.84(s,3H),3.38–3.31(m,2H),3.17(t,3JH-H＝6.6,2H),3.09(q,3JH-H＝7.1,2H),2.99(s,1H),2.05–1.95(m,2H),0.99(t,3JH-H＝7.1,3H),13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ155.0,138.3,128.2,126.1,122.2(q,1JC-F＝280),114.2,111.6,83.9,75.8,63.8(q,2JC-F＝40),55.5,49.9,49.1,46.7,21.6,12.2；19F-NMR(376MHz,CDCl3)δ-74.0；ESI-LRMS(+)m/z 380[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C16H21NO4SF3]+计算380.1143,实测380.1155。
化合物55b
在氩气下，将三乙胺三氢氟酸(1.1mL,6.75mmol)加入到化合物54b(195mg,0.446mmol)的无水THF(3mL)溶液中。将溶液在30℃搅拌48小时，然后减压去除溶剂。然后，将残余物溶解在CH2Cl2(30mL)中，用水(3×30mL)洗涤。将合并的水层用CH2Cl2(2×30mL)萃取，将合并的有机层经K2CO3干燥，获得浅棕色油状物(160mg,98％)。将该产物不经进一步纯化用于下一步；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.15(dd,3JH-H＝8.3,4JH-H＝1.9,1H),7.07(d,4JH-H＝1.9,1H),6.78(d,3JH-H＝8.3,1H),4.50(q,3JH-F＝8.0,2H),3.85(s,3H),3.43–3.37(m,2H),3.10(t,3JH-H＝6.6,2H)2.99(s,1H),2.73(s,3H),2.17–2.07(m,2H)；13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ153.3,141.1,127.4,123.2,122.2(q,1JC-F＝280),114.4,111.2,83.9,75.8,63.8(q,2JC-F＝40),55.5,53.0,49.0,39.4,21.5；19F-NMR(376MHz,CDCl3)δ-74.0；ESI-LRMS(+)m/z 366[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C15H19NO4SF3]+计算366.0987,实测366.0986。
化合物56a
在氩气下，将化合物55a(207mg,0.546mmol)和(6-(羟甲基)-4-(溴吡啶-2-基)(甲基)次膦酸乙酯6(152mg,0.517mmol)在无水CH3CN(5mL)中合并。向该溶液中依次加入Pd2Cl2(烯丙基)2(20mg,0.055mmol)、P(tBu)3(0.02mL,0.082mmol)和哌啶(0.11mL,1.11mmol)。在氩气下，将所得的混合物在35℃搅拌18小时，然后减压去除溶剂。将残余物溶解在CH2Cl2(40mL)中，用H2O(3×40mL)洗涤，将合并的水层用CH2Cl2(2×40mL)萃取。将合并的有机层经K2CO3干燥，减压去除溶剂，获得橙色油状物，将其通过反相HPLC(10至100％CH3CN，10分钟,tr＝11.3min)纯化，获得浅黄色油状物(111mg,36％)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.02(d,3JH-P＝6.0,1H),7.51(s,1H),7.21(dd,3JH-H＝8.4,4JH-H＝2.0,1H),7.11(d,4JH-H＝2.0,1H),6.84(d,3JH-H＝8.4,1H),4.81(s,2H),4.46(q,3JH-F＝8,2H),4.16–4.05&3.91–3.79(m,2H),3.86(s,3H),3.38–3.31(m,2H),3.19(t,3JH-H＝6.6,2H),3.11(q,3JH-H＝7.1,2H),2.08–1.99(m,2H),1.77(d,2JH-P＝15,3H),1.31–1.14(t,3JH-H＝7.0,3H),1.01(t,3JH-H＝7.1,3H)；13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ161.0(d,3JC-P＝19),155.6,153.2(d,1JC-P＝155),138.6,133.1(d,3JC-P＝11),128.2(d,2JC-P＝22),128.1,125.8,124.1(d,4JC-P＝3),122.1(q,1JC-F＝280),113.8,111.8,96.4,85.2(d,4JC-P＝2),64.2,63.7(q,2JC-F＝40),61.3(d,2JC-P＝6),55.6,49.8,49.1,46.7,21.6,16.5(d,3JC-P＝6),13.5(d,1JC-P＝104)12.2；19F-NMR(376MHz,CDCl3)δ-74.0；31P-NMR(162MHz,CDCl3)δ+39.5；ESI-LRMS(+)m/z 593[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C25H33N2O7SF3P]+计算593.1698,实测593.1709。
化合物56b
在氩气下，将化合物55b(160mg,0.438mmol)和(6-(羟甲基)-4-(溴吡啶-2-基)(甲基)次膦酸乙酯6(116mg,0.395mmol)在无水CH3CN(3mL)中合并。向该溶液中依次加入Pd2Cl2(烯丙基)2(16mg,0.044mmol)、P(tBu)3(0.016mL,0.066mmol)和哌啶(0.09mL,0.92mmol)。在氩气下，将所得的混合物在35℃搅拌16小时，然后减压去除溶剂。将残余物溶解在CH2Cl2(40mL)中，用H2O(3×40mL)洗涤，将合并的水层用CH2Cl2(2×40mL)萃取。将合并的有机层经K2CO3干燥，减压去除溶剂，获得棕色油状物，将其通过反相HPLC(10至100％CH3CN，10分钟,tr＝10.8min)纯化，获得浅黄色油状物(119mg，52％)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ8.00(d,3JH-P＝6.0,1H),7.50(s,1H),7.18(dd,3JH-H＝8.4,4JH-H＝2.0,1H),7.09(d,4JH-H＝2.0,1H),6.82(d,3JH-H＝8.4,1H),4.80(s,2H),4.49(q,3JH-F＝8.0,2H),4.13–4.06&3.91–3.82(m,2H),3.86(s,3H),3.42–3.38(m,2H),3.12(t,3JH-H＝6.3,2H),2.75(s,3H),2.16–2.09(m,2H),1.76(d,2JH-P＝15,3H),1.26(t,3JH-H＝7.1,3H)；13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ161.0(d,3JC-P＝19),153.9,153.3(d,1JC-P＝155),141.4,133.1(d,3JC-P＝11),128.2(d,2JC-P＝22),127.5,124.1(d,4JC-P＝3),123.0,122.2(q,1JC-F＝280),114.0,111.5,96.4,85.2(d,4JC-P＝2),64.2,63.8(q,2JC-F＝40),61.3(d,2JC-P＝7),55.5,53.0,49.0,39.4,21.5,16.5(d,3JC-P＝6),13.5(d,1JC-P＝104)；19F-NMR(376MHz,CDCl3)δ-73.9；31P{1H}-NMR(162MHz,CDCl3)δ+39.6；ESI-LRMS(+)m/z 579[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C24H31N2O7SF3P]+计算579.1542,实测579.1543。
化合物57a
在氩气下，将化合物56a(110mg,0.186mmol)、甲磺酸酐(65mg,0.373mmol)和DIPEA(0.065mL,0.373mmol)在无水THF(3mL)中合并。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后减压去除溶剂。将所得的残余物溶解在CH2Cl2(40mL)中，用水(3×40mL)洗涤，将有机层经K2CO3干燥。减压去除溶剂，获得黄色油状物(125mg,100％)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.09(dd,3JH-P＝6.0,4JH-H＝1.3,1H),7.63(s,1H),7.24(dd,3JH-H＝8.4,4JH-H＝1.9,1H),7.13(d,4JH-H＝1.9,1H),6.86(d,3JH-H＝8.4,1H),5.36(s,2H),4.46(q,3JH-F＝8.0,2H),4.18–4.06&3.93–3.83(m,2H),3.87(s,3H),3.38–3.32(m,2H),3.20(t,3JH-H＝6.4,2H),3.15–3.09(m,5H),2.09–1.99(m,2H),1.77(d,2JH-P＝15),1.27(t,3JH-H＝7.1,3H),1.02(t,3JH-H＝7.0,3H)；ESI-LRMS(+)m/z 671[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C26H35N2O9S2F3P]+计算671.1474,实测671.1483。
化合物57b
在氩气下，将化合物56b(119mg，0.206mmol)、甲磺酸酐(72mg，0.413mmol)和DIPEA(0.072mL，0.413mmol)在无水THF(3mL)中合并。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后减压去除溶剂。将所得的残余物溶解在CH2Cl2(40mL)中，用水(3×40mL)洗涤，将有机层经K2CO3干燥。减压去除溶剂，获得透明无色油状物(88mg，65％)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.08(d,3JH-P＝6.0,1H),7.63(s,1H),7.21(dd,3JH-H＝8.3,4JH-H＝2.0,1H),7.11(d,4JH-H＝2.0,1H),6.84(d,3JH-H＝8.3,1H),5.36(s,2H),4.50(q,3JH-F＝8.0,2H),4.17–4.08&3.93–3.83(m,2H),3.87(s,3H),3.44–3.38(m,2H),3.17–3.11(m,5H),2.77(s,3H),2.18–2.09(m,2H),1.76(d,2JH-P＝15,3H),1.27(t,3JH-H＝7.1,3H)。
化合物58(混合物E,Z)
在氩气氛下，将化合物6(74mg,0.25mmol)、N-烯丙基氨基甲酸叔丁酯(155mg,0.99mmol)、乙酸钯(II)(11mg,0.05mmol)和三苯基膦(20mg,0.08mmol)在甲苯(2mL)中合并。通过将氩气在溶液中鼓泡15分钟来将反应混合物脱气。加入三乙胺(0.3mL，2.2mmol)，将混合物在氩气下加热至80℃持续18小时。在冷却后，减压去除溶剂，将所得的残余物溶解在CH2Cl2(30mL)中，用H2O(4×30mL)洗涤，经MgSO4干燥。减压去除溶剂，获得粗产物，将其通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝9.1min)纯化，获得黄色油状物，为E/Z异构混合物(93mg,63％)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.03–7.91(2×d,1H),7.45–7.28(2×s,1H),6.61–6.44(m,2H),4.83–4.77(2×s,2H),4.14–4.03&3.89–3.77(m,2H),3.97–3.93(m,2H),1.80–1.74(2×d,3H),1.48–1.40(2×t,3H)；31P{1H}-NMR(298K,162MHz,CDCl3)δ+40.5,+40.4；ESI-LRMS(+)m/z 371[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C17H28N2O5P]+计算371.1736,实测371.1746。
化合物59
在一个容器中，将化合物58的E/Z异构混合物(210mg,0.57mmol)溶解在EtOH(60mL)中，向其中加入Pd/C(Pd含量10％，10mg)。然后，将容器装载到Parr氢化器(压力40巴H2)上，将反应混合物搅拌8小时。此后，过滤去除催化剂，减压去除溶剂，获得浅黄色油状物(211mg，定量)；1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ7.82(d,3JH-P＝6.0,1H),7.24(s,1H),4.78(s,2H),4.66(br s,1H),4.12–3.79(m,2H),3.18–3.11(m,2H),2.73–2.68(m,2H),1.87–1.81(m,2H),1.76(d,2JH-P＝15,3H),1.43(s,9H),1.26(t,3JH-H＝7.0,3H)；13C-NMR(151MHz,CDCl3)δ160.5(d,3JC-P＝19),156.1,153.0(d,1JC-P＝156),152.2(d,3JC-P＝10),127.0(d,2JC-P＝21),123.0,79.5,64.1,61.2(d,2JC-P＝6),40.0,32.6,30.8,28.5,16.6(d,3JC-P＝6),13.7(d,1JC-P＝104)；31P{1H}-NMR(243MHz,CDCl3)δ+39.9；ESI-LRMS(+)m/z 373[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C17H30N2O5P]+计算373.1892,实测373.1880；Rf＝0.4(SiO2,5％CH3OH的CH2Cl2溶液)。
化合物60
在氩气下，将化合物59(25mg,0.067mmol)、甲磺酸酐(20mg,0.115mmol)和DIPEA(0.03mL,0.172mmol)在无水THF(0.5mL)中合并。将反应混合物在室温搅拌1小时，通过TLC监测。完全转化后，减压去除溶剂，将所得的粗残余物溶解在CH2Cl2(40mL)中，用水(3×40mL)洗涤，将有机层经K2CO3干燥。减压去除溶剂，获得透明油状物(30mg，定量)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(d,3JH-P＝6.0,1H),7.41(s,1H),5.33(s,2H),4.66(br s,1H),4.15–3.77(m,2H),3.19–3.09(m,5H),2.76–2.67(m,2H),1.89–1.79(m,2H),1.74(d,2JH-P＝15,3H),1.42(s,9H),1.25(t,3JH-H＝7.1,3H)；ESI-LRMS(+)m/z 373[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C18H32N2O7PS]+计算451.1668,实测451.1666；Rf＝0.5(SiO2,5％CH3OH的CH2Cl2溶液)。
根据WO2018/229408中描述的用于羧酸酯衍生物的过程来制备化合物61、62和63。
如化合物13所述合成化合物64。
如络合物14所述合成络合物65。
如化合物11所述合成化合物66。
如化合物12所述合成化合物67。
如化合物13所述合成化合物68。
如络合物14所述合成络合物69。
如络合物78a-b所述合成络合物70。
如络合物99a-b所述合成络合物71。
如化合物13所述合成化合物72。
如络合物14所述合成络合物73a。
如络合物78a-b所述合成络合物73b。
化合物74a
在氩气下，将1-叔丁氧基羰基-1,4,7-三氮杂环壬烷二盐酸盐(66mg,0.218mmol)、甲磺酸酯30(288mg,0.484mmol)和K2CO3(122mg,0.833mmol)在无水CH3CN(2.5mL)中合并。将所得的混合物加热至70℃持续16小时，然后冷却至室温。通过过滤将溶液与无机盐分离，减压去除溶剂，获得粗产物，为粘稠的残余物。将其通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝17.5min)纯化，获得橙色油状物(160mg,27％)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ8.01–7.97(m,2H),7.65(s,1H),7.56(s,1H),7.11(d,2H),7.05(s,2H),6.80(d,2H),4.13(q,4H),4.11–4.06&3.88–3.80(m,4H),4.05(t,4H),3.94(s,2H),3.93(s,2H),3.41–3.31(m,4H),3.15(q,8H),3.12–3.04(m,4H),2.74–2.62(m,4H),2.51(t,4H),2.18–2.11(m,4H),1.76(d,2JH-P＝15),1.75(d,2JH-P＝15),1.47(s,9H),1.26–1.22(m,12H),1.04(t,12H)；13C-NMR(176MHz,CDCl3)δ173.1,161.7(d,3JC-P＝20),161.4(d,3JC-P＝20),155.7,154.1,153.9(d,1JC-P＝157),153.6(d,1JC-P＝157),140.1,132.8(app.t,3JC-P＝11),127.9(app.t,2JC-P＝21),126.5,126.4(d,4JC-P＝3),126.2(d,4JC-P＝3),124.8,114.0,113.8,112.8,96.5,96.3,85.2,85.1,79.5,67.5,62.9,62.6,61.1(d,2JC-P＝6.4),61.0(d,2JC-P＝6.4),60.6,56.1,55.0,54.7,54.0,50.0,49.7,45.7,30.9,28.8,24.7,16.6(d),14.3,13.4(d,1JC-P＝104),13.3(d,1JC-P＝104),12.4；31P{1H}-NMR(283MHz,CDCl3)δ+40.1,+40.0；ESI-LRMS(+)m/z1226[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C65H94N7O12P2]+计算1226.644,实测1226.646。
化合物74b
在氩气下，将1-叔丁氧基羰基-1,4,7-三氮杂环壬烷二盐酸盐(38mg,0.126mmol)、甲磺酸酯44(167mg,0.288mmol)和K2CO3(104mg,0.753mmol)在无水CH3CN(4mL)中合并。将所得的混合物加热至60℃持续48小时，然后冷却至室温。通过过滤将溶液与无机盐分离，减压去除溶剂，获得粗产物。将其通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝12.2min)纯化，获得淡橙色油状物(110mg,73％)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.00(d,2H),7.65(s,1H),7.59(s,1H),7.12(dd,2H),7.06(s,2H),6.80(d,2H),4.18–3.78(m,16H),3.47–3.32(m,4H),3.21–3.06(m,8H),2.83–2.72(m,10H),2.53(t,4H),2.23–2.14(m,4H),1.76(d,6H),1.48(s,9H),1.28–1.22(m,12H),1.11(t,6H)；31P{1H}-NMR(162MHz,CDCl3)δ+40.2,+40.1；ESI-LRMS(+)m/z 400[M+3H]3+,600[M+2H]2+,1198[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C63H90N7O12P2]+计算1198.612,实测1198.607。
化合物75a
制备化合物74a(19mg，0.016mmol)在三氟乙酸和CH2Cl2中的溶液(10％v/v，总共3mL)，在氩气下搅拌40分钟。紧接着，减压去除溶剂。加入另外的CH2Cl2(～50mL)，减压去除溶剂。将该过程重复3次。将残余物溶解在CH2Cl2(30mL)中，用Na2CO3水溶液(4％，pH＝11，3×30mL)洗涤，经K2CO3干燥。减压去除溶剂，获得橙色油状物(17mg，定量)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.95(dd,3JH-P＝6.0,4JH-H＝1.3,2H),7.38(app.s,2H),7.12(dd,3JH-H＝8.4,4JH-H＝2.0,2H),7.06(d,4JH-H＝2.0,2H),6.81(d,3JH-H＝8.4,2H),4.23–4.10&3.96–3.86(m,8H),4.05(t,3JH-H＝6.4,4H),3.99(s,4H),3.31–3.24(m,4H),3.16(q,3JH-H＝7.1,8H),3.13–3.07(m,4H),2.73(br s,4H),2.52(t,3JH-H＝7.2,4H),2.20–2.11(m,4H),1.77(d,2JH-P＝15,6H),1.31–1.22(m,12H),1.05(t,3JH-H＝7.1,12H)；13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ173.2,159.4(d,3JC-P＝20),154.6(d,1JC-P＝157),154.2,140.2,133.4(d,3JC-P＝12),127.9(d,2JC-P＝22),126.7,126.3,124.8,113.5,112.8,97.5,84.7,67.5,61.3(d,2JC-P＝6),60.7,60.0,53.9,51.6,50.1,49.4,49.2,45.7,44.8,31.0,24.7,16.7(d,3JC-P＝6),14.4,13.8(d,1JC-P＝103),12.5；31P{1H}-NMR(162MHz,CDCl3)δ+39.2；ESI-LRMS(+)m/z 1127[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C60H86N7O10P2]+计算1126.592,实测1126.592。
化合物75b
制备化合物74b(110mg,0.092mmol)在三氟乙酸和CH2Cl2中的溶液(10％v/v，总共3mL)，在氩气下搅拌60分钟。减压去除溶剂，加入另外的CH2Cl2(～50mL)，减压去除溶剂。将该过程重复4次。将残余物溶解在CH2Cl2(30mL)中，用Na2CO3水溶液(4％,pH＝11,3×30mL)洗涤，经K2CO3干燥。减压去除溶剂，获得橙色油状物(111mg，定量)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ7.89(d,3JH-P＝6.0,2H),7.77(s,2H),7.64(dd,3JH-H＝8.5,4JH-H＝1.3,2H),7.57(s,2H),7.13(d,3JH-H＝8.5,2H),4.39(s,4H),4.22(t,3JH-H＝6.5,4H),4.15–4.07&3.97–3.90(m,8H),3.68(q,3JH-H＝7.2,4H),3.64–3.51(m,8H),3.43–3.35(m,4H),3.29(s,6H),2.51(t,3JH-H＝6.8,4H),2.21–2.16(m,4H),1.75(d,2JH-P＝15,6H),1.27(td,,3JH-H＝7.1,4JH-P＝3.0,6H),1.23(t,3JH-P＝7.1,6H),1.18(t,3JH-H＝7.2,6H)；13C-NMR(176MHz,CDCl3)δ173.1,156.2(d,3JC-P＝21),153.3(d,1JC-P＝160),152.5,135.6,128.2,128.1(d,2JC-P＝20),127.7,127.1(d,4JC-P＝4),115.4,114.2,94.6,86.2(d,4JC-P＝2.6),69.1,62.6(d,2JC-P＝7.0),61.0,59.7,54.1,53.6,51.5,50.0,44.2,30.5,24.0,16.3(d,3JC-P＝6.2),14.2,13.4(d,1JC-P＝102),10.3；31P-NMR(162MHz,CDCl3)δ+40.8；ESI-LRMS(+)m/z1098[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C58H82N7O10P2]+计算1098.5598,实测1098.5573。
化合物76a
在氩气下，将化合物75a(43mg,0.038mmol)、化合物60(45mg,0.10mmol)和K2CO3(30mg,0.22mmol)在无水CH3CN(2mL)中合并，加热至70℃持续18小时。这段时间之后，LCMS分析证实了大环化合物的完全转化。使反应混合物冷却，然后通过过滤将其与无机盐分离。减压去除溶剂，获得橙色固体(88mg)，其不经进一步纯化直接用于下一步；ESI-LRMS(+)m/z1481[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C77H113N9O14P3]+计算1480.762,实测1480.760。
化合物76b
在氩气下，将化合物75b(111mg,0.0919mmol)、化合物60(59mg,0.130mmol)和K2CO3(45mg,0.33mmol)在无水CH3CN(3mL)中合并，加热至65℃持续16小时。这段时间之后，LCMS分析证实了大环化合物的完全转化。使反应混合物冷却，然后通过过滤将溶液与无机盐分离。减压去除溶剂，获得橙色油状物(165mg)，其不经进一步纯化直接用于下一步；ESI-LRMS(+)m/z 1453[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C75H109N9O14P3]+计算1452.731,实测1452.729。
络合物77a
将来自前面步骤的粗配体76a(88mg)溶解在CH3OH/H2O混合物(4:1,总计2.5mL)中，使用NaOH水溶液将pH调节至12。将溶液加热至60℃持续1.5小时。这段时间之后，LCMS分析证实了次膦酸酯和发色团头酯基团的完全水解。在冷却并使用盐酸(0.1M)将pH调节至7后，加入EuCl3.6H2O(42mg,0.115mmol)，将反应混合物加热至60℃持续18小时。将反应混合物通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝8.5min)纯化，获得黄色固体(22mg，三步39％)；ESI-LRMS(+)m/z 1490[M+H]+,746[M+2H]2+；ESI-HRMS(+)[C67H91 151EuN9O14P3]2+计算745.7561,实测745.7562；τH2O(ms)＝0.27(pH＝8),0.39(pH＝7),0.53(pH＝6),0.95(pH＝5),0.97(pH＝4)。
络合物77b
将来自前面步骤的粗配体76b(165mg)溶解在CH3OH/H2O混合物(1:1,总计2mL)中，使用NaOH水溶液将pH调节至12。将溶液加热至60℃持续1.5小时。这段时间之后，LCMS分析证实了次膦酸酯和发色团头酯基团的完全水解。在冷却并使用盐酸(0.1M)将pH调节至7后，加入EuCl3.6H2O(34mg,0.093mmol)，将反应混合物加热至60℃持续17小时。将反应混合物通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝8.7min)纯化，获得黄色固体(50mg，三步37％)；ESI-LRMS(+)m/z 1462[M+H]+,732[M+2H]2+；ESI-HRMS(+)[C65H86 151EuN9O14P3]+计算1462.473,实测1462.468。
络合物78a
在氩气下，将络合物77a(3.9mg,2.6μmol)和DIPEA(6μL,34μmol)在无水DMSO(0.4mL)中合并。向该溶液中加入HATU(5mg,13μmol)、高牛磺酸(2mg,14μmol)和水(40μL)。将混合物在室温搅拌19小时。在用水稀释后，将反应混合物通过反相HPLC(10至100％CH3OH的H2O溶液，10分钟，tr＝11.6min)纯化，获得黄色固体(4mg，89％)；ESI-LRMS(-)m/z 1730[M-H]-,865[M-2H]2-；ESI-HRMS(+)[C73H101 151EuN11O18P3S2]2-计算864.7601,实测864.7610；τH2O(ms)＝0.25(pH 8),0.34(pH 7),0.70(pH 6),0.98(pH 5),1.04(pH 4)；ε330nm＝39000LM-1cm-1；ФpH 8＝0.3％,ФpH 4＝16％(λexc＝330nm)。
络合物78b
在氩气下，将络合物77b(20mg,13.7μmol)和DIPEA(15μL,85μmol)在无水DMSO(0.5mL)中合并。向该溶液中加入HATU(12mg,31μmol)、高牛磺酸(4.5mg,31μmol)和水(50μL)，将混合物在室温搅拌16小时。在用水稀释后，将反应混合物通过反相HPLC(10至100％CH3OH的H2O溶液，10分钟，tr＝10.6min)纯化，获得黄色固体(9mg,38％)；ESI-LRMS(-)m/z1701[M-H]-,850[M-2H]2-；ESI-HRMS(+)[C71H99 151EuN11O18P3S2]2+计算852.7530实测852.7601；τH2O(ms)＝0.30(pH 8),0.29(pH 7),0.42(pH 6),0.77(pH 5),1.05(pH 4)；ε330nm＝39000L M-1cm-1；ФpH 8＝0.01％,ФpH 4＝14.5％(λexc＝330nm)。
如化合物11所述合成化合物80。
如化合物12所述合成化合物81。
如化合物17所述合成化合物82。
如络合物18所述合成络合物83。
使用WO 2004/113275中描述的方法将络合物84官能化。
化合物85a
在氩气下，将1-(叔丁氧基羰基)-1,4,7-三氮杂环壬烷二盐酸盐9(24mg,0.0794mmol)、甲磺酸酯57a(125mg,0.186mmol)和K2CO3(44mg,0.32mmol)在无水CH3CN(3mL)中合并。将所得的混合物加热至65℃持续16小时，然后将粗溶液与无机盐分离，减压去除溶剂，获得橙色油状物，将其通过反相HPLC(10至100％CH3CN在含有0.1％甲酸的H2O中的溶液，10分钟，tr＝13.5min)纯化，获得淡黄色油状物(88mg，80％)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ8.01(s,2H),7.66(s,1H),7.61(s,1H),7.22(d,2H),7.12(s,2H),6.84(d,2H),4.46(q,4H),4.17–3.77(m,14H),3.46–3.31(m,8H),3.25–3.04(m,12H),2.87–2.65(m,4H),2.11–1.98(m,4H),1.77(d,6H),1.48(s,9H),1.25(t,6H),1.01(t,6H)；13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ161.5(d),155.6(d),155.5,153.1,138.6,132.7(d),128.1,127.9(d),126.5(d),125.8,122.1(q),113.9(d),111.8,96.1,85.4,79.7,63.8(q)62.5,61.1(d),55.7,55.6,54.8,54.4,53.7,49.8,49.4,49.1,46.7,46.0,28.7,21.6,16.6(d),13.4(2×d),12.2；19F-NMR(376MHz,CDCl3)δ-74.0；31P-NMR(162MHz,CDCl3)δ+40.1(s)；ESI-LRMS(+)m/z 1379[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C61H84F6N7O14P2S2]+计算1378.490,实测1378.489。
化合物85b
在氩气下，将1-(叔丁氧基羰基)-1,4,7-三氮杂环壬烷二盐酸盐9(18mg,0.06mmol)、甲磺酸酯57b(88mg,0.134mmol)和K2CO3(35mg,0.25mmol)在无水CH3CN(3mL)中合并。将所得的混合物加热至65℃持续18小时，然后将粗溶液与无机盐分离，减压去除溶剂，获得橙色油状物，将其通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝14.2min)纯化，获得淡黄色油状物(58mg,72％)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ8.02–7.98(m,2H),7.65(s,1H),7.58(s,1H),7.20(d,2H),7.11(s,2H),6.83(d,2H),4.50(q,4H),4.15–4.06&3.89–3.81(m,10H),3.95(2×s,4H),3.44–3.32(m,8H),3.16–3.05(m,8H),2.76(s,6H),2.73–2.65(m,4H),2.17–2.10(m,4H),1.76(2×d,6H),1.48(s,9H),1.28–1.22(m,6H)；19F-NMR(376MHz,CDCl3)δ-73.9；31P-NMR(162MHz,CDCl3)δ+40.1(s)；ESI-LRMS(+)m/z1350[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C59H80F6N7O14P2S2]+计算1350.458,实测1350.455。
化合物86a
制备化合物85a(88mg，0.064mmol)在三氟乙酸和CH2Cl2中的溶液(10％v/v，总共3mL)，在氩气下搅拌60分钟。紧接着，减压去除溶剂。加入另外的CH2Cl2(～50mL)，减压去除溶剂。将该过程重复3次。在高真空下干燥数小时，获得橙色油状物(88mg，定量)；1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ8.00(d,4JH-H＝1.9,2H),7.98(dd,3JH-P＝6.0,4JH-H＝1.1,2H),7.82(dd,3JH-H＝8.8,4JH-H＝1.9,2H),7.75–7.74(m,2H),7.42(d,3JH-H＝8.8,2H),5.20–5.08(m,12H),4.70(q,3JH-F＝8.3,4H),4.43(s,4H),4.16–3.90(m,10H),3.88–3.80(m,4H),3.75(q,3JH-H＝7.1,4H),3.49(t,3JH-H＝7.2,4H),2.04–1.94(m,4H),1.80(d,2JH-P＝15,6H),1.30(t,3JH-H＝7.0,6H),1.13(t,3JH-H＝7.1,6H)；13C-NMR(101MHz,CD3OD)δ161.3(d,3JC-P＝20),155.5,155.1(d,1JC-P＝157),137.0,134.2(d,3JC-P＝12),128.9(d,4JC-P＝2.5),128.8(d,2JC-P＝22),127.8,126.1,123.8(q,1JC-F＝280),116.8,115.0,94.9,87.2(d,4JC-P＝2.2),65.7(q,2JC-F＝38),63.1(d,2JC-P＝6.5),60.6,57.7,56.6,55.3,52.4,51.0,48.0,45.5,32.7,26.7,23.7,20.8,16.8(d,3JC-P＝6.2),13.7(d,1JC-P＝103),10.4；19F-NMR(376MHz,CD3OD)δ-73.5(-SO2CH2CF 3),-74.9(TFA盐)；31P-NMR(162MHz,CD3OD)δ+40.8；ESI-LRMS(+)m/z 1279[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C56H76F6N7O12P2S2]+计算1278.437,实测1278.440。
化合物86b
制备化合物85b(29mg,0.021mmol)在三氟乙酸和CH2Cl2中的溶液(10％v/v，总共3mL)，在氩气下搅拌60分钟。紧接着，减压去除溶剂。加入另外的CH2Cl2(～50mL)，减压去除溶剂。将该过程重复3次。在高真空下干燥数小时，获得橙色油状物(29mg，定量)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(d,3JH-P＝6.0,2H),7.57–7.43(m,6H),7.00(d,3JH-H＝8.5,2H),4.51(q,3JH-F＝7.9,4H),4.27–4.09&4.03–3.87(m,14H),3.67–3.53(m,6H),3.47–3.26(m,12H),3.13–3.03(m,8H),2.14–2.05(m,4H),1.77(d,2JH-P＝15,6H),1.31(t,3JH-H＝7.4,6H)；19F-NMR(376MHz,CDCl3)δ-74.6(-SO2CH2CF 3),-76.3(TFA盐)；31P-NMR(162MHz,CDCl3)δ+40.3；ESI-LRMS(+)m/z 1250[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C54H72N7F6O12P2S2]+计算1250.406,实测1250.408。
化合物87a
在氩气下，将化合物86a(44mg,0.032mmol)、化合物60(30mg,0.067mmol)和K2CO3(30mg,0.22mmol)在无水CH3CN(2mL)中合并，加热至60℃持续15小时。这段时间之后，LC-MS分析证实了大环化合物的完全转化。使反应混合物冷却，然后通过过滤将溶液与无机盐分离。减压去除溶剂，获得黄色油状物(72mg)，其不经进一步纯化直接用于下一步；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.96(d,3JH-P＝6.2,1H),7.78(d,3JH-P＝6.2,2H),7.42(s,1H),7.24(s,2H),7.19(dd,3JH-H＝8.4,4JH-H＝2.0,2H),7.09(d,4JH-H＝2.0,2H),6.82(d,3JH-H＝8.4,2H),4.76(s,6H)4.68(br s,1H),4.45(q,3JH-F＝8.0,4H),4.12–3.76(m,16H),3.37–3.30(m,4H),3.20–3.05(m,10H),2.94–2.82(m,8H),2.72–2.64(m,2H),1.83–1.79(m,4H),1.73(d,2JH-P＝15,9H),1.41(s,9H),1.26–1.20(m,9H),0.99(t,3JH-H＝7.1,6H)；19F-NMR(376MHz,CDCl3)δ-74.0；31P-NMR(162MHz,CDCl3)δ+40.0；ESI-LRMS(+)m/z 1633[M+H]+,817[M+2H]2+；ESI-HRMS(+)[C73H104F6N9O16P3S2]2+计算816.8080,实测816.8085。
化合物87b
在氩气下，将化合物86b(29mg,0.021mmol)、化合物60(19mg,0.042mmol)和K2CO3(20mg,0.15mmol)在无水CH3CN(2mL)中合并，加热至60℃持续15小时。这段时间之后，LCMS分析证实了大环化合物的完全转化。使反应混合物冷却，然后通过过滤将溶液与无机盐分离。减压去除溶剂，获得黄色油状物(47mg)，其不经进一步纯化直接用于下一步；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.99(d,3JH-P＝6.0,1H),7.80(dd,3JH-P＝6.0,4JH-H＝1.4,2H),7.44–7.42(m,1H),7.25–7.22(m,2H),7.22–7.16(m,2H),7.09(d,4JH-H＝1.8,2H),6.83(d,3JH-H＝8.4,2H),4.77(s,6H),4.50(q,3JH-F＝8.0,4H),4.13–3.76(m,16H),3.43–3.38(m,2H),3.17–3.09(m,14H),2.75(s,6H),2.71–2.66(m,2H),1.85–1.80(m,4H),1.74(d,2JH-P＝15,9H),1.42(s,9H),1.25(t,3JH-H＝7.1,9H)；19F-NMR(376MHz,CDCl3)δ-73.9；31P-NMR(162MHz,CDCl3)δ+40.0；ESI-LRMS(+)m/z 1605[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C71H99F6N9O16P3S2]+计算1604.577,实测1604.577。
络合物88a
将粗配体87a(57mg)溶解在CH3OH/NaOH水溶液的混合物(0.1M，3:1，总计2mL)中。将溶液加热至70℃持续24小时。这段时间之后，LCMS分析证实了次膦酸酯和磺酸酯基团的完全水解。在冷却并使用稀盐酸(0.1M)将pH调节至6后，加入EuCl3.6H2O(14mg,0.038mmol)，将反应混合物加热至75℃持续24小时。将反应混合物通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝7.9min)纯化，获得淡黄色固体(13mg,两步27％)；τH2O(ms)＝0.31(pH9),0.31(pH8),0.29(pH 7),0.41(pH 6),0.76(pH 5),1.07(pH 4)；ε332nm＝35000M-1cm-1；ФpH 8＝0.06％,ФpH 4＝13.4％(λexc＝332nm)。
络合物88b
将粗配体87b(23mg)溶解在CH3OH/NaOH水溶液的混合物(0.1M，3:1，总计2mL)中。将溶液加热至70℃持续48小时。这段时间之后，LCMS分析证实了次膦酸酯和磺酸酯基团的完全水解。在冷却并使用盐酸(0.1M)将pH调节至5.5后，加入EuCl3.6H2O(8mg，0.022mmol)，将反应混合物加热至75℃持续24小时。将反应混合物通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝7.9min)纯化，获得深黄色固体(1.8mg，两步11％)；τH2O(ms)＝0.30(pH6.5),0.31(pH6),0.40(pH 5),0.83(pH 4),1.01(pH 3).ε336nm＝35000M-1cm-1；ФpH 6＝0.06％,ФpH 3＝13％(λexc＝336nm)。
如化合物92所述合成化合物89。
如化合物93所述合成化合物90。
如化合物78a所述合成化合物91。
化合物92
在氩气下，将化合物85a(44mg,0.032mmol)、化合物38(31mg,0.049mmol)和K2CO3(30mg,0.22mmol)在无水CH3CN(2mL)中合并，加热至60℃持续14小时。这段时间之后，LCMS分析证实了大环化合物85a的完全转化。使反应混合物冷却，然后通过过滤将溶液与无机盐分离。减压去除溶剂，获得黄色油状物(47mg)，其不经进一步纯化直接用于下一步；1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ7.91–7.82(m,5H),7.30–7.16(m,7H),6.99–6.93(m,3H),4.84(s,6H),4.64(q,3JH-F＝8.1,4H),4.14–3.84(m,22H),3.43–3.37(m,2H),3.30–3.24(m,2H),3.19–3.07(m,8H),2.91–2.83(m,8H),2.02–1.89(m,6H),1.77(d,2JH-P＝15,9H),1.44(s,9H),1.26–1.21(m,9H),1.03–0.98(m,12H)；19F-NMR(376MHz,CD3OD)δ-76.8；31P-NMR(162MHz,CD3OD)δ+41.8；ESI-LRMS(+)m/z 1821[M+H]+,911[M+2H]2+；ESI-HRMS(+)[C85H117F6N10O17P3S2]2+计算910.8594,实测910.8554。
络合物93
将粗配体92(38mg)溶解在CH3OH/NaOH水溶液的混合物(0.1M，3:1，总计2mL)中。将溶液加热至70℃持续24小时。这段时间之后，LCMS分析证实了次膦酸酯和磺酸酯基团的完全水解。在冷却并使用盐酸(0.1M)将pH调节至6.5后，加入EuCl3.6H2O(14mg,0.038mmol)，将反应混合物加热至75℃持续24小时。将反应混合物通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝8.8min)纯化，获得淡黄色固体(11mg，两步25％)；τH2O(ms)＝0.20(pH 9),0.21(pH8),0.22(pH 7),0.35(pH 6),0.69(pH 5),0.98(pH 4),0.98(pH 4),1.01(pH3.5).ε332nm＝75000M-1cm-1；ФpH 8＝0.01％,ФpH 4＝15.9％(λexc＝332nm)。
根据US9,981,967中描述的过程获得化合物94。
如化合物20所述制备化合物95。
如络合物21所述制备络合物96。
如络合物78a所述制备络合物97。
如络合物99a所述制备络合物98。
络合物99a
向络合物78a(6.93mg,4μmol)中加入三氟乙酸(200μL)。将混合物在室温下搅拌1小时，然后通过制备型HPLC(柱Waters Xbridge C18,5μm,20×100mm–A/H2O 25mM TEAAc pH7B/CH3CN t＝0min 2％B–t＝18min 40％B–20mL.min-1)纯化，获得黄色固体(3.5μmol,87％)。ESI-LRMS(-)m/z 814.70[M-2H]2-。
络合物99b
向络合物78b(9mg,5283nmol)中加入三氟乙酸(1mL)。将混合物在室温下搅拌1小时，然后通过制备型HPLC(柱Waters Xbridge C18，5μm，20×100mm–A/H2O 25mM TEAAc pH7B/CH3CN t＝0min 2％B–t＝18min 40％B–20mL.min-1)纯化，获得黄色固体(4256nmol，81％)。ESI-LRMS(-)m/z 800.83[M-2H]2-。
BG-MB-NHS(结构方案26)
如Inorganic Chemistry-2014-53-1854所述获得化合物。
络合物100a
将BG-MB-NHS(0.615mg，1μmol)在干燥DMSO(100μL)中的溶液加入到络合物99a(1.403mg，860nmol)中。向所得的溶液中加入DIPEA(0.5μl，2862nmol)，将混合物在室温下搅拌1小时，通过制备型HPLC(柱Waters Xbridge C18，5μm，20×100mm–A/H2O 25mM TEAAcpH 7B/CH3CN t＝0min 2％B–t＝18min 40％B–20mL.min-1)纯化，获得白色粉末(370nmol,43％)。ESI-LRMS(-)m/z1064.89[M-2H]2-。
络合物100b
将BG-MB-NHS(0.738mg,1.20μmol)在干燥DMSO(430μL)中的溶液加入到络合物99b(1.924mg,1.2μmol)中。向所得的溶液中加入DIPEA(0.5μl,2862nmol)，将混合物在室温下搅拌1小时，通过制备型HPLC(柱Waters Xbridge C18,5μm,20×100mm–A/H2O 25mM TEAAcpH 7B/CH3CN t＝0min 2％B–t＝18min 40％B–20mL.min-1)纯化，获得白色粉末(0.728μmol，产率60％)。ESI-LRMS(-)m/z 1051.09[M+H]2-。
络合物101a
向络合物99a(1.403mg,860nmol)在干燥DMSO(100μL)中的溶液中加入DIPEA(0.150μl,860nmol)和6-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(0.271mg,860nmol)的无水DMSO(5μL)溶液。将混合物在室温下搅拌1小时，通过制备型HPLC(柱Waters Xbridge C18,5μm,20×100mm–A/H2O 25mM TEAAc pH 5B/CH3CN t＝0min 2％B–t＝18min 40％B–20mL.min-1)纯化，获得黄色粉末(761nmol,产率89％)。ESI-LRMS(-)m/z 911.75[M+H]2-。
络合物101b
向络合物99b(1.283mg,800nmol)在干燥DMSO(100μL)中的溶液中加入DIPEA(0.140μl,800nmol)和6-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(0.252mg,800nmol)的无水DMSO(5μL)溶液。将混合物在室温下搅拌1小时，通过制备型HPLC(柱Waters Xbridge C18,5μm,20×100mm–A/H2O 25mM TEAAc pH 5B/CH3CN t＝0min 2％B–t＝18min 40％B–20mL.min-1)纯化，获得黄色粉末(726nmol,产率91％)。ESI-LRMS(-)m/z 898.2[M+H]2-。
按照Helvetica Chimica Acta,1993,76,877中描述的过程合成化合物102。
化合物103
在氩气下，将化合物36(74mg,0.214mmol)和化合物102(140mg,0.195mmol)在无水CH3CN(2.5mL)中合并。向该溶液中依次加入Pd2Cl2(烯丙基)2(10mg,0.027mmol)、P(tBu)3(0.01mL,0.041mmol)和哌啶(0.06mL,0.66mmol)。在氩气下，将所得的混合物在40℃搅拌17小时，然后减压去除溶剂。将粗产物通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，tr＝19.8min)纯化，获得淡橙色油状物(73mg,40％)；1H-NMR(700MHz,CDCl3)δ7.59(s,2H),7.18–7.11(m,2H),6.81(d,3JH-H＝8.2,1H),4.09(t,3JH-H＝5.4,2H),4.01(s,4H),3.49(s,8H),3.40–3.34(m,2H),3.15(q,3JH-H＝6.7,4H),2.03–1.98(m,2H),1.46(s,36H),1.45(s,9H),1.02(t,3JH-H＝6.7,6H)；13C-NMR(176MHz,CDCl3)δ170.7,159.1,156.4,154.6,139.6,133.1,127.3,125.8,122.8,114.9,112.8,94.0,86.4,81.2,79.0,68.5,59.9,56.0,46.4,39.3,29.7,28.7,28.3,12.0；ESI-LRMS(+)m/z 939[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C51H80N5O11]+计算938.5854,实测938.5851。
络合物104
制备络合物102(36mg,0.038mmol)在三氟乙酸和CH2Cl2(20％v/v,总共4mL)中的溶液。将溶液在室温下搅拌6小时，然后减压去除溶剂，获得橙色残余物。将残余物通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝1.2min)纯化，获得游离胺，将所述游离胺溶解在H2O(3mL)中，将pH调节至6.5，然后加入EuCl3.6H2O(14mg,0.038mmol)。将混合物加热至60℃持续24小时，然后通过过滤将溶液与无机盐分离。将溶液通过反相HPLC(10至100％CH3CN的H2O溶液，10分钟，tr＝1.7min)纯化，获得黄色固体(27mg,两步93％)；ESI-LRMS(+)m/z 763[M+H]+；ESI-HRMS(+)[C30H36 151EuN5O9]+计算763.1729,实测763.1731；τH2O(ms)＝0.30(pH 8),0.32(pH 7),0.35(pH 6),0.37(pH 5),0.38(pH 4)；ε330nm＝12000M-1cm-1；ФpH 8＝0.17％,ФpH 4＝3.2％(λexc＝330nm)。
络合物105
向络合物104(0.655mg,860nmol)在干燥DMSO(100μL)中的溶液中加入DIPEA(0.150μl,860nmol)和6-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(0.271mg,860nmol)的无水DMSO(5μL)溶液。将混合物在室温下搅拌1小时，通过制备型HPLC(柱Waters Xbridge C18,5μm,20×100mm–A/H2O 25mM TEAAc pH 6B/CH3CN t＝0min 5％B–t＝19min 40％B–20mL.min-1)纯化，获得黄色粉末。ESI-LRMS(-)m/z 956.85[M+H]-。
络合物106
将BG-MB-NHS(783μg,1274nmol)在干燥DMSO(430μL)中的溶液加入到络合物104(970μg,1274nmol)中。向所得的溶液中加入DIPEA(0.5μl,2862nmol)，将混合物在室温下搅拌1小时，通过制备型HPLC(柱Waters Xbridge C18,5μm,20×100mm–A/H2O 25mM TEAAc pH6B/CH3CN t＝0min 5％B–t＝19min 40％B–20mL.min-1)纯化，获得白色粉末(0.728μmol,产率60％)。ESI-LRMS(-)m/z 1262.06[M+H]-。
研究了本发明的代表性络合物(络合物14、18、21、78a、78b、88a、88b、93、104)的性质。预计Boc基团的存在不会改变这些性质。因此，用Boc基团对官能化的络合物进行了实验。在pH梯度(pH 4至pH 10)中记录吸收和发射光谱。
1)光物理性质
表1和表2总结了光物理性质。
表1：一些铕络合物的光物理性质
络合物 14 18 21 78a 78b 88a 88b 93 104
λexc(nm) 331 328 331 330 330 332 336 332 330
ε(M-1.cm-1) 11450 35000 45000 39000 39000 35000 35000 75000 12000
Q.Y.pH 8 0.5 0.2 0.1 0.3 0.01 0.06 0.06 0.01 0.17
Q.Y.pH 4 16.8 17.6 17 16 14.5 13.4 13 15.9 3.2
传统上，摩尔消光系数ε是使用Beer-Lambert方程计算的，涉及测量一系列不同已知浓度的络合物溶液的吸光度。特定波长的吸光度与浓度的关系图允许根据线性相关的梯度来确定ε。络合物的量子产率(quantum yield，QY)随着pH的降低而增加。对于络合物78b、88a、88b和93，在pH 8时的量子产率接近0，因此这意味着这些络合物在生理pH下几乎不发光，相反，这些络合物在pH 4时非常明亮。
出乎意料的是，在332nm处观察到等吸光点。这可能是有用的，因为在该波长处或附近的激发将允许未质子化的和质子化的络合物的同等激发，所述未质子化的和质子化的络合物存在于溶液中的pH依赖性平衡中。络合物14未观察到等吸光点。
表2：不同pH下络合物的激发态寿命(ms)
络合物 14 18 21 78a 78b 88a 88b 93 104
pH 9 0.5 0.34 0.24 - - 0.31 - 0.2
pH 8 0.53 0.34 0.25 0.25 0.3 0.31 - 0.21 0.3
pH 7 0.74 0.47 0.32 0.34 0.29 0.29 0.3 0.22 0.32
pH 6 1.06 0.78 0.59 0.7 0.42 0.41 0.31 0.35 0.35
pH 5 1.15 0.96 0.83 0.98 0.77 0.76 0.4 0.69 0.37
pH 4 1.16 1 0.84 1.04 1.05 1.07 0.83 0.98 0.38
pH 3 - - - - - - 1.01 1.01 -
2)络合物的发射
对于所有发射光谱，随着pH降低超过生理范围，观察到令人印象深刻的发射强度“开关”(Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.2010,11,50)。ΔJ＝2波段((图2中显示的ΔJ分配)显然是发射光谱中最强的，因此也是最合适的参考波段，尤其是在较高波长激发的情况下。对于本发明的所有络合物，发射强度随pH发生变化。将一个扩展发色团替换为单个吡啶以及在发色团外围安装长头基团对铕发射光谱的形式没有影响。事实上，对络合物所做的重大修饰不会影响铕(III)中心周围的直接协调环境，所述环境实际上保持不受干扰。
作为最具发射性的波段，选择ΔJ＝2波段的最大波长(图2中显示的ΔJ分配)作为要监测的发射波长。
3)络合物的pKa值
表3显示了本发明的络合物的pKa值。
表3：络合物的pKa值(295K,I＝0.1M NaCl)
络合物 14 18 21 78a 78b 88a 88b 93 104
pKa 6.75 6.3 6.21 6.20 5.34 5.2 4.32 5.19 6.35
实验测量的激发态寿命对pH的依赖性具有非常相似的曲线，与铕络合物中并入的发色团的数量无关。
发射寿命随pH的变化如图3、图6、图9、图12、图15、图18、图21、图24和图27所示。通过绘制发射寿命随时间的衰减并将曲线拟合到简单的指数衰减模型，获得每个pH的发射寿命值。对于可逆质子化确定络合物的pKa值。一个发色团的质子化对络合物(络合物18和21)中另一个发色团的pKa没有影响。
发色团的化学修饰涉及pKa值的一些变化(4.32至6.75)。可以微调此pKa值以专门得到期望的值。这一结果是非常期望的，因为可以设想监测细胞内的pH细胞器变化，例如在溶酶体、核内体、反式高尔基体网络中。
4)时间门控实验
镧系元素的长发射寿命的一个好处是可以进行时间门控测量。此外，由于络合物18的“开关”特性，未质子化的和质子化的形式的发射寿命不同。这些性质提供了独特的机会，在某种程度上，通过改变时间窗口来控制表观pKa值以及探针“开关”的相对程度。这方面在实践中使用不同pH值的适当缓冲液(在0.1M NaCl的存在下)在图28中进行了说明。
通过测量激发后延迟时间较长的不同pH下超敏ΔJ＝2波段的发射强度(图28顶部)，获得了较浅的曲线(较低的表观pKa)。
用三个不同的时间窗口(图28底部)说明了这个概念：60–460、1000–2000和1500–2500μs。
除了表观pKa的微调以外，这些时间门控结果还证明了通过改变时间窗口来改变探针的开/关比的幅度的可能性。
表4汇总了络合物18在pH 4(传感物打开)和pH 8(传感物关闭)时的发射强度比率(λem＝613.5nm)，其中发射信号是在不同时间窗口之间测量的。
表4
出于比较目的，络合物的开关响应程度可以量化为pH 4(传感物完全“打开”)和pH8(传感物有效“关闭”)时ΔJ＝2波段最大值的发射强度比例。这些值总结在表4中。
随着使用更长的时间窗口，相对开关响应显著增加。
值得注意的是，由于在络合物外围存在亲水性磺酸根基团，络合物78a-b、88a-b和93的水溶性明显高于络合物14、18和21。
5)荧光强度
使用配备有闪光灯的读板器Pherastar FS测量本发明的代表性络合物(78a、78b、104)的荧光强度。将缓冲液(pH 4至pH 7.8)分布在白色96孔板中，然后将镧系元素络合物(10μL，110nM)分布在包含0.1％BSA的水溶液中。紧接着，在pH 4至pH 7.8之间记录荧光强度，结果报告在图29中。通过比较，还测量了以下络合物的荧光强度：
如WO 2014/111661中所述合成络合物107至110。络合物111为市售可得的，商品名为Lumi4-Tb。
从图29可以看出，本发明的络合物(78a、78b和104)对pH敏感：当pH降低时，这些络合物的荧光强度增加。相比之下，对比络合物(107、108、109、110和111)对pH不敏感，因为它们的荧光强度不会随着pH的变化而显著变化。

Claims (18)

1.一种式(I)化合物：
其中：
R1为–CO2H、-PO(OH)R5或–CH2N(CH2CO2H)2；
R2为–CH2OH、-CH2OSO2CH3、Cl、Br或–CH2N(CH2CO2H)2；
R3为任选地被基团–L1-E或基团G取代的(C1-C6)烷基；
R4为–(CH2)m-NR6R7；
R5为(C1-C4)烷基，优选甲基；任选地被基团–SO3 -取代的苯基，所述基团–SO3 -优选在间位或对位；或苄基；
R6为H或(C1-C4)烷基；
R7为任选地被基团–L1-E取代的(C1-C6)烷基；
或者R6和R7与它们连接的氮原子一起形成哌啶、吗啉或哌嗪，所述哌嗪任选地被叔丁氧基羰基N-保护或任选地被R8 N-取代；
R8为任选地被基团–L1-E取代的(C1-C6)烷基；
L1为键、–CONH-(CH2)n-或–NHCO-(CH2)n-；
E为-SO3H、-SO2(OCH2CF3)、-N+Alk1Alk2Alk3、碳水化合物残基或磺基-甜菜碱；
G为任选地以酯的形式受保护的羧基、任选地被叔丁氧基羰基保护的氨基、琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰氨基、肼基、异硫氰酸酯基或马来酰亚胺基；
Alk1、Alk2和Alk3各自独立地表示(C1-C6)烷基，优选(C1-C4)烷基；
m为0、1、2或3；
n为0、1、2或3。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R1为–CO2H或-PO(OH)R5，其中R5为(C1-C4)烷基，优选甲基，R2为–CH2OH或-CH2OSO2CH3。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中R1和R2各自为–CH2N(CH2COOH)2。
4.一种式(II)或(III)化合物：
其中：
Ra不存在或为–CH2NH2；
Rb、Rc、Rd和Re中的一个为式(IV)基团，其他各自独立地选自–CH2COORf和-CH2PO(OH)Rg；
Rf为H、(C1-C4)烷基、-NHCH(Rh)-(C1-C4)烷基或-NHCH(Rh)-C(O)ORj；
Rg为(C1-C4)烷基；
Rh为(C1-C4)烷基或苯基；
Rj为H或(C1-C4)烷基；
Chrom1、Chrom2和Chrom3各自独立地选自式(IV)基团和式(V)基团：
其中：
每个R1为–CO2H或-PO(OH)R5；
R3为任选地被基团–L1-E或基团G取代的(C1-C6)烷基；
R4为–(CH2)m-NR6R7；
R5为(C1-C4)烷基，优选甲基；任选地被基团–SO3 -取代的苯基，所述基团–SO3 -优选在间位或对位；或苄基；
R6为H或(C1-C4)烷基；
R7为任选地被基团–L1-E取代的(C1-C6)烷基；
或者R6和R7与它们连接的氮原子一起形成哌啶、吗啉或哌嗪，所述哌嗪任选地被叔丁氧基羰基N-保护或任选地被基团R8 N-取代；
R8为任选地被基团–L1-E取代的(C1-C6)烷基；
R9为任选地被基团–L1-E或基团G取代的(C1-C6)烷基；
L1为键、–CONH-(CH2)n-或–NHCO-(CH2)n；
E为-SO3H、-SO2(OCH2CF3)、-N+Alk1Alk2Alk3、碳水化合物残基或磺基-甜菜碱；
G为任选地以酯的形式受保护的羧基、任选地被叔丁氧基羰基保护的氨基、琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰氨基、肼基、异硫氰酸酯基或马来酰亚胺基；
Alk1、Alk2和Alk3各自独立地表示(C1-C6)烷基；
m为0、1、2或3；
n为0、1、2或3；
条件是式(II)化合物包含至少一个式(IV)基团。
5.根据权利要求4所述的化合物，其为式(II)化合物。
6.根据权利要求5所述的化合物，其仅包含一个式(IV)基团。
7.根据权利要求5所述的化合物，其包含两个式(IV)基团。
8.根据权利要求5所述的化合物，其包含三个式(IV)基团。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的化合物，其中每个R1为-PO(OH)R5，其中R5为(C1-C4)烷基，优选甲基。
10.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R4为–NR6R7，其中R6和R7各自独立地为(C1-C4)烷基，或者R6和R7与它们连接的氮原子一起形成哌嗪，所述哌嗪任选地被叔丁氧基羰基N-保护或任选地被基团R8 N-取代。
11.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中L1为键或–CONH-(CH2)n-。
12.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中E为-SO3H或-SO2(OCH2CF3)。
13.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中G为任选地以酯的形式受保护的羧基或任选地被叔丁氧基羰基保护的氨基。
14.一种铕络合物，其包含铕(III)离子和根据权利要求3至13中任一项所述的式(I)、(II)或(III)化合物。
15.根据权利要求14所述的络合物，其具有以下结构：
16.根据权利要求14所述的络合物，其具有以下结构：
其中Z为：
17.一种缀合物，其通过(i)根据权利要求14至16中任一项所述的铕络合物，所述络合物具有基团G，和(ii)目标分子的反应获得。
18.根据权利要求17所述的缀合物，其中目标分子为氨基酸、肽、蛋白质、抗体、糖、碳水化合物链、核苷、核苷酸、寡核苷酸或酶底物。
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