CN116640781B

CN116640781B - MtAHA5基因、MtAHA5蛋白在苜蓿植物中的应用

Info

Publication number: CN116640781B
Application number: CN202310897596.9A
Authority: CN
Inventors: 江文波; 庞永珍; 魏解冰; 闫依诺
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2023-07-21
Filing date: 2023-07-21
Publication date: 2023-11-14
Anticipated expiration: 2043-07-21
Also published as: CN116640781A

Abstract

本发明提供一种MtAHA5基因、MtAHA5蛋白在苜蓿植物中的应用，涉及生物技术和基因工程应用领域，具体应用在S1）调控苜蓿植物中跨液泡膜质子电化学势梯度，促进原花色素前体转运进入苜蓿植物的液泡中；S2）调控苜蓿的原花色素，使苜蓿中的原花色素含量升高；S3）调控苜蓿的原花色素，使苜蓿中的原花色素含量降低；S4）制备高含量原花色素的苜蓿产品中的应用；S5）培育高含量原花色素的转基因紫花苜蓿的应用；S6）培育防止反刍动物臌胀病发生的苜蓿，该苜蓿中具有较高含量的原花色素。本发明为调控苜蓿植物体中原花色素的含量提供了一种切实可行的途径，方法简单，对畜牧业具有重大意义。

Description

MtAHA5基因、MtAHA5蛋白在苜蓿植物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程应用领域，尤其涉及一种MtAHA5基因、MtAHA5蛋白及其应用。

背景技术

原花色素(Proanthocyanidins，PA)，又称缩合单宁，其基本结构单元是黄烷-3-醇，是一种聚多酚类化合物，在酸、碱或酶的作用下，氧化脱水缩合产生不溶于水的大分子化合物（参见由中国林业出版社出版，孙达旺主编的《植物单宁化学》）。植物体内的原花色素大部分以多聚物的形式存在。原花色素主要存在于植物的叶、茎秆、果实、种子、花和外皮中，通常出现在细胞的液泡中。蔬菜、水果、饲用牧草、树木、灌木、豆科植物、谷类及籽实中均富含原花色素。不仅在种子休眠、寿命和萌发的调控中起着重要作用，而且还参与调控植物的生物和非生物逆境胁迫(Debeaujon et al., 2003)。除此之外，还具有抗氧化、抗炎和抗癌等有益于人类健康的功效(Dixon et al., 2005)。

紫花苜蓿被誉为“牧草之王”，具有高产、稳产、易栽培、饲用价值好和蛋白质含量高等特点。然而，反刍动物例如奶牛等采食紫花苜蓿后却会发生臌胀病，从而严重限制了紫花苜蓿在畜牧业中的利用与营养潜力的发挥。原花色素是抗臌胀病的关键因子，紫花苜蓿中其含量高于干重的2%时，可以有效地防止反刍动物臌胀病的发生(Verdier et al.,2012)，这是由于原花色素在反刍动物的弱酸性环境（pH 5.5-7.0）的瘤胃中与可溶性蛋白结合形成较稳定的单宁蛋白结合物——过瘤胃蛋白，当进入真胃（pH 2.5-3.5）和小肠（pH8.0-8.5）之后，pH 值变化，蛋白质随之释放，在小肠中被吸收利用，这样避免了可溶性蛋白在瘤胃中发酵分解产生气体，减少了可溶性蛋白在瘤胃中的降解和在瘤胃中产生的泡沫，从而预防臌胀病的发生，起到保护瘤胃蛋白质的作用，因此在反刍动物的饲料中添加适量的原花色素具有一定的营养生理作用。原花色素易与生物体内蛋白质结合形成较稳定的复合物，降低了蛋白质在瘤胃中的溶解度及表面活性，起到保护蛋白质的作用。同时，原花色素能够抑制瘤胃蛋白质分解细菌，最终提高蛋白质的利用率。另外原花色素的降解产物对反刍动物也不会产生毒性作用。但牧草中原花色素含量过高（超过3%）极易影响反刍动物的采食量和饲草在瘤胃内的降解速率，并降低了饲草的整体消化率。由于原花色素具有收敛性和涩味，动物过量采食后会对口腔与前胃上皮产生不适感，这样就影响了其适口性，进一步减少了反刍动物的采食量。反刍动物过量采食富含原花色素的牧草会出现中毒症状，损伤肝、肾等器官及其功能（牛菊兰等，红豆草中单宁对过瘤胃蛋白的保护研究）。

目前的一些研究试图增加紫花苜蓿等的原花色素含量(Verdier et al., 2012;Escaray et al., 2014; Yuan and Grotewold, 2015; Li et al., 2016)，其结果不理想，远远达不到干重2%的水平，因此不能够有效地防止牛、羊等反刍动物臌胀病的发生。Zhao等人和Li等人认为无法获得比较好的原花色素的改良效果的最大障碍是原花色素生物合成和调控非常复杂，仍然有很多问题亟待解决(Zhao et al., 2010; Li et al.,2016)。

发明内容

为实现从基因水平调控苜蓿植物中原花色素的含量，从而获得高原花色素含量的苜蓿，用于减少反刍动物臌胀病的发生的问题，本发明提供一种通过应用MtAHA5基因或MtAHA5蛋白来改变苜蓿原花色素生物合成，使植物中的原花色素含量可调可控，从而获得原花色素含量较高的苜蓿植株。

为实现本发明的技术目的，本发明第一方面提供一种MtAHA5基因的应用，为S1）或S2）或S3）或S4）或S5）或S6）：

S1）调控苜蓿植物中跨液泡膜质子电化学势梯度，促进原花色素前体转运进入苜蓿植物的液泡中；

S2）调控苜蓿的原花色素，使苜蓿中的原花色素含量升高；

S3）调控苜蓿的原花色素，使苜蓿中的原花色素含量降低；

S4）制备高含量原花色素的苜蓿产品中的应用；

S5）培育高含量原花色素的转基因紫花苜蓿的应用；

S6）培育防止反刍动物臌胀病发生的苜蓿，该苜蓿中原花色素含量高。

特别是，所述MtAHA5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

特别是，所述MtAHA5基因通过核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示的引物对得到。

尤其是，MtAHA5基因的表达水平可以通过核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物组进行检测。

本发明第二方面提供一种MtAHA5蛋白的应用，为K1）或K2）或K3）或K4）或K5）或K6）：

K1）调控苜蓿植物中跨液泡膜质子电化学势梯度，促进原花色素前体转运进入苜蓿植物的液泡中；

K2）调控苜蓿的原花色素，使苜蓿中的原花色素含量升高；

K3）调控苜蓿的原花色素，使苜蓿中的原花色素含量降低；

K4）制备高含量原花色素的苜蓿产品中的应用；

K5）培育高含量原花色素的转基因紫花苜蓿的应用；

K6）培育防止反刍动物臌胀病发生的苜蓿，该苜蓿中原花色素含量高。

特别是，所述MtAHA5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

尤其是，所述MtAHA5蛋白可以通过以下生物材料获得，为下述B1)至B3)中的任一种：

B1)编码MtAHA5蛋白的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

特别是，B1)所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明第三方面提供一种苜蓿原花色素含量的调节剂，其具有上述的MtAHA5基因、或上述的MtAHA5蛋白、或上述的B1）-B3）所述的生物材料。

本发明第四方面提供一种培育转基因植物的方法，通过提高受体植物中MtAHA5蛋白的表达量，得到转基因植物；与受体植物相比，转基因苜蓿中原花色素的含量增高；

其中，所述通过提高受体植物中MtAHA5蛋白的表达量是向紫花苜蓿中导入编码所述MtAHA5蛋白的核酸分子实现。

附图说明

图1是本发明实施例1和试验例3中提供的MtAHA5基因的Tnt1插入突变体的鉴定分析结果图，其中，1A图为NF0707、NF19445、NF7687突变体的Tnt1插入位置，图1B为NF0707的Tnt1插入纯合突变体的PCR鉴定结果，图1C为NF7687的Tnt1插入纯合突变体的PCR鉴定结果，图1D为NF19445的Tnt1插入纯合突变体的PCR鉴定结果；图1E为NF0707纯合突变体中MtAHA5基因的表达水平分析结果，图1F为NF7687纯合突变体中MtAHA5基因的表达水平分析结果，图1G为NF19445纯合突变体中MtAHA5基因的表达水平分析结果；

图2是本发明实施例1提供的MtAHA3、MtAHA4和MtAHA9基因的Tnt1插入突变体的鉴定分析结果图，其中，图2A为NF12901的Tnt1插入纯合突变体的PCR鉴定结果；图2B为NF10457的Tnt1插入纯合突变体的PCR鉴定结果；图2C为NF3114的Tnt1插入纯合突变体的PCR鉴定结果；图2D为NF12901纯合突变体中MtAHA3基因的表达水平分析结果；图2E为NF10457纯合突变体中MtAHA4基因的表达水平分析结果；图2F为NF3114纯合突变体中MtAHA9基因的表达水平分析结果；

图3是本发明实施例1提供的Tnt1插入纯合突变体的原花色素含量分析结果图，其中，图3A为NF0707、NF12901、NF10457和NF3114纯合突变体中原花色素的含量分析结果，图3B为MtAHA5基因的NF0707、NF19445和NF7687纯合突变体中原花色素的含量分析结果；

图4是本发明实施例2提供MtAHA5基因能够恢复NF0707突变体中原花色素减少的表型的分析结果图；

图5是本发明实施例3中携带有MtAHA5-RFP基因的农杆菌与vac-ck-CFP的农杆菌共注射烟草叶片后，MtAHA5蛋白定位结果；

图6是本发明试验例1中拟南芥原花色素生物合成途径中关键基因、MtANR、MtAHA5基因在种子发育过程中的基因表达模式分析结果；

图7 是本发明试验例2中MtAHA5基因遗传转化aha10突变体的转基因株系中MtAHA5基因表达的鉴定结果和原花色素含量的定性分析结果，其中，图7A为MtAHA5基因遗传转化aha10突变体的转基因株系中MtAHA5基因表达分析结果，图7B为MtAHA5基因遗传转化aha10突变体的转基因株系种子的种皮颜色，图7C为MtAHA5基因遗传转化aha10突变体的转基因株系种子经过DMACA染色后的种皮颜色；

图8是本发明试验例2中MtAHA5基因遗传转化aha10突变体的转基因株系种子中原花色素含量的定量分析结果；

图9是本发明试验例3提供的Tnt1插入纯合突变体NF0707的花青素含量分析结果图及植物照片；

图10是本发明试验例3提供的Tnt1插入纯合突变体NF0707、NF19445、NF7687的花青素含量分析结果图及植物照片：其中，图10A为MtAHA5基因的NF0707、NF19445和NF7687纯合突变体中三天幼苗下胚轴中的花青素观察结果，图10B为MtAHA5基因的NF0707、NF19445和NF7687纯合突变体的苗期的花青素观察，茎基部深色为花青素积累，图10C为MtAHA5基因的NF0707、NF19445和NF7687纯合突变体的叶片中花青素观察，花青素斑点为花青素积累，图10中D为MtAHA5基因的NF0707、NF19445和NF7687纯合突变体的叶片中花青素含量分析结果。

具体实施方式

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1 MtAHA5基因的表型分析

为了体现MtAHA5基因在蒺藜苜蓿原花色素积累过程中的作用，发明人购买了该基因的Tnt1插入突变体NF0707，同时还将与蒺藜苜蓿原花色素生物合成途径中关键基因在种子发育过程中的基因表达模式相同的MtAHA3、MtAHA4和MtAHA9基因作为对照，相应的突变体分别为NF12901、NF10457和 NF3114。

首先根据Tnt1的序列和Tnt1插入侧翼序列，设计引物，采用PCR鉴定Tnt1插入纯合突变体，然后提取突变体中的RNA，提取方法采用常规方法进行。然后采用qRT-PCR分析突变体中基因的表达水平，鉴定结果以及基因表达水平结果如图1和图2所示，可见，本发明的试验材料均为纯合突变体，NF0707可以作为MtAHA5基因功能分析的实验材料。

同时种植R108和Tnt1插入纯合突变体，种植方法采用现有技术领域任一一种方法均可，本发明不做限制。收获成熟的R108和Tnt1插入纯合突变体种子，然后定性和定量分析种子中原花色素的含量，结果如图3所示，根据图3的分析结果可以发现只有MtAHA5的Tnt1插入纯合突变体NF0707中原花色素含量显著少于野生型。

其中，在本发明的一个实施例中，可以采用Jun, J.H., Liu, C., Xiao, X. &Dixon, R.A等公开的文献 The transcriptional repressor MYB2 regulates bothspatial and temporal patterns of proanthocyanidin and anthocyaninpigmentation in Medicago truncatula. Plant Cell. (2015) 27: 2860-2879.进行操作。当然，本领域技术人员还可以采用其他方法进行定性定量分析，本发明不做限制。

通过以上结果可以看出，MtAHA5在蒺藜苜蓿原花色素积累过程中发挥关键作用。

本发明提供的MtAHA5基因是从蒺藜苜蓿基因组（ Medicago truncatula A17r5.0 genome，网址：https://medicago.toulouse.inra.fr/MtrunA17r5.0-ANR/）中获得，MtAHA5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。在一个实施例中，可以利用如SEQ ID NO.3-4所示的引物组获得MtAHA5基因。在一个实施例中，还可以利用如SEQ ID NO.5-6所示的检测引物组检测MtAHA5基因水平。

实施例2 互补试验

为了验证MtAHA5基因的突变是NF0707突变体中原花色素减少的直接因素，发明人以NF0707突变体为材料进行遗传转化转入了MtAHA5基因，然后对转入了MtAHA5基因植株中的原花色素进行定量分析，结果如图4所示。

通过图4的分析结果可以看出可溶性原花色素含量基本恢复到野生型的水平，不可溶性原花色素含量也显著地高于NF0707突变体，但仍然低于野生型水平。总体上，MtAHA5基因能够恢复NF0707突变体中原花色素减少的表型，进一步证实了MtAHA5基因能够改变蒺藜苜蓿中原花色素的积累。

当然，本领域技术人员还可以根据本发明提供的MtAHA5基因序列，如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构建。

实施例3 MtAHA5蛋白的分析

为了进一步阐释MtAHA5基因的功能原理，本申请研究MtAHA5蛋白并对MtAHA5蛋白进行亚细胞定位，具体是将MtAHA5基因与RFP基因融合构建入植物表达载体pCAMBIA1302中，转入农杆菌GV3101，其中载体构建方法及转入方法均为本领域常规方法，本发明不做限制。将携带有MtAHA5-RFP基因的农杆菌与vac-ck-CFP（液泡膜的Marker line）的农杆菌共注射烟草叶片，结果如图5所示，图中显示：MtAHA5蛋白定位于液泡膜，MtAHA5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。蛋白定位的结果与原花色素积累于液泡中的结果是一致的，进一步表明了MtAHA5基因影响了在原花色素生物合成过程中的从细胞质向液泡中的运输。可见，MtAHA5基因通过改变原花色素前体从细胞质向液泡中运输来改变原花色素在液泡中的积累。

为了进一步验证本发明提供的MtAHA5基因在原花色素积累中的作用，发明人以模式植物拟南芥为实验植株进行验证，具体实验如下：

需要说明的是，以下实验例仅仅是发明人在研究MtAHA5基因实验过程中的一部分，仅为示例性的说明MtAHA5基因的功能。

试验例1原花色素生物合成途径中关键基因在种子发育过程中的基因表达模式分析实验

为了验证本发明提供的MtAHA5基因在改变植物原花色素含量方面的效果，发明人从基因表达模式方面将MtAHA5基因的表达模式与拟南芥原花色素生物合成途径中关键基因表达模式进行比较分析，具体如下：

拟南芥中原花色素主要在种皮中积累，其生物合成起始于双受精后1到2天的珠孔区域，随后在内种皮中朝着合点的方向逐渐积累，直到大概5到6天时在合点区域的生物合成结束，因此本发明首先对拟南芥原花色素生物合成途径中的关键基因DFR、ANS、ANR、TT12、TT19和TT2的表达模式进行研究，并从Arabidopsis eFP Browser获得了原花色素生物合成途径中关键基因（DFR、ANS、ANR、TT12、TT19和TT2）在种子发育不同阶段的基因表达数据。基因表达数据显示，拟南芥在种子发育的早期即心形期之前，这些基因的表达维持在比较高的水平，而心形期之后它们的表达水平快速下降，如图6所示。当然，拟南芥的原花色素生物合成途径中关键基因的上述表达模式也可以从现有的技术文献中查询知晓（例如Jiang W, Xia Y, Su X, Pang Y. ARF2 positively regulates flavonols andproanthocyanidins biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Planta 2022, 256:44）。

同时，发明人还将MtAHA5基因的表达模式与蒺藜苜蓿原花色素生物合成途径中典型基因MtANR的表达模式进行比较分析，进一步验证本发明提供的MtAHA5基因在改变植物原花色素含量方面的功能，具体如下：

构建蒺藜苜蓿原花色素生物合成途径中关键基因MtANR的表达模式，同时构建本发明的MtAHA5基因的表达模式，通过基因表达的定量分析，分析结果如图6所示。

从图6中可以看出，构建MtANR基因的蒺藜苜蓿种子发育的早期阶段上述关键基因表达维持在较高的水平，随后快速地下降。构建本发明的MtAHA5基因同样表现出在蒺藜苜蓿种子发育的早期阶段表达维持在较高的水平，随后快速地下降。

可见，本发明提供的MtAHA5基因可能与拟南芥的原花色素生物合成途径中关键基因以及蒺藜苜蓿中的原花色素生物合成途径中典型基因的功能相似。

试验例2 MtAHA5基因通过产生跨液泡膜质子电化学势梯度从而介导原花色素前体的转运实验

应用生物学常规方法将MtAHA5基因遗传转化不能够积累原花色素的拟南芥的aha10突变体，获得转拟南芥基因株系，MtAHA5基因表达的鉴定结果如图7A所示，然后通过DMACA染色定性分析原花色素的含量，结果显示：染色前和后，MtAHA5基因在aha10突变体中的表达均能够使得原花色素的积累与野生型相似，如图7B和7C所示。定量分析的结果如图8所示，可以看出MtAHA5基因能够恢复拟南芥aha10突变体中原花色素的积累。

可见，MtAHA5基因能够恢复拟南芥原花色素的积累，并且通过产生跨液泡膜质子电化学势梯度从而驱动原花色素前体转运进入液泡中，从而提高花色素前体在液泡中的积累。

试验例3 MtAHA5基因对花青素积累的影响实验

本申请还采购了MtAHA5基因的另外2个Tnt1插入突变体NF19445和NF7687，采用实施例1中的方法对其进行PCR鉴定结果以及基因表达水平分析，鉴定和分析结果显示突变体NF19445和NF7687均为MtAHA5基因的纯合突变体（如图1所示），可以作为MtAHA5基因功能分析的实验材料。

本申请首先种植收获的R108和Tnt1插入纯合突变体NF0707种子，观察NF0707突变体中花青素的含量，种植的苜蓿苗表型照片如图9所示：图9A中NF0707纯合突变体中茎基部没有花青素积累，而野生型R108茎基部有花青素积累，显示深色，图9B为NF0707纯合突变体中叶片中没有花青素积累，而野生型R108茎基部有花青素积累，显示为深色；图9C中NF0707纯合突变体中叶片的花青素含量比野生型叶片中的花青素含量降低。可见，MtAHA5基因可能参与花青素的调控。

为了进一步验证MtAHA5基因是否参与花青素的调控，本申请再次种植收获的R108和Tnt1插入纯合突变体NF19445和NF7687的种子，观察三天幼苗中的花青素表型，如图10A所示，以及苜蓿苗期的花青素表型，如图10B、10C所示，同时检测叶片中花青素含量，如图10D所示。

图10A显示，NF0707的三天幼苗下胚轴为无色，没有花青素积累，而NF19445和NF7687均为深色，有花青素积累；图10B显示NF0707苗期的茎基部为无色，没有花青素积累，而NF19445和NF7687均为深色，有花青素积累；图10C显示NF0707叶片无花青素斑点，没有花青素积累，而NF19445和NF7687均有花青素斑点，有花青素积累；图10D显示NF0707并无花青素积累，而NF19445和NF7687有花青素的积累。

综上可知，MtAHA5基因的突变体NF19445和NF7687的花青素并没有受到MtAHA5基因突变的影响。而引起NF0707突变体中花青素含量的变化可能是受到突变体中其他插入基因的调控，与MtAHA5基因无关。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1. MtAHA5基因在制备降低原花色素含量的苜蓿产品中的应用，其特征在于，在MtAHA5基因中插入外源核苷酸序列抑制苜蓿MtAHA5基因的表达水平，从而减少苜蓿原花色素的积累，MtAHA5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. MtAHA5基因在培育降低原花色素含量的转基因紫花苜蓿的应用，其特征在于，在MtAHA5基因中插入外源核苷酸序列抑制苜蓿MtAHA5基因的表达水平，从而减少苜蓿原花色素的积累，MtAHA5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3. MtAHA5基因在培育防止反刍动物臌胀病发生的苜蓿中的应用，其特征在于，在MtAHA5基因中插入外源核苷酸序列抑制苜蓿MtAHA5基因的表达水平，从而减少苜蓿原花色素的积累，MtAHA5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；降低该苜蓿的原花色素含量以防止反刍动物臌胀病发生。

4.如权利要求1-3任一所述应用，所述MtAHA5基因通过如SEQ ID NO.3-4所示的核苷酸序列构成的引物对得到。

5. 如权利要求1-3任一所述应用，其通过核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物组检测MtAHA5基因的表达水平。