CN116640706B - 一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺及其用培养基 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及氨基酸生产技术领域，公开了一种γ‑聚谷氨酸的发酵工艺及其用培养基。一种γ‑聚谷氨酸的发酵工艺用培养基，包括以下培养基，斜面培养基、发酵培养基和产酸培养基；其中，发酵培养基的组分包括，葡萄糖20‑35g/L、疏桃多酚提取物40‑65g/L、氯化铵12‑18g/L、谷氨酸钠28‑45g/L、磷酸氢二钾1‑1.8g/L、甘油5‑10g/L、蛋白胨8‑15g/L、血蓝蛋白0.1‑0.3g/L和蚯蚓血红蛋白0.5‑1.2g/L；所述产酸培养基的组分包括，AEBSF 2‑6g/L、EDTA 1‑3g/L、胃蛋白酶抑制剂0.5‑1g/L、4‑DAMP 0.8‑1.2g/L和氯化钠15‑28g/L。本申请生产聚谷氨酸的发酵用培养基，细胞活性高，代谢速率快且聚谷氨酸产量高。
Description
技术领域
本申请涉及氨基酸生产技术领域，尤其是涉及一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺及其用培养基。
背景技术
γ-聚谷氨酸是自然界中微生物发酵产生的水溶性多聚氨基酸，其结构为谷氨酸单元通过α-氨基和γ-羧基形成肽键的高分子聚合物，具有良好的生物相容性、吸水保水性、肥料增效等作用。
聚谷氨酸是多肽的升级产品，材料来源分为生物合成与化学合成两种，生物合成的高分子聚合氨基酸官能团有一定的变化、对根皮的互溶性较好，化学合成的高分子聚谷氨酸结构一致、官能团较为统一。
而传统的聚谷氨酸生物合成技术通过两种菌株混合发酵，通过水解谷氨酸发酵废弃菌体将其开发为蛋白质水解液，但此技术存在培养基组分较为复杂，菌株混合发酵可控性差，可能带来不能预期的风险，且生产的聚谷氨酸产量较低。
因此急需开发一种工艺简单，聚谷氨酸产量高的发酵工艺。
发明内容
为了解决上述至少一种技术问题，开发一种工艺简单，聚谷氨酸产量高的发酵工艺，本申请提供一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺及其用培养基。
一方面，本申请提供的一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺用培养基，包括以下培养基，斜面培养基、发酵培养基和产酸培养基；
其中，发酵培养基的组分包括，葡萄糖20-35g/L、疏桃多酚提取物40-65g/L、氯化铵12-18g/L、谷氨酸钠28-45g/L、磷酸氢二钾1-1.8g/L、甘油5-10g/L、蛋白胨8-15g/L、血蓝蛋白0.1-0.3g/L和蚯蚓血红蛋白0.5-1.2g/L；
所述产酸培养基的组分包括，AEBSF 2-6g/L、EDTA 1-3g/L、胃蛋白酶抑制剂0.5-1g/L、4-DAMP 0.8-1.2g/L、氯化钠15-28g/L和烷烃，所述烷烃含量为产酸培养基含量的1-1.6v%。
通过采用上述技术方案，采用本申请γ-聚谷氨酸的发酵工艺用的培养基，细胞活性高，生产的聚谷氨酸产量高；本申请采用疏桃多酚提取物作为发酵培养基的组分之一，疏桃多酚提取物即可作为营养物质为枯草芽孢杆菌提供营养，又可使得细胞活性增强，促进细胞生长；且还添加有血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白体系，血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白作为氧载体，为枯草芽孢杆菌提供氧气，提高了细胞的代谢速率，进而提高了聚谷氨酸的产量；本申请产酸培养基中，添加AEBSF、EDTA和胃蛋白酶抑制剂，提高了对异柠檬酸裂解酶的抑制作用，使得聚谷氨酸的片段不断延长，促进了聚谷氨酸产量的增加；且添加的4-DAMP在保证了细胞的完整性的基础上，提高了细胞内的渗透压，促进了聚谷氨酸的分泌；烷烃的添加，为枯草芽孢杆菌提供氧气，提高了细胞的代谢速率，进而提高了聚谷氨酸的产量。
可选的，所述发酵培养基的组分包括，葡萄糖25g/L、疏桃多酚提取物55g/L、氯化铵14g/L、谷氨酸钠32g/L、磷酸氢二钾1.2g/L、甘油7g/L、蛋白胨11g/L、血蓝蛋白0.2g/L和蚯蚓血红蛋白0.6g/L。
通过采用上述技术方案，本申请选取最优配比的发酵培养基的组分，生产的聚谷氨酸产量更高。
可选的，所述疏桃多酚提取物包括以下组分，儿茶素、黄酮和槲皮苷，所述儿茶素、黄酮和槲皮苷的重量比为0.5：1：（0.8-1.5）。
通过采用上述技术方案，本申请的疏桃多酚提取物为儿茶素、黄酮和槲皮苷，分子量小，易于细胞吸收，更易提高细胞活性。
可选的，所述血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白的浓度比为（0.2-0.5）：1。
通过采用上述技术方案，本申请控制血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白的浓度比，使得细胞活性趋于较优的状态，有利于聚谷氨酸产量的增长。
可选的，所述发酵培养基的组分还包括丹参酮IIA硫酸钠1-10g/L。
通过采用上述技术方案，本申请发酵培养基中还添加有丹参酮IIA硫酸钠，且严格控制丹参酮IIA硫酸钠的含量，既提高了细胞活性，又避免含量偏高，抑制了细胞生长。
可选的，所述烷烃为正辛烷和正十二烷。
可选的，所述正辛烷和正十二烷的重量比为（0.2-0.5）：1。
可选的，所述S1中斜面培养基的包括以下重量分数组分，蛋白胨0.8-1wt%，牛肉膏0.5-0.8wt%，氯化钠0.5-1wt%，葡萄糖0.5-1wt%，琼脂1.2-2wt%，余量为水。
另一方面，本申请提供的一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺，包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌菌种接种在斜面培养基中，在25-37℃温度下，静置培养15-20h后，振荡培养18-20h，制备枯草芽孢杆菌种子液；
S2、将制备的枯草芽孢杆菌种子液按照4-7%的接种量接入30-40L的发酵培养基中，进行发酵培养，发酵培养时间为50-72h，发酵温度为30-40℃，pH值为7.2-8.5；
S3、在发酵培养基中发酵培养结束后，加入8-12L的产酸培养基，进行产酸发酵培养，发酵培养时间为10-18h，发酵温度为30-40℃，pH值为7.2-8.5。
可选的，所述S2中，在发酵时间为25-30h时，加入血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白；所述S3中，在产酸发酵时间为5-6h时，加入烷烃。
通过采用上述技术方案，本申请控制血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白体系和烷烃的添加时间，控制在发酵过程中的氧浓度，促进了细胞的活性。
综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：
1. 本申请γ-聚谷氨酸的发酵工艺用的培养基，细胞活性高，代谢速率快，生产的聚谷氨酸产量高；
2.本申请采用疏桃多酚提取物作为发酵培养基的组分之一，疏桃多酚提取物即可作为营养物质为枯草芽孢杆菌提供营养，又可使得细胞活性增强，促进细胞生长；还添加有血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白体系，可作为氧载体，为枯草芽孢杆菌提供氧气，提高了细胞的代谢速率，进而提高了聚谷氨酸的产量；
3. 本申请产酸培养基中，添加AEBSF、EDTA和胃蛋白酶抑制剂，提高了对异柠檬酸裂解酶的抑制作用，使得聚谷氨酸的片段不断延长，促进了聚谷氨酸产量的增加；且添加的4-DAMP在保证了细胞的完整性的基础上，提高了细胞内的渗透压，促进了聚谷氨酸的分泌；
4. 本申请γ-聚谷氨酸的发酵工艺，工艺流程简单，且生产的聚谷氨酸产量高。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
本申请提供的一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺用的培养基，包括以下培养基，斜面培养基、发酵培养基和产酸培养基；
其中，发酵培养基的组分包括，葡萄糖20-35g/L、疏桃多酚提取物40-65g/L、氯化铵12-18g/L、谷氨酸钠28-45g/L、磷酸氢二钾1-1.8g/L、甘油5-10g/L、蛋白胨8-15g/L、血蓝蛋白0.1-0.3g/L和蚯蚓血红蛋白0.5-1.2g/L；
所述产酸培养基的组分包括，AEBSF 2-6g/L、EDTA 1-3g/L、胃蛋白酶抑制剂0.5-1g/L、4-DAMP 0.8-1.2g/L、氯化钠15-28g/L和烷烃，所述烷烃含量为产酸培养基含量的1-1.6v%。
另一方面，本申请提供的一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺，包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌菌种接种在斜面培养基中，在25-37℃温度下，静置培养15-20h后，振荡培养18-20h，制备枯草芽孢杆菌种子液；
S2、将制备的枯草芽孢杆菌种子液按照4-7%的接种量接入30-40L的发酵培养基中，进行发酵培养，发酵培养时间为50-72h，发酵温度为30-40℃，pH值为7.2-8.5；
S3、在发酵培养基中发酵培养结束后，加入8-12L的产酸培养基，进行产酸发酵培养，发酵培养时间为10-18h，发酵温度为30-40℃，pH值为7.2-8.5。
目前，聚谷氨酸生物合成技术主要是通过两种菌株混合发酵，通过水解谷氨酸发酵废弃菌体将其开发为蛋白质水解液，但此技术存在培养基组分较为复杂，菌株混合发酵可控性差，可能带来不能预期的风险，且生产的聚谷氨酸产量较低。
针对以上问题，本申请的发明人设计了本申请的技术方案，设计了采用疏桃多酚提取物作为发酵培养基的组分之一，疏桃多酚提取物即可作为营养物质为枯草芽孢杆菌提供营养，又可使得细胞活性增强，促进细胞生长；且还添加有血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白体系，血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白可作为氧载体，为枯草芽孢杆菌提供氧气，提高了细胞的代谢速率，提高了聚谷氨酸的产量。
本申请产酸培养基中，添加AEBSF、EDTA和胃蛋白酶抑制剂，提高了对异柠檬酸裂解酶的抑制作用，使得聚谷氨酸的片段不断延长，促进了聚谷氨酸产量的增加；且添加的4-DAMP在保证了细胞的完整性的基础上，提高了细胞内的渗透压，促进了聚谷氨酸的分泌。
采用本申请的技术方案，γ-聚谷氨酸的发酵工艺，工艺流程简单，细胞活性高，代谢速率快，且生产的聚谷氨酸产量高。
实施例
本申请的原料型号如下，若无特殊说明外，本申请采用的原料皆为市售：
葡萄糖：纯度99%；
儿茶素：纯度≥97%；
黄酮：纯度98%；
槲皮苷：纯度≥98%；
氯化铵：纯度99.5%；
谷氨酸钠：纯度99%；
磷酸氢二钾：纯度99%；
甘油：纯度≥99.7%；
蛋白胨：纯度99%；
血蓝蛋白：纯度≥85%；
蚯蚓血红蛋白：纯度90%；
AEBSF：纯度98%；
EDTA：纯度99%；
胃蛋白酶抑制剂：纯度≥75%；
4-DAMP：纯度≥98%；
氯化钠：纯度99.5%；
正辛烷：纯度99%；
正十二烷：纯度99%；
丹参酮IIA硫酸钠：纯度98%；
牛肉膏：纯度99%；
琼脂：纯度99%。
性能检测：
聚谷氨酸含量的检测：往样品中添加5M的盐酸溶液，95℃水解12h，然后蒸发去除盐酸，采用高效液相法检测L-谷氨酸的含量，通过计算水解前后的谷氨酸的含量差来确定聚谷氨酸的含量。
实施例1-6
实施例1-6的斜面培养基、发酵培养基和产酸培养基具体组分含量见表1。
表1 实施例1-6的斜面培养基、发酵培养基和产酸培养基具体组分含量
其中，斜面培养基的余量为水，发酵培养基中的疏桃多酚提取物具体组分配比见表2。
表2发酵培养基中的疏桃多酚提取物具体组分配比
产酸培养基中的烷烃为正辛烷和正十二烷，正辛烷和正十二烷具体重量配比见表3。
表3 正辛烷和正十二烷具体重量配比
枯草芽孢杆菌菌种选自保藏号为CGMCC NO.7034。
实施例1
一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺，包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌菌种接种在斜面培养基中，在25℃温度下，静置培养20h后，振荡培养19.5h，制备枯草芽孢杆菌种子液，种子液密度为4.5*109cfu/mL；
S2、将制备的枯草芽孢杆菌种子液按照5%的接种量接入32L的发酵培养基中，进行发酵培养，发酵培养时间为55h，发酵温度为30℃，pH值为7.5，在发酵培养时间为26h时，加入血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白；
S3、在发酵培养基中发酵培养结束后，加入12L的产酸培养基，进行产酸发酵培养，发酵培养时间为12h，发酵温度为30℃，pH值为7.5，在发酵培养时间为6h时，加入烷烃。
实施例2
一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺，包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌菌种接种在斜面培养基中，在28℃温度下，静置培养16h后，振荡培养18h，制备枯草芽孢杆菌种子液,种子液密度为4.8*109cfu/mL；
S2、将制备的枯草芽孢杆菌种子液按照6%的接种量接入30L的发酵培养基中，进行发酵培养，发酵培养时间为60h，发酵温度为32℃，pH值为7.2，在发酵培养时间为28h时，加入血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白；
S3、在发酵培养基中发酵培养结束后，加入10L的产酸培养基，进行产酸发酵培养，发酵培养时间为10h，发酵温度为32℃，pH值为7.2，在发酵培养时间为5.5h时，加入烷烃。
实施例3
一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺，包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌菌种接种在斜面培养基中，在30℃温度下，静置培养15h后，振荡培养19h，制备枯草芽孢杆菌种子液，种子液密度为4.3*109cfu/mL；
S2、将制备的枯草芽孢杆菌种子液按照7%的接种量接入34L的发酵培养基中，进行发酵培养，发酵培养时间为50h，发酵温度为38℃，pH值为7.8，在发酵培养时间为25h时，加入血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白；
S3、在发酵培养基中发酵培养结束后，加入9L的产酸培养基，进行产酸发酵培养，发酵培养时间为18h，发酵温度为38℃，pH值为7.8，在发酵培养时间为5.2h时，加入烷烃。
实施例4
一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺，包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌菌种接种在斜面培养基中，在35℃温度下，静置培养18h后，振荡培养20h，制备枯草芽孢杆菌种子液，种子液密度为5.1*109cfu/mL；
S2、将制备的枯草芽孢杆菌种子液按照5%的接种量接入40L的发酵培养基中，进行发酵培养，发酵培养时间为65h，发酵温度为36℃，pH值为8.1，在发酵培养时间为30h时，加入血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白；
S3、在发酵培养基中发酵培养结束后，加入8L的产酸培养基，进行产酸发酵培养，发酵培养时间为16h，发酵温度为36℃，pH值为8.1，在发酵培养时间为5.6h时，加入烷烃。
实施例5
一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺，包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌菌种接种在斜面培养基中，在37℃温度下，静置培养17h后，振荡培养18.5h，制备枯草芽孢杆菌种子液，种子液密度为5*109cfu/mL；
S2、将制备的枯草芽孢杆菌种子液按照4%的接种量接入36L的发酵培养基中，进行发酵培养，发酵培养时间为68h，发酵温度为40℃，pH值为8.5，在发酵培养时间为27h时，加入血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白；
S3、在发酵培养基中发酵培养结束后，加入11L的产酸培养基，进行产酸发酵培养，发酵培养时间为14h，发酵温度为40℃，pH值为8.5，在发酵培养时间为5.8h时，加入烷烃。
实施例6
一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺，包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌菌种接种在斜面培养基中，在33℃温度下，静置培养19h后，振荡培养18h，制备枯草芽孢杆菌种子液，种子液密度为4.6*109cfu/mL；
S2、将制备的枯草芽孢杆菌种子液按照6%的接种量接入38L的发酵培养基中，进行发酵培养，发酵培养时间为72h，发酵温度为34℃，pH值为8.3，在发酵培养时间为29h时，加入血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白；
S3、在发酵培养基中发酵培养结束后，加入8L的产酸培养基，进行产酸发酵培养，发酵培养时间为15h，发酵温度为34℃，pH值为8.3，在发酵培养时间为5h时，加入烷烃。
对比例1-4
对比例1
以实施例5为基础，除发酵培养基不同外，其中以等量的葡萄糖替代发酵培养基中的疏桃多酚提取物，其余组分及制备方法皆与实施例5一致。
对比例2
以实施例5为基础，除发酵培养基不同外，其中以等量的磷酸氢二钾替代血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白，其余组分及制备方法皆与实施例5一致。
对比例3
以实施例5为基础，除发酵培养基不同外，其中以等量的磷酸氢二钾替代血蓝蛋白，其余组分及制备方法皆与实施例5一致。
对比例4
以实施例5为基础，除发酵培养基不同外，其中以等量的磷酸氢二钾替代蚯蚓血红蛋白，其余组分及制备方法皆与实施例5一致。
检测实施例1-6及对比例1-4发酵结束后培养基中的聚谷氨酸的含量，结果见表4。
表4实施例1-6及对比例1-4的聚谷氨酸含量
由实施例1-6、对比例1-4及表4可知，本申请制备聚谷氨酸的发酵工艺，生产的聚谷氨酸含量高，可到41.9g/L。
由对比例1、实施例5及表4可知，当疏桃多酚提取物被替代后，谷草芽孢杆菌的活性相应降低，相应的聚谷氨酸产量降低。
由对比例2-4、实施例5及表4可知，血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白的添加，使得聚谷氨酸产量得到提高，血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白不仅提高了代谢效率，也提高了细胞的活性。
发明人推测，血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白体系中，不仅可作为样的载体为枯草芽孢杆菌提供氧气，进而提高代谢速率，且血蓝蛋白的铜元素和蚯蚓血红蛋白的铁元素更进一步的提高了细胞的活性，提高了聚谷氨酸的产量。因此在发酵培养基中添加血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白，极大提高了聚谷氨酸的产量。
实施例7-11
以实施例1为基础，除血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白的配比不同外，其余组分及制备方法皆与实施例1一致，具体配比见表5。
表5实施例7-10的血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白的配比
检测实施例7-11发酵结束后培养基中的聚谷氨酸的含量，结果见表6。
表6实施例7-11的聚谷氨酸的含量
由实施例7-11及表6可知，随着血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白的配比的增大，聚谷氨酸的产量逐渐增大，后保持不变，在血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白的配比为0.5:1时，达到最大值42.8g/L。
实施例12-16
以实施例10为基础，除发酵培养基还添加有丹参酮IIA硫酸钠外，其余组分及制备方法皆与实施例10一致，具体含量见表7。
表7 实施例12-16丹参酮IIA硫酸钠的含量
检测实施例12-16发酵结束后培养基中的聚谷氨酸的含量，结果见表8。
表8实施例12-16的聚谷氨酸的含量
由实施例12-16及表8可知，本申请发酵培养基中还添加有丹参酮IIA硫酸钠，生产的聚谷氨酸的产量先增大后减小，最高可为43.8g/L，随着丹参酮IIA硫酸钠的增大，反而会抑制细胞的活性，进而影响聚谷氨酸的产量。
以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺用培养基，其特征在于，由以下培养基组成，斜面培养基、发酵培养基和产酸培养基；
其中，发酵培养基的组分如下所示，葡萄糖20-35g/L、疏桃多酚提取物40-65g/L、氯化铵12-18g/L、谷氨酸钠28-45g/L、磷酸氢二钾1-1.8g/L、甘油5-10g/L、蛋白胨8-15g/L、血蓝蛋白0.1-0.3g/L和蚯蚓血红蛋白0.5-1.2g/L；
所述产酸培养基的组分如下所示，AEBSF 2-6g/L、EDTA 1-3g/L、胃蛋白酶抑制剂0.5-1g/L、4-DAMP 0.8-1.2g/L、氯化钠15-28g/L和烷烃，所述烷烃含量为产酸培养基含量的1-1.6v%；
所述疏桃多酚提取物包括以下组分，儿茶素、黄酮和槲皮苷，所述儿茶素、黄酮和槲皮苷的重量比为0.5：1：（0.8-1.5）；
所述烷烃为正辛烷和正十二烷。
2.根据权利要求1所述的一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺用培养基，其特征在于，所述发酵培养基的组分如下所示，葡萄糖25g/L、疏桃多酚提取物55g/L、氯化铵14g/L、谷氨酸钠32g/L、磷酸氢二钾1.2g/L、甘油7g/L、蛋白胨11g/L、血蓝蛋白0.2g/L和蚯蚓血红蛋白0.6g/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺用培养基，其特征在于，所述血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白的浓度比为（0.2-0.5）:1。
4.根据权利要求1所述的一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺用培养基，其特征在于，所述发酵培养基的组分还添加丹参酮IIA硫酸钠1-10g/L。
5.根据权利要求1所述的一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺用培养基，其特征在于，所述正辛烷和正十二烷的重量比为（0.2-0.5）：1。
6.根据权利要求1所述的一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺用培养基，其特征在于，所述斜面培养基的重量分数组分如下所示，蛋白胨0.8-1wt%，牛肉膏0.5-0.8wt%，氯化钠0.5-1wt%，葡萄糖0.5-1wt%，琼脂1.2-2wt%，余量为水。
7.一种权利要求1所述的γ-聚谷氨酸的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌菌种接种在斜面培养基中，在25-37℃温度下，静置培养15-20h后，振荡培养18-20h，制备枯草芽孢杆菌种子液；
S2、将制备的枯草芽孢杆菌种子液按照4-7%的接种量接入30-40L的发酵培养基中，进行发酵培养，发酵培养时间为50-72h，发酵温度为30-40℃，pH值为7.2-8.5；
S3、在发酵培养基中发酵培养结束后，加入8-12L的产酸培养基，进行产酸发酵培养，发酵培养时间为10-18h，发酵温度为30-40℃，pH值为7.2-8.5。
8.根据权利要求7所述的γ-聚谷氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述S2中，在发酵时间为25-30h时，加入血蓝蛋白和蚯蚓血红蛋白；所述S3中，在产酸发酵时间为5-6h时，加入烷烃。
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Address after: 250200 Pu Ji Jie Dao Pu Dong Cun Nan, Zhangqiu District, Jinan City, Shandong Province Patentee after: SHANDONG TUXIUCAI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Country or region after: China Patentee after: Jintian Biotechnology (Guangxi) Co.,Ltd. Address before: 250200 Pu Ji Jie Dao Pu Dong Cun Nan, Zhangqiu District, Jinan City, Shandong Province Patentee before: SHANDONG TUXIUCAI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Country or region before: China Patentee before: Guangxi Siwei Lianchuang Agricultural Development Co.,Ltd. |