CN116640696A - 一种小麦根际土壤舒尔曼氏菌新菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种舒曼氏菌新菌(Schumannellasp.)M29及其应用。本发明从新疆和田地区墨玉县冬小麦根际土壤中分离得到一种舒曼氏菌新菌(Schumannellasp.)M29，该菌株可耐受3％NaCl，具有溶解难溶性无机磷和有机磷活性，并具有脲酶和较弱的降解纤维素活性，将其应用于植物促生溶磷菌剂的制备，不仅可以减少化肥用量，还可以促进植物生长，在农业生物肥料方面具有广阔的开发和应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小麦根际舒曼氏菌新菌及其分离方法和应用。
背景技术
磷是植物生长必需的三大主要营养元素之一，土壤中的磷素主要以难溶性状态存在。对农田生态系统，将磷肥施到土壤中是供给磷素的主要方式。然而，已有的研究表明，磷肥施入土壤后当季的利用率10-25％，其他大多形成难溶性的磷素，如磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝等化合物。
土壤微生物是驱动着土壤中多种元素的循环。例如，一些微生物能将难溶性或固定态的磷转化为植物可吸收利用的形态，这些微生物被称为溶磷微生物(Phosphate-solubilizing microorganisms，PSM)。相比根周和裸土，作物根际通常分布有大量的溶磷微生物。利用其特有的生态功能，人们从土壤中已分离到溶芽孢杆菌属(Bacillus)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、肠杆菌属(Enterobacter)和欧文氏菌属(Erwinia)等多个具有溶磷功能的菌群。其中，个别菌株已开发成促生溶磷菌剂，并成功应用于农业生产。
目前，尽管现有的技术中已有多个具有溶磷功能的微生物菌种，但分离筛选新的、高活性的植物根际溶磷菌，研究其溶磷机制、对植物的促生作用对化肥减量、保障农业绿色可持续发展等具有重要的意义。
发明内容
针对磷肥利用率低，高活性的植物根际溶磷菌少，且未见有文献和专利报道舒曼氏菌(Schumannela sp.)在制备促生溶磷菌剂中应用的技术现状，本发明旨在于提供一种舒曼氏新菌(Schumannella sp.)M29及其应用。本发明从新疆和田地区墨玉县冬小麦根际土壤中分离得到一种舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29，该菌可耐受3％NaCl，具有溶解难溶性无机磷和有机磷活性，并具有脲酶和较弱的降解纤维素活性，该新菌种舒曼氏(Schumannella sp.)M29及其促生溶磷菌剂在植物促生方面具有广阔的开发和应用前景，舒曼氏(Schumannella sp.)M29促生溶磷菌剂不仅可以减少化肥用量，还可以促进植物生长，在农业生物肥料方面具有广阔的开发和应用前景。
为了达到以上技术效果，本发明通过如下技术方案实现。
一种舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29促生溶磷菌剂，该促生溶磷菌剂由舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29经发酵制备获得。
本发明提供的舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29是从新疆和田地区墨玉县冬小麦根际土壤中筛选分离，经16S rRNA序列系统发育分析和形态学分析，M29菌株属于舒曼氏菌属。通过对该菌株基因测序，所得序列在NCBI网站进行BLAST比对分析，菌株M29的16SrRNA基因序列与舒曼氏菌Schumannella luteola KHIA(AB362159)的同源性最高，相似度为96.6％。选取同源性较高的序列采用不同的方法构建16S rRNA系统发育树，菌株M29与Schumannella luteola KHIA(AB362159)亲缘关系最近，置信度分别为91、73和70，经过系列多相分类鉴定可确定该菌株M29为Schumannella sp.新菌种，具有新菌种典型性的特点。
本发明提供的舒曼氏菌(Schumannella sp.)M29经过上述本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定，结合根据形态学鉴定、生理生化特征多相分类系统鉴定分析，本发明涉及的舒曼氏菌(Schumannella sp.)M29与该属同源性最近的标准模式菌株存在多项不同，证实该舒曼氏菌(Schumannella sp.)M29属于舒曼氏菌属的新菌种，将其命名为舒曼氏菌(Schumannella sp.)M29，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.24257，保藏日期：2022年01月06日。
上述舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明中，舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29的分离活化培养基为(g/L)：葡萄糖0.5，酵母膏0.5，蛋白胨0.5，酸水解酪蛋白0.5，可溶性淀粉0.5，丙酮酸钠0.3，磷酸氢二钾0.3，硫酸镁0.05，琼脂1，蒸馏水定容到1000mL，pH 7.2。
本发明中，舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29的纯化培养基为：葡萄糖10.0，硫酸铵0.5，酵母浸粉0.5，NaCl 0.3，KCl 0.3，硫酸镁0.3，硫酸亚铁0.03，硫酸锰0.03，磷酸钙5.0，pH 7.0-7.5，琼脂15.0。
同时，本发明提供一种舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29促生溶磷菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：将舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29的单菌落接种到NB培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养2天，得到舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29种子液；将舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29种子液，按照体积比为1％的接种量接入到NB液体培养基，于30℃、180rpm发酵培养3天，制备获得舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29促生溶磷菌剂。
进一步，本发明提供一种舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29在植物促生中的应用，可促进植物生长，在植物促生方面具有广阔的开发和应用前景。
同时，本发明提供一种舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29促生溶磷菌剂在植物促生中的应用，可促进植物生长，在植物促生方面具有广阔的开发和应用前景。
通过以上技术方案，本发明得到以下技术效果：
(1)本发明提供一种舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29，经过本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定，结合根据形态学鉴定、生理生化特征、化学特征等多相分类系统鉴定分析，舒曼氏菌(Schumannella sp.)M29与该属同源性最近的标准模式菌株存在多项不同，确为是舒曼氏菌属新菌种，证实获得Schumannella范畴内菌种编号为M29属于一种典型的新菌种，进而有必要进行按照法律要求的保藏。
(2)本发明提供一种舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29可耐受3％NaCl，具有溶解难溶性有机磷和无机磷活性，可溶解土壤中植酸钙、磷酸钙等多种难溶性磷化合物；可制备植物促生溶磷菌剂，具有广阔的开发和应用前景，舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29促生溶磷菌剂不仅可以减少化肥用量，还可以促进植物生长，在农业生物肥料方面具有广阔的开发和应用前景。
附图说明
图1显示为基于16S rRNA基因序列采用邻接法构建的菌株M29的系统发育进化树。
图2显示为基于16S rRNA基因序列采用最大简约法构建的菌株M29的系统发育进化树。
图3显示为基于16S rRNA基因序列采用最大似然法构建的菌株M29的系统发育进化树。
图4显示为菌株M29形态特征图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为体积百分比，除非特别指出除外。
本发明舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29促生溶磷菌剂制备中采用的NB培养基为(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏粉3，氯化钠5，去离子水1L，pH值7.4±0.2。
实施例1：舒曼氏菌(Schumannella sp.)M29的分离、纯化及鉴定
(一)分离、纯化
采用平板稀释法分离，从新疆维吾尔自治区和田地区冬小麦根际采集土壤，装入塑料袋后密封带回实验室，4℃保存待用。准确称取2g土样，加入18mL无菌水，30℃、180rpm摇床震荡30min；用无菌水将浓度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度，取200μL样品悬液于细菌无机磷培养基平板上，于30℃培养7d。挑取单菌落，在相同培养基上划线纯化，得到的纯菌用20％脱脂奶粉冷冻低温保藏。
(二)16S rRNA基因鉴定
1.DNA的提取
将舒曼氏菌(Schumannella sp.)M29接种于纯化液体培养基中，30℃培养3天，获得菌体细胞，采用细菌基因组DNA快速提取试剂盒进行基因组DNA提取。
2.PCR扩增
16S rRNA序列引物：
27F：5′-AGA GTT TGATCC TGG CTC-3′；
1492R：5′-CGG CTACCT TGT TAC GAC TT-3′。
反应体系及条件：
3.序列测定
PCR扩增产物经电泳检测和纯化后测序，其序列长度为1514bp，测序结果见SEQ IDNo：1，于NCBI进行BLAST同源序列检索，利用本领域常见采用的MEGA 7.0软件通过Neighbor-Joining方法建立系统进化树(重复抽样1000次)，结果见附图1-3所示，所得序列在NCBI网站进行比对分析发现，菌株M29的16S rRNA基因序列与舒曼氏菌Schumannellaluteola KHIA(AB362159)的同源性最高，相似性为96.6％，具体数据参见表1。以16S rRNA基因序列采用不同的方法构建的系统发育树中，菌株M29的16S rRNA序列与Schumannellaluteola KHIA(AB362159)菌株的亲缘关系最近，菌株M29与S.luteola KHIAT聚在一起、且形成一个独立的分枝，置信度分别为91、73和70；表明该菌株M29作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，通过菌种的相似性和同源性的综合判定，证实获得的Schumannella属范畴内菌种编号为M29属于一种典型的舒曼氏菌属新菌种。
表1：本发明菌株的同源性
实施例2：舒曼氏菌(Schumannella sp.)M29的分类鉴定
(一)舒曼氏菌(Schumannella sp.)M29的菌落形态特征
将待观察的菌株M29接种到NB平板上，于30℃培养4天，待菌落长满整个平板观察菌落特征记录并拍照保存，同时记录菌落的扫描电镜照片，记录结果参见附图4所示。
由附图4结果可知，菌株M29在NB培养基30℃培养4天，可观察到菌落直径约1mm，其边缘整齐，中间凸起，呈黄色，细胞呈杆状，直径约为0.3μm，长度约为0.8-0.9μm。
基于以上生物学特征，将上述菌株M29鉴定为Schumannella sp.。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：中国.北京.北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101，保藏日期：2022年01月06日，保藏号为CGMCC No.24257。
(二)舒曼氏菌(Schumannella sp.)M29的生理生化特征
将菌株M29接种于NB培养基上，分别检测各生理生化特征。生长温度、盐度、pH值范围、明胶液化、硝酸盐还原、过氧化氢产生、尿素酶、淀粉酶、酯酶、纤维素分解、碳源利用等特征分析主要参考《常见细菌系统鉴定手册》。
菌株M29在TSA、NB鉴别培养基上生长情况较好，在NA、R2A培养基鉴别培养基上生长情况较差。可在含0-3％NaCl培养基上生长，最适浓度为0％；在25-40℃可生长，最适生长温度为30℃；在pH 6-9能生长，最适pH为7.0。牛奶凝固阳性，明胶液化阴性，牛奶胨化阴性；脲酶阳性，吐温20和80水解呈阳性，有较弱淀粉水解活性；不降解纤维素；能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、D-木糖、鼠李糖、乙酸、蜜二糖、甘露醇、半乳糖、甜醇、草酸、苹果酸、山梨醇、核糖，不能利用甘露糖、纤维二糖、阿拉伯糖、丁二酸、柠檬酸；麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、乳糖、甘露糖、甘油、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸。能利用半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、L-色氨酸、L-天门冬氨酸、黄嘌呤、羟脯氨酸、甘氨酸、腺嘌呤、L-精氨酸、L-色氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、L-丙氨酸。
采用平皿显色法，将菌株M29点接到含有难溶性卵磷脂或磷酸钙的磷细菌培养基上，在30℃培养3天后，在菌落周围观察到明显的透明圈，表明菌株M29具有溶解难溶性有机磷和无机磷活性。
由此可见，菌株M29其与该属同源性最近的菌株Schumannella luteola KHIA(AB362159)生理生化特性相似，但存在多项不同，是舒曼氏菌属的潜在新种。
综合16S rRNA基因序列同源性对比分析以及形态学鉴定、生理生化特征分析其与同源性最近的标准模式菌株具有鲜明的区别，确定该菌株M29为一种舒曼氏菌属新菌种，根据其分离来源将其命名为舒曼氏菌(Schumannella sp.)M29。
实施例3：舒曼氏菌(Schumannella sp.)M29促生溶磷菌剂的制备
本实施例在实施例1-2的基础上，舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29促生溶磷菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：将舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29的单菌落接种到NB培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养2天，得到舒曼氏菌新菌(Schumannellasp.)M29种子液；将舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29种子液，按照体积比为1％的接种量接入到NB液体培养基，于30℃、180rpm发酵培养3天，制备获得舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29促生溶磷菌剂。
实施例4：舒曼氏菌(Schumannella sp.)M29的应用
参照标准NY/T 1847-2010所述方法，将M29接种到分别含有10.0g/L磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁，卵磷脂或植酸钙的磷细菌液体培养基的三角瓶中，置摇床200rpm、30℃培养72h。结束后，测定上清液中有效磷的含量，具体测试结果详见表2。其中，溶磷液体培养基：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL，pH 7.2。
表2：菌株M29的溶磷活性
由表2数据可知，本发明提供的菌株M29对磷酸钙的溶解活力为7.37mg/L，对磷酸铝的溶解活力为4.03mg/L，对磷酸铁的溶解活力为7.92mg/L；对植酸钙的溶解活力为29.04mg/L，对卵磷脂的溶解活力为0.52mg/L；这表明本发明提供的菌株M29具有显著的溶解难溶性有机磷和无机磷活性。
将菌株M29接种活化培养基中，30℃下摇瓶培养2天，得到小麦根际舒曼氏菌M29活化菌液；制备溶磷液体培养基；将舒曼氏菌M29菌液按照1：100的比例接入溶磷液体培养基中，于30℃下180rpm培养3天。采用钼锑抗比色法测定溶磷促生菌剂的溶磷能力，将M29促生溶磷菌剂接种到分别含有10.0g/L磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁，卵磷脂或植酸钙的磷细菌液体培养基的三角瓶中，置摇床200rpm、30℃培养72h。结束后，测定上清液中有效磷的含量，具体结果参见附表3所示。其中，溶磷液体培养基：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL，pH＝7.2。
表3：菌株M29促生溶磷菌剂的溶磷活性
由表3数据可知，本发明提供的菌株M29促生溶磷菌剂对磷酸钙的溶解活力为7.59mg/L，对磷酸铝的溶解活力为4.27mg/L，对磷酸铁的溶解活力为8.16mg/L；对植酸钙的溶解活力为31.21mg/L，对卵磷脂的溶解活力为0.65mg/L；这表明本发明提供的菌株M29促生溶磷菌剂具有显著的溶解难溶性有机磷和无机磷活性。
以上数据分析可知，采用本发明提供的舒曼氏菌新菌(Schumannella sp.)M29能耐3％NaCl、溶解土壤中的难溶解性磷，尤其是有机磷植酸钙，可在一定程度上增加土壤中的可溶性磷的含量，促进植物对磷元素的吸收和利用，进而促进植物生长，减少磷肥的使用量，将其应用于促生溶磷菌剂的制备，不仅可以减少化肥用量，还可以促进植物生长，具有良好的生态效益和社会效益，在农业生物肥料方面具有广阔的开发和应用前景。
Claims (6)
1.一种舒曼氏菌新菌(Schumannellasp.)M29，其特征在于，所述舒曼氏菌新菌(Schumannellasp.)M29菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCCNo.24257。
2.如权利要求1所述的一种舒曼氏菌新菌(Schumannellasp.)M29，其特征在于，所述舒曼氏菌新菌(Schumannellasp.)M29菌株的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
3.一种舒曼氏菌新菌(Schumannellasp.)M29促生溶磷菌剂，其特征在于，该促生溶磷菌剂由舒曼氏新菌(Schumannellasp.)M29经发酵获得。
4.一种如权利要求3所述的舒曼氏新菌(Schumannellasp.)M29促生溶磷菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：将菌株舒曼氏(Schumannellasp.)M29的单菌落接种于NB培养基中，于30℃摇瓶培养2天，获得舒曼氏菌(Schumannellasp.)M29种子液；将舒曼氏菌(Schumannellasp.)M29种子液，按照体积比为1％的接种量接入到NB液体培养基，于30℃、180rpm发酵培养3天，获得舒曼氏(Schumannellasp.)M29促生溶磷菌剂。
5.如权利要求1所述的舒曼氏菌新菌(Schumannellasp.)M29在植物促生中的应用。
6.如权利要求3所述的舒曼氏菌新菌(Schumannellasp.)M29促生溶磷菌剂在植物促生中的应用。
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