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CN116640238B - 一种胍基吡啶壳聚糖鎓盐及其制备方法和应用 - Google Patents

一种胍基吡啶壳聚糖鎓盐及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116640238B
CN116640238B CN202310618433.2A CN202310618433A CN116640238B CN 116640238 B CN116640238 B CN 116640238B CN 202310618433 A CN202310618433 A CN 202310618433A CN 116640238 B CN116640238 B CN 116640238B
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张书伟
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Abstract

本发明提供了一种胍基吡啶壳聚糖鎓盐及其制备方法和应用，属于抗菌剂技术领域。本发明首先将对氯甲基苯甲酸酯类化合物与吡啶类化合物进行反应，再与氰胺类化合物进行反应得到胍基吡啶季铵盐，然后再接枝到壳聚糖分子链上，得到的胍基吡啶壳聚糖鎓盐具有优异的水溶性，具有更高的抗菌、抑菌活性，能够抑制生物被膜的形成，同时对成熟的细菌生物被膜具有较好的清除效果。

Description

一种胍基吡啶壳聚糖鎓盐及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及抗菌剂技术领域，尤其涉及一种胍基吡啶壳聚糖鎓盐及其制备方法和应用。
背景技术
壳聚糖是由甲壳素通过脱乙酰得到的一种多糖类天然高分子，具有良好的生物相容性与生物降解性，无毒、无刺激性等性能，目前广泛的应用于医用、食品、农业等领域。壳聚糖具有广谱抗菌性，但是单纯的壳聚糖其抗菌性能并不显著，且溶解性受到限制。胍类化合物是指结构中含有-NH2C(＝NH)NH2基团的化合物及其衍生物。迄今为止，胍是自然界中被发现的具有最强正电性生物活性的有机碱，最常见的精氨酸就是胍盐的一种。胍类抗菌剂通过自身的正电荷与细菌的细胞膜作用，不易产生耐药性，胍类抗菌剂因此备受关注。将胍基接枝到壳聚糖分子结构中可以不仅可以提升壳聚糖的水溶性，对于提升壳聚糖的抗菌活性也有积极的作用。
目前研究较多的胍化壳聚糖主要是有壳聚糖单胍盐酸盐和壳聚糖双胍盐酸盐。但是其抗菌性能仍较为一般且对成熟的细菌生物被膜的清除效果较差。因此，如何进一步提高胍化壳聚糖的抗菌性能及对成熟的细菌生物被膜的清除效果成为现有技术的难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胍基吡啶壳聚糖鎓盐及其制备方法和应用。本发明制备的胍基吡啶壳聚糖鎓盐具有更高的抗菌性能且对成熟的细菌生物被膜具有优异的清除效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种胍基吡啶壳聚糖鎓盐的制备方法，包括以下步骤：
(1)将对氯甲基苯甲酸酯类化合物与溶剂和吡啶类化合物混合后进行季铵化反应，得到吡啶季铵盐；
(2)将所述步骤(1)得到的吡啶季铵盐与溶剂、盐酸和氰胺类化合物混合后进行加成反应，得到中间产物；
(3)将所述步骤(2)得到的中间产物与溶剂和碱混合进行皂化反应后加酸，得到胍基吡啶季铵盐；
(4)将所述步骤(3)得到的胍基吡啶季铵盐与溶剂、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和壳聚糖溶液混合后进行接枝反应，得到胍基吡啶壳聚糖鎓盐。
优选地，所述步骤(1)中对氯甲基苯甲酸酯类化合物和吡啶类化合物的物质的量之比为1：(1～2)。
优选地，所述步骤(1)中季铵化反应的温度为50～140℃，季铵化反应的时间为4～48h。
优选地，所述步骤(2)中吡啶季铵盐与氰胺类化合物的物质的量之比为1：(1～3)。
优选地，所述步骤(2)中加成反应的温度为40～100℃，加成反应的时间为4～48h。
优选地，所述步骤(4)中胍基吡啶季铵盐与壳聚糖溶液中壳聚糖的物质的量之比为(1～3)：1。
优选地，所述步骤(4)中胍基吡啶季铵盐与1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的物质的量之比为1：(1～3)。
优选地，所述步骤(4)中接枝反应的温度为20～50℃，接枝反应的时间为12～48h。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备的胍基吡啶壳聚糖鎓盐。
本发明还提供了上述技术方案所述胍基吡啶壳聚糖鎓盐在抑菌及抑制细菌生物被膜中的应用。
本发明提供了一种胍基吡啶壳聚糖鎓盐的制备方法，包括以下步骤：(1)将对氯甲基苯甲酸酯类化合物与溶剂和吡啶类化合物混合后进行季铵化反应，得到吡啶季铵盐；(2)将所述步骤(1)得到的吡啶季铵盐与溶剂、盐酸和氰胺类化合物混合后进行加成反应，得到中间产物；(3)将所述步骤(2)得到的中间产物与溶剂和碱混合进行皂化反应后加酸，得到胍基吡啶季铵盐；(4)将所述步骤(3)得到的胍基吡啶季铵盐与溶剂、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和壳聚糖溶液混合后进行接枝反应，得到胍基吡啶壳聚糖鎓盐。本发明首先将对氯甲基苯甲酸酯类化合物与吡啶类化合物进行反应，再与氰胺类化合物进行反应得到胍基吡啶季铵盐，然后再接枝到壳聚糖分子链上，得到胍基吡啶壳聚糖鎓盐，其中的胍基和吡啶鎓盐均有良好的水溶性，且胍基和吡啶鎓盐都带有正电荷，二者电荷叠加，其抗菌性能得到提高，具有更高的抗菌、抑菌活性，能够抑制生物被膜的形成，同时对成熟的细菌生物被膜具有较好的清除效果。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的胍基吡啶壳聚糖鎓盐的1H NMR图；
图2为本发明对比例1制备的壳聚糖季铵盐的1H NMR图；
图3为本发明对比例2制备的壳聚糖双胍盐酸盐的1H NMR图。
具体实施方式
本发明提供了一种胍基吡啶壳聚糖鎓盐的制备方法，包括以下步骤：
(1)将对氯甲基苯甲酸酯类化合物与溶剂和吡啶类化合物混合后进行季铵化反应，得到吡啶季铵盐；
(2)将所述步骤(1)得到的吡啶季铵盐与溶剂、盐酸和氰胺类化合物混合后进行加成反应，得到中间产物；
(3)将所述步骤(2)得到的中间产物与溶剂和碱混合进行皂化反应后加酸，得到胍基吡啶季铵盐；
(4)将所述步骤(3)得到的胍基吡啶季铵盐与溶剂、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和壳聚糖溶液混合后进行接枝反应，得到胍基吡啶壳聚糖鎓盐。
如无特殊说明，本发明对所述各原料的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的市售产品即可。
本发明将对氯甲基苯甲酸酯类化合物与溶剂和吡啶类化合物混合后进行季铵化反应，得到吡啶季铵盐。
在本发明中，所述对氯甲基苯甲酸酯类化合物优选包括对氯甲基苯甲酸甲酯、对氯甲基苯甲酸乙酯、对氯甲基苯甲酸丁酯或对氯甲基苯甲酸叔丁醇酯。
在本发明中，所述溶剂优选包括乙酸乙酯、四氢呋喃、丙酮、石油醚、乙腈和甲苯中的一种或多种。
在本发明中，所述对氯甲基苯甲酸酯类化合物和溶剂的质量比优选为(1～2)：20，更优选为(1.5～2)：20。本发明将对氯甲基苯甲酸酯类化合物和溶剂的质量比限定在上述范围内，能够使原料溶解的更加充分。
在本发明中，所述吡啶类化合物优选包括2-氨基吡啶、3-氨基吡啶、4-氨基吡啶或4-氨基-N-甲基哌啶。
在本发明中，所述对氯甲基苯甲酸酯类化合物和吡啶类化合物的物质的量之比优选为1：(1～2)，更优选为1：(1.2～1.8)。本发明将对氯甲基苯甲酸酯类化合物和吡啶类化合物的物质的量之比限定在上述范围内，能够使得两者充分反应。
在本发明中，所述季铵化反应的温度优选为50～140℃，更优选为80～100℃；所述季铵化反应的时间优选为4～48h，更优选为10～30h。本发明将季铵化反应的温度和时间限定在上述范围内，能够使得对氯甲基苯甲酸酯类化合物和吡啶类化合物充分反应。
季铵化反应完成后，本发明优选将所述季铵化反应的产物依次进行过滤、洗涤和干燥，得到吡啶季铵盐。
本发明对所述过滤、洗涤和干燥的操作没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过滤、洗涤和干燥的技术方案即可。
得到吡啶季铵盐后，本发明将所述吡啶季铵盐与溶剂、盐酸和氰胺类化合物混合后进行加成反应，得到中间产物。
在本发明中，所述溶剂优选包括乙醇。
在本发明中，所述吡啶季铵盐与溶剂的质量比优选为(2～3)：5，更优选为(2.5～3)：5。本发明将吡啶季铵盐与溶剂的质量比限定在上述范围内，能够使得各原料充分溶解。
在本发明中，所述盐酸的浓度优选为10～15mol/L，更优选为12mol/L；所述吡啶季铵盐和盐酸中氯化氢的物质的量之比优选为(0.5～1.5)：1，更优选为1:1。在本发明中，所述盐酸用于稳定生成的胍基。
在本发明中，所述氰胺类化合物优选包括单氰胺或双氰胺。
在本发明中，所述吡啶季铵盐与氰胺类化合物的物质的量之比优选为1：(1～3)，更优选为1：(1.5～2.5)。本发明将吡啶季铵盐与氰胺类化合物的物质的量之比限定在上述范围内，能够使得两者充分反应。
在本发明中，所述加成反应的温度优选为40～100℃，更优选为60～80℃；所述加成反应的时间优选为4～48h，更优选为6～35h。本发明将加成反应的温度和时间限定在上述范围内，能够使得吡啶季铵盐与氰胺类化合物充分反应。
加成反应完成后，本发明优选将所述加成反应后的产物依次进行浓缩、沉淀，得到中间产物。
本发明对所述浓缩的操作没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩的技术方案即可。
在本发明中，所述沉淀优选加入丙酮进行沉淀。本发明对所述加入丙酮的量没有特殊的限定，保证产物沉淀完全即可。
得到中间产物后，本发明将所述中间产物与溶剂和碱混合进行皂化反应后加酸，得到胍基吡啶季铵盐。
在本发明中，所述溶剂优选包括乙醇。
在本发明中，所述吡啶季铵盐与溶剂的质量比优选为(2～3)：3，更优选为(2.5～3)：3。本发明将吡啶季铵盐与溶剂的质量比限定在上述范围内，能够使得中间产物充分溶解。
在本发明中，所述碱优选包括氢氧化钠。
在本发明中，所述吡啶季铵盐与碱的质量比优选为(2～3)：0.4，更优选为(2.5～3)：0.4。在本发明中，所述碱用于和酯发生皂化反应。
在本发明中，所述皂化反应的温度优选为50～70℃，更优选为60℃；所述皂化反应的时间优选为8～15h，更优选为10～12h。
在本发明中，所述酸优选为盐酸；所述盐酸的浓度优选为10～15mol/L，更优选为12mol/L。在本发明中，所述加入酸的量优选为使体系的pH值降低到4以下。在本发明中，所述加入酸后优选反应20～40min，然后依次进行过滤、浓缩、沉淀。在本发明中，所述加酸用于形成羧基。
得到胍基吡啶季铵盐后，本发明将所述胍基吡啶季铵盐与溶剂、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和壳聚糖溶液混合后进行接枝反应，得到胍基吡啶壳聚糖鎓盐。
在本发明中，所述溶剂优选包括乙醇与水的混合溶液或乙醇。在本发明中，当所述溶剂为乙醇与水的混合溶液时，所述乙醇的体积含量优选为40～60％，更优选为50％。
在本发明中，所述胍基吡啶季铵盐与溶剂的质量比优选为(4～5)：50，更优选为(4.2～4.8)：50。本发明将胍基吡啶季铵盐与溶剂的质量比限定在上述范围内，能够使得胍基吡啶季铵盐充分溶解。
在本发明中，所述胍基吡啶季铵盐与1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的物质的量之比优选为1：(1～3)，更优选为1：(1.5～2.5)。
在本发明中，所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的物质的量之比优选为1：(0.5～1.5)，更优选为1:1。
在本发明中，所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺用于活化羧基，以利于其接枝到壳聚糖中。
在本发明中，所述壳聚糖溶液中的溶剂优选为醋酸水溶液；所述醋酸水溶液的体积浓度优选为1.5～2.5％，更优选为2％。
在本发明中，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度优选为0.1～5％，更优选为1～4％，最优选为1～3％。本发明将壳聚糖的浓度限定在上述范围内，能够使其充分溶解。
在本发明中，所述胍基吡啶季铵盐与壳聚糖溶液中壳聚糖的物质的量之比优选为(1～3)：1，更优选为(1.5～2.5)：1。本发明将胍基吡啶季铵盐与壳聚糖溶液中壳聚糖的物质的量之比限定在上述范围内，能够调节产物中胍基吡啶季铵盐的含量，进一步提高其抗菌性能。
在本发明中，所述胍基吡啶季铵盐与溶剂、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和壳聚糖溶液的混合优选为：首先将胍基吡啶季铵盐溶解在溶剂中，然后加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，最后再加入壳聚糖溶液。
在本发明中，所述接枝反应的温度优选为20～50℃，更优选为20～30℃；所述接枝反应的时间优选为12～48h，更优选为20～35h。本发明将接枝反应的温度和时间限定在上述范围内，能够使得胍基吡啶季铵盐和壳聚糖充分反应。
接枝反应完成后，本发明优选将所述接枝后的产物依次进行超滤、浓缩和干燥，得到胍基吡啶壳聚糖鎓盐。
本发明对所述超滤、浓缩和干燥的操作没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的超滤、浓缩和干燥的技术方案即可。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备的胍基吡啶壳聚糖鎓盐。
本发明提供的胍基吡啶壳聚糖鎓盐具有优异的水溶性，更高的抗菌、抑菌活性，能够抑制生物被膜的形成，同时对成熟的细菌生物被膜具有较好的清除效果。
本发明还提供了上述技术方案所述胍基吡啶壳聚糖鎓盐在抑菌及抑制细菌生物被膜中的应用。
本发明对所述胍基吡啶壳聚糖鎓盐在抑菌及抑制细菌生物被膜中的应用的操作没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的胍基吡啶壳聚糖鎓盐在抑菌及抑制细菌生物被膜中的应用的技术方案即可。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)称取1.85kg对氯甲基苯甲酸甲酯溶解于20kg乙酸乙酯(对氯甲基苯甲酸甲酯和乙酸乙酯的质量比为1.85:20)中，并投入到反应釜中，搅拌状态下加入1.13kg 4-氨基吡啶(对氯甲基苯甲酸甲酯和4-氨基吡啶的物质的量之比为1:1.2)，升高温度至85℃，回流搅拌10h，反应过程中有大量白色固体析出，反应结束后抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤多次，干燥得4-氨基-1-(4-甲氧羰基)苄基吡啶氯化物；
(2)称取2.78kg 4-氨基-1-(4-甲氧羰基)苄基吡啶氯化物溶解在5kg乙醇(4-氨基-1-(4-甲氧羰基)苄基吡啶氯化物和乙醇的质量比为2.78:5)溶液中，加入盐酸溶液(浓度为12mol/L，4-氨基-1-(4-甲氧羰基)苄基吡啶氯化物和盐酸中氯化氢的物质的量之比为1:1)，完全溶解后加入0.84kg双氰胺(4-氨基-1-(4-甲氧羰基)苄基吡啶氯化物和双氰胺的物质的量之比为1:1)，60℃回流搅拌6h，浓缩，丙酮沉淀得中间产物，将中间产物溶解在3kg乙醇(4-氨基-1-(4-甲氧羰基)苄基吡啶氯化物和乙醇的质量比为2.78:3)中，加入0.4kg氢氧化钠(4-氨基-1-(4-甲氧羰基)苄基吡啶氯化物和氢氧化钠的质量比为2.78:0.4)，60℃回流过夜，冷却后用12mol/L盐酸调节体系pH值至4以下，搅拌30min，过滤，浓缩滤液，丙酮沉淀得到双胍基-1-(4-羧基苄基)吡啶盐酸盐；
(3)称取1.61kg壳聚糖溶解在100kg体积分数为2％的醋酸水中，得壳聚糖醋酸溶液，此时壳聚糖的质量百分浓度为1.6％；
(4)称取4.21kg双胍基-1-(4-羧基苄基)吡啶盐酸盐溶解在50kg体积分数为50％的乙醇水中(双胍基-1-(4-羧基苄基)吡啶盐酸盐和乙醇水的质量比为4.21:50)，加入1.92kg 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(双胍基-1-(4-羧基苄基)吡啶盐酸盐和1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的物质的量之比为1:1)和1.15kgN-羟基丁二酰亚胺(1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的物质的量之比为1:1)，完全溶解后得到胍基吡啶季铵盐溶液，溶液中双胍基-1-(4-羧基苄基)吡啶盐酸盐的质量百分浓度为8.4％；
(5)将胍基吡啶季铵盐溶液缓慢滴加到反应釜内的壳聚糖醋酸水溶液中，加料完毕后室温反应24h，双胍基-1-(4-羧基苄基)吡啶盐酸盐与壳聚糖醋酸水溶液中壳聚糖的物质的量之比为1:1；
(6)室温反应24h结束后，将产物转移至超滤装置中，加水超滤提纯，浓缩干燥得到胍基吡啶壳聚糖鎓盐；
本实施例的反应过程如下所示：
对比例1
步骤1、称取1.70kg对氯甲基苯甲酸溶解于20kg乙酸乙酯中，并投入到反应釜中，搅拌状态下加入0.95kg吡啶，升高温度至85℃，回流搅拌10h，反应过程中有大量白色固体析出，反应结束后抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤多次，干燥得N-吡啶-(4-羧基苄基)鎓盐；
步骤2、称取1.61kg壳聚糖溶解在50kg体积分数为2％的醋酸水中，得壳聚糖醋酸溶液，此时壳聚糖的质量百分浓度为3.2％；
步骤3、称取2.49kgN-吡啶-(4-羧基苄基)鎓盐溶解在50kg水中，加入1.92kg 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1.15kgN-羟基丁二酰亚胺，完全溶解后得到小分子溶液，溶液中N-吡啶-(4-羧基苄基)鎓盐的质量百分浓度为3.84％，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的摩尔百分比为1:1；
步骤4、将吡啶季铵盐溶液缓慢滴加到反应釜内的壳聚糖醋酸水溶液中，加料完毕后30℃反应24h，本实施例中，N-吡啶-(4-羧基苄基)鎓盐与步骤2中加入的壳聚糖的摩尔比为1:1；
步骤5、室温反应24h结束后，将产物转移至超滤装置中，加水超滤提纯，浓缩干燥得到壳聚糖季铵盐。
对比例2
步骤1、称取1.37kg对氨基苯甲酸溶解于10kg乙醇中，加入盐酸溶液，加入0.84kg双氰胺，60℃回流搅拌6h，浓缩，丙酮沉淀得粗产物，丙酮和水重结晶得对双胍基苯甲酸盐酸盐；
步骤2、称取1.61kg溶解在100kg体积分数为2％的醋酸水中，得到壳聚糖醋酸溶液，此时壳聚糖的质量百分浓度为1.6％；
步骤3、称取2.94kg对双胍基苯甲酸溶解在50kg体积分数为50％的乙醇水中，加入1.92kg 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1.15kgN-羟基丁二酰亚胺，完全溶解后得到小分子溶液，溶液中对双胍基苯甲酸的质量百分浓度为5.9％，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的摩尔百分比为1:1；
步骤4、将对双胍基苯甲酸溶液缓慢滴加到反应釜内的壳聚糖醋酸水溶液中，加料完毕后室温反应24h，本实施例中，对双胍基苯甲酸与步骤2中加入的壳聚糖的摩尔比为1:1；
步骤5、室温反应24h结束后，将产物转移至超滤装置中，加水超滤提纯，浓缩干燥得到壳聚糖双胍盐酸盐。
实施例1制备的胍基吡啶壳聚糖鎓盐、对比例1制备的壳聚糖季铵盐、对比例2制备的壳聚糖双胍盐酸盐的1H NMR图分别如图1～3所示。从图1～3中证明了所得产物的结构。
抗菌性能测试
采用平板计数法对实施例1和对比例1～2中壳聚糖衍生物的抗菌性能进行测试，通过公式1计算抑菌率，结果列于表1和表2中。
表1实施例1和对比例1～2中不同浓度的壳聚糖衍生物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果
浓度 2.5mg/mL 1.0mg/mL 0.5mg/mL
实施例1 100 100 100
对比例1 100 100 100
对比例2 97.92 91.90 88.16
表2实施例1和对比例1～2中不同浓度的壳聚糖衍生物对大肠杆菌的抑菌效果
浓度 2.5mg/mL 1.0mg/mL 0.5mg/mL
实施例1 73.22 58.48 43.25
对比例1 68.24 50.00 34.12
对比例2 48.73 38.24 26.06
通过比浊法测定实施例1和对比例1～2中壳聚糖衍生物的最低抑菌浓度(MIC)和最低生物被膜抑制浓度(MBC)，结合平板计数法测定实施例1和对比例1～2中壳聚糖衍生物的最低杀菌浓度(MBC)和最低生物被膜杀灭浓度(MBBC)，结果列于表3和表4中，具体方法如下：
在96孔板中加入稀释好的菌液100μL和100μL经倍半稀释后的壳聚糖溶液，再分别做一个只加壳聚糖衍生物溶液不加菌液的对照组和只加菌液不加壳聚糖衍生物溶液的对照组，每个浓度的壳聚糖衍生物做3组平行，于37℃培养箱中培养18h后观察结果，以澄清的孔中所对应的壳聚糖衍生物最低浓度作为MIC，取澄清的孔中的菌液和样品溶液的混合液100μL进行涂板，以每皿菌落数小于5个所对应的最低浓度记为MBC。
在96孔板中加入稀释好的菌液置于37℃培养箱中培养36～48h，使菌液在孔板上形成生物被膜，然后弃去浮游菌，用无菌生理盐水或PBS漂洗，干燥固定，向96孔板中加入稀释好的壳聚糖衍生物样品溶液100μL和100μL培养基，以无菌水作为对照组，置于37℃培养箱中培养18h后观察结果，以澄清的孔中所对应的壳聚糖衍生物最低浓度作为MBIC，取澄清的孔中的菌液和样品溶液的混合液100μL进行涂板，以每皿菌落数小于5个所对应的最低壳聚糖衍生物浓度记为MBBC。
表3金黄色葡萄球菌BF形成前后耐药性的变化
表4大肠杆菌BF形成前后耐药性的变化
结晶紫染色的方法可以快速简便的测量药物对生物被膜的干预作用。通过不同药物作用下OD值的大小，可以反应壳聚糖衍生物对生物被膜形成的抑制强弱，具体方法如下：
在96孔板中加入稀释好的菌液100μL和100μL稀释至一定浓度的壳聚糖衍生物溶液(4MIC、2MIC、MIC)，以水为对照组，壳聚糖衍生物的终浓度为2MIC、MIC和1/2MIC。每个浓度的药物做3组平行，于37℃恒温箱中培养36～48h，然后弃去浮游菌及壳聚糖衍生物溶液，用无菌生理盐水漂洗，干燥固定，加入0.1％的结晶紫溶液染色15min，弃去结晶紫溶液并用无菌生理盐水漂洗3次，无菌风干燥，加入95％的乙醇溶液，5min后用酶标仪在595nm处测定吸光度，通过公式2计算生物被膜形成抑制率，结果列于表5和表6中。
表5壳聚糖衍生物对金黄色葡萄球菌生物被膜形成抑制效果
浓度 1/2MIC MIC 2MIC
实施例1 69.06％ 79.77％ 90.62％
对比例1 60.72％ 71.2％ 83.42％
对比例2 62.99％ 74.96％ 79.98％
表6壳聚糖衍生物对大肠杆菌生物被膜形成抑制效果
在96孔板中加入稀释好的菌液200μL，然后置于37℃恒温培养箱中培养36～48h，弃去菌液，无菌生理盐水漂洗，干燥固定，然后加入壳聚糖衍生物溶液200μL，无菌水作为对照组，37℃培养箱中恒温1h，弃去壳聚糖衍生物溶液，无菌生理盐水漂洗，结晶紫染色，干燥，加入95％的乙醇溶液，5min后用酶标仪测定595nm处的吸光度，通过公式3计算生物被膜的清除率，结果列于表7和表8中。
表7壳聚糖衍生物对金黄色葡萄球菌生物被膜清除效果
浓度 2.5mg/mL 5.0mg/mL
实施例1 90.06％ 94.01％
对比例1 83.81％ 89.04％
对比例2 88.46％ 91.83％
表8壳聚糖衍生物对大肠杆菌生物被膜的清除效果
浓度 2.5mg/mL 5.0mg/mL
实施例 72.87％ 77.98％
对比例1 46.18％ 50.22％
对比例2 65.61％ 76.79％
上述结果表明，通过本发明制备方法制备的胍基吡啶壳聚糖鎓盐对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有效果，还能抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生物被膜形成，对成熟的生物被膜有一定的清除作用，且通过对比例可以发现，制备得胍基吡啶壳聚糖鎓盐的抗菌活性和抗生物被膜活性均优于对应的胍基壳聚糖和对应的壳聚糖季铵盐。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种胍基吡啶壳聚糖鎓盐的制备方法，包括以下步骤：
(1)将对氯甲基苯甲酸酯类化合物与溶剂和吡啶类化合物混合后进行季铵化反应，得到吡啶季铵盐；所述吡啶类化合物包括2-氨基吡啶、3-氨基吡啶、4-氨基吡啶或4-氨基-N-甲基哌啶；
(2)将所述步骤(1)得到的吡啶季铵盐与溶剂、盐酸和氰胺类化合物混合后进行加成反应，得到中间产物；
(3)将所述步骤(2)得到的中间产物与溶剂和碱混合进行皂化反应后加酸，得到胍基吡啶季铵盐；
(4)将所述步骤(3)得到的胍基吡啶季铵盐与溶剂、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和壳聚糖溶液混合后进行接枝反应，得到胍基吡啶壳聚糖鎓盐。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中对氯甲基苯甲酸酯类化合物和吡啶类化合物的物质的量之比为1：(1～2)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中季铵化反应的温度为50～140℃，季铵化反应的时间为4～48h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中吡啶季铵盐与氰胺类化合物的物质的量之比为1：(1～3)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中加成反应的温度为40～100℃，加成反应的时间为4～48h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中胍基吡啶季铵盐与壳聚糖溶液中壳聚糖的物质的量之比为(1～3)：1。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中胍基吡啶季铵盐与1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的物质的量之比为1：(1～3)。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中接枝反应的温度为20～50℃，接枝反应的时间为12～48h。
9.权利要求1～8任意一项所述制备方法制备的胍基吡啶壳聚糖鎓盐。
10.权利要求9所述胍基吡啶壳聚糖鎓盐在制备抑菌及抑制细菌生物被膜的药物中的应用。
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