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CN116622659A - 氧甲基转移酶Cy6OMT及其在催化苄基异喹啉生物碱中的应用 - Google Patents

氧甲基转移酶Cy6OMT及其在催化苄基异喹啉生物碱中的应用 Download PDF

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CN116622659A
CN116622659A CN202210124561.7A CN202210124561A CN116622659A CN 116622659 A CN116622659 A CN 116622659A CN 202210124561 A CN202210124561 A CN 202210124561A CN 116622659 A CN116622659 A CN 116622659A
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CN
China
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protein
sequence
cy6omt
biological material
hydroxymethylation
Prior art date
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Pending
Application number
CN202210124561.7A
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English (en)
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黄璐琦
郭娟
卜俊玲
刘秀玉
李琦爽
马莹
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Institute of Materia Medica of CACMS
Original Assignee
Institute of Materia Medica of CACMS
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Publication date
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Publication of CN116622659A publication Critical patent/CN116622659A/zh
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Abstract

本发明公开了氧甲基转移酶Cy6OMT及其在催化苄基异喹啉生物碱化合物中的应用。本发明所保护的一个技术方案是蛋白质相关的生物材料及该蛋白质在作为氧甲基转移酶或制备苄基异喹啉生物碱中的应用。所述蛋白质的氨基酸序列可为序列表中序列1或序列1的第166‑513位。本发明筛选的Cy6OMT具有对1‑BIA底物(S)–去甲乌药碱的C6位羟基甲基化催化特异性强，并同时对(原)小檗碱型化合物的异喹啉结构的C6或C7位羟基具有甲基化催化功能。该Cy6OMT酶具有催化底物骨架广的特点，目前已报道的6OMT一般不具备对小檗碱型化合物的羟基甲基化催化功能或催化能力非常微弱。

Description

氧甲基转移酶Cy6OMT及其在催化苄基异喹啉生物碱中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及氧甲基转移酶Cy6OMT及其在催化苄基异喹啉生物碱化合物中的应用。
背景技术
中药延胡索是罂粟科紫堇属延胡索Corydalis yanhusuo的干燥块茎，具有活血、行气、止痛的功效，用于治疗胸胁、脘腹疼痛，胸痹心痛，经闭痛经，产后瘀阻，跌扑肿痛4。延胡索的主要成分为苄基异喹啉类生物碱，其中延胡索乙素，延胡索甲素和延胡索丑素被认为是延胡索的主要止痛成分。近年来，越来越多的药理证据显示出原小檗碱型化合物具有开发为非成瘾性止痛药物的潜力以及治疗物质使用障碍(substance use disorders)的潜力，如缓解使用吗啡类药物引发的成瘾综合征等。因此,传统中药延胡索是一个极具前景的止痛药物的资源库，值得我们进一步的开发。
苄基异喹啉生物碱(BIA)是一类重要的次生代谢物，主要分布于罂粟科、毛茛科、小檗科和防己科植物。目前已报道的BIA大约有2,500种，包括麻醉镇痛药可待因(Codeine)和吗啡(Morphine)，镇痛药延胡索乙素(Tetrahydropalmatine)，抗菌药血根碱(Sanguinarine)和小檗碱(Berberine chloride hydrate)等。异喹啉类生物碱活性与立体结构严格相关，对于结构复杂的BIAs类化合物，提取纯化和化学合成都有很大局限，因此次生代谢物的合成生物学研究即利用分子生物学技术和代谢工程手段构建高产的基因工程菌的方法受到广泛关注。近些年BIAs的微生物代谢工程研究取得了许多突破性的进展,在微生物中已构建出蒂巴因、氢可待因、诺斯卡品、延胡索乙素等生物碱的完整通路，极大促进苄基异喹啉类化合物的异源生产。少数植物物种被视为研究BIA生物合成途径的模型系统，除模式植物外，还有许多在传统医学中历史悠久的含BIAs的植物也同样具有研究开发的潜力。
延胡索的主要成分是小檗碱型和原小檗碱型化合物，生物合成途径主体较为清晰：去甲乌药碱合酶NCS通过催化多巴胺和4-HPAA两分子间形成C-C键生成(S)-Norcoclaurine，再经过3个甲基转移酶(6OMT,CNMT,4’OMT)以及一个P450酶NMCH生成重要中间体(S)-Reticuline，它是吗啡类、原小檗碱类和苯骈菲啶类化合物重要的共同中间体。在原小檗碱途径上，BBE催化(S)-Reticuline形成(S)-Scoulerine,接着甲基转移酶SOMT、CoOMT进一步催化(S)-Scoulerine形成延胡索乙素。原小檗碱型化合物如延胡索乙素在STOX酶作用下氧化成小檗碱型化合物。
6OMT催化(S)-Norcoclaurine甲基化生成(S)-Coclaurine，被认为是BIA途径中的限速酶，在E.californica细胞中过表达Coptis japonica 6OMT及在opium poppy中过表达6OMT都显著提升细胞中总生物碱的积累。分离鉴定的6OMT主要来自Papaver somniferum、Glaucium flavum、Thalictrum flavum、Coptis japonica、C.chinensis、C.teeta和Stephania tetrandra。在体外功能验证中，Cj6OMT(Coptis japonica来源的6OMT)具有较高的专一性，具有甲基化1-BIA类化合物C6位羟基的功能，但不能高效催化原小檗碱型化合物。Cc6OMT(C.chinensis来源的6OMT)催化(S)-Norcoclaurine C6位羟基甲基化功能，并伴随少量C7位羟基甲基化产物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何获得能够催化1-BIA化合物(S)-Norcoclaurine的C6位羟基甲基化，并同时对(原)小檗碱型化合物的异喹啉结构的羟基具有催化功能的氧甲基转移酶。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质相关的生物材料。所述蛋白质可为如下A1)、A2)、A3)或A4)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质。
A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第166-513位的蛋白质。
A3)在A1)或A2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。
A4)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)或A2)衍生的或与A1)或A2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。所述生物材料可为下述B1)至B6)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子。
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒。
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体。
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
B5)促进或提高所述蛋白质表达的核酸分子。
B6)含有B5)所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
上文所述的生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b1)、b2)或b3)所示的所述蛋白质的编码基因：
b1)编码序列是序列表中序列2的第496-1542位核苷酸的cDNA分子或DNA分子。
b2)核苷酸是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子。
b3)与b2)限定的cDNA或DNA分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
上文所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上文所述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上文所述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上文所述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上文所述杂交可为在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述生物材料中，B2)所述的含有核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上文所述蛋白质的DNA。所述表达盒还可包括表达上述任意一种蛋白的核酸分子所必需的所有调控序列的单链或双链核酸分子。所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中表达上述任一种蛋白质。所述调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入载体的特定限制性酶位点以便将调控序列与编码蛋白质的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导蛋白质表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内蛋白质的基因。调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码蛋白质的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于编码蛋白质的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。调控序列还可以是信号肽编码区，该区编码一段连在蛋白质氨基端的氨基酸序列，能引导编码蛋白质进入细胞分泌途径。能引导表达后的蛋白质进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。添加能根据宿主细胞的生长情况来调节蛋白质表达的调控序列可能也是需要的。调控系统的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出反应，从而开放或关闭基因表达的系统。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在这些例子中，应将编码蛋白质的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了蛋白质作为氧甲基转移酶在制备苄基异喹啉(类)生物碱中的应用，所述蛋白质可为上文所述的蛋白质。
上文所述的蛋白质也属于本发明的保护范围。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了蛋白质在作为氧甲基转移酶或在制备苄基异喹啉(类)生物碱中的应用。所述蛋白质可为上文所述的蛋白质。
所述苄基异喹啉(类)生物碱可为(S)-乌药碱、四氢巴马汀和/或巴马汀。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上文所述的生物材料和/或上文所述的蛋白质的下述任一种应用：
F1、上文所述的生物材料和/或上文所述的蛋白质在催化(S)-去甲乌药碱(S)-Norcoclaurine的C6位羟基甲基化中的应用。
F2、上文所述的生物材料和/或上文所述的蛋白质在催化非洲防己碱(Columbamine)C2位羟基(即异喹啉结构的C7位羟基)甲基化中的应用。
F3、上文所述的生物材料和/或上文所述的蛋白质在催化药根碱(Jatrorrhizine)C3位羟基甲基化中的应用。
F4、上文所述的生物材料和/或上文所述的蛋白质在催化四氢药根碱(Tetrahyjatrorrhizine)C3位羟基(即异喹啉结构的C6位羟基)甲基化中的应用。
F5、上文所述的生物材料和/或上文所述的蛋白质在制备苄基异喹啉(类)生物碱中的应用。
F6、上文所述的生物材料和/或上文所述的蛋白质在制备苄基异喹啉(类)生物碱产品中的应用。
上文所述的生物材料和/或上文所述的蛋白质相关的下述任一种产品也属于本发明的保护范围：
P1、生产苄基异喹啉(类)生物碱的产品。
P2、制备催化(S)-去甲乌药碱(S)-Norcoclaurine的C6位羟基甲基化的产品。
P3、制备催化非洲防己碱(Columbamine)C2位羟基(即异喹啉结构的C7位羟基)甲基化的产品。
P4、制备催化药根碱(Jatrorrhizine)C3位羟基(即异喹啉结构的C6位羟基)甲基化的产品。
P5、制备催化四氢药根碱(Tetrahyjatrorrhizine)C3位羟基(即异喹啉结构的C6位羟基)甲基化的产品。
P6、生产延胡索来源的(S)-Norcoclaurine 6位氧甲基转移酶Cy6OMT的产品。
上文所述的产品中，所述苄基异喹啉(类)生物碱可为(S)-乌药碱、四氢巴马汀和/或巴马汀。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种制备延胡索来源的(S)-Norcoclaurine6位氧甲基转移酶Cy6OMT的方法。所述方法包括如下步骤：将上文所述蛋白质的编码基因在原核微生物中进行表达得到所述延胡索来源的(S)-Norcoclaurine 6位氧甲基转移酶Cy6OMT。
上文所述方法中，将所述蛋白质的编码基因在原核微生物中进行表达可包括将上文所述蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述延胡索来源的(S)-Norcoclaurine 6位氧甲基转移酶Cy6OMT的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述延胡索来源的(S)-Norcoclaurine 6位氧甲基转移酶Cy6OMT的步骤。
上文所述方法中，所述表达可为诱导表达。
上文所述方法中，所述原核微生物可为大肠杆菌。
本发明通过基因的筛选、异源表达以及酶活性的体外检测等技术对延胡索的1个OMT基因进行了功能鉴定，该酶可以高效催化(S)-Norcoclaurine的C6位羟基甲基化，同时具有催化底物骨架广的特点，命名为延胡索来源的(S)-Norcoclaurine 6位氧甲基转移酶Cy6OMT。
本发明实施例中结果显示Cy6OMT对1-苄基异喹啉生物碱(1-BIA)化合物(S)-去甲乌药碱((S)-Norcoclaurine)的C6位羟基甲基化催化效率高，催化位点特异性较强；Cy6OMT催化原小檗碱型化合物四氢药根碱(Tetrahyjatrorrhizine)的C3位(即异喹啉结构的C6位)羟基甲基化生成四氢巴马汀(Tetrahydropalmatine)；同时Cy6OMT可催化小檗碱型化合物非洲防己碱(Columbamine)的C2位(即异喹啉结构C7位)和药根碱(Jatrorrhizine)的C3位(即异喹啉结构的C6位)羟基甲基化生成巴马汀(Palmatine)。Cy6OMT具有对底物(S)-NorcoclaurineC6位催化特异性强以及催化底物骨架广的特点。目前已报道的6OMT一般不具备对小檗碱型化合物的催化功能或催化能力非常微弱。
附图说明
图1为重组质粒pET32a-Cy6OMT的PCR鉴定。M：DNA分子量标准(DL2000)；P：PCR产物。
图2为重组酶Cy6OMT以(S)-Norcoclaurine为底物的酶促反应产物UPLC-TOF分析。A：重组酶Cy6OMT催化(S)-Norcoclaurine图示；B：重组酶Cy6OMT与空载体粗酶催化(S)-Norcoclaurine反应产物色谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为相对丰度；1对应的峰代表底物(S)-Norcoclaurine，2对应的峰代表产物(S)-Coclaurine；C：(S)-Coclaurine的标样二级质谱图；横坐标为质核比，纵坐标为相对丰度；D：重组酶Cy6OMT催化产物峰(S)-Coclaurine的二级质谱图；横坐标为质核比，纵坐标为相对丰度。
图3为重组酶Cy6OMT以Tetrahydrojatrorrhizine为底物的酶促反应产物UPLC-TOF分析。A：重组酶Cy6OMT催化Tetrahydrojatrorrhizine图示；B：重组酶Cy6OMT与空载体粗酶催化Tetrahydrojatrorrhizine反应产物色谱图；1对应的峰代表底物Tetrahydrojatrorrhizine，2对应的峰代表产物Tetrahydropalmatine；C：Tetrahydropalmatine的标样二级质谱图；D：重组酶Cy6OMT催化产物峰Tetrahydropalmatine的二级质谱图。
图4为重组酶Cy6OMT以Jatrorrhizine为底物的酶促反应产物UPLC-TOF分析。A：重组酶Cy6OMT催化Jatrorrhizine图示；B：重组酶Cy6OMT与空载体粗酶催化Jatrorrhizine反应产物色谱图；1对应的峰代表底物Jatrorrhizine，2对应的峰代表产物Palmatine；C：Palmatine的标样二级质谱图；D：重组酶Cy6OMT催化产物峰Palmatine的二级质谱图。
图5为重组酶Cy6OMT以Columbamine为底物的酶促反应产物UPLC-TOF分析。A：重组酶Cy6OMT催化Columbamine图示；B：重组酶Cy6OMT与空载体粗酶催化Columbamine反应产物色谱图；1对应的峰代表底物Columbamine，2对应的峰代表产物Palmatine；C：Palmatine的标样二级质谱图；D：重组酶Cy6OMT催化产物峰Palmatine的二级质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中所用标准品的来源：
Tetrahydrojatrorrhizine(四氢药根碱)：CAS号27313-86-6，上海源叶生物科技有限公司产品；
(S)-Norcoclaurine((S)–去甲乌药碱)：CAS号22672-77-1，加拿大TRC；
Tetrahydropalmatine(四氢巴马汀)：CAS号483-14-7，上海源叶生物科技有限公司产品；
Columbamine(非洲防己碱)：CAS号3621-36-1，上海源叶生物科技有限公司产品；
Jatrorrhizine(药根碱)：CAS号3621-38-3，上海源叶生物科技有限公司产品。
Palmatine(巴马汀)：CAS号3486-67-7，上海源叶生物科技有限公司产品。
(S)-Coclaurine((S)-乌药碱)：CAS号486-39-5，加拿大TRC产品。
甲基供体SAM(S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸对甲苯磺酸盐)为Sigma公司产品，货号A2408，CAS号52248-03-0。
实施例1、Cy6OMT蛋白的诱导表达与蛋白提取、纯化
将重组基因表达载体pET32a-Cy6OMT扩大培养后提取重组质粒pET32a-Cy6OMT。重组基因表达载体pET32a-Cy6OMT的构建过程见实施例2。
随后将所提重组质粒pET32a-Cy6OMT转化进入表达感受态细胞，转化所用细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(TransGen公司，CD601)，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-Cy6OMT。同时将pET32a(+)空载质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a。
将重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-Cy6OMT和空载对照重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a分别涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基中，37℃过夜培养。挑取单克隆于5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养后，取1mL菌液转接至100mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm培养，直到菌液OD600nm达到0.6-0.8时，得到未诱导pET32a-Cy6OMT全菌液和未诱导空载全菌液BL21(DE3)/pET32a。
待全菌液降温后加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，17℃诱导16h后，收集发酵液，将重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-Cy6OMT诱导表达得到的发酵液命名为诱导pET32a-Cy6OMT全菌液，将重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a诱导表达得到的发酵液命名为诱导空载全菌液。将诱导pET32a-Cy6OMT全菌液和诱导空载全菌液4℃下以5000rpm转速离心10min，弃取上清后以灭菌水再次清洗并离心收集菌体，确保培养基清除干净。随后，用10mL缓冲液Tris-HCl(100mmol/L Tris-HCl,300mmol/L NaCl,pH 7.4)重悬，加Phenylmethyanesulfonyl Fluoride(PMSF)至终浓度1mmol/L超声破碎细胞(Bransondigital sonifer,USA；10％amplitude,10min,3s ON,3s OFF)。12000rpm离心15min,取上清即为粗酶，分别得到诱导pET32a-Cy6OMT上清和诱导空载上清。利用Ni-Agarose Resin(Ni-Agarose Resin：康为世纪，CW0010)与上清液中的蛋白结合后，用含低浓度咪唑缓冲溶液(含20mmol/L咪唑)除去杂蛋白，含高浓度咪唑缓冲溶液(含250mmol/L咪唑)洗脱目的蛋白的方式纯化蛋白，利用超滤管(Amicon Ultra 15K column)以100mmol/L Tris-HCl(pH7.4)去除盐成分，最终得到纯化后的重组Cy6OMT蛋白(氨基酸序列为序列表中序列1)，即重组酶Cy6OMT。
实施例2、Cy6OMT基因全长的克隆及载体构建
采用高通量测序技术，提取延胡索叶和块茎RNA，送北京诺禾致源科技股份有限公司进行转录组测序，筛选得到高表达的氧甲基转移酶(延胡索来源的(S)-Norcoclaurine 6位氧甲基转移酶Cy6OMT，氨基酸序列为序列表中序列1的第166-513位)，根据基因的核苷酸序列(序列表中序列2的第496-1542位核苷酸)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上引入载体重叠序列(Cy6OMT基因特异性引物序列如表1所示)。以cDNA为模板进行PCR反应，PCR反应参数为：首先95℃变性5min；其次，98℃变性10sec，55℃退火15sec，72℃衍生2min，30个循环；最后70℃延伸10min。(PCR扩增的高保真酶：Takara公司，PrimeStar HS DNA polymerase R010B)经PCR扩增后，利用无缝拼接技术(无缝拼接酶：TransGen公司，Basic Seamless Cloning and Assembly Kit CU201)将克隆得到的Cy6OMT基因构建到原核表达载体pET32a(+)(索莱宝公司，货号P3100)上，测序分析，成功获得Cy6OMT基因的重组表达载体pET32a-Cy6OMT，pET32a-Cy6OMT含有序列表中序列2的第496-1542位核苷酸所示的Cy6OMT基因的CDS序列，能表达序列表中序列1所示的重组酶Cy6OMT。
表1 Cy6OMT基因特异性引物序列
实施例3、重组酶Cy6OMT的催化分析
酶促反应的体系为：100μM底物(包括四氢药根碱(Tetrahydrojatrorrhizine)、(S)–去甲乌药碱((S)-Norcoclaurine)、非洲防己碱(Columbamine)和药根碱(Jatrorrhizine))，500μM甲基供体SAM，50μg纯酶，Tris-HCl缓冲液(100mmol/L，pH 7.5)构成反应体系200μL，在温度＝37℃，时间＝180min下，使底物与酶进行反应，反应结束后加入400ul甲醇终止反应。最后用UPLC-QTOF-MS(Waters Technologies，Milford，MA，USA)检测其产物，色谱柱为T3柱(2.1mm×100mm，2.7μm)，流动相：A相为0.1％甲酸-水，B相为0.1％甲酸-乙腈；梯度为：0-6min，5％-30％B，6-12min，30％-60％B，12-13.5min，60％-90％B，13.5-15min，90％-5％B，15-17min，5％B。进样体积为1μL，柱温为35℃，流动相流速为0.5mL/min。电喷雾离子源(ESI)，在正离子模式下进行扫描并采集MS数据；scan range为50-1500Da；scan time为0.1s；Ramp collision energy为30-50V。UPLC-QTOF-MS检测的催化反应色谱峰如图2和图3所示。
实施例4、产物鉴定
依据质谱裂解规律，根据特征碎片及保留时间确定各反应的催化产物。
Cy6OMT对1-苄基异喹啉生物碱(1-BIA)化合物(S)–去甲乌药碱((S)-Norcoclaurine)C6位甲基化催化效率高，生成(S)-乌药碱((S)-Coclaurine)，催化位点特异性较强(图2中B的峰1为底物(S)-Norcoclaurine，峰2为产物(S)-Coclaurine)。
Cy6OMT催化原小檗碱型化合物四氢药根碱(Tetrahyjatrorrhizine)的C3位(即异喹啉结构的C6位)羟基甲基化生成四氢巴马汀(Tetrahydropalmatine)(图3中B的峰1为底物Tetrahyjatrorrhizine，峰2为产物Tetrahydropalmatine)。
Cy6OMT催化小檗碱型化合物非洲防己碱(Columbamine)的C2位(即异喹啉结构的C7位)和药根碱(Jatrorrhizine)的C3位(即异喹啉结构的C6位)羟基甲基化生成巴马汀(Palmatine)(图4中B的峰1为底物Jatrorrhizine，峰2为产物Palmatine和图5中B的峰1为底物Columbamine，峰2为产物Palmatine)。
综上，Cy6OMT具有对底物(S)–去甲乌药碱的C6位羟基催化特异性强以及催化底物骨架广的特点。目前已报道的6OMT一般不具备对小檗碱型化合物的催化功能或催化能力非常微弱。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国中医科学院中药研究所
<120> 氧甲基转移酶Cy6OMT及其在催化苄基异喹啉生物碱中的应用
<130> GNCSQ220521
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 513
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met
145 150 155 160
Ala Asp Ile Gly Ser Met Glu Val Ile Lys Lys Ser Asp Gln Thr Asp
165 170 175
Gln Ala Lys Leu Trp Lys Phe Ile Tyr Gly Phe Ala Asp Ser Leu Val
180 185 190
Leu Lys Cys Ala Val Glu Leu Glu Ile Ala Asp Thr Ile His Lys His
195 200 205
Gly Glu Pro Met Thr Leu Ser Glu Leu Ala Ser Gln Leu Pro Lys Gln
210 215 220
Pro Ile Asp Ala Asp Arg Leu Tyr Arg Ile Met Arg Tyr Leu Val Gln
225 230 235 240
Ile Lys Leu Phe Ser Lys Glu Thr Thr Ser Glu Ser Gly Glu Ile Lys
245 250 255
Tyr Gly Leu Leu Pro Pro Ala Lys Tyr Val Val Arg Gly Trp Gln Asn
260 265 270
Ser Met Val Ala Ala Leu Leu Leu Ile Asn Asp Lys Asn Phe Ile Ala
275 280 285
Ser Trp His Tyr Leu Lys Asp Gly Leu Gly Gly Glu Cys Asp Ala Phe
290 295 300
Glu Lys Ala Asn Gly Lys Lys Ile Trp Asp Phe Met Ser Glu Asn Pro
305 310 315 320
Glu Lys Asn Lys Leu Phe Asn Glu Ala Met Ala Cys Asp Ser Arg Leu
325 330 335
Val Thr Trp Ala Leu Val Gln Asp Cys Lys Asp Val Phe Lys Gly Ile
340 345 350
Lys Thr Leu Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Thr Ala Val Lys Ala
355 360 365
Ile Ser Asp Ala Phe Pro Asp Ile Lys Cys Ala Val Tyr Asp Leu Pro
370 375 380
His Val Ile Ala Asp Ser Pro Val Ala Pro Asn Ile Asp Arg Ile Glu
385 390 395 400
Gly Asp Met Phe Lys Ser Ile Pro Asn Ala Asp Ala Ile Phe Met Lys
405 410 415
Cys Ile Leu His Asp Trp Asn Asp Asp Glu Cys Ile Gln Ile Leu Lys
420 425 430
Gln Cys Lys Lys Ala Leu Pro Arg Asp Gly Gly Lys Val Ile Ile Val
435 440 445
Asp Val Val Leu Asn Val Asp Ser Lys His Pro Tyr Thr Lys Met Arg
450 455 460
Leu Thr Leu Asp Leu Asp Met Met Leu Asn Thr Gly Gly Lys Glu Arg
465 470 475 480
Thr Glu Glu Glu Trp Lys Glu Leu Phe Glu Ala Ala Gly Phe Ser Gly
485 490 495
Tyr Lys Ile Ile Gln Thr Ser Ala Leu Gln Ser Val Ile Glu Ala Tyr
500 505 510
Pro
<210> 2
<211> 1542
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360
catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420
ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480
gctgatatcg gatccatgga agtgatcaag aagagtgatc aaacagatca agccaaactc 540
tggaagttca tctatggatt tgcagattca ctagttctta aatgcgcggt ggagctagaa 600
atagccgata cgattcataa gcatggggaa ccgatgacgc tttccgaatt agcttctcaa 660
cttcctaagc aacctatcga tgcagaccgt ctatatcgaa taatgcggta cttggttcaa 720
ataaaattgt ttagcaaaga gacgacttct gaatccgggg aaatcaaata cgggctttta 780
ccaccggcga aatatgtggt aagaggatgg cagaattcca tggttgctgc attgctatta 840
atcaatgata agaatttcat tgcatcttgg cattatctca aggatggttt gggtggcgaa 900
tgtgatgcat ttgagaaggc taacggaaag aaaatttggg attttatgtc cgaaaacccc 960
gaaaagaata aacttttcaa tgaggctatg gcttgtgata gtaggctcgt tacttgggcg 1020
ttggttcaag attgtaagga tgttttcaaa ggaattaaga cacttgttga tgttggtggt 1080
ggcactggaa ccgcagtgaa ggcgatttct gatgcttttc cggatataaa atgcgcggtt 1140
tatgatcttc ctcatgtcat tgcggattct ccagttgctc ctaatattga tcgaatcgag 1200
ggggatatgt ttaagtccat cccaaatgca gatgccatct ttatgaagtg catcctccat 1260
gattggaacg acgacgaatg cattcaaata cttaagcaat gtaaaaaggc gctaccacga 1320
gacggaggta aagtaatcat cgtagatgtc gtgttgaatg tggattcgaa gcatccttac 1380
acaaaaatga gattgacttt ggatttggat atgatgctca acactggagg gaaagagagg 1440
acagaggagg aatggaaaga actgtttgaa gctgcaggtt tcagtggata caaaatcatt 1500
caaacatcag cactacaatc tgtgattgag gcttatcctt aa 1542

Claims (10)

1.蛋白质相关的生物材料，其特征在于：所述蛋白质是如下A1)、A2)、A3)或A4)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第166-513位的蛋白质；
A3)在A1)或A2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；
A4)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)或A2)衍生的或与A1)或A2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；
所述生物材料为下述B1)至B6)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)促进或提高所述蛋白质表达的核酸分子；
B6)含有B5)所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
2.根据权利要求1所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)b2)或b3)所示的所述蛋白质的编码基因：
b1)编码序列是序列表中序列2的第496-1542位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b2)核苷酸是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的cDNA或DNA分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
3.权利要求1中所述的蛋白质。
4.蛋白质在作为氧甲基转移酶或在制备苄基异喹啉生物碱中的应用，所述蛋白质为权利要求1中所述的蛋白质。
5.权利要求1或2所述的生物材料和/或权利要求3所述的蛋白质的下述任一种应用：
F1、权利要求1或2所述的生物材料和/或权利要求3所述的蛋白质在催化(S)-去甲乌药碱的C6位羟基甲基化中的应用；
F2、权利要求1或2所述的生物材料和/或权利要求3所述的蛋白质在催化非洲防己碱C2位羟基甲基化中的应用；
F3、权利要求1或2所述的生物材料和/或权利要求3所述的蛋白质在催化药根碱C3位羟基甲基化中的应用；
F4、权利要求1或2所述的生物材料和/或权利要求3所述的蛋白质在催化四氢药根碱C3位羟基甲基化中的应用；
F5、权利要求1或2所述的生物材料和/或权利要求3所述的蛋白质在制备苄基异喹啉生物碱中的应用；
F6、权利要求1或2所述的生物材料和/或权利要求3所述的蛋白质在制备苄基异喹啉生物碱产品中的应用。
6.权利要求1或2所述的生物材料和/或权利要求3所述的蛋白质相关的下述任一种产品：
P1、生产苄基异喹啉生物碱的产品；
P2、制备催化(S)-去甲乌药碱(S)-Norcoclaurine的C6位羟基甲基化的产品；
P3、制备催化非洲防己碱C2位羟基甲基化的产品；
P4、制备催化药根碱C3位羟基甲基化的产品；
P5、制备催化四氢药根碱C3位羟基甲基化的产品；
P6、生产延胡索来源的(S)-Norcoclaurine 6位氧甲基转移酶Cy6OMT的产品。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：所述苄基异喹啉生物碱为(S)-乌药碱、四氢巴马汀和/或巴马汀。
8.一种制备延胡索来源的(S)-Norcoclaurine 6位氧甲基转移酶Cy6OMT的方法，包括如下步骤：将权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因在原核微生物中进行表达得到所述延胡索来源的(S)-Norcoclaurine 6位氧甲基转移酶Cy6OMT。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：将权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因在原核微生物中进行表达包括将权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述延胡索来源的(S)-Norcoclaurine 6位氧甲基转移酶Cy6OMT的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述延胡索来源的(S)-Norcoclaurine 6位氧甲基转移酶Cy6OMT。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述表达为诱导表达。
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