CN116615491A - 新酯酶及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新酯酶，更特别地涉及，与SEQ ID N°1的酯酶相比具有改善的活性和/或改善的热稳定性的酯酶变体，及其用于降解含聚酯材料(诸如塑料制品)的用途。本发明的酯酶特别适合于降解聚对苯二甲酸乙二醇酯以及含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的材料。

Description

新酯酶及其用途

本发明涉及新酯酶，更特别地，涉及与亲本酯酶相比具有改善的活性和/或改善的热稳定性的酯酶。本发明还涉及所述新型酯酶用于降解含聚酯材料(诸如塑料制品)的用途。本发明的酯酶特别适合于降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和含聚对苯二甲酸乙二醇酯的材料。

背景技术

酯酶能够催化多种聚合物(包括聚酯)的水解。在本文中，酯酶在许多工业应用中显示出有希望的效果，包括作为应用于餐具洗涤和洗衣的洗涤剂，作为用于加工生物质和食品的降解酶，作为环境污染物解毒中的生物催化剂，或用于纺织工业中聚酯织物的处理。酯酶作为用于水解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的降解酶的用途特别令人感兴趣。实际上，PET用于许多技术领域，诸如用于制作衣服、地毯，或以热固性树脂的形式用于包装制造或汽车塑料等，使得PET在填埋场中的积聚成为日益严重的生态问题。

聚酯，特别是PET的酶降解被认为是减少塑料废物积聚的令人感兴趣的解决方案。实际上，酶可以加速含聚酯材料，更特别是塑料制品的水解，甚至达到单体水平。此外，水解产物(即单体和低聚物)可以作为用于合成新聚合物的材料回收。

在这种情况下，几种酯酶已被鉴定为聚酯的候选降解酶，且已经开发了这些酯酶的一些变体。在酯酶中，角质酶也称为角质水解酶(EC 3.1.1.74)，特别令人感兴趣。已从各种真菌(P.E.Kolattukudy in"Lipases",Ed.B.Borg-stróm and H.L.Brockman,Elsevier1984,471-504)、细菌和植物花粉中鉴定角质酶。最近，宏基因组学方法已经可以鉴定其他的酯酶。

然而，仍需要与已知的酯酶相比具有改善的活性和/或改善的热稳定性的酯酶，以提供更有效的并由此更有竞争力的聚酯降解方法。

发明简述

本发明提供新酯酶，其与具有如SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列的亲本或野生型酯酶相比，表现出增加的活性和/或增加的热稳定性。该野生型酯酶对应于UniProt数据库中为E5BBQ3且描述为具有聚酯降解活性的酯酶。本发明的酯酶在用于降解塑料制品，更特别地是含有PET的塑料制品的方法中特别有用。

对此，本发明的目的是提供酯酶，其(i)与SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，和(ii)在位置上具有至少一个选自下组的氨基酸取代：F209I/G/H/L/R/T、D12F/Y/R、T50P、T63Q、S66H、W69R、T89R/F、D94S、S121W、T153A、N158Q、T168Q、P180E、A182R、F188I/Y、S197P、E202M、G205C/K、T207L、P211A、N212D/Q、K216P、K220E、Q238T、L240A、P242K、G243Y、P244N、G247A/D/E/H/S、G250C/Y和P260S，其中所述位置参照SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列编号，(iii)具有聚酯降解活性。优选地，与SEQ ID N°1的酯酶相比，所述酯酶表现出增加的热稳定性和/或增加的降解活性。

优选地，所述酯酶包含至少一个选自以下的取代：T168Q、F209I/G/H/L/R/S/T和N212D/Q，更优选选自T168Q、F209I和N212D，更优选至少F209I。

本发明的另一个目的是提供编码本发明酯酶的核酸。本发明还涉及包含所述核酸的表达盒或表达载体，以及包含所述核酸、表达盒或载体的宿主细胞。

本发明还提供了包含本发明酯酶、本发明宿主细胞或其提取物的组合物。

本发明的另一个目的是提供产生本发明酯酶的方法，包括：

(a)在适于表达编码酯酶的核酸的条件下，培养根据本发明的宿主细胞；以及任选地

(b)从细胞培养物中回收所述酯酶。

本发明的另一个目的是提供一种降解聚酯的方法，包括：

(a)使所述聚酯与根据本发明的酯酶或根据本发明的宿主细胞或根据本发明的组合物接触；以及，任选地

(b)回收单体和/或低聚物。

特别地，本发明提供降解PET的方法，包括使PET与至少一种本发明的酯酶接触，以及任选地，回收PET的单体和/或低聚物。

本发明还涉及本发明的酯酶用于降解PET或含有PET的塑料制品的用途。

本发明还涉及包含酯酶的材料，其中包括本发明的酯酶或宿主细胞或组合物。

本发明还涉及包含根据本发明的酯酶或宿主细胞的洗涤剂组合物或包含本发明酯酶的组合物。

发明详述

定义

通过参考以下定义将最好地理解本公开。

本文中，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”、“酶”是指通过肽键连接的氨基酸链，而与形成所述链的氨基酸数目无关。本文中氨基酸根据以下命名法用其单字母或三字母代码表示：A：丙氨酸(Ala)；C：半胱氨酸(Cys)；D：天冬氨酸(Asp)；E：谷氨酸(Glu)；F：苯丙氨酸(Phe)；G：甘氨酸(Gly)；H：组氨酸(His)；I：异亮氨酸(Ile)；K：赖氨酸(Lys)；L：亮氨酸(Leu)；M：甲硫氨酸；N：天冬酰胺(Asn)；P：脯氨酸(Pro)；Q：谷氨酰胺(Gln)；R：精氨酸(Arg)；S：丝氨酸(Ser)；T：苏氨酸(Thr)；V：缬氨酸(Val)；W：色氨酸(Trp)以及Y：酪氨酸(Tyr)。

术语“酯酶”是指属于根据酶命名法分类为EC 3.1.1的水解酶类的酶，其催化酯水解成酸和醇。术语“角质酶”或“角质水解酶”是指根据酶命名法分类为EC 3.1.1.74的酯酶，其能够催化由角质和水产生角质单体的化学反应。

术语“野生型蛋白”或“亲本蛋白”是指天然存在的多肽的非突变形式。在本发明中，亲本酯酶是指具有如SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列的酯酶。

术语“突变体”和“变体”是指衍生自SEQ ID N°1的多肽，且在一个或多个(例如，若干个)位置处包含至少一种修饰或改变(即，取代、插入和/或缺失)且具有聚酯降解活性。变体可通过本领域熟知的各种技术获得。特别地，改变编码野生型蛋白质的DNA序列的技术的实例包括但不限于，定点诱变、随机诱变和合成寡核苷酸构建。因此，本文所用的与特定位置相关的术语“修饰”和“改变”是指与野生型蛋白质中该特定位置的氨基酸相比，该特定位置的氨基酸已被修饰。

“取代”是指一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代。优选地，术语“取代”是指用另一种氨基酸残基替代氨基酸残基，所述另一种氨基酸残基选自天然存在的标准20种氨基酸残基，稀有的天然存在的氨基酸残基(例如羟脯氨酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、别异亮氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、焦谷氨酰胺、氨基丁酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸)和通常合成制备的非天然存在的氨基酸残基(例如环己基丙氨酸)。优选地，术语“取代”是指用氨基酸残基被另一个选自天然存在的标准20个氨基酸残基(G、P、A、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、K、R、Q、N、E、D、S和T)的替换。符号“+”表示取代的组合。在本文中，以下术语用于表示取代：L82A表示亲本序列第82位的氨基酸残基(亮氨酸，L)被丙氨酸(A)取代。A121V/I/M表示亲本序列第121位的氨基酸残基(丙氨酸，A)被以下氨基酸之一取代：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或甲硫氨酸(M)。取代可以是保守或非保守取代。保守取代的实例包括碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸)，疏水性氨基酸(甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和缬氨酸)，芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)。

除非另有说明，本申请公开的位置参考SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列编号。

如本文所用，术语“序列同一性”或“同一性”是指两个多肽序列之间匹配(相同氨基酸残基)的数目(或以百分比％表示的分数)。通过比较序列比对时来确定序列同一性，以便使重叠和同一性最大化，同时使序列缺口最小化。特别地，根据两个序列的长度，可以使用多种数学全局或局部比对算法中的任一种来确定序列同一性。相似长度的序列优选使用全局比对算法(例如Needleman和Wunsch算法；Needleman和Wunsch，1970)，其在整个长度上最佳地比对序列，而基本上不同长度的序列优选使用局部比对算法(例如Smith和Waterman算法(Smith和Waterman，1981)或Altschul算法(Altschul等，1997；Altschul等，2005))。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以用本领域技术人员已知的各种方式实现，例如，使用可在互联网网站(诸如http//blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)上获得的可公开获得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。出于本文的目的，％氨基酸序列同一性值是指使用成对序列比对程序EMBOSS Needle产生的值，其使用Needleman-Wunsch算法产生两个序列的最佳全局比对，其中所有搜索参数设置为默认值，即评分矩阵＝BLOSUM62，Gap open＝11，Gap extend＝1。

“聚合物”是指其结构由通过共价化学键连接的多个单体(重复单元)构成的化学化合物或化合物的混合物。在本发明的上下文中，术语聚合物包括由单一类型的重复单元(即均聚物)或不同重复单元的混合物(即共聚物或杂聚物)构成的天然或合成聚合物。根据本发明，“低聚物”是指含有2至约20个单体的分子。

在本发明的上下文中，“含聚酯材料”或“含聚酯产品”是指包含至少一种结晶、半结晶或完全无定形形式的聚酯的产品，诸如塑料制品。在一个具体实施方案中，含聚酯材料是指由至少一种塑料材料(诸如塑料片、管、棒、型材、形状、膜、大块等)制成的任何物品，其含有至少一种聚酯和可能的其他物质或添加剂，诸如增塑剂、矿物或有机填料。在另一个具体实施方案中，含聚酯材料是指熔融或固态的塑料化合物或塑料制剂，其适合于制备塑料制品。在另一个具体实施方案中，含聚酯材料是指包含至少一种聚酯的纺织品、织物或纤维。在另一个具体实施方案中，含聚酯材料是指包含至少一种聚酯的塑料废物或纤维废物。

在本说明书中，术语“聚酯”包括但不限于聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸异山梨醇酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)、聚琥珀酸己二酸丁二醇酯(PBSA)、聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)、聚呋喃酸乙二醇酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚己二酸乙二醇酯(PEA)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)和这些聚合物的共混物/混合物。

新酯酶

本发明提供与亲本酯酶相比具有改善的活性和/或改善的热稳定性的新型酯酶。更具体地，本发明人设计了特别适用于工业过程的新型酶。本发明的酯酶特别适合于降解聚酯，更特别是PET，包括含PET的材料和特别是含PET的塑料制品。在一个具体的实施方案中，所述酯酶表现出增加的活性和增加的热稳定性。

因此，本发明的一个目的是提供与具有如SEQ ID N°1所示的氨基酸序列的酯酶(也称为亲本酯酶)相比，表现出增加的活性的酯酶。

特别地，发明人已鉴定了SEQ ID N°1中的特定氨基酸残基，其旨在酯酶的X射线晶体结构(即，折叠3D结构)中，与聚合物底物接触，所述聚合物底物可以被有利地修饰以促进底物与酯酶的接触并使得聚合物吸附增加和/或由此增加所述酯酶在该聚合物上的活性。

在本发明的上下文中，术语“增加的活性”或“增加的降解活性”表示与SEQ ID N°1的酯酶在相同温度在相同聚酯上降解和/或吸附的能力相比，酯酶在给定温度降解聚酯的能力增加和/或在聚酯上的吸附能力增加。特别地，本发明的酯酶具有增加的PET降解活性。这种增加可以比SEQ ID N°1的酯酶的PET降解活性高至少10％，优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％或更高。特别地，降解活性是得到聚酯的单体和/或低聚物的解聚活性，其可以进一步回收，以及任选地再利用。

酯酶的“降解活性”可以由本领域技术人员根据本领域本身已知的方法来评估。例如，降解活性可以通过测量特定聚合物的解聚活性速率，测量降解分散在琼脂板中的固体聚合物化合物的速率，或测量反应器中聚合物的解聚活性速率来评估。特别地，降解活性可以通过测量酯酶的“比降解活性(specific degrading activity)”来评估。酯酶对PET的“比降解活性”对应于在反应的初始时期(即，前24小时)期间每mg酯酶水解的PET的μmol/min或产生的等效TA的mg/h，且由反应的水解曲线的线性部分确定，这样的曲线通过在前24小时期间在不同时间进行的若干取样来建立。作为另一个实例，“降解活性”可以通过在限定的时间段后，测量在合适的温度、pH和缓冲液条件下，当聚合物或含聚合物的塑料制品与降解酶接触时，释放的低聚物和/或单体的速率和/或产率来评估。

本领域技术人员可以根据本领域本身已知的方法评估酶吸附在底物上的能力。例如，酶吸附在底物上的能力可以从含有酶的溶液中测定，其中酶已经预先在合适的条件下与底物孵育。

发明人还鉴定了SEQ ID N°1中的靶氨基酸残基，其可以被有利地修饰以改善相应酯酶在高温下，且有利地在高于50℃，优选60℃，更优选高于65℃的温度下的稳定性(即改善的热稳定性)。

因此，本发明的目的是提供新酯酶，其与具有SEQ ID N°1中所示氨基酸序列的酯酶(即亲本酯酶)的热稳定性相比，表现出增加的热稳定性。

在本发明的上下文中，除非另外指明，给定温度对应于所述温度+/-1℃。

在本发明的上下文中，术语“增加的热稳定性”表示与SEQ ID N°1的酯酶相比，酯酶在高温下，特别是在50℃-90℃的温度下抵抗其化学和/或物理结构变化的能力提升。在一个具体实施方案中，与亲本酯酶的热稳定性相比，在50℃-90℃、50℃-80℃、50℃-75℃、50℃-70℃、50℃-65℃、55℃-90℃、55℃-80℃、55℃-75℃、55℃-70℃、55℃-65℃、60℃-90℃、60℃-80℃、60℃-75℃、60℃-70℃、60℃-65℃、65℃-90℃、65℃-80℃、65℃-75℃、65℃-70℃的温度下，所述酯酶的热稳定性得到改善。在一个具体实施方案中，与亲本酯酶的热稳定性相比，所述酯酶的热稳定性至少在50℃-65℃的温度下得到改善。

特别地，热稳定性可以通过评估酯酶的解链温度(Tm)来评估。在本发明的上下文中，“解链温度”是指所考虑的酶群体的一半解折叠或错误折叠时的温度。通常，与SEQ IDN°1的酯酶的Tm相比，本发明的酯酶显示约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、10℃或更高的提高的Tm。特别地，与SEQ ID N°1的酯酶相比，本发明的酯酶可以在50℃-90℃的温度下具有增加的半衰期。具体地，与SEQ ID N°1的酯酶相比，本发明的酯酶可以在50℃-90℃、50℃-80℃、50℃-75℃、50℃-70℃、50℃-65℃、55℃-90℃、55℃-80℃、55℃-75℃、55℃-70℃、55℃-65℃、60℃-90℃、60℃-80℃、60℃-75℃、60℃-70℃、60℃-65℃、65℃-90℃、65℃-80℃、65℃-75℃、65℃-70℃的温度下具有增加的半衰期。在一个具体的实施方案中，与SEQ ID N°1的酯酶相比，本发明的酯酶至少在50℃-65℃的温度下具有增加的半衰期。

酯酶的解链温度(Tm)可以由本领域技术人员根据本领域本身已知的方法来测量。例如，DSF可用于定量酯酶热变性温度的变化，从而确定其Tm。或者，可通过使用圆二色谱分析蛋白质折叠来评估Tm。优选地，如实验部分中所述，使用DSF或圆二色谱测量Tm。在本发明的上下文中，Tm与在相同条件(例如pH、聚酯的性质和量等)下测量的Tm进行比较。

或者，热稳定性可以通过测量在不同温度下孵育后酯酶的酯酶活性和/或聚酯解聚活性，并与亲本酯酶的酯酶活性和/或聚酯解聚活性比较来评估。还可以评估在不同温度下进行多轮聚酯解聚测定的能力。快速且有价值的测试可在于通过晕圈直径测量评估酯酶在不同温度下孵育后降解分散在琼脂板中的固体聚酯化合物的能力。

因此，本发明的一个目的是提供酯酶，其(i)与SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，和(ii)具有至少一个选自以下的氨基酸取代：F209I/A/G/H/L/R/S/T、D12F/Y/R、T50P、T63Q、S66H、W69R、T89R/F、D94S、S121W、A125G、L152Q、T153A、N158Q、T168Q、P180E、A182R、F188I/Y、S197P、E202M、G205C/K、T207L、P211A、N212D/Q、K216P、K220E、Q238T、L240A、P242K、G243Y、P244N、G247A/D/E/H/S、G250C/Y和P260S，其中位置参照SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列编号，(iii)具有聚酯降解活性，且优选地(iv)与SEQ ID N°1的酯酶相比具有增加的热稳定性和/或增加的降解活性。

在一个实施方案中，所述酯酶包含至少一个选自以下的取代：F209I/G/H/L/R/T、D12F/Y/R、T50P、T63Q、S66H、W69R、T89R/F、D94S、S121W、T153A、N158Q、T168Q、P180E、A182R、F188I/Y、S197P、E202M、G205C/K、T207L、P211A、N212D/Q、K216P、K220E、Q238T、L240A、P242K、G243Y、P244N、G247A/D/E/H/S、G250C/Y和P260S。

优选地，所述酯酶包含至少一个选自以下的取代：D12F/Y、T50P、T63Q、S66H、W69R、T89R、D94S、S121W、A125G、L152Q、T153A、N158Q、T168Q、P180E、A182R、F188I/Y、S197P、E202M、G205C、T207L、F209I、P211A、N212D、K216P、K220E、Q238T、L240A、P242K、G243Y、P244N、G247A、G250C/Y和P260S，更优选选自D12F/Y、T50P、T63Q、S66H、W69R、T89R、D94S、S121W、T153A、N158Q、T168Q、P180E、A182R、F188I/Y、S197P、E202M、G205C、T207L、F209I、P211A、N212D、K216P、K220E、Q238T、L240A、P242K、G243Y、P244N、G247A、G250C/Y和P260S。

在一个实施方案中，所述酯酶包含至少一个选自以下的取代：T168Q、F209I/A/G/H/L/R/S/T和N212D/Q，优选选自T168Q、F209I/G/H/L/R/T和N212D/Q，更优选选自T168Q、F209I和N212D。

在一个优选的实施方案中，所述酯酶包含至少一个选自以下的取代：F209I/G/H/L/R/T和T168Q，优选选自F209I和T168Q。

特别地，所述酯酶包含至少一个选自F209I/A/G/H/L/R/S/T的取代，优选选自F209I/G/H/L/R/T，更优选取代F209I。

在一个实施方案中，所述酯酶在选自以下的位置上还包含至少一个取代：T11、D12、S23、T50、A53、Y60、T61、T63、A65、T88、T89、L90、Q92、M107、S121、A125、L152、M127、G135、S136、P151、L157、K159、T177、T183、D204、T207、F209、A210、N212、I213、K216、Q238、D246、E253和D174，优选选自T61、A65、Q92、G135、T177、T183、D204、F209、N212和E253。

特别地，所述酯酶还包含至少一个选自以下的取代：T11N、D12H、S23P、T50E、A53L、Y60F/M、T61M/V、T63N、A65T、T88S、T89Q、L90W/F、Q92G/P、M107L、S121R、A125G、L152Q、M127V、G135A、S136T、P151A、L157E/G/N/Q/W/T、K159T、T177N/H/Q、T183E、D204C/K/R、T207D、F209W/S/A、A210T、N212M、I213F、K216N、Q238D、D246Y/C/E/P、E253C和D174R，优选选自T61M/V、A65T、Q92G/P、G135A、T177N/H/Q、T183E、D204C/K/R、F209W/S/A、N212M和E253C，更优选选自T61M/V、A65T、Q92G/P、G135A、T177N、T183E、D204C、F209W、N212M和E253C。

在一个优选的实施方案中，所述酯酶还包含至少一个选自以下的取代：Q92G/P、G135A、T183E、D204C/K/R、F209W/S/A和E253C，优选选自Q92G、G135A、T183E、D204C/K/R、F209W和E253C。特别地，所述酯酶还包含至少一个选自以下的取代：Q92G/P、G135A、T183E、D204C/K/R和E253C，优选选自Q92G、G135A、T183E、D204C和E253C。

在一个优选的实施方案中，所述酯酶还至少包含D204C+E253C的取代组合。

在一个实施方案中，所述酯酶还包含至少一个选自D204K/R的氨基酸取代以及至少如亲本酯酶中的氨基酸残基E253。

在一个实施方案中，所述酯酶包含选自F209I/A/G/H/L/R/S/T的取代，优选选自F209I/G/H/L/R/T，和至少一个选自以下的取代：T61M/V、A65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N/H/Q、T183E、D204C/K/R、N212D/Q/M和E253C，优选选自Q92G/P、G135A、T168Q、T183E、D204C/K/R和E253C，更优选选自Q92G、G135A、T168Q、T183E、D204C和E253C。特别地，所述酯酶包含选自F209I/A/G/H/L/R/S/T的取代，优选选自F209I/G/H/L/R/T，以及至少两个取代，优选地至少三个取代，选自T61M/V、A65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N/H/Q、T183E、D204C/K/R、N212D/Q/M和E253C，优选选自Q92G/P、G135A、T168Q、T183E、D204C/K/R和E253C，更优选选自Q92G、G135A、T168Q、T183E、D204C和E253C。

特别地，所述酯酶包含至少三个取代，优选至少四个取代，选自下组：F209I/A/G/H/L/R/S/T/W、T61M/V、A65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N/H/Q、T183E、D204C/K/R、N212D/Q/M和E253C。优选地，所述酯酶包含至少三个取代，优选地至少四个取代，选自下组：F209I/G/H/L/R/T/W、T61M/V、A65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N/H/Q、T183E、D204C/K/R、N212D/Q/M和E253C。

在一个具体的实施方案中，所述酯酶与SEQ ID N°1所示的氨基酸序列相比具有1-31个氨基酸取代，所述1-31个氨基酸取代选自下组：F209I/G/H/L/R/T、D12F/Y/R、T50P、T63Q、S66H、W69R、T89R/F、D94S、S121W、T153A、N158Q、T168Q、P180E、A182R、F188I/Y、S197P、E202M、G205C/K、T207L、P211A、N212D/Q、K216P、K220E、Q238T、L240A、P242K、G243Y、P244N、G247A/D/E/H/S、G250C/Y和P260S，优选选自F209I、D12F/Y、T50P、T63Q、S66H、W69R、T89R、D94S、S121W、T153A、N158Q、T168Q、P180E、A182R、F188I/Y、S197P、E202M、G205C、T207L、P211A、N212D、K216P、K220E、Q238T、L240A、P242K、G243Y、P244N、G247A、G250C/Y和P260S，更优选选自209I、D12F/Y、T50P、T63Q、S66H、W69R、T89R、D94S、S121W、T153A、N158Q、T168Q、P180E、A182R、F188I/Y、S197P、E202M、G205C、T207L、P211A、N212D、K216P、K220E、Q238T、L240A、P242K、G243Y、P244N、G247A、G250C/Y和P260S。特别地，所述酯酶与SEQ ID N°1相比具有1-3个氨基酸取代，选自T168Q、F209I/G/H/L/R/T和N212D/Q，优选选自T168Q、F209I和N212D。

在一个实施方案中，与SEQ ID N°1相比，所述酯酶具有SEQ ID N°1所示的氨基酸序列，以及一个或两个氨基酸取代，所述取代选自下组：F209I/G/H/L/R/T和T168Q，优选地选自F209I和T168Q。

在一个具体实施方案中，所述酯酶与SEQ ID N°1所示的氨基酸序列相比具有单个氨基酸取代，所述单个氨基酸取代选自下组：F209I/G/H/L/R/T、D12F/Y/R、T50P、T63Q、S66H、W69R、T89R/F、D94S、S121W、T153A、N158Q、T168Q、P180E、A182R、F188I/Y、S197P、E202M、G205C/K、T207L、P211A、N212D/Q、K216P、K220E、Q238T、L240A、P242K、G243Y、P244N、G247A/D/E/H/S、G250C/Y和P260S，优选选自F209I、D12F/Y、T50P、T63Q、S66H、W69R、T89R、D94S、S121W、A125G、L152Q、T153A、N158Q、T168Q、P180E、A182R、F188I/Y、S197P、E202M、G205C、T207L、P211A、N212D、K216P、K220E、Q238T、L240A、P242K、G243Y、P244N、G247A、G250C/Y和P260S，更优选选自F209I、D12F/Y、T50P、T63Q、S66H、W69R、T89R、D94S、S121W、T153A、N158Q、T168Q、P180E、A182R、F188I/Y、S197P、E202M、G205C、T207L、P211A、N212D、K216P、K220E、Q238T、L240A、P242K、G243Y、P244N、G247A、G250C/Y和P260S。特别地，所述酯酶包含与SEQ ID N°1的酯酶相比的单个取代，其选自T168Q、F209I/G/H/L/R/T和N212D/Q，优选选自T168Q、F209I和N212D。

在一个实施方案中，所述酯酶具有SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列，以及与SEQID N°1相比的单个氨基酸取代，选自F209I/G/H/L/R/T和T168Q，优选选自F209I和T168Q。

特别地，所述酯酶具有在SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列，以及与SEQ ID N°1相比的单个氨基酸取代，选自F209I/G/H/L/R/T，优选取代F209I。有利地，与SEQ ID N°1的酯酶相比，所述酯酶表现出增加的降解活性。

本发明的另一个目的是提供酯酶，其(i)与SEQ ID N°1中所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，和(ii)在选自以下的位置具有至少三个氨基酸取代：F209、T61、A65、Q92、G135、T168、T177、T183、D204、N212和E253，其中所述位置参照SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列编号，(iii)具有聚酯降解活性，且优选地(iv)与SEQ ID N°1的酯酶相比，具有增加的热稳定性和/或增加的降解活性。优选地，所述酯酶在选自以下位置具有至少四个氨基酸取代：F209、T61、A65、Q92、G135、T168、T177、T183、D204、N212和E253。

优选地，所述酯酶包含至少三各取代，更优选至少四个氨基酸取代，选自F209I/A/G/H/L/R/S/T/W、T61M/V、A65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N/H/Q、T183E、D204C/K/R、N212D/Q/M和E253C，优选选自F209I/G/H/L/R/T/W、Q92G/P、G135A、T168Q、T183E、D204C/K/R和E253C，更优选选自F209I/W、Q92G/P、G135A、T168Q、T183E、D204C和E253C，甚至更优选选自F209I、Q92G、G135A、T168Q、T183E、D204C和E253C。

在一个实施方案中，所述酯酶包含选自F209I/A/G/H/L/R/S/T/W的取代，优选选自F209I/G/H/L/R/T，和至少两个选自以下的取代：T61M/V、A65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N/H/Q、T183E、D204C/K/R、N212D/Q/M和E253C，优选选自Q92G/P、G135A、T168Q、T183E、D204C/K/R和E253C，更优选Q92G、G135A、T168Q、T183E、D204C和E253C。特别地，所述酯酶包含选自F209I/A/G/H/L/R/S/T/W的取代，优选选自F209I/G/H/L/R/T，和至少三个选自以下的取代：T61M/V、A65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N/H/Q、T183E、D204C/K/R、N212D/Q/M和E253C，优选选自Q92G/P、G135A、T168Q、T183E、D204C/K/R和E253C，更优选选自Q92G、G135A、T168Q、T183E、D204C和E253C。

在一个实施方案中，所述酯酶包含至少一种在位置F209+D204+E253的取代组合，优选至少一种选自F209I/A/G/H/L/RF209I/W+D204C+E253C的取代组合，更优选选自F209I/W+D204C+E253C的取代组合，甚至更优选选自F209I+D204C+E253C的取代组合。

在一个实施方案中，所述酯酶包含至少一种在位置F209+D204+E253的取代组合，以及至少一个在选自以下位置的取代：T61、A65、Q92、G135、T168、T177、T183和N212，优选选自以下位置：Q92、G135、T168和T183。

优选地，所述酯酶包含至少一种选自F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C的取代组合，优选选自F209I/A/G/H/L/R/S/T+D204C/K/R+E253C，更优选选自F209I+D204C+E253C。特别地，所述酯酶还在选自以下的位置包含至少一个取代：T61、A65、Q92、G135、T168、T177、T183和N212，优选至少一个选自以下的取代：T61M/V、A65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N/H/Q、T183E和N212D/Q/M，更优选选自Q92G/P、G135A、T168Q和T183E，甚至更优选选自Q92G、G135A、T168Q和T183E。在一个实施方案中，所述酯酶包含如SEQ ID N°1所示的氨基酸序列组成的氨基酸序列，以及取代组合F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C，优选选自F209I/A/G/H/L/R/S/T+D204C/K/R+E253C，更优选选自F209I+D204C+E253C。

在一个实施方案中，所述酯酶在选自下组的位置包含至少取代组合：F209+D204+E253、F209+D204+E253+Q92、F209+D204+E253+N212、F209+D204+E253+Q92+G135+T168、F209+D204+E253+Q92+G135+T168+T183、F209+D204+E253+Q92+T183或F209+D204+E253+Q92+T168+T183。优选地，所述酯酶包含选自以下的取代组合：F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C+Q92G/P、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C+N212D/M/Q、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C+Q92G/P+G135A+T168Q、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C+Q92G/P+G135A+T168Q+T183E、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C+Q92G/P+T183E、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C+Q92G/P+T168Q+T183E，更优选选自F209I/W+D204C+E253C、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P、F209I/W+D204C+E253C+N212D/M、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+G135A+T168Q、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+G135A+T168Q+T183E、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+T183E、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+T168Q+T183E，甚至更优选选自F209I+D204C+E253C+Q92G、F209I+D204C+E253C+Q92G+T183E和F209I+D204C+E253C+Q92G+G135A+T168Q+T183E。有利地，与SEQ ID N°1的酯酶相比，所述酯酶表现出增加的热稳定性和增加的聚酯降解活性。优选地，与SEQ ID N°1的酯酶相比，所述酯酶在50℃-65℃的温度下，更优选在50℃和/或65℃下，表现出增加的热稳定性和增加的聚酯降解活性。

在一个实施方案中，所述酯酶包含至少在位置F209+D204+E253+Q92的取代组合，优选选自F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C+E253C+Q92G/P的取代组合，更优选F209I+D204C+E253C+Q92G。

在一个实施方案中，酯酶还可在选自以下位置包含至少一个取代：L14、G62、R73、D85、T86、A179、A206、N215、I217、G219、F239、R245、F249、E251、V252和D174。优选地，所述取代选自以下：L14D/E、G62D/S、R73C/D/E/F/G/I/M/N/Q/S/V、D85A/E/F、T86E/S、A179C、A206D、N215C/D/E、I217Q、G219A/E、F239E、R245C/E、F249T、E251D/E/H/S、V252T。

在一个具体的实施方案中，所述酯酶具有在于如SEQ ID N°1所示的氨基酸序列的酯酶的氨基酸序列，以及与SEQ ID N°1相比的3-11个取代，选自F209I/A/G/H/L/R/S/T/W、T61M/V、A65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N/H/Q、T183E、D204C/K/R、N212D/Q/M和E253C，优选具有与SEQ ID N°1相比的3-7个取代，选自F209I/A/G/H/L/R/S/T/W、Q92G/P、G135A、T168Q、T183E、D204C/K/R和E253C，更优选选自F209I/W、Q92G/P、G135A、T168Q、T183E、D204C和E253C，甚至更优选选自F209I、Q92G、G135A、T168Q、T183E、D204C和E253C。

在一个具体实施方案中，所述酯酶的氨基酸序列与SEQ ID N°1所示的氨基酸序列相比具有取代组合，所述取代组合选自F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C+E253C、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C+E253C+Q92G/P、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C+E253C+N212D/M/Q、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C+E253C+Q92G/P+G135A+T168Q、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C+E253C+Q92G/P+G135A+T168Q+T183E、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C+E253C+Q92G/P+T183E、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C+E253C+Q92G/P+T168Q+T183E，更优选选自F209I/W+D204C+E253C、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P、F209I/W+D204C+E253C+N212D/M、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+G135A+T168Q、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+G135A+T168Q+T183E、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+T183E、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+T168Q+T183E、甚至更优选F209I+D204C+E253C+Q92G、F209I+D204C+E253C+Q92G+T183E和F209I+D204C+E253C+Q92G+G135A+T168Q+T183E。有利地，与SEQ ID N°1的酯酶相比，所述酯酶表现出增加的热稳定性和增加的降解活性。优选地，与SEQ ID N°1的酯酶相比，所述酯酶在50℃-65℃的温度下，更优选在50℃和/或65℃下，表现出增加的热稳定性和增加的聚酯降解活性。

在另一个实施方案中，所述酯酶的氨基酸序列与SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列相比具有取代组合，所述取代组合选自F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C，优选选自F209I/A/G/H/L/R/S/T+D204C/K/R+E253C，更优选地选自F209I+D204C+E253C。

在一个实施方案中，所述酯酶包含至少一个如在亲本酯酶中的选自以下的氨基酸残基：D176、H208、S130、M131、C241、C259、G59、H129、G132、W155、I171、I178、P214、D174，即本发明的酯酶在这些位置中的一个、两个或全部未被修饰。

在一个实施方案中，所述酯酶至少包含如亲本酯酶中的，形成酯酶催化位点的氨基酸D176、H208和S130和/或形成二硫键的氨基酸C241和C259。优选地，所述酯酶包含至少一种如亲本酯酶中的组合，选自D176+H208+S130、C241+C259和D176+H208+S130+C241+C259。在一个实施方案中，所述酯酶包含亲本酯酶中的组合D176+H208+S130+C241+C259+M131+D174。

或者或另外地，本发明的酯酶包含至少一个如亲本酯酶中的选自以下的氨基酸：G59、H129、G132、W155、I171、I178和P214。优选地，所述酯酶包含至少一个如亲本酯酶中的选自I171和I178的氨基酸，更优选至少如亲本酯酶中的组合I171+I178。在一个实施方案中，所述酯酶包含如亲本酯酶中的组合I171+I178+G59+H129+G132+W155+P214。

在一个实施方案中，所述酯酶包含如亲本蛋白酶中的组合D176+H208+S130+C241+C259+I171+I178。

变体的聚酯降解活性

本发明的一个目的是提供具有酯酶活性的新型酶。在一个具体的实施方案中，本发明的酶表现出角质酶活性。

在一个具体的实施方案中，本发明的酯酶具有聚酯降解活性，优选聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解活性，和/或聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)降解活性，和/或聚己内酯(PCL)降解活性，和/或聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)活性，更优选聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解活性，和/或聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)降解活性。甚至更优选地，本发明的酯酶具有聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解活性。

有利地，本发明的酯酶至少在20℃-90℃，优选40℃-90℃，更优选50℃-90℃，甚至更优选60℃-90℃的温度范围内表现出聚酯降解活性。特别地，本发明的酯酶在65℃-90℃、65℃-85℃、65℃-80℃、70℃-90℃、70℃-85℃、70℃-80℃的温度范围内表现出聚酯降解活性。在一个具体实施方案中，所述酯酶在60℃下表现出聚酯降解活性。在一个具体实施方案中，所述酯酶在70℃下表现出聚酯降解活性。在一个具体实施方案中，所述聚酯降解活性在55℃-70℃的温度下仍可测量。如上所述，必须考虑+/-1℃的温度。

在一个具体实施方案中，与SEQ ID N°1的酯酶相比，本发明的酯酶在给定温度下具有增加的聚酯降解活性，更具体地在40℃-90℃，更优选地在50℃-90℃的温度下。

在一个具体实施方案中，所述酯酶在65℃下的聚酯降解活性比SEQ ID N°1的酯酶的聚酯降解活性高至少5％，优选至少高10％、20％、50％、100％或更多。

在一个具体的实施方案中，本发明的酯酶至少在pH 5-9的范围内，优选在pH 6-9的范围内，更优选在pH 6.5-9的范围内，甚至更优选在pH 6.5-8的范围内，表现出可测量的酯酶活性。

核酸、表达盒、载体、宿主细胞

本发明的另一个目的是提供编码如上所定义的酯酶的核酸。

如本文所用，术语“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核苷酸序列”是指脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的序列。核酸可以是DNA(cDNA或gDNA)、RNA或其混合物。其可以是单链形式或双链体形式或其混合物。其可以是重组的、人工的和/或合成来源的，且其可以包括修饰的核苷酸，包括例如修饰的键、修饰的嘌呤或嘧啶碱基，或修饰的糖。本发明的核酸可以是分离的或纯化的形式，并通过本领域本身已知的技术制备、分离和/或操作，例如cDNA文库的克隆和表达、扩增、酶促合成或重组技术。核酸也可通过众所周知的化学合成技术体外合成，如Belousov(1997)Nucleic Acids Res.25:3440-3444中所述。

本发明还涵盖在严格条件下与编码上述酯酶的核酸杂交的核酸。优选地，此类严格条件包括在约42℃下在2X SSC/0.1％ SDS中孵育杂交滤膜约2.5小时，随后在1X SSC/0.1％ SDS中在65℃下洗涤滤膜四次，每次15分钟。所用的方案描述于例如Sambrook等(Molecular Cloning:a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor N.Y.(1988))和Ausubel(Current Protocols in Molecular Biology(1989))的参考文献中。

本发明还涵盖编码本发明酯酶的核酸，其中所述核酸的序列，或至少所述序列的一部分，已使用优化的密码子进行了工程化。

或者，根据本发明的核酸可以从根据本发明的酯酶的序列推导出，且密码子的使用可以根据核酸转录的宿主细胞进行调整。这些步骤可以根据本领域技术人员熟知的方法进行，其中一些描述于参考手册Sambrook等(Sambrook等，2001)。

本发明的核酸可进一步包含其他的核苷酸序列，诸如调节区，即启动子、增强子、沉默子、终止子、信号肽等，其可以用于引起或调节多肽在所选宿主细胞或系统中的表达。

本发明进一步涉及表达盒，其包含根据本发明的核酸，其可操作地连接至指导所述核酸在合适的宿主细胞中表达的一个或多个控制序列。

如本文所用，术语“表达”是指涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

术语“表达盒”表示包含编码区(即本发明的核酸)和调节区(即包含一个或多个控制序列)可操作地连接的核酸构建体。

通常，表达盒包含与控制序列(诸如转录启动子和/或转录终止子)可操作连接的根据本发明的核酸，或由其组成。控制序列可以包括被宿主细胞或用于表达编码本发明酯酶的核酸的体外表达系统识别的启动子。启动子含有介导酶表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。控制序列也可以是转录终止子，其被宿主细胞识别以终止转录。终止子与编码酯酶的核酸的3’-端可操作地连接。在宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。通常，表达盒包含与转录启动子和转录终止子可操作地连接的根据本发明的核酸，或由其组成。

本发明还涉及包含如上定义的核酸或表达盒的载体。

如本文所用，术语“载体”或“表达载体”是指包含本发明表达盒的DNA或RNA分子，其用作将重组遗传物质转移到宿主细胞中的媒介。载体的主要类型是质粒、噬菌体、病毒、粘粒和人工染色体。载体本身通常是由插入片段(异源核酸序列、转基因)和作为载体“骨架”的较大序列组成的DNA序列。将遗传信息转移至宿主的载体的目的通常是在靶细胞中分离、繁殖或表达插入物。称为表达载体(表达构建体)的载体特别适于在靶细胞中表达异源序列，且通常具有驱动编码多肽的异源序列表达的启动子序列。通常，存在于表达载体中的调节元件包括转录启动子、核糖体结合位点、终止子和任选存在的操纵子。优选地，表达载体还含有用于在宿主细胞中自主复制的复制起点、选择标记、有限数目的有用的限制酶位点和高拷贝数的潜力。表达载体的实例是克隆载体、修饰的克隆载体，特别设计的质粒和病毒。在不同宿主中提供合适的多肽表达水平的表达载体是本领域熟知的。载体的选择通常取决于载体与待导入载体的宿主细胞的相容性。优选地，表达载体是线性或环状双链DNA分子。

本发明的另一个目的是提供包含上述核酸、表达盒或载体的宿主细胞。因此，本发明涉及根据本发明的核酸、表达盒或载体用于转化、转染或转导宿主细胞的用途。载体的选择通常取决于载体与其必须导入的宿主细胞的相容性。

根据本发明，宿主细胞可以瞬时或稳定的方式转化、转染或转导。将本发明的表达盒或载体导入宿主细胞，使得该表达盒或载体作为染色体整合体或作为自我复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”还涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本宿主细胞不同的亲本宿主细胞的任何后代。宿主细胞可以是可用于产生本发明变体的任何细胞，例如原核生物或真核生物。原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。宿主细胞也可以是真核细胞，诸如酵母、真菌、哺乳动物、昆虫或植物细胞。在一个具体的实施方案中，宿主细胞选自下组：大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、弧菌属(Vibrio)或耶氏酵母属(Yarrowia)。

根据本发明的核酸、表达盒或表达载体可以通过本领域技术人员已知的任何方法引入宿主细胞，诸如电穿孔、接合、转导、感受态细胞转化、原生质体转化、原生质体融合、生物射弹“基因枪”转化、PEG介导的转化、脂质辅助的转化或转染、化学介导的转染、乙酸锂介导的转化、脂质体介导的转化。

任选地，可以将多于一个拷贝的本发明的核酸、盒或载体插入宿主细胞中以增加变体的产量。

在一个具体的实施方案中，所述宿主细胞是重组微生物。本发明确实可以用改善的降解含聚酯材料能力的微生物的工程化。例如，本发明的序列可用于补充已知能够降解聚酯的真菌或细菌的野生型菌株，从而改善和/或增加菌株能力。

酯酶的生产

本发明的另一个目的是提供生产本发明酯酶的方法，包括表达编码酯酶的核酸，以及任选地回收酯酶。

具体地，本发明涉及产生本发明酯酶的体外方法，包括(a)使本发明的核酸、盒或载体与体外表达系统接触；和(b)回收产生的酯酶。体外表达系统是本领域技术人员熟知的且是可商购的。

优选地，生产方法包括：

(a)在适于表达所述核酸的条件下培养包含编码本发明酯酶的核酸的宿主细胞；以及任选地

(b)从细胞培养物中回收所述酯酶。

有利地，宿主细胞是重组芽孢杆菌、重组大肠杆菌、重组曲霉属、重组木霉属、重组链霉菌属、重组酵母属、重组毕赤酵母属、重组弧菌属或重组耶氏酵母属。

使用本领域已知的方法，在适于生产多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可通过摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中在合适的培养基中和在使得酶表达和/或分离的条件下进行的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。培养在合适的营养培养基中进行，所述营养培养基来自商业供应商或根据公开的组合物制备(例如，在美国类型培养物保藏中心的目录中)。

如果酯酶分泌到营养培养基中，酯酶可以直接从培养上清液中回收。相反地，所述酯酶可以从细胞裂解物或透化后回收。可以使用本领域已知的任何方法回收酯酶。例如，所述酯酶可以通过常规方法从营养培养基中回收，包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。任选地，所述酯酶可以通过本领域已知的多种方法部分或完全纯化，包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)，电泳方法(例如制备等电聚焦)，差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)，SDS-PAGE或提取以获得基本上纯的多肽。

酯酶可以单独或与其他的酶组合，以纯化形式原样使用，以催化聚酯和/或含聚酯材料(诸如含聚酯的塑料制品)的降解和/或回收中涉及的酶反应。酯酶可以是可溶形式，或在固相上。特别地，其可以结合到细胞膜或脂质囊泡，或结合到合成支持物，诸如玻璃、塑料、聚合物、过滤器、膜，例如以珠、柱、板等形式。

组合物

本发明的另一个目的是提供包含本发明的酯酶或宿主细胞或其提取物的组合物。在本发明的上下文中，术语“组合物”涵盖包含本发明的酯酶或宿主细胞的任何种类的组合物。

基于组合物的总重量，本发明的组合物可包含按重量计0.1％-99.9％，优选0.1％-50％，更优选0.1％-30％，甚至更优选0.1％-5％的酯酶。或者，所述组合物可包含5-10重量％的本发明酯酶。

所述组合物可以是液体或干燥的，例如粉末形式。在一些实施方案中，所述组合物是冻干物。

所述组合物可进一步包含赋形剂和/或试剂等。合适的赋形剂涵盖生物化学中常用的缓冲剂，用于调节pH的试剂，保鲜剂诸如苯甲酸钠，山梨酸钠或抗坏血酸钠，防腐剂，保护剂或稳定剂诸如淀粉、糊精、阿拉伯胶，盐，糖诸如山梨糖醇、海藻糖或乳糖，甘油，聚乙二醇，聚丙二醇，丙二醇，螯合剂诸如EDTA，还原剂，氨基酸，载体诸如溶剂或水溶液等。本发明的组合物可以通过将酯酶与一种或几种赋形剂混合来获得。

在一个具体的实施方案中，基于组合物的总重量，按重量计，所述组合物包含0.1％-99.9％，优选50％-99.9％，更优选70％-99.9％，甚至更优选95％-99.9％的赋形剂。或者，按重量计，所述组合物可包含90％-95％的赋形剂。

在一个具体的实施方案中，所述组合物可以进一步包含显示酶活性的其他多肽。本发明的酯酶的量将容易由本领域技术人员根据，例如待降解的聚酯和/或包含在组合物中的其他酶/多肽的性质，来调整。

在一个具体的实施方案中，本发明的酯酶与一种或几种赋形剂，特别是能够稳定或保护多肽免于降解的赋形剂一起溶解在水性介质中。例如，可以将本发明的酯酶溶解在水中，最后加入其他的组分，诸如甘油、山梨醇、糊精、淀粉、二醇诸如丙二醇，盐等。然后可以将得到的混合物干燥以获得粉末。干燥这种混合物的方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于冻干、冷冻干燥、喷雾干燥、超临界干燥、下吸式蒸发、薄层蒸发、离心蒸发、传送带干燥、流化床干燥、转鼓式干燥或其任意组合。

在一个具体的实施方案中，所述组合物为粉末形式，且包含酯酶和稳定/增溶量的甘油，山梨糖醇或糊精，诸如麦芽糖糊精和/或环糊精、淀粉，二醇诸如丙二醇，和/或盐。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物包含至少一个表达本发明酯酶的重组细胞，或其提取物。“细胞提取物”是指从细胞获得的任何级分，诸如细胞上清液、细胞碎片、细胞壁、DNA提取物、酶或酶制剂，或通过化学、物理和/或酶处理从细胞衍生的任何制剂，其基本上不含活细胞。优选的提取物是酶活性提取物。本发明的组合物可以包含一种或几种本发明的重组细胞，或其提取物，以及任选的一种或几种其他的细胞。

在一个实施方案中，所述组合物由表达和分泌本发明酯酶的重组微生物的培养基组成，或包含所述培养基。在一个具体的实施方案中，所述组合物包含此类冻干的培养基。

酯酶的用途

本发明的另一个目的是提供使用本发明的酯酶在需氧或厌氧条件下用于降解和/或回收聚酯或含聚酯材料的方法。本发明的酯酶特别适用于降解PET和含PET的材料。

因此，本发明的目的是使用本发明的酯酶，或其相应的重组细胞或提取物，或组合物来酶促降解聚酯。

在一个具体实施方案中，酯酶靶向的聚酯选自聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸异山梨醇酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)、聚琥珀酸己二酸丁二醇酯(PBSA)、聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)、聚呋喃酸乙二醇酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚己二酸乙二醇酯(PEA)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)和这些材料的共混物/混合物，优选聚对苯二甲酸乙二醇酯。

在优选的实施方案中，所述聚酯是PET，和至少单体(例如，单乙二醇或对苯二甲酸)和/或低聚物(例如，对苯二甲酸甲基-2-羟基乙酯(MHET)、对苯二甲酸双(2-羟基乙酯)(BHET)、对苯二甲酸1-(2-羟基乙酯)4-甲酯(HEMT)和对苯二甲酸二甲酯(DMT))。

本发明的另一个目的是使用本发明的酯酶，或其相应的重组细胞或提取物，或组合物来酶促降解含聚酯材料中的至少一种聚酯。

本发明的另一个目的是提供用于降解含聚酯材料中的至少一种聚酯的方法，其中使含聚酯材料与本发明的酯酶或宿主细胞或其提取物或组合物接触，从而降解含聚酯材料中的至少一种聚酯。

有利地，聚酯被解聚成单体和/或低聚物。

特别地，本发明提供了用于降解含PET材料的PET的方法，其中使含PET材料与本发明的酯酶或宿主细胞或组合物接触，从而降解PET。

在一个实施方案中，至少一种聚酯降解成可再聚合的单体和/或低聚物，其可以有利地回收以便再使用。得到的单体/低聚物可用于回收(例如，再聚合聚酯)或甲烷化。在一个具体实施方案中，至少一种聚酯是PET，并得到单乙二醇、对苯二甲酸、对苯二甲酸甲基-2-羟基乙酯(MHET)、对苯二甲酸双(2-羟基乙酯)(BHET)、对苯二甲酸1-(2-羟基乙酯)4-甲酯(HEMT)和/或对苯二甲酸二甲酯(DMT)。

在一个实施方案中，含聚酯材料的聚酯被完全降解。

降解含聚酯材料所需的时间可根据含聚酯材料本身(即含聚酯材料的性质和来源，其组成、形状等)，所用酯酶的类型和量以及各种工艺参数(即温度、pH、其他试剂等)而变化。本领域技术人员可以容易地使工艺参数适应含聚酯材料和预想的降解时间。

有利地，降解过程在20℃-90℃，优选40℃-90℃，更优选50℃-70℃的温度下实施。在一个具体的实施方案中，降解过程在60℃下实施。在另一个具体实施方案中，降解过程在65℃下实施。在另一个具体的实施方案中，降解过程在70℃下实施。更通常地，将温度维持在失活温度以下，所述失活温度对应于酯酶失活(即，与其在其最佳温度下的活性相比，失去超过80％的活性)和/或重组微生物不再合成酯酶的温度。特别地，将温度保持在目标聚酯的玻璃化转变温度(Tg)以下。

有利地，所述方法在连续流动过程中，在酯酶可使用数次和/或回收的温度下实施。

有利地，降解过程在5-9的pH下实施，优选在6-9的pH范围内，更优选在6.5-9的pH范围内，甚至更优选在6.5-8的pH范围内。

在一个具体的实施方案中，含聚酯的材料可以在与酯酶接触之前进行预处理，以便物理改变其结构，从而增加聚酯和酯酶之间的接触表面。

本发明的另一个目的是提供从含聚酯材料生产单体和/或低聚物的方法，包括将含聚酯材料暴露于本发明的酯酶，或相应的重组细胞或其提取物，或组合物，以及任选地，回收单体和/或低聚物。

由解聚产生的单体和/或低聚物可以顺序地或连续地回收。根据起始的含聚酯材料，可以回收单一类型的单体和/或低聚物或几种不同类型的单体和/或低聚物。

本发明的方法特别可用于由PET和/或包含PET的塑料制品生产选自单乙二醇和对苯二甲酸的单体，和/或选自以下的低聚物：对苯二甲酸甲基-2-羟乙基酯(MHET)、对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(BHET)、对苯二甲酸1-(2-羟乙基)-4-甲基酯(HEMT)和对苯二甲酸二甲酯(DMT)。

回收的单体和/或低聚物可使用所有合适的纯化方法进一步纯化并以可再聚合形式调节。

回收的可再聚合单体和/或低聚物可以再用于例如合成聚酯。有利地，将相同性质的聚酯再聚合。然而，可以将回收的单体和/或低聚物与其他单体和/或低聚物混合，以便例如合成新的共聚物。或者，回收的单体可用作化学中间体以产生新的目标化合物。

本发明还涉及含聚酯材料的表面水解或表面官能化的方法，包括将含聚酯材料暴露于本发明的酯酶，或相应的重组细胞或其提取物，或组合物。本发明的方法特别适用于提高聚酯材料的亲水性或吸水性。这种增加的亲水性在纺织品生产、电子和生物医学应用中具有特别的意义。

本发明的另一个目的是提供其中包含本发明酯酶和/或表达和分泌所述酯酶的重组微生物的含聚酯材料。例如，在专利申请WO2013/093355、WO2016/198650、WO2016/198652、WO2019/043145和WO2019/043134中公开了制备这种包含本发明酯酶的含聚酯材料的方法。

因此，本发明的目的是提供含有本发明酯酶和/或重组细胞和/或其组合物或其提取物以及至少PET的含聚酯材料。根据一个实施方案，本发明提供了包含PET和具有PET降解活性的本发明酯酶的塑料制品。

因此，本发明的另一个目的是提供含有本发明酯酶和/或重组细胞和/或其组合物或其提取物和至少PBAT的含聚酯材料。根据一个实施方案，本发明提供了包含PBAT和具有PBAT降解活性的本发明酯酶的塑料制品。

因此，本发明的另一个目的是提供含有本发明酯酶和/或重组细胞和/或其组合物或提取物和至少PBS的含聚酯材料。根据一个实施方案，本发明提供了包含PBS和具有PBS降解活性的本发明酯酶的塑料制品。

因此，本发明的另一个目的是提供含有本发明酯酶和/或重组细胞和/或其组合物或提取物和至少PCL的含聚酯材料。根据一个实施方案，本发明提供了包含PCL和具有PCL降解活性的本发明酯酶的塑料制品。

典型地，本发明的酯酶可用于洗涤剂、食品、动物饲料、造纸、纺织品和药物应用。更具体地，本发明的酯酶可用作洗涤剂组合物的组分。洗涤剂组合物包括但不限于手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，诸如适用于预处理沾污的织物和漂洗添加的织物软化剂组合物的洗衣添加剂组合物，用于一般家庭硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，用于手洗或机洗餐具洗涤操作的洗涤剂组合物。在一个具体的实施方案中，本发明的酯酶可用作洗涤剂添加剂。因此，本发明提供了包含本发明酯酶的洗涤剂组合物。特别地，本发明的酯酶可用作洗涤剂添加剂以减少纺织品清洁过程中的起球和变灰作用。

本发明还涉及在动物饲料中使用本发明酯酶的方法，以及包含本发明酯酶的饲料组合物和饲料添加剂。术语“饲料”和“饲料组合物”是指适于或旨在由动物摄取的任何化合物、制剂、混合物或组合物。在另一个具体的实施方案中，本发明的酯酶用于水解蛋白质，并产生包含肽的水解产物。这样的水解产物可以用作饲料组合物或饲料添加剂。

本发明的另一个目的是提供在造纸工业中使用本发明酯酶的方法。更具体地，本发明的酯酶可用于从造纸机的纸浆和水管线中除去粘性物。

具体实施方式

实施例1-酯酶的构建、表达和纯化

-构建

根据本发明的酯酶已使用质粒构建产生。该质粒在于克隆编码SEQ ID N°1的酯酶的基因，其针对pET-26b(+)表达载体(Merck Millipore,Molsheim,France)的NdeI和XhoI限制性位点之间的大肠杆菌表达进行优化。编码PelB前导序列的核苷酸序列已被添加在SEQ ID N°1和NdeI限制性位点之间。表达的融合蛋白针对细菌周质，其中PelB前导序列通过信号肽酶去除，产生与SEQ ID N°1相同但添加有C端氨基酸延伸的功能蛋白。根据供应商的建议使用两个定点诱变试剂盒以产生酯酶变体：QuikChange II定点诱变试剂盒和来自Agilent(Santaclara,California,USA)的QuikChange Lightning Multi Site-Directed。

-酯酶的表达和纯化

菌株Stellar^TM(Clontech,California,USA)和大肠杆菌BL21(DE3)(New EnglandBiolabs,Evry,France)已被连续用于在50mL LB-Miller培养基或ZYM自动诱导培养基中进行克隆和重组表达(Studier et al.,2005-Prot.Exp.Pur.41,207-234)。在16℃下用0.5mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG,Euromedex,Souffelweyersheim,France)在LB-Miller培养基中进行诱导。通过在Avanti J-26XP离心机(Beckmancoulter,Brea,USA)中离心(8000rpm，10℃下，20分钟)停止培养。将细胞悬浮在20mL Talon缓冲液(Tris-HCl 20mM，NaCl 300mM，pH 8)中。然后用FB 705超声波仪(Fisherbrand,Illkirch,France)以30％的振幅超声处理细胞悬浮液2分钟(2秒开和1秒关，循环)。然后，进行离心步骤：在10000g，10℃下，在Eppendorf离心机中，30分钟。收集可溶性级分并进行亲和层析。用金属亲和胶(Clontech,CA,USA)完成该纯化步骤。用补充有咪唑的Talon缓冲液进行蛋白质洗脱。将纯化的蛋白质Talon缓冲液透析，然后根据制造商说明(Lifescience Bio-Rad,France)使用Bio-Rad蛋白质测定法定量，并储存在+4℃。

实施例2-酯酶降解活性的评估

测定酯酶的降解活性并与SEQ ID N°1的酯酶活性进行比较。

已使用多种方法评估比活性：

(1)基于PET水解的比活性

(2)基于固体形式聚酯降解活性

(3)基于大于100mL的反应器中的PET水解的活性

2.1.基于PET水解的比活性

称取100mg粉末形式的无定形PET(根据WO 2017/198786制备以达到低于20％的结晶度)并放入100mL玻璃瓶中。将在Talon缓冲液(Tris-HCl 20mM，NaCl 0.3M，pH 8)中以0.69μM制备的包含SEQ ID N°1的酯酶(作为参考对照)或本发明的酯酶的1mL酯酶制剂放入玻璃瓶中。最后，加入49mL 0.1M磷酸钾缓冲液pH 8。

解聚通过在Max Q 4450培养箱(Thermo Fisher Scientific,Inc.Waltham,MA,USA)中在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃和150rpm下孵育每个玻璃瓶开始。

解聚反应的初始速率(以产生的等效TA的mg/小时计)通过在前24小时期间的不同时间进行取样来测定，且通过超高效液相色谱(UHPLC)来分析。如需要，将样品稀释在0.1M磷酸钾缓冲液pH 8中。然后，将150μL甲醇和6.5μL HCl 6N加入到150μL样品或稀释液中。在混合和在0.45μm注射器过滤器上过滤之后，将样品加载到UHPLC上以监测对苯二甲酸(TA)、MHET和BHET的释放。使用的色谱系统是Ultimate 3000UHPLC系统(Thermo FisherScientific,Inc.Waltham,MA,USA)，其包括泵模块、自动进样器，恒温在25℃的柱温箱和240nm的UV检测器。使用的柱是HS C18HPLC柱(150x 4.6mm，5μm，配备有前置柱，Supelco,Bellefonte,USA)。TA、MHET和BHET使用MeOH(30％-90％)在1mM H₂SO₄中的梯度以1mL/min分离。注射20μL样品。根据标准曲线测量TA、MHET和BHET，所述标准曲线是在与样品相同的条件下由商业TA和BHET和内部合成的MHET制备的。在反应的水解曲线的线性部分中测定PET水解的比活性(每mg酶的等效TA的mg/小时)，该曲线通过在前72小时期间的不同时间进行取样来建立。等效TA对应于测量的TA与测量的MHET和BHET中所含的TA之和。所述等效TA的测量也可用于反映在给定时间的PET解聚测定的产率。

2.2.基于固体形式的聚酯的降解的活性

将20μL酶制剂保存在含有PET的琼脂平板中产生的孔中。琼脂平板的制备通过将500mg PET溶解在六氟-2-丙醇(HFIP)中并将该培养基倒入250mL水溶液中来实现。在52℃和140mbar下HFIP蒸发后，将溶液与含有3％琼脂的0.2M磷酸钾缓冲液(pH 8)v/v混合。使用约30mL混合物制备各板并在4℃下储存。

在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃下2-24小时后，测量并比较由于野生型酯酶和变体的聚酯降解而形成的晕圈的直径或表面积。

2.3.基于反应器中PET水解的活性

在500mL Minibio生物反应器(Applikon Biotechnology,Delft,TheNetherlands)中，将在80mL 100mM磷酸钾缓冲液pH 8中制备的0.69μmol-2.07μmol的纯化酯酶与20g无定形PET(根据WO 2017/198786制备以达到低于20％的结晶度)混合。通过水浴浸渍进行在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃下的温度调节，且使用单个船用叶轮保持以250rpm恒定搅拌。PET解聚测定的pH由6N氢氧化钠调节至pH8，并由my-Control生物控制器系统(Applikon Biotechnology,Delft,The Netherlands)确保。在测定期间记录碱消耗且可以用于表征PET解聚测定。

通过测定残余PET重量或通过测定产生的等效TA或通过碱消耗来测定PET解聚测定的最终产率。在反应结束时，通过12-15μm的11级无灰纸过滤器(Dutscher SAS,Brumath,France)过滤反应体积，并在称重前干燥该渗余物，评估残余PET的重量测定。使用2.1中描述的UHPLC方法实现产生的等效TA的测定，且基于给定时间下的摩尔浓度(TA+MHET+BHET)与初始样品中包含的TA总量的比例计算水解百分比。PET解聚产生的酸单体将被碱中和以能够维持反应器中的pH。使用相应的摩尔碱消耗来计算产生的等效TA的测定，且基于在给定时间下当量TA的摩尔浓度与初始样品中包含的TA总量的比例来计算水解百分比。

24小时后，本发明的酯酶(变体)的PET解聚产率示于下表1(在50℃下)和表2(在65℃下)中。两个表都表明，与用作参照的SEQ ID N°1的酯酶的PET解聚产率(认为其PET解聚产率等于1)相比，本发明的变体的PET解聚产率提高。

PET解聚产率如实施例2.1中所述的测量。

表1：与SEQ ID N°1的酯酶相比，本发明的酯酶在50℃下24小时后的PET解聚产率的改善。

变体V1-V4具有如SEQ ID N°1中所示的确切氨基酸序列，除了分别还有如表1中列出的取代组合。

表1显示所有变体在50℃下的PET解聚产率比SEQ ID N°1的酯酶的PET解聚产率高至少2.4倍。

表2：与SEQ ID N°1的酯酶相比，本发明的酯酶在65℃下24小时后的PET解聚产率的改善。

变体V1-V3具有如SEQ ID N°1中所示的确切氨基酸序列，除了分别还有表2中列出的取代组合。

表2显示所有变体在65℃下的PET解聚产率比SEQ ID N°1的酯酶的PET解聚产率高至少11倍。

本发明的酯酶(变体)的比降解活性示于下表3中。SEQ ID N°1的酯酶的比降解活性用作参照，并视作100％比降解活性。如实施例2.1中在65℃下所述来测量比降解活性。

表3：本发明变体的比降解活性

变体V1-V3具有如SEQ ID N°1中所示的确切氨基酸序列，除了分别还有表3中列出的取代组合。

实施例3-评估本发明酯酶的热稳定性

已测定了本发明的酯酶的热稳定性并与SEQ ID N°1的酯酶的热稳定性进行了比较。

已使用不同的方法学来评估热稳定性：

(1)溶液中蛋白质的圆二色谱；

(2)在给定的温度、时间和缓冲液条件下孵育蛋白质后的残余酯酶活性；

(3)在给定的温度、时间和缓冲液条件下蛋白质孵育后的残余聚酯解聚活性；

(4)在给定的温度、时间和缓冲液条件下孵育蛋白质后，降解分散在琼脂板中的固体聚酯化合物(诸如PET或PBAT或类似物)的能力；

(5)在给定的温度、缓冲液、蛋白质浓度和聚酯浓度条件下进行多轮聚酯解聚测定的能力；

(6)差示扫描荧光测定法(DSF)；

这些方法的方案细节如下。

3.1圆二色谱

用Jasco 815装置(Easton,USA)进行圆二色谱(CD)以比较SEQ ID N°1的酯酶的解链温度(T_m)与本发明的酯酶的Tm。技术上，在Talon缓冲液中以0.5mg/mL制备400μL蛋白质样品并用于CD。进行280-190nm的第一次扫描以确定对应于蛋白质正确折叠的CD的两个最大强度。然后从25℃-110℃在对应于这样的最大强度的长波下进行第二次扫描，并提供通过Sigmaplot版本11.0软件分析的特定曲线(S形参数y＝a/(1+e^((x-x0)/b)))，当x＝x0时确定T_m。获得的T_m反映了给定蛋白质的热稳定性。T_m越高，变体在高温下越稳定。

3.2残余酯酶活性

在不同温度(40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和90℃)下孵育1mL的40mg/L(在Talon缓冲液中)SEQ ID N°1的酯酶或本发明的酯酶的溶液达10天。定期取样，在0.1M磷酸钾缓冲液pH 8.0中稀释1-500倍，并进行对硝基苯酚-丁酸酯(pNP-B)测定。将20μL样品与175μL 0.1M磷酸钾缓冲液pH 8.0和5μL pNP-B在2-甲基-2-丁醇(40mM)中的溶液混合。在30℃下在搅拌下进行酶反应15分钟，并通过微板分光光度计(Versamax,Moleculardevices,Sunnyvale,CA,USA)获得405nm处的吸光度。使用水解曲线的线性部分中释放的对硝基苯酚的标准曲线测定pNP-B水解的活性(以μmol pNPB/min表示的初始速度)。

3.3残余聚酯解聚活性

分别在不同温度(40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和90℃)下孵育10mL的40mg/L(在Talon缓冲液中)的SEQ ID N°1的酯酶和本发明的酯酶的溶液达30天。定期地，取1mL样品，并转移至含有100mg在250-500μm微粉化的无定形PET(根据WO 2017/198786制备以达到低于20％的结晶度)和49mL 0.1M磷酸钾缓冲液pH 8.0的瓶中，并在50℃、55℃、60℃、65℃或70℃孵育。定期取样10μL缓冲液。需要时，将样品稀释在0.1M磷酸钾缓冲液pH 8中。然后，将150μL甲醇和6.5μL HCl 6N加入到150μL样品或稀释液中。在混合和在0.45μm注射器过滤器上过滤之后，将样品加载到U HPLC上以监测对苯二甲酸(TA)、MHET和BHET的释放。使用的色谱系统是Ultimate 3000U HPLC系统(Thermo Fisher Scientific,Inc.Waltham,MA,USA)，包括泵模块、自动进样器、恒温在25℃的柱温箱和240nm的UV检测器。使用的柱是HS C18HPLC柱(150x 4.6mm，5μm，配备有前置柱，Supelco,Bellefonte,USA)。TA、MHET和BHET使用MeOH(30％-90％)在1mM H₂SO₄中的梯度以1mL/min分离。注射20μL样品。根据标准曲线测量TA、MHET和BHET，所述标准曲线是在与样品相同的条件下由商业TA和BHET和内部合成的MHET制备的。PET水解的活性(水解的PET的μmol/min或产生的等效TA的mg/小时)在水解曲线的线性部分中测定，这样的曲线通过在前24小时期间在不同时间进行取样来建立。等效TA对应于测量的TA与测量的MHET和BHET中所含的TA之和。

3.4固体形式的聚酯的降解

在不同温度(40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和90℃)下分别孵育1mL的40mg/L(在Talon缓冲液中)SEQ ID N°1的酯酶和本发明的酯酶的溶液达30天。定期地，将20μL的酶制剂保存在包含PET的琼脂板中产生的孔中。通过将500mg PET溶解在六氟-2-丙醇(HFIP)中，并将该培养基倒入250mL水溶液中来制备含有PET的琼脂平板。在52℃和140mbar下HFIP蒸发后，将溶液与含有3％琼脂的0.2M磷酸钾缓冲液(pH 8)v/v混合。使用约30mL的混合物制备每个omnitray并储存在4℃。在50℃、55℃、60℃、65℃或70℃下2-24小时后，测量并比较由于野生型酯酶和本发明变体的聚酯降解而形成的晕圈的直径或表面积。酶在给定温度下的半衰期对应于晕圈直径减少2倍所需的时间。

3.5多轮聚酯解聚

在酶反应器中评估酯酶进行连续几轮聚酯解聚测定的能力。用3g无定形PET(根据WO 2017/198786制备以达到低于20％的结晶度)和100mL含有3mg酯酶的10mM磷酸钾缓冲液pH 8启动Minibio 500生物反应器(Applikon Biotechnology B.V.,Delft,TheNetherlands)。使用船用叶轮将搅拌设定在250rpm。通过浸入外部水浴中将生物反应器恒温在50℃、55℃、60℃、65℃或70℃。通过加入3M的KOH将pH调节至8。通过BioXpert软件V2.95监测不同的参数(pH、温度、搅拌、碱的添加)。每20h加入1.8g无定形PET(根据WO2017/198786制备以达到低于20％的结晶度)。定期取样500μL反应介质。

如实施例2.3所述，通过HPLC测定TA、MHET和BHET的量。使用恒温于65℃的AminexHPX-87K柱(Bio-Rad Laboratories,Inc,Hercules,California,USA)测定EG的量。洗脱液为0.6mL.min^-1的5mM的K₂HPO₄。注射量为20μL。使用折射计监测乙二醇。

基于给定时间下的摩尔浓度(TA+MHET+BHET)与初始样品中所含的TA总量的比例，或基于给定时间下的摩尔浓度(EG+MHET+2×BHET)与初始样品中所含的EG总量的比例，计算水解百分比。降解速率以每小时释放的总TA的mg数或每小时总EG的mg数计算。

评估酶的半衰期为获得50％降解速率损失所需的孵育时间。

3.6差示扫描荧光测定法(DSF)

使用DSF通过测定其解链温度(T_m)(一半蛋白质群体解折叠时的温度)来评估野生型蛋白质(SEQ ID N°1)及其变体的热稳定性。以14μM的浓度制备蛋白质样品并储存在由20mM Tris HCl pH 8.0，300mM NaCl组成的缓冲液A中。首先将SYPRO橙色染料5000x在DMSO中的储备溶液在水中稀释至250x。将蛋白质样品加载到白色透明96孔PCR板(Bio-Rad cat#HSP9601)上，每个孔含有25μl的最终体积。各孔中蛋白质和SYPRO橙染料的最终浓度分别为5μM(0.14mg/ml)和10X。每孔的加载体积如下：15μL缓冲液A，9μL的14μM蛋白质溶液和1μL的250x Sypro Orange稀释溶液。然后用光学质量的密封带密封PCR板，并在室温下以2000rpm旋转1分钟。然后使用设置为使用450/490激发和560/580发射过滤器的CFX96实时PCR系统进行DSF实验。将样品以0.3℃/秒的速率从25℃加热至100℃。每0.03秒进行一次荧光测量。使用Bio-Rad CFX Manager软件由熔融曲线的一阶导数的峰测定熔融温度。

然后，基于其Tm值比较SEQ ID N°1的酯酶和本发明的酯酶。由于对来自不同生产的相同蛋白质的实验之间的高再现性，0.8℃的ΔTm被认为对于比较变体是显著的。Tm值对应于至少3次测量的平均值。

如实施例3.6中所述的，SEQ ID N°1的酯酶的Tm评估为等于68.0℃+/-0.2℃。

本发明酯酶变体的热稳定性示于下表4中，以Tm值表示并根据实施例3.6评估。与SEQ ID N°1的酯酶相比Tm的增加在括号中示出。

表4：本发明酯酶的Tm

变体V1-V3具有如SEQ ID N°1中所示的确切氨基酸序列，除了具有分别列于表4中的取代组合。

Claims (36)

1.酯酶，其(i)与SEQ ID N°1中所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，和(ii)具有至少一个选自下组的氨基酸取代：F209I/G/H/L/R/T、D12F/Y/R、T50P、T63Q、S66H、W69R、T89R/F、D94S、S121W、T153A、N158Q、T168Q、P180E、A182R、F188I/Y、S197P、E202M、G205C/K、T207L、P211A、N212D/Q、K216P、K220E、Q238T、L240A、P242K、G243Y、P244N、G247A/D/E/H/S、G250C/Y和P260S，其中位置参照SEQ IDN°1中所示的氨基酸序列编号，(iii)具有聚酯降解活性，以及(iv)与SEQ ID N°1的酯酶相比，具有增加的热稳定性和/或增加的降解活性。

2.根据权利要求1所述的酯酶，其中所述酯酶包含至少一个选自下组的取代：T168Q、F209I/G/H/L/R/T和N212D/Q，优选选自T168Q、F209I和N212D。

3.根据权利要求1或2所述的酯酶，其中所述酯酶包含至少一个选自以下的取代：F209I/G/H/L/R/T和T168Q，优选选自F209I和T168Q。

4.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶包含至少一个选自以下的取代：F209I/G/H/L/R/T，优选至少F209I取代。

5.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶进一步包含至少一个选自以下的取代：T11N、D12H、S23P、T50E、A53L、Y60F/M、T61M/V、T63N、A65T、T88S、T89Q、L90W/F、Q92G/P、M107L、S121R、A125G、L152Q、M127V、G135A、S136T、P151A、L157E/G/N/Q/W/T、K159T、T177N/H/Q、T183E、D204C/K/R、T207D、F209W/S/A、A210T、N212M、I213F、K216N、Q238D、D246Y/C/E/P、E253C和D174R，优选至少一个选自以下的取代：T61M/V、A65T、Q92G/P、G135A、T177N/H/Q、T183E、D204C/K/R、F209W/S/A、N212M和E253C，更优选地选自：T61M/V、A65T、Q92G/P、G135A、T177N、T183E、D204C、F209W、N212M和E253C。

6.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶还包含至少一个选自以下的取代：Q92G/P、G135A、T183E、D204C/K/R、F209W/S/A和E253C，优选选自Q92G、G135A、T183E、D204C/K/R、F209W和E253C。

7.根据权利要求5或6所述的酯酶，其中所述酯酶进一步包含至少一个选自以下的取代：Q92G/P、G135A、T183E、D204C/K/R和E253C，优选选自Q92G、G135A、T183E、D204C和E253C。

8.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶还至少包含D204C+E253C的取代组合。

9.根据前述权利要求中任一项的酯酶，其中所述酯酶包含至少一个选自F209I/A/G/H/L/R/S/T的取代，优选选自F209I/G/H/L/R/T，和至少一个取代，优选至少两种取代，更优选至少三种取代，选自以下：T61M/V、A65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N/H/Q、T183E、D204C/K/R、N212D/Q/M和E253C，优选选自Q92G/P、G135A、T168Q、T183E、D204C/K/R和E253C，更优选选自Q92G、G135A、T168Q、T183E、D204C和E253C。

10.酯酶，其(i)与SEQ ID N°1中所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，和(ii)在选自以下的位置具有至少三个氨基酸取代：F209、T61、A65、Q92、G135、T168、T177、T183、D204、N212和E253，优选选自以下的至少三个氨基酸取代：F209I/A/G/H/L/R/S/T/W、T61M/V、A65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N/H/Q、T183E、D204C/K/R、N212D/Q/M和E253C，其中所述位置参照SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列编号，(iii)具有聚酯降解活性，以及(iv)与SEQ ID N°1的酯酶相比，具有增加的热稳定性和/或增加的降解活性。

11.根据权利要求10所述的酯酶，其中所述酯酶包含至少三个选自以下的氨基酸取代：F209I/A/G/H/L/R/S/T/W、Q92G/P、G135A、T168Q、T183E、D204C/K/R和E253C，优选选自F209I/W、Q92G/P、G135A、T168Q、T183E、D204C和E253C，更优选选自F209I、Q92G、G135A、T168Q、T183E、D204C和E253C。

12.根据权利要求10或11所述的酯酶，其中所述酯酶包含至少在位置F209+D204+E253的取代组合，优选至少选自F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C+E253C的取代组合，更优选选自F209I/W+D204C+E253C的组合。

13.根据权利要求12所述的酯酶，其中所述酯酶进一步在选自在以下位置包含至少一个取代：T61、A65、Q92、G135、T168、T177、T183和N212，优选选自以下位置：Q92、G135、T168和T183。

14.根据权利要求12和13所述的酯酶，其中所述酯酶包含至少一种选自以下的取代组合：F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C，优选选自F209I/A/G/H/L/R/S/T+D204C+E253C，和至少一个选自以下的取代：T61M/V、A65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N/H/Q、T183E和N212D/Q/M，优选选自Q92G/P、G135A、T168Q和T183E，更优选选自Q92G、G135A、T168Q和T183E。

15.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶在选自以下位置包含至少四个氨基酸取代：F209、T61、A65、Q92、G135、T168、T177、T183、D204、N212和E253。

16.根据前述权利要求任一项所述的酯酶，其中所述酯酶在选自下组位置包含至少取代组合：F209+D204+E253、F209+D204+E253+Q92、F209+D204+E253+N212、F209+D204+E253+Q92+G135+T168、F209+D204+E253+Q92+G135+T168+T183、F209+D204+E253+Q92+T183或F209+D204+E253+Q92+T168+T183。

17.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶在位置F209+D204+E253+Q92包含至少取代组合，优选选自以下的取代组合：F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C+Q92G/P，更优选选自F209I/W+D204C+E253C+Q92G，甚至更优选F209I+D204C+E253C+Q92G。

18.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶包含至少一种选自以下的取代组合：F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C+Q92G/P、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C+N212D/M/Q、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C+Q92G/P+G135A+T168Q、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C+Q92G/P+G135A+T168Q+T183E、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C+Q92G/P+T183E、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C/K/R+E253C+Q92G/P+T168Q+T183E，优选选自F209I/W+D204C+E253C、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P、F209I/W+D204C+E253C+N212D/M、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+G135A+T168Q、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+G135A+T168Q+T183E、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+T183E、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+T168Q+T183E，更优选选自F209I+D204C+E253C+Q92G、F209I+D204C+E253C+Q92G+T183E和F209I+D204C+E253C+Q92G+G135A+T168Q+T183E。

19.根据权利要求1所述的酯酶，其中所述酯酶与SEQ ID N°1所示的氨基酸序列相比具有1-31个氨基酸取代，所述1-31个氨基酸取代选自下组：F209I/G/H/L/R/T、D12F/Y/R、T50P、T63Q、S66H、W69R、T89R/F、D94S、S121W、T153A、N158Q、T168Q、P180E、A182R、F188I/Y、S197P、E202M、G205C/K、T207L、P211A、N212D/Q、K216P、K220E、Q238T、L240A、P242K、G243Y、P244N、G247A/D/E/H/S、G250C/Y和P260S，优选与SEQ ID N°1相比具有1-3个氨基酸取代，其选自T168Q、F209I/G/H/L/R/T和N212D/Q，优选选自T168Q、F209I和N212D。

20.根据权利要求1所述的酯酶，其中所述酯酶的氨基酸序列与SEQ ID N°1所示的氨基酸序列相比具有单个氨基酸取代，所述单个氨基酸取代选自F209I/G/H/L/R/T、D12F/Y/R、T50P、T63Q、S66H、W69R、T89R/F、D94S、S121W、T153A、N158Q、T168Q、P180E、A182R、F188I/Y、S197P、E202M、G205C/K、T207L、P211A、N212D/Q、K216P、K220E、Q238T、L240A、P242K、G243Y、P244N、G247A/D/E/H/S、G250C/Y和P260S，优选选自T168Q、F209I/G/H/L/R/T和N212D/Q，更优选选自F209I/G/H/L/R/T和T168Q，甚至更优选选自F209I和T168Q。

21.根据权利要求20所述的酯酶，其中单个取代选自F209I/G/H/L/R/T，优选F209I。

22.根据权利要求18所述的酯酶，其中所述酯酶的氨基酸序列与SEQ ID N°1所示的氨基酸序列相比具有取代组合，所述取代组合选自F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C+E253C、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C+E253C+Q92G/P、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C+E253C+N212D/M/Q、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C+E253C+Q92G/P+G135A+T168Q、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C+E253C+Q92G/P+G135A+T168Q+T183E、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C+E253C+Q92G/P+T183E、F209I/A/G/H/L/R/S/T/W+D204C+E253C+Q92G/P+T168Q+T183E，优选选自F209I/W+D204C+E253C、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P、F209I/W+D204C+E253C+N212D/M、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+G135A+T168Q+T183E、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+T183E，F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+T168Q+T183E，甚至更优选选自F209I+D204C+E253C+Q92G,F209I+D204C+E253C+Q92G+T183E和F209I+D204C+E253C+Q92G+G135A+T168Q+T183E。

23.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶包含至少一个如亲本酯酶中的选自以下的氨基酸残基：D176、H208、S130、M131、C241、C259、G59、H129、G132、W155、I171、I178、P214、D174，优选地所述酯酶包含至少一种如亲本酯酶中的选自以下的组合：D176+H208+S130、C241+C259和D176+H208+S130+C241+C259，更优选D176+H208+S130+C241+C259+M131+D174。

24.根据前述任一项所述的酯酶，其中所述酯酶包含至少一个如亲本酯酶中的选自以下的氨基酸：G59、H129、G132、W155、I171、I178和P214，优选至少一个选自I171和I178的氨基酸，更优选至少I171+I178的组合，甚至更优选至少如亲本酯酶中的组合：I171+I178+G59+H129+G132+W155+P214。

25.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中与SEQ ID N°1的酯酶相比，所述酯酶表现出增加的热稳定性和增加的降解活性。

26.根据权利要求25所述的酯酶，其中与SEQ ID N°1的酯酶相比，所述酯酶在50℃-65℃，更优选在50℃和/或65℃的温度下表现出增加的热稳定性和增加的聚酯降解活性。

27.核酸，其编码权利要求1-26中任一项定义的酯酶。

28.表达盒或载体，其包含权利要求27所述的核酸。

29.宿主细胞，其包含权利要求27所述的核酸或权利要求28所述的表达盒或载体。

30.组合物，其包含权利要求1-26中任一项定义的酯酶，或根据权利要求29所述的宿主细胞，或其提取物。

31.降解聚酯的方法，其包括：

(a)使所述聚酯与根据权利要求1-26中任一项所述的酯酶或根据权利要求29所述的宿主细胞或根据权利要求30所述的组合物接触；以及，任选地

(b)回收单体和/或低聚物。

32.权利要求31所述所述的方法，其中所述聚酯选自：聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸异山梨醇酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)、聚琥珀酸己二酸丁二醇酯(PBSA)、聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)、聚呋喃酸乙二醇酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚己二酸乙二醇酯(PEA)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)和这些材料的共混物/混合物，优选聚对苯二甲酸乙二醇酯。

33.权利要求31或32所述的方法，其中步骤(a)在20℃-90℃，优选40℃-90℃，更优选50℃-70℃的温度下实施。

34.权利要求31-33所述的方法，其中步骤(a)在包括5-9，优选6-9的pH范围内，更优选6.5-9的pH范围内的pH下实施。

35.含有根据权利要求1-26中任一项所述的酯酶或根据权利要求29所述的宿主细胞或根据权利要求30所述的组合物的含聚酯材料。

36.洗涤剂组合物，其包含根据权利要求1-26中任一项所述的酯酶或根据权利要求29所述的宿主细胞或根据权利要求30所述的组合物。