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CN116615443A - 针对cd33的单结构域抗体 - Google Patents

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CN116615443A
CN116615443A CN202180075831.3A CN202180075831A CN116615443A CN 116615443 A CN116615443 A CN 116615443A CN 202180075831 A CN202180075831 A CN 202180075831A CN 116615443 A CN116615443 A CN 116615443A
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S·卡西姆
J·谢勒
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Vor Biopharma Inc
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Abstract

本公开包含特异性CD33的抗体以及制备和使用此类抗体的方法。

Description

针对CD33的单结构域抗体
相关申请交叉引用
本申请根据35U.S.C.119(e)要求于2020年9月14日提交的美国临时申请第63/078,134号的权益，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。
背景技术
CD33，也被称为Siglec(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素)，经常在急性髓系白血病(AML)细胞上表达。AML仍然是血液肿瘤学中一个主要的治疗挑战和未满足的需求。AML是一种导致未成熟髓性母细胞在骨髓和外周血中不可控积聚的疾病，并且所述疾病具有多种亚型，这给开发全面的靶向疗法带来了挑战。尽管对所述疾病的分子遗传学了解增加了，但批准用于AML的新型疗法相对较少。因此，仍然需要用于AML的新型治疗剂。
发明内容
本公开提供了针对CD33的新型抗体。本公开还提供了此类抗体用于治疗与CD33表达相关的血液赘生性疾病和恶性病、造血系统恶性病(例如，急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、多发性骨髓瘤(MM))的用途。
一方面，本公开提供了一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括选自由SEQ ID NO:1-88组成的组的氨基酸序列。另一方面，本公开提供了一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括涵盖在SEQID NO:1-88中的任一个内的互补决定区(CDR)序列。另一方面，本公开提供了一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括涵盖在SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73或81中的任一个内的CDR1、CDR2和CDR3。另一方面，本公开提供了一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:1-88中的任一个中描绘的至少一个CDR(例如，CDR1、CDR2和/或CDR3)。另一方面，本公开提供了一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括至少一个CDR，所述至少一个CDR与SEQ ID NO:1-88中的任一个中描绘的CDR(例如，CDR1、CDR2和/或CDR3)至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。另一方面，本公开提供了一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括重链可变结构域，例如单结构域抗体VHH，所述重链可变结构域包括选自由SEQ ID NO:1-88组成的组的氨基酸序列。另一方面，本公开提供了一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括VHH，所述VHH包括涵盖在SEQ ID NO:1-88中的任一个内的CDR序列。另一方面，本公开提供了一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括VHH，所述VHH包括涵盖在SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73或81中的任一个内的CDR1、CDR2和CDR3。另一方面，本公开提供了一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括VHH，所述VHH包括SEQ ID NO:1-88中的任一个中描绘的至少一个CDR(例如，CDR1、CDR2和/或CDR3)。另一方面，本公开提供了一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括VHH，所述VHH包括至少一个CDR，所述至少一个CDR与SEQ ID NO:1-88中的任一个中描绘的CDR(例如，CDR1、CDR2和/或CDR3)至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段与本文所描述的抗体或其抗原结合片段竞争。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和一个或多个附加区，如一个或多个恒定区。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段是包括重链可变结构域的单结构域抗体，所述单结构域抗体可以被称为VHH。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段是由重链可变结构域组成的单结构域抗体。
在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括CH2恒定结构域和CH3恒定结构域。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段是重链抗体。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段是骆驼科抗体。
本公开的各方面还提供了嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括本文所描述的任何抗体或其抗原结合片段。本公开的各方面还提供了表达本文所描述的任何嵌合抗原受体的细胞。在一些实施例中，所述细胞是免疫效应细胞。在一些实施例中，所述细胞是淋巴细胞。在一些实施例中，所述细胞是T细胞。在一些实施例中，所述细胞是NK细胞。
另一方面，本公开提供了一种核酸，所述核酸包括编码本文所描述的任何抗体或其抗原结合片段或本文所描述的任何嵌合抗原受体的核酸序列。
另一方面，本公开提供了一种载体，所述载体包括本文所描述的任何核酸。
另一方面，本公开提供了宿主细胞，所述宿主细胞包括本文所描述的任何核酸或本文所描述的任何载体。在一些实施例中，所述宿主细胞是选自由以下组成的组的免疫细胞：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。
另一方面，本公开提供了产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达所述抗体或其抗原结合片段的条件下培养本文所描述的任何宿主细胞。
另一方面，本公开提供了治疗CD33相关疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文所描述的任何抗体或其抗原结合片段，或本文所描述的任何嵌合抗原受体。另一方面，本公开提供了治疗患有或有风险患有与CD33表达相关的血液赘生性疾病或恶性病的受试者的方法。在一些实施例中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述疾病或恶性病是造血系统恶性病。在一些实施例中，与CD33表达相关的血液赘生性疾病或恶性病是骨髓增生异常综合征(MDS)、急性髓系白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)或其组合。
在一些实施例中，本公开的方法进一步包括向所述受试者施用有效量的化学治疗剂或溶瘤治疗剂。在一些实施例中，方法进一步包括施用造血细胞群体，其中所述造血细胞被基因工程化成使得编码CD33的基因被工程化为降低或消除CD33的表达。
附图说明
图1示出了用于评估由示例性抗CD33抗体结合的表位的测定的图示。显示出与生物素化的CD33接触的抗体被认为与CD33上的不同表位结合，而不与生物素化的CD33接触的第三抗体被认为与其它抗体之一结合相同的表位，并且因此不能与CD33相互作用。
图2示出了来自评估第一抗CD33抗体(饱和抗体(mAb))与第二抗CD33抗体(竞争抗体(mAb))之间的竞争的测定的结合数据的图。
图3示出了来自评估第一抗CD33抗体与第二抗CD33抗体之间的竞争的测定的结合数据的热图表示。
图4示出了CD33的带状结构，示出了描绘了CD33中针对突变靶向的氨基酸的三种不同的结构表示。
图5示出了用突变CD33-GFP融合蛋白瞬时转染的293FT细胞的(顶部)细胞门控和分析sdAb 348或hu195与示例性CD33突变W22A结合的(底部)FACS数据。
图6示出了用十个sdAb进行的突变CD33-GFP结合实验的荧光激活细胞分选(FACS)分析数据的热图表示。
图7示出了CD33的蛋白质结构图，示出了被确定为对所测试的并在图上标出的所指示的抗CD33 sdAb中的每一个的结合很重要的氨基酸。
图8示出了CD33的蛋白质结构图，示出了被确定为对所测试的并在图上标出的所指示的抗CD33 sdAb中的每一个的结合很重要的氨基酸。
图9A-9C示出了本文所描述的示例性报告细胞的流式细胞术分析图。图9A示出了含有在组成型活性E1Fα启动子控制下的mOrange报告分子和在本文所描述的IL-2报告系统控制下的mTurquoise报告分子(mTurq)的Jurkat细胞。细胞不被激活(“-PMA/离子”，顶行)，或者用佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)和离子霉素激活(“+PMA/离子”，底行)。图的左栏示出了表达mOrange报告分子的细胞；中间栏示出了表达mTurquoise报告分子的细胞；并且右栏示出了表达CD69(T细胞激活的指标)的细胞。图9B示出了含有在组成型活性E1Fα启动子控制下的mTurquoise报告分子(mTurq)和在本文所描述的IL-2报告系统控制下的mOrange报告分子的Jurkat细胞。细胞不被激活(“-PMA/离子”，顶行)，或者用佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)和离子霉素激活(“+PMA/离子”，底行)。图的左栏示出了表达mTurquoise报告分子的细胞；中间栏示出了表达mOrange报告分子的细胞；并且右栏示出了表达CD69(T细胞激活的指标)的细胞。图9C示出了图9A和9B的定量流式细胞术分析的图。y轴示出了基于表达第一报告分子(FP1)的细胞的表达第二报告分子(FP2)的细胞的百分比，第二报告分子在本文所描述的IL-2报告系统的控制下，第一报告分子在组成型活性启动子EF1a的控制下。细胞不被激活(“-PMA/离子”)，或者用佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)和离子霉素激活(“+PMA/离子”)。“EF1a_mOrange_IL-2_mTurq”是指含有在组成型活性E1Fα启动子控制下的mOrange报告分子(FP1)和在本文所描述的IL-2报告系统控制下的mTurquoise报告分子(mTurq)(FP2)的Jurkat细胞。“EF1a_mTurq_IL-2_mOrange”是指含有在组成型活性E1Fα启动子控制下的mTurquoise报告分子(FP1)和在本文所描述的IL-2报告系统控制下的mOrange报告分子(FP2)的Jurkat细胞。
图10示出了当Jurkat细胞暴露于表达MOLM13 CD33的细胞时，IL-2诱导型荧光蛋白(FP2，mTurq以黑色表示或者mOrange以浅灰色表示)的增加倍数的图，其中Jurkat细胞表达所指示的CAR或共刺激蛋白。
图11示出了当Jurkat细胞暴露于表达MOLM13 CD33的细胞时，IL-2诱导型荧光(ΔFP2)(mTurq以黑色表示或者mOrange以浅灰色表示)的绝对变化的图，其中Jurkat细胞表达所指示的CAR或共刺激蛋白。
图12A和12B示出了含有在组成型激活EF-1a启动子的控制下的报告分子的示例性基因构建体的示意图。图12A示出了在组成型激活EF-1a启动子的控制下的mOrange。图12B示出了在组成型激活EF-1a启动子的控制下的mTurquoise。这些构建体在转染的细胞中提供了相关荧光蛋白的组成型表达。
图13A和13B示出了本文所描述的IL-2报告系统的示例性基因构建体的示意图。图13A示出了在含有6个NFAT结合位点的最小NFAT应答性启动子和最小IL-2启动子(“minP”)的控制下的mOrange报告分子和在组成型活性E1Fα启动子的控制下的mTurquoise报告分子(mTurq)。图13B示出了在含有6个NFAT结合位点的最小NFAT应答性启动子和最小IL-2启动子(“minP”)的控制下的mTurquoise报告分子和在组成型活性E1Fα启动子的控制下的mOrange报告分子。这些构建体在CAR激活时在IL-2报告系统的控制下提供报告分子的表达，这可以相对于在组成型启动子的控制下的报告分子的表达来评估。
具体实施方式
本公开部分地基于与CD33选择性地结合的新型抗体的发现。在一些实施例中，抗体包括重链可变结构域。在一些实施例中，抗体是单结构域抗体。在一些实施例中，抗体包括重链可变结构域和一个或多个恒定结构域。本公开还涉及编码所述抗体的核酸、产生所述抗体的方法以及用于治疗癌症(例如，急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS))的治疗方法的方法。
抗体
术语“抗体”以最广泛的含义在本文使用并且涵盖各种抗体结构，包含但不限于：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和/或抗体片段(优选地那些展现出期望的抗原结合活性的片段)。本文所描述的抗体可以是免疫球蛋白、重链抗体、轻链抗体、基于LRR的抗体或具有抗体样性质的其它蛋白质支架，以及本领域已知的其它免疫结合部分，包含例如Fab、Fab'、Fab'2、Fab2、Fab3、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv、SMIP、抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体、(单结构域抗体)、大抗体、单链抗体、DVD、BiTe、TandAb等，或其任何组合。在一些实施例中，抗体是重链抗体。在一些实施例中，抗体是骆驼科抗体。在一些实施例中，抗体包括重链可变区和一个或多个恒定区(例如，CH2和CH3)。在一些实施例中，抗体是/>也被称为单结构域抗体或“VHH”。不同类抗体的亚单位结构和三维构型是本领域已知的。
“单克隆抗体”或“mAb”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即包括所述群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产期间产生)可能的变体抗体，此类变体通常以少量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体都针对抗原上的单个决定簇。
“抗原结合片段”是指完整抗体的结合所述完整抗体所结合的抗原的部分。抗体的抗原结合片段包含特异性地结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。示例性抗体片段包含但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，仅scFv或VHH或VH或VL结构域)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施例中，本文所描述的抗体的抗原结合片段是scFv。在一些实施例中，本文所描述的抗体的抗原结合片段仅是VHH结构域。与完整抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段可以包括至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性地结合单独的抗原或同一抗原的不同表位。
“多特异性抗体”是指包括至少两个不同的抗原结合结构域的抗体，所述抗原结合结构域识别并且特异性结合至少两个不同的抗原。“双特异性抗体”是一种类型的多特异性抗体并且指包括识别并且特异性与至少两个不同抗原结合的两个不同抗原结合结构域的抗体。
“不同抗原”可以指不同的和/或独特的多个蛋白质、多肽或分子；以及不同的和/或独特的多个表位，所述表位可以被包含在一个蛋白质、多肽或其它分子内。
术语“表位”是指与抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定簇，称为互补位。单个抗原可以具有多于一个表位。因此，不同抗体可以与抗原的不同区域结合并且可以具有不同的生物效应。术语“表位”还指抗原的B细胞和/或T细胞所响应的位点。其还指抗体所结合的抗原区域。表位可以被定义为结构的或功能的。功能性表位通常是结构性表位的子集，并且具有直接有助于相互作用亲和力的那些残基。表位也可以是构象的，即，由非线性氨基酸构成。在某些实施例中，表位可以包含作为如氨基酸、糖侧链、磷酰基基团或磺酰基基团等分子的化学活性表面分组的决定簇，并且在某些实施例中，可以具有特定的三维结构特性和/或特定的电荷特性。
如本文所用，“选择性结合(selective binding)”、“选择性地结合(selectivelybinds)”、“特异性结合(specific binding)”或“特异性结合(specifically binds)”，就抗原结合部分和抗原靶标而言，是指抗原结合部分优先与抗原靶标缔合，而不是与非抗原靶标的实体缔合。抗原结合部分与非靶标之间可能发生一定程度的非特异性结合。在一些实施例中，如果与抗原结合部分与非靶标的结合相比，抗原结合部分与抗原靶标之间的结合大于2倍、大于5倍、大于10倍或大于100倍，则抗原结合部分选择性地结合抗原靶标。在一些实施例中，如果结合亲和力小于约10-5M、小于约10-6M、小于约10-7M、小于约10-8M或小于约10-9M，则抗原结合部分选择性地结合抗原靶标。在一些实施例中，如果与抗原结合部分与抗原靶标的非靶标或另一个表位的结合相比，抗原结合部分与抗原靶标的表位之间的结合大于2倍、大于5倍、大于10倍或大于100倍，则抗原结合部分选择性地结合抗原靶标的表位。在一些实施例中，如果结合亲和力小于约10-5M、小于约10-6M、小于约10-7M、小于约10-8M或小于约10-9M，则抗原结合部分选择性地结合抗原靶标的表位。
在一些实施例中，抗体或其片段选择性地结合经常交叉竞争结合抗原的相同的表位或重叠的表位。因此，在一些实施例中，本公开提供了与如本文所公开的示例性抗体或其片段交叉竞争的抗体或其片段。在一些实施例中，“交叉竞争(cross-compete)”、“竞争(compete)”、“交叉竞争(cross-competition)”或“竞争(competition)”是指抗体或其片段竞争靶标上的相同表位或结合位点。此类竞争可以通过参考抗体或其片段防止或抑制测试抗体或其片段的特异性结合并且反之亦然的测定来确定。许多类型的竞争性结合测定可以用于确定测试分子是否与参考分子竞争结合。可以采用的测定的实例包含固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如，Stahli等人《酶学方法(Methods in Enzymology)》(1983)9:242-253)、固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如，Kirkland等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》(1986)137:3614-9)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定、Luminex(Jia等人“一种用于表征单克隆抗体的多重竞争性抗体分仓新型方法(A novel method of Multiplexed Competitive AntibodyBinning for the characterization of monoclonal antibodies)”《免疫学方法杂志(J.Immunological Methods)》(2004)288,91-98)和表面等离子共振(Song等人“感染患者的具有抗HIV-1活性的人源化抗CD4单克隆抗体伊巴珠单抗的表位定位(Epitope Mappingof Ibalizumab,a Humanized Anti-CD4 Monoclonal Antibody with Anti-HIV-1Activity in Infected Patients)”《病毒学杂志(J.Virol.)》(2010)84,6935-42)。在一些实施例中，当竞争性抗体或其片段过量存在时，它会将参考抗体或其片段与共同抗原的结合抑制至少50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些情况下，结合被抑制至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。
抗体可以是四条多肽链的免疫球蛋白分子，例如两条重(H)链和两条轻(L)链。在一些实施例中，轻链是λ轻链。在一些实施例中，轻链是κ轻链。重链可以包含重链可变结构域和重链恒定结构域。重链恒定结构域可以包含CH1区、铰链区、CH2区、CH3区以及在一些情况下CH4区中的任何一个或多个。轻链可以包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域。轻链恒定结构域可以包含CL。
重链的重链可变结构域和轻链的轻链可变结构域通常可以进一步细分为穿插有被称为构架区(FR)的更保守的区域的被称为互补决定区(CDR)的可变区。在一些实施例中，此类重链和/或轻链可变结构域可以各自包含三个CDR和四个框架区，从氨基末端到羧基末端以以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4，其中一个或多个可以如本文所描述进行工程化。重链中的CDR分别被命名为“CDRH1”、“CDRH2”和“CDRH3”，并且轻链中的CDR被命名为“CDRL1”、“CDRL2”和“CDRL3”。
存在五种主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类中的若干类可以进一步分为亚类(同种异型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类别的免疫球蛋白对应的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
示例性单结构域抗体
单结构域抗体是其互补决定区是单结构域多肽的一部分的抗体。实例包含但不限于重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、衍生自常规4链抗体的单结构域抗体、工程化抗体和除衍生自抗体的那些之外的单结构域支架。单结构域抗体可以是本领域已知的任何抗体，或任何未来的单结构域抗体。单结构域抗体可以衍生自任何物种，包含但不限于小鼠、人类、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。根据本公开的一个方面，如本文所用的单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体，被称为缺乏轻链的重链抗体。例如PCT公开第WO 94/04678号中公开了此类单结构域抗体。源自天然缺乏轻链的重链抗体的此类可变结构域在本文中被称为“VHH”或此类VHH可以源自骆驼科物种，例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼、骆马、羊驼和原驼中产生的抗体。除骆驼科以外的其它物种可能产生天然缺乏轻链的重链抗体；此类VHH在本公开的范围内。在一些实施例中，抗体是/>或“VHH”,并且包括重链可变区。在一些实施例中，抗体包括重链可变区和一个或多个重链恒定区。在一些实施例中，抗体包括重链可变区，并且不包括一个或多个重链恒定区。在一些实施例中，抗体包括重链可变区，并且不包括轻链区(轻链可变区或轻链恒定区)。
骆驼科动物的VHH结构域的氨基酸残基根据以下给出的VH结构域的通用编号进行编号：Kabat等人,“具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequence of proteins ofimmunological interest)”,美国国立卫生研究院美国公共卫生局(US Public HealthServices,NIH)(马里兰州贝塞斯达(Bethesda,MD)),公开号91–3242(1991)；还参见Riechmann等人,《免疫学方法杂志》(1999)231:25-38。根据此编号，FR1包括位置1-30处的氨基酸残基，CDR1包括位置31-35处的氨基酸残基，FR2包括位置36-49处的氨基酸，CDR2包括位置50-65处的氨基酸残基，FR3包括位置66-94处的氨基酸残基，CDR3包括位置95-102处的氨基酸残基，并且FR4包括位置103-113处的氨基酸残基。
然而，应当注意的是(如本领域众所周知的VH结构域和VHH结构域)，每个CDR中氨基酸残基的总数量可能不同，并且可能不对应于Kabat编号所指示的氨基酸残基的总数量(即，根据Kabat编号的一个或多个位置在实际序列中可能不被占据，或者实际序列可能含有比Kabat编号所允许的数量更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，根据Kabat的编号可能或可能不对应于实际序列中的氨基酸残基的实际编号。
用于对VH结构域的氨基酸残基进行编号的替代方法是本领域已知的，所述方法也可以以类似的方式应用于VHH结构域。然而，在本公开、权利要求和附图中，将遵循如上文所描述的根据Kabat并应用于VHH结构域的编号，除非另有说明。
在一些实施例中，氨基酸残基的位置编号可以基于参考序列中的对应氨基酸残基来引用。
本公开提供了可以包含本文所描述的各种重链的抗体。在一些实施例中，抗体包括两条重链和轻链。在一些实施例中，抗体包括两条重链，所述重链可以是两条相同的重链(具有相同的氨基酸序列)或不同的重链(具有不同的氨基酸序列)。在一些实施例中，抗体包括两条重链，所述重链可以与靶抗原的相同表位或不同表位结合。在一些实施例中，抗体包括两条重链，所述重链可以与不同靶抗原的表位结合。在一些实施例中，本公开涵盖一种抗体，所述抗体包含如本文所公开的至少一条重链、如本文所公开的至少一个重链框架结构域和/或如本文公开的至少一个重链CDR序列。
在一些实施例中，本文所公开的抗体是同二聚体单克隆抗体。在一些实施例中，本文所公开的抗体是异二聚体抗体。在一些实施例中，抗体是例如典型的抗体或双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体、(单结构域抗体)、大抗体、tandab、DVD、BiTe、scFv、TandAb scFv、Fab、Fab2、Fab3、F(ab')2等，或其任何组合。在一些实施例中，抗体是重链抗体。在一些实施例中，抗体是骆驼科抗体。在一些实施例中，抗体是美洲驼抗体。在一些实施例中，抗体包括重链可变区和一个或多个恒定区。在一些实施例中，抗体是/>也被称为单结构域抗体或“VHH”。在一些实施例中，抗体包括一个、两个或三个免疫球蛋白恒定结构域(例如，选自CH1、CH2、CH3和CH4)。在一些实施例中，抗体包括一个、两个或三个IgG1恒定结构域。在一些实施例中，抗体包括CH2和CH3结构域。在一些实施例中，抗体包括CH融合体。用于本公开的抗体的示例性IgG1 CH2和CH3结构域在下文提供：
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV
HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:89)。
除其它外，本公开还提供了抗CD33抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段，选自由SEQ ID NO:1-88组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括涵盖在SEQ ID NO:1-88中的任一个内的CDR序列。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括涵盖在SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73或81中的任一个内的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:1-88中的任一个中描绘的至少一个CDR(例如，CDR1、CDR2和/或CDR3)。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括至少一个CDR，所述至少一个CDR与SEQ ID NO:1-88中的任一个中描绘的CDR(例如，CDR1、CDR2和/或CDR3)至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。
除其它外，本公开还提供了一种包括VHH的抗CD33抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括VHH，所述VHH包括选自由SEQ ID NO:1-88组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括VHH，所述VHH包括涵盖在SEQ ID NO:1-88中的任一个内的CDR序列。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括VHH，所述VHH包括涵盖在SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73或81中的任一个内的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括VHH，所述VHH包括SEQ ID NO:1-88中的任一个中描绘的至少一个CDR(例如，CDR1、CDR2和/或CDR3)。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括VHH，所述VHH包括至少一个CDR，所述至少一个CDR与SEQ ID NO:1-88中的任一个中描绘的CDR(例如，CDR1、CDR2和/或CDR3)至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。
在一些实施例中，抗CD33抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，抗CD33抗体或其抗原结合片段是骆驼科抗体或源自骆驼科抗体。在一些实施例中，本公开提供了一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，其与包括选自由SEQ ID NO:1-88组成的组的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段竞争。
在一些实施例中，本公开提供了一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，其相对于抗CD33抗体或其抗原结合片段包括1个至24个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、10个或更多个)添加、缺失或取代，其中所述抗CD33抗体包括选自由SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73和81组成的组的氨基酸序列并且例如所述抗体或片段选择性地结合CD33。在一些实施例中，本公开提供了一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括与选自由SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73和81组成的组的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且例如抗体或片段选择性地结合CD33。
除其它外，本公开还提供了制备抗CD33抗体或其抗原结合片段的方法。制备抗体的方法在本领域中是已知的。例如，可以使用多种已知技术产生单克隆抗体，如以下描述的标准体细胞杂交技术：Kohler和Milstein,《自然(Nature)》(1975)256:495。也可以采用用于产生单克隆抗体的其它技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化或使用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。
在一些实施例中，通过直接从获自人受试者的人B细胞克隆重链和轻链基因来获得人抗体。从外周血中分离B细胞(例如，通过流式细胞术，例如FACS)，对B细胞标志物进行染色，并且评估抗原结合。提取编码重链可变区和轻链可变区(或整个重链和轻链)的RNA，并且将所述RNA逆转录成DNA，从所述DNA中扩增抗体基因(例如，通过PCR)并对所述抗体基因进行测序。然后，已知的抗体序列可以用于表达针对已知靶抗原的重组人抗体。在一些情况下，可以通过向转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经被修饰为响应于抗原攻击产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或一部分，所述人免疫球蛋白基因座替代内源性免疫球蛋白基因座或者是染色体外存在的或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已经失活。来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区可以被进一步修饰，例如，通过与不同的人恒定区组合。
在一些情况下，抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。在一些实施例中，用于生成产生人单克隆抗体的杂交瘤的动物系统是鼠类系统。小鼠中杂交瘤的产生在本领域是众所周知的，包含用于分离和融合经免疫的脾细胞的免疫方案和技术。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已经进行了描述。
也可以通过分离选自人源性噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来生成人抗体。此类可变结构域序列然后可以与期望的人恒定结构域组合。
在一些实施例中，本公开提供了产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养包括编码本文所描述的任何抗CD33抗体的核酸的宿主细胞。在一些实施例中，所述方法涉及在适于表达抗体或其抗原结合片段的条件下培养包括选自由SEQ ID NO:1-88组成的组的核酸序列的细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括收集、分离和/或纯化抗体或其抗原结合片段。
融合蛋白和缀合物
在一些实施例中，本公开提供了融合蛋白，其包括(i)本文所描述的一种或多种单结构域抗体或其抗原结合片段(例如，包括本文所描述的一个或多个CDR)；以及(ii)一个或多个另外的多肽。在一些实施例中，本公开提供了融合蛋白，其包括(i)本文所描述的一种或多种单结构域抗体或其抗原结合片段(例如，包括本文所描述的一个或多个CDR)；以及(ii)一个或多个另外的结构域。例如，融合蛋白可以包含本文所描述的一种或多种单结构域抗体和一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个或更多个)恒定区，或Fc区。在一些实施例中，如PCT公开第WO 2017/075537号、第WO 2017/075533号、第WO 2018156802号和第WO2018156791号中所描述，本文所描述的一种或多种单结构域抗体或其抗原结合片段(例如，本文所描述的一个或多个CDR)可以与抗原(例如，用于细胞治疗的抗原靶标，例如CAR-T细胞或抗体药物缀合物)非共价或共价缀合，例如融合。
在一些实施例中，本公开提供了包括如本文所描述的一个或多个VHH和一个或多个另外的多肽或多肽结构域的融合蛋白。在一些实施例中，另外的多肽包括另外的抗体或其片段。另外的抗体包含例如完整的IgG、IgE和IgM、双特异性抗体或多特异性抗体(例如，等)、单链Fv、多肽-Fc融合物、Fab、骆驼状抗体、遮蔽抗体(例如，/>)、小模块免疫药物(“SMIPsTM”)、单链或串联双抗体/>VHH(包含但不限于本公开中描述的那些)、/>微型抗体、/>锚蛋白重复蛋白或DART、TCR样抗体、/> 微量蛋白、/>和
在一些实施例中，所述一个或多个另外的多肽或多肽结构域包括第二抗原结合结构域，如与相同靶抗原(即，CD33)，例如本文所描述的任何抗CD33抗体或其抗原结合片段结合的第二抗原结合结构域。在一些实施例中，所述一个或多个另外的多肽或多肽结构域包括第二抗原结合结构域，如与不同靶抗原(例如，不是CD33的表位)结合的第二抗原结合结构域。
在一些实施例中，本公开的抗体可以通过连接子(例如，通过二硫化物或不可切割的硫醚连接子)与药物(例如，细胞毒性剂，如毒素)共价连接作为抗体药物缀合物(ADC)。抗体与其共价连接的药物在未与抗体缀合时可能具有细胞毒性或抑制细胞生长的作用。ADC可以用于选择性地将有效剂量的细胞毒性剂递送至细胞(例如，递送至肿瘤组织)。与当药物和/或抗体以其未经缀合形式施用时相比，ADC可以提高药物和/或抗体的生物利用度。
多种连接子类型和策略是本领域已知的，并且这些类型和策略中的任何一种或全部都被考虑用于本公开的抗体或ADC。在一些实施例中，连接子是可生物降解的，例如，可被内源性蛋白酶(例如，存在于靶组织和/或细胞中)切割。在一些实施例中，所述连接子包括蛋白酶可切割位点。在一些实施例中，连接子包括pH敏感位点，例如对酸性pH敏感的例如在酸性条件下水解的位点。在一些实施例中，连接子在生理条件下是稳定的，例如足够稳定，使得抗体在释放药物之前将药物靶向靶组织。在一些实施例中，连接子包括二硫键，例如谷胱甘肽敏感性二硫键。在一些实施例中，与抗体缀合的药物仅在连接子的切割之后才具有活性。在一些实施例中，与抗体缀合的药物仅在抗体的蛋白水解消化之后才具有活性(例如，在靶细胞的溶酶体中)。在一些实施例中，连接子是不可切割的异双官能硫醚连接子，例如马来酰亚胺连接子，例如包括N-羟基琥珀酰亚胺酯(琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯或SMCC)。
与本公开的ADC相容的多种药物是本领域已知的，并且这些药物中的任何一种或全部都被考虑与本公开的抗体一起使用。
包括本文所描述的任何抗CD33抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体(CAR)也在本公开的范围内。CAR是含有与T细胞信号传导结构域连接的一种或多种抗体的抗原结合结构域(例如，单链可变片段(scFv))的人工构建的杂合蛋白或多肽。CAR的特性包含其利用单克隆抗体的抗原结合性质，以非MHC限制性方式将T细胞特异性和反应性重新导向选定的靶标的能力。非MHC限制性抗原识别使表达CAR的T细胞能够识别独立于抗原处理的抗原，从而绕开了肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，有利地，CAR不会与内源性T细胞受体(TCR)α和β链发生二聚。如本文所用，短语“抗原特异性(antigen(ic)specificity)”和“引发抗原特异性应答”意指CAR可以与抗原特异性地结合并免疫识别抗原，使得CAR与抗原的结合引发免疫应答。
在含有抗体的抗原结合结构域的常规CAR中，存在三代CAR。“第一代”CAR通常由与跨膜结构域融合的细胞外抗原结合结构域(例如，scFv)构成，所述跨膜结构域与细胞质/细胞内信号传导结构域融合。第一代CAR可以提供从头抗原识别，并通过单个融合分子中的CD3ζ链信号传导结构域激活CD4+和CD8+T细胞两者，而不依赖HLA介导的抗原呈递。“第二代”CAR将来自各种共刺激信号传导分子(例如，CD28、4-1BB、ICOS、0X40、CD27、CD40/My88和NKGD2)的细胞内信号传导结构域添加到CAR的细胞质尾部，以向T细胞提供另外的信号。第二代CAR包括提供共刺激(例如，CD28或4-1BB)和激活(CD3ζ)两者的那些。“第三代”CAR包括提供多个共刺激结构域(例如，CD28和4-1BB)和提供激活的信号传导结构域(例如，CD3ζ)的那些。
本文所描述的CAR包括CAR的含有抗CD33结合片段、跨膜结构域和信号传导结构域的细胞外部分。在一些实施例中，CAR进一步包括以下中的一个或多个：连接子区、铰链区和共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，CAR进一步包括信号肽/信号序列。
CAR可以由或基本上由本文所描述的一个或多个指定氨基酸序列组成，使得其它组分，例如其它氨基酸，不会实质性地改变功能变体的生物活性。
本公开的CAR(包含功能部分和功能变体)可以是任何长度的，即可以包括任何数量的氨基酸，条件是CAR(或其功能部分或功能变体)保留其生物活性，例如与靶抗原(例如，CD33)特异性结合、检测哺乳动物的患病细胞、或治疗或预防哺乳动物的疾病等的能力。例如，CAR可以是约50至约5000个氨基酸长，如长度为50个、70个、75个、100个、125个、150个、175个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个或更多个氨基酸。
在一些实施例中，CAR构建体(包含本发明的功能部分和功能变体)可以包括代替一种或多种天然存在的氨基酸的合成氨基酸。此类合成氨基酸是本领域已知的，并且包含，例如，氨基环己烷甲酸、正亮氨酸、a-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、b-苯基丝氨酸、b-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、a-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-甲酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N'-苄基-N'-甲基-赖氨酸、N',N'-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、a-氨基环戊烷甲酸、a-氨基环己烷甲酸、a-氨基环庚烷甲酸、a-(2-氨基-2-降冰片烷)-甲酸、a,g-二氨基丁酸、a,b-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和a-叔丁基甘氨酸。
在一些实施例中，CAR构建体(包含功能部分和功能变体)可以是糖基化的、酰胺化的、羧基化的、磷酸化的、酯化的、N-酰化的、通过例如二硫键环化的或转化成酸加成盐和/或任选地二聚化或聚合的或共轭的。
在一些实施例中，CAR构建体(包含其功能部分和功能变体)可以通过本领域已知的方法获得。在一些实施例中，CAR构建体可以通过任何合适的制备多肽或蛋白质的方法来制备，包含从头合成。CAR构建体可以使用本文所描述的核酸通过使用标准重组方法重组产生。参见，例如Green等人，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》,第4版,纽约市冷泉港的冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press,ColdSpring Harbor,NY)2012。进一步，本文所描述的一些CAR构建体的各部分(包含其功能部分和功能变体)可以从如植物、细菌、昆虫、哺乳动物，例如大鼠、人等来源分离和/或纯化。分离和纯化的方法是本领域众所周知的。可替代地，本文所描述的CAR构建体(包含其功能部分和功能变体)可以由公司商业合成，如Synpep公司(加利福尼亚州都柏林)、肽技术公司(Peptide Technologies Corp.)(马里兰州盖瑟斯堡市)和多肽系统公司(MultiplePeptide Systems)(加利福尼亚州圣地亚哥)。在这方面，CAR构建体可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。
本文进一步提供了包括编码本文所描述的任何CAR构建体(包含其功能部分和功能变体)的核苷酸序列的核酸。本文所描述的核酸可以包括编码以下各项中的任一个的核苷酸序列：前导序列(例如，信号肽)、抗原结合结构域、跨膜结构域、连接子区、共刺激信号传导结构域和/或细胞内T细胞信号传导结构域。
在一些方面，本文所描述的任何抗原结合结构域可以与CAR的另一个结构域，如跨膜结构域或细胞内结构域可操作地连接，以便在细胞中表达。在一些实施例中，编码抗原结合结构域的核酸与编码跨膜结构域的核酸和编码细胞内结构域的核酸可操作地连接。
在一些实施例中，编码抗CD33抗原结合结构域的核酸与编码连接子区的核酸、编码跨膜结构域的核酸和/或编码细胞内结构域(例如，共刺激信号传导结构域、信号传导结构域)的核酸可操作地连接。在一些实施例中，CAR包括本文所描述的任何抗CD33抗体或其抗原结合片段(例如，包括本文所描述的一个或多个CDR)。在一些实施例中，CAR包括SEQ IDNO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81中的任一个中提供的任何抗CD33抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，CAR包括连接子区。在一些实施例中，抗原结合结构域的轻链可变区和重链可变区可以通过连接子彼此连接。在一些实施例中，抗原结合结构域可以与另一个结构域，如跨膜结构域、铰链和/或具有连接子区的细胞内结构域连接。连接子可以包括任何合适的氨基酸序列。在一些实施例中，连接子是长度为约1个至约100个、约3个至约20个、约5个至约30个、约5个至约18个或约3个至约8个氨基酸的Gly/Ser连接子，并且按顺序由甘氨酸残基和/或丝氨酸残基组成。因此，Gly/Ser连接子可以由甘氨酸残基和/或丝氨酸残基组成。优选地，Gly/Ser连接子包括GGGGS(SEQ ID NO:100)的氨基酸序列，并且连接子内可以存在多个SEQ ID NO:100。任何连接子序列都可以用作抗原结合结构域与CAR的任何其它结构域如跨膜结构域之间的间隔子。在一些实施例中，区连接子是([G]x[S]y)z(SEQID NO:111)，例如其中x可以为1-10，y可以为1-3，并且z可以为1-5。在一些实施例中，连接子区包括氨基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:101)。在一些实施例中，连接子区包括氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:102)。
在一些实施例中，抗原结合结构域包括一个或多个前导序列(信号肽、信号序列)，如本文所描述的那些。在一些实施例中，前导序列可以定位于CAR构建体内的CAR的氨基末端。前导序列可以包括任何合适的前导序列，例如，本文所描述的任何CAR可以包括任何前导序列，例如本文所描述的那些。在一些实施例中，虽然前导序列可以促进释放的CAR在细胞的表面上的表达，但是为了使CAR发挥功能，前导序列在表达的CAR中的存在不是必需的。在一些实施例中，在细胞表面上表达CAR后，前导序列可以被切割掉。因此，在一些实施例中，释放的CAR(例如，表面表达的)缺少前导序列。在一些实施例中，CAR构建体中的CAR缺少引导序列。
铰链
在一些实施例中，CAR包括将细胞外抗原结合结构域与另一个结构域如跨膜结构域连接的铰链/间隔子区。铰链/间隔子区可以足够柔韧，以允许抗原结合结构域在不同方向上定向，从而促进靶抗原识别。在一些实施例中，铰链结构域是CD8α或CD28的铰链结构域的一部分，例如，含有CD8α或CD28的铰链结构域的至少15个(例如，20个、25个、30个、35个或40个)连续氨基酸的片段。
在一些实施例中，CAR包括铰链结构域，如来自CD8、CD28或IgG4的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域是CD8(例如，CD8a)铰链结构域。在一些实施例中，CD8铰链结构域是人的(例如，获自/源自人蛋白质序列)。在一些实施例中，CD8铰链结构域包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:103。
CD8铰链区
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD[SEQ ID NO:103]
在一些实施例中，铰链结构域是CD28铰链结构域。在一些实施例中，CD28铰链结构域是人的(例如，获自/源自人蛋白质序列)。在一些实施例中，CD28铰链结构域包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:104。
CD28铰链区
AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP[SEQ ID NO:104]
抗体的铰链结构域，如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体，也适用于本文所描述的嵌合受体。在一些实施例中，铰链结构域是连接抗体的恒定结构域CH1和CH2的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域是抗体的，并且包括抗体的铰链结构域和抗体的一个或多个恒定区。在一些实施例中，铰链结构域包括抗体的铰链结构域和抗体的CH3恒定区。在一些实施例中，铰链结构域包括抗体的铰链结构域和抗体的CH2恒定区和CH3恒定区。在一些实施例中，抗体是IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体。在一些实施例中，抗体是IgG抗体。在一些实施例中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施例中，铰链区包括IgG1抗体的铰链区以及CH2恒定区和CH3恒定区。在一些实施例中，铰链区包括IgG1抗体的铰链区和CH3恒定区。在一些实施例中，铰链结构域是IgG4铰链结构域。
包括铰链结构域的CAR也在本公开的范围内，所述铰链结构域是非天然存在的肽。在一些实施例中，Fc受体的细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域是肽连接子，如(GlyxSer)n(SEQ ID NO:105)连接子，其中x和n独立地可以是介于3与12之间的整数，包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更大。
可以用于本文所描述的嵌合受体铰链结构域的另外的肽连接子是本领域已知的。参见例如，Wriggers等人《肽科学的当前趋势(Current Trends in Peptide Science)》(2005)80(6):736-74和PCT公开第WO 2012/088461号。
在一些实施例中，目前公开的CAR的铰链/间隔子区包括如本文所描述的CD28多肽的天然或经修饰的铰链区。在某些实施例中，目前公开的CAR构建体的铰链/间隔子区包括如本文所描述的CD8α多肽的天然或经修饰的铰链区。在某些实施例中，目前公开的CAR构建体的铰链/间隔子区包括如本文所描述的IgG4多肽的天然或经修饰的铰链区。
跨膜结构域
关于跨膜结构域，CAR可以被设计成包括将CAR的抗原结合结构域连接到CAR的细胞内区域的跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域与CAR中的一个或多个结构域相关。在一些实例中，跨膜结构域可以通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。
跨膜结构域可以源自天然的或合成的来源。在所述来源是天然的情况下，所述结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。特别用于本发明的跨膜区可以衍生自(即，至少包括)以下各项的跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8a、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9。
在一些实施例中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下跨膜结构域将主要包括如亮氨酸和缬氨酸等疏水性残基。优选地，将在合成的跨膜结构域的每一端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
在一些实施例中，跨膜结构域是CD8(例如，CD8a)跨膜结构域。在一些实施例中，CD8跨膜结构域是人的(例如，获自/源自人蛋白质序列)。在一些实施例中，CD8跨膜结构域包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:106。
CD8跨膜区
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC[SEQ ID NO:106]
在一些实施例中，跨膜结构域是CD28跨膜结构域。在一些实施例中，CD28跨膜结构域是人的(例如，获自/源自人蛋白质序列)。在一些实施例中，CD28跨膜结构域包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:107。
CD28跨膜结构域
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS[SEQ ID NO:107]
细胞内信号传导结构域
在一些实施例中，CAR构建体包括细胞内信号传导结构域，其可以包含一个或多个信号传导结构域和共刺激结构域。CAR的细胞内信号传导结构域涉及CAR被表达的细胞的激活。在一些实施例中，本文所描述的CAR构建体的细胞内信号传导结构域涉及T淋巴细胞或NK细胞的激活。在一些实施例中，本文所描述的CAR构建体的信号传导结构域包含涉及信号激活和/或转导的结构域。
用于本文所描述的CAR构建体的细胞内信号传导结构域的实例包含但不限于表面受体的细胞质部分、共刺激分子和在细胞(例如，免疫细胞(例如，T淋巴细胞)、NK细胞)中协同作用以启动信号转导的任何分子，以及这些元件的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。
可以用于本文所描述的CAR的细胞内信号传导结构域的信号传导结构域的实例包含但不限于来自一种或多种分子或受体的片段或结构域，所述分子或受体包含但不限于TCR、CD3ζ(CD3 zeta)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、共同FcRγ、FcRβ(FcεRib)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、DAP 12、T细胞受体(TCR)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD l id、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉的)、CEACAMl、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGLl、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD 162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、本文所描述的其它共刺激分子、其任何衍生物、变体或片段、具有相同功能能力的共刺激分子的任何合成序列，以及其任何组合。
任何细胞质信号传导结构域都可以用于本文所描述的CAR。通常，细胞质信号传导结构域传递信号，如细胞外配体结合结构域与其配体的相互作用，以刺激细胞应答，如诱导细胞的效应子功能(例如，细胞毒性)。
对本领域普通技术人员来说显而易见的是，涉及T细胞激活的因素是细胞质信号传导结构域的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的磷酸化。本领域已知的任何含ITAM的结构域可以用于构建本文所描述的嵌合受体，并且包含作为细胞质信号传导结构域的一部分。通常，ITAM基序可以包括氨基酸序列YxxL/I的间隔6-8个氨基酸的两个重复序列，其中每个x独立地是任何氨基酸，产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。在一些实施例中，细胞质信号传导结构域来自CD3ζ。
CD3ζ与TCR缔合以产生信号，并且含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在一些实施例中，CD3ζ细胞内T细胞信号传导序列是人类的(例如，从人类蛋白质获得或源自人类蛋白质)。在一些实施例中，CD3ζ细胞内T细胞信号传导序列包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:108或109的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:108或109的氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施例中，细胞内T细胞信号传导结构域包括含有一个或多个突变和/或缺失的ITAM的CD3ζ。
CD3ζ信号传导结构域(变体A)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR[SEQ ID NO:108]
CD3ζ信号传导结构域(变体B)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR[SEQ ID NO:109]
在某些非限制性实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域进一步包括至少一个(例如，1个、2个、3个或更多个)共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包括可以提供最佳的淋巴细胞激活的至少一种共刺激分子。通常，除了刺激抗原特异性信号外，许多免疫细胞还需要共刺激，以促进细胞增殖、分化和存活，并且激活细胞的效应子功能。宿主细胞(例如，免疫细胞)中的共刺激信号传导结构域的激活可以诱导细胞增加或减少细胞因子的产生和分泌、吞噬性质、增殖、分化、存活和/或细胞毒性。任何共刺激蛋白的共刺激信号传导结构域可以相容以供在本文所描述的嵌合受体中使用。共刺激信号传导结构域的类型可以基于以下因素进行选择：如CAR将被表达的细胞的类型(例如，原代T细胞、T细胞系、NK细胞系)和期望的免疫效应子功能(例如，细胞毒性)。
此类共刺激信号传导结构域的实例包含来自一种或多种分子或受体的片段或结构域，所述一种或多种分子或受体包含但不限于4-1BB、CD28、ICOS、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、CD116受体β链、CSF1-R、LRP1/CD91、SR-A1、SR-A2、MARCO、SR-CL1、SR-CL2、SR-C、SR-E、CR1、CR3、CR4、凝集素1、DEC-205、DC-SIGN、CD14、CD36、LOX-1、CD11b、连同以任何组合在上文段落中列出的信号传导结构域中的任何信号传导结构域一起。在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域包含一种或多种共刺激信号传导分子的任何部分，如来自CD3的至少一个信号传导结构域、FcεRIγ链、其任何衍生物或变体(包含其具有相同功能能力的任何合成序列)以及其任何组合。
在一些实施例中，一个或多个共刺激信号传导结构域(例如，1个、2个、3个或更多个)包含在具有CD3ζ细胞内T细胞信号传导序列的CAR构建体中。在一些实施例中，所述一个或多个共刺激信号传导结构域选自CD137(4-1BB)和CD28；或其组合。在一些实施例中，CAR包括4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，CAR包括CD28共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，CAR包括4-1BB共刺激信号传导结构域和CD28共刺激信号传导结构域两者。
4-1BB，也被称为CD137，向T细胞传输有效的共刺激信号，促进分化并增强T淋巴细胞的长期存活。在一些实施例中，4-1BB细胞内T细胞信号传导序列是人类的(例如，从人类蛋白质序列获得/源自人类蛋白质序列)。在一些实施例中，4-1BB细胞内T细胞信号传导序列包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:110。在一些实施例中，4-1BB共刺激信号传导结构域包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:110的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:110的氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。
4-1BB共刺激信号传导结构域
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL[SEQ ID NO:110]
本文提供了一些合适的共刺激结构域，并且鉴于本领域的知识，基于本公开，其它合适的共刺激结构域和共刺激结构域序列对于本领域技术人员将是显而易见的。合适的共刺激结构域包含例如以下中描述的那些：Weinkove等人,选择嵌合抗原受体的共刺激结构域：功能和临床考虑(Selecting costimulatory domains for chimeric antigenreceptors:functional and clinical considerations),《临床转化免疫学(Clin TranslImmunology.)》2019；8(5):e1049，所述文献的全部内容通过引用并入本文。
在抗原结合结构域与CAR的跨膜结构域之间，或者在细胞内信号传导结构域与CAR的跨膜结构域之间，可以掺入间隔子结构域。如本文所用，术语“间隔子结构域”通常意指在多肽链中用于将跨膜结构域与抗原结合结构域或细胞内结构域连接的任何寡肽或多肽。在一些实施例中，间隔子结构域可以包括至多300个氨基酸，优选地10个至100个氨基酸，并且最优选地25个至50个氨基酸。在一些实施例中，短寡肽或多肽连接子，优选地长度介于2个与10个氨基酸之间，可以形成CAR的跨膜结构域与细胞内结构域之间的连接。连接子的实例包含甘氨酸-丝氨酸双链体。
信号肽
在一些实施例中，本文所描述的任何CAR可以进一步包括信号肽(信号序列)。通常，信号肽是将多肽靶向细胞中的某个位点的短氨基酸序列。在一些实施例中，信号肽将CAR导向细胞的分泌通路，并且将允许CAR整合和锚定到细胞表面处的脂质双层中。相容以供在本文所描述的嵌合受体中使用的信号序列(包含天然存在的蛋白质的信号序列或合成的非天然存在的信号序列)对本领域技术人员来说将是显而易见的。
本文所描述的CAR可以制备成处于具有例如自切割肽的构建体中，使得含有抗CD33 CAR组分的CAR构建体是双顺反子的、三顺反子的等。
本文公开了各种CAR构建体和CAR构建体的许多元件(例如，各种CD33结合结构域、信号肽、连接子、铰链序列、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域)，并且鉴于本领域的知识，本领域技术人员将能够基于本公开确定这些元件和本领域已知的其它合适元件的序列。示例性CAR元件序列，例如CD33结合结构域、信号肽、连接子、铰链序列、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域的CAR元件序列公开于PCT/US2019/022309(公布为WO/2019/178382)中，例如贯穿说明书和在表1-6中，所述文献的全部内容通过引用并入本文。
CAR5
本文所描述的包括一种或多种单结构域抗体或其抗原结合片段的示例性CAR构建体包括如SEQ ID NO:25中包括的CD33结合结构域、CD8a跨膜结构域、CD8a铰链结构域、CD137(4-1BB)共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，CAR包括SEQ ID NO:90中所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:90中所示的氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。
MELGLSWVVLAALLQGVQAQVKLEESGGGSVQAGESLRLSCTASGITFRDYDIDWYRQAPGKEREWLATITPSGTTHYPDSVKGRATISRDSAKNTVYLQMNSLKPEDTARYECNTLAYWGSGTQVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR[SEQ ID NO:90]
CAR 6
本文所描述的包括一种或多种单结构域抗体或其抗原结合片段的示例性CAR构建体包括如SEQ ID NO:73中包括的CD33结合结构域、CD8a跨膜结构域、CD8a铰链结构域、CD137(4-1BB)共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，CAR包括SEQ ID NO:91中所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:91中所示的氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。
MELGLSWVVLAALLQGVQAQVQLVETGGGLVRAGGSLRLSCAASGRTADIYNIGWFRQAPGKEREFVAAITWIGRTPYYADAVKGRFAFSTDSAKNTVSLQMDNLKPEDTGVYYCNAAHYLEGNTDYYWGQGTQVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR[SEQ IDNO:91]
CAR 7
本文所描述的包括一种或多种单结构域抗体或其抗原结合片段的示例性CAR构建体包括如SEQ ID NO:9中包括的CD33结合结构域、CD8a跨膜结构域、CD8a铰链结构域、CD137(4-1BB)共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，CAR包括SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。
MELGLSWVVLAALLQGVQAQVQLVQPGGSLRLFCVASEEFFSIYAMGWYRQAPGKQHEMVARFTRDGKITYADSAKGRFTITRDAKNTLNLQMNGLIPEDTAVYYCNINHYWGQGTQVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR[SEQ ID NO:92]
CAR 8
本文所描述的包括一种或多种单结构域抗体或其抗原结合片段的示例性CAR构建体包括如SEQ ID NO:17中包括的CD33结合结构域、CD8a跨膜结构域、CD8a铰链结构域、CD137(4-1BB)共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，CAR包括SEQ ID NO:93中所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:93中所示的氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。
MELGLSWVVLAALLQGVQADVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSVSGNIDRFYAMGWYRQAPGKQRELVAQLTNNEITTYGDSVEGQFSISGDFDANTVYLQMDSLKPEDTAVYYCHAHVTTTRWSQDYYWGQGTRVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR[SEQ IDNO:93]
任何融合蛋白，如本文所描述的任何CAR，可以在细胞中表达，并且由此在细胞的表面上呈递。在一些实施例中，细胞可以是免疫细胞，如T细胞(即，T淋巴细胞)或NK细胞。T细胞淋巴细胞可以是任何T细胞，如培养的T细胞，例如原代T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞，例如TIB-153TM、Jurkat、SupTl等，或获自哺乳动物的T细胞。
核苷酸序列和表达
本公开包含编码本文所描述的任何一种或多种抗CD33抗体(例如，本文所述的VHH)或其部分(例如，本文所描述的一个或多个CDR)和/或本文所描述的一种或多种融合蛋白的核苷酸序列。在各种情况下，此类核苷酸序列可以存在于如表达载体的载体中。在各种情况下，此类核苷酸可以存在于细胞的基因组中，例如需要治疗的受试者的细胞或用于产生抗体的细胞，例如用于产生抗体的哺乳动物细胞。
在一些实施例中，本文所描述的任何抗体由载体，例如病毒载体中包括的多核苷酸编码。任选地，编码如本文所描述的多肽的多核苷酸可以被密码子优化以增强表达或稳定性。密码子优化可以根据本领域已知的任何标准方法进行。在一些实施例中，多肽的表达可以由组成型表达的启动子或诱导型表达的启动子驱动。在一些实施例中，如本文所描述的抗体包含信号肽。信号肽可以源自任何具有细胞外结构域或被分泌的蛋白质。如本文所描述的抗体可以包含本领域已知的任何信号肽。
逆转录病毒，如慢病毒，为编码所关注基因或嵌合基因的核酸序列的递送提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将所选核酸序列插入到载体中，并且包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以将重组病毒分离并且递送至细胞，例如体外或离体。逆转录病毒系统是本领域众所周知的并且描述于以下中：例如美国专利第5,219,740号；Kurth和Bannert(2010)“逆转录病毒：分子生物学、基因组学和发病机理(Retroviruses:MolecularBiology,Genomics and Pathogenesis)”卡尔斯特学术出版社(Calster Academic Press)(ISBN:978-1-90455-55-4)；以及Hu和Pathak《药理学评论(Pharmacological Reviews)》2000 52:493-512；所述文献通过引用整体并入本文。在一些实施例中，通过转染或电穿孔包括编码抗体的核酸的表达载体，在哺乳动物细胞中表达本文所描述的抗体。转染方法或电穿孔方法是本领域已知的。
另一方面，本公开涉及一种细胞，例如哺乳动物细胞，其包括本文所描述的任何抗体；或一种编码本文所描述的任何抗体的核酸。在一个实施例中，所述细胞包括本文所描述的抗体，或编码本文所描述的抗体的核酸。细胞或组织例如哺乳动物细胞或组织可以源自人、灵长类动物、仓鼠、兔子、啮齿动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫。在一些实施例中，可以使用任何其它哺乳动物细胞。在一些实施例中，哺乳动物细胞是人的细胞。
本文所描述的抗体的高效表达可以使用检测编码抗体的核酸的mRNA、DNA或基因产物的标准测定如RT-PCR、FACS、northern印迹、western印迹、ELISA或免疫组织化学来评估。在一些实施例中，本文所描述的抗体由重组核酸序列编码。
CD33
CD33，也被称为Siglec(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素)，在介导细胞-细胞相互作用和维持免疫细胞处于静止状态中发挥作用。CD33优先识别和结合α-2,3-连接的带有唾液酸的聚糖和更亲合的α-2,6-连接的带有唾液酸的聚糖，并且在配体如C1q或涎酸化糖蛋白的参与下，定位于CD33的细胞质尾部的两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)被Src样激酶如LCK磷酸化。这些磷酸化为蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN6/SHP-1和PTPN11/SHP-2的募集和激活提供了对接位点。进而，这些磷酸酶被认为通过信号传导分子的去磷酸化来调节下游通路。CD33对单核细胞激活的抑制作用之一需要磷酸肌醇3-激酶/PI3K。
CD33由骨髓干细胞(CFU-GEMM、CFU-GM、CFU-G和E-BFU)、成髓细胞和单核细胞、单核细胞/巨噬细胞、粒细胞前体(其随着成熟表达减少)和肥大细胞表达。成熟的粒细胞可能显示出非常低水平的CD33表达。CD33可以在某些浆细胞骨髓瘤病例上异常表达。CD33不在红细胞、血小板、B细胞、T细胞或NK细胞中表达。CD33是一种优秀的骨髓标志物，并且通常用于急性髓系白血病(AML)的诊断。然而，大约10-20％的B淋巴母细胞或T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤可能异常表达CD33(参见Naeim等人,《血液病理学图谱(Atlas ofHematopathology)》(第二版),2018)。
CD33相关病症
本公开的任何抗体和/或融合蛋白可以用于例如检测和/或治疗CD33相关病症，即与标准对照(例如，正常、非疾病、非癌细胞)中的CD33表达相比，与CD33的细胞表面表达升高或降低相关的疾病。在一些实施例中，CD33相关病症包括血液恶性病或赘生物。在一些实施例中，血液恶性病或赘生物包括骨髓增生异常综合征(MDS)、急性髓系白血病(AML)或多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施例中，CD33相关病症包括AML。
急性髓系白血病(AML)是一种需要更有效的疗法的骨髓癌症。根据美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)的数据，美国有超过60,000人患有AML，并且不到30％的患者在诊断后存活五年。AML细胞可以通过检测细胞表面标志物的表达来表征并与其它细胞区分开来。AML细胞可以是CD33+(尽管有些是CD33-)、CLL-1+、CD45+和CDw52+。AML的特征是一种起源于逐渐获得了破坏关键分化和生长调节通路的关键遗传变化的转化细胞的异质性克隆性赘生性疾病。(Dohner等人,《新英格兰医学杂志(NEJM)》,(2015)373:1136)。
CD33也经常在骨髓增生异常综合征和慢性粒单核细胞白血病中表达，伴有原始细胞计数升高(参见Sanford等人《白血病和淋巴瘤(Leuk Lymphoma)》(2016)57(8):1965–1968)并且还在大量骨髓瘤患者的浆细胞上表达，表明它可以表示多发性骨髓瘤的治疗靶标(参见Robillard等人《白血病(Leukemia)》(2005)19(11):2021-2)。
在一些实施例中，与CD123相关的造血系统恶性病或血液系统病症是癌前病状，如骨髓发育异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期。骨髓增生异常综合征(MDS)是以无序和无效的造血作用或血液产生为特征的血液医学病状。因此，造血细胞的数量和质量不可逆转地下降。一些患有MDS的患者可能会发展成严重的贫血，而其他人则是无症状的。MDS的分类方案是本领域已知的，其标准指定了特定血细胞类型例如成髓细胞、单核细胞和红细胞前体的比率或频率。MDS包含难治性贫血、伴有环状成高铁红细胞的难治性贫血、伴有过量母细胞的难治性贫血、伴有转化中过量母细胞的难治性贫血、慢性粒单核细胞白血病(CML)。在一些实施例中，MDS可以发展成急性髓系白血病(AML)。
在各种情况下，表达本文所描述的任何前述物质的抗体和/或融合蛋白和/或细胞治疗、缓解CD33相关病症(例如，AML、MDS、MM)的一种或多种症状或生物标志物，减轻其患病率，降低其频率，或降低其水平或量。具体症状和症状进展因受试者而异。因此，在一些实施例中，将本文所描述的抗体和/或融合蛋白施用于有需要的受试者，例如患有CD33相关病症(例如，AML、MDS、MM)的受试者。在一些实施例中，本文所描述的任何抗体和/或融合蛋白的施用预防了癌症或造血系统恶性病或恶性病前期，包含减轻疾病的一种或多种症状和/或延缓疾病的进展。
在各种情况下，本文所描述的抗体和/或融合蛋白的施用使得CD33相关病症的一种或多种症状或生物标志物的患病率、频率、水平和/或量降低，例如，与受试者中的先前测量结果或参考值相比，一种或多种症状或生物标志物降低至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。
在一些实施例中，如本文所描述的抗体和/或融合蛋白的有效剂量可以是例如小于1,000mg/剂量，例如小于900mg/剂量、800mg/剂量、700mg/剂量、600mg/剂量、500mg/剂量、550mg/剂量、400mg/剂量、350mg/剂量、300mg/剂量、200mg/剂量、100mg/剂量、50mg/剂量、25mg/剂量或更少。可替代地或与如本文所公开的剂量组合，如本文所描述的抗体和/或融合蛋白可以以少于每周一次，例如少于每周一次、2周一次、3周一次、4周一次、5周一次、6周一次、7周一次、8周一次、9周一次、10周一次、11周一次、12周一次、3个月一次、4个月一次、5个月一次、6个月一次、7个月一次、8个月一次、9个月一次、10个月一次、11个月一次或一年一次的频率有效或有用地施用。
在一些实施例中，表达融合蛋白如本文所描述的CAR的细胞(例如，免疫细胞)的有效剂量，可以在例如一百万个至1000亿个细胞的范围内；然而，低于或高于此示例性范围的量也在本公开的范围内。例如，细胞的日剂量可以为约1百万个至约500亿个细胞(例如，约5百万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞，或由前述值中的任何两个值定义的范围)，优选地约1000万个至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞，或由前述值中的任何两个值定义的范围)，更优选地约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约3.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞，或由前述值中的任何两个值定义的范围)。
在一些实施例中，本文所描述的抗体和/或融合蛋白可以用于许多诊断和/或治疗应用中。例如，如本文所描述的抗体的可检测标记版本可以用于检测样品(例如，生物样品)中的CD33的存在或量的测定。本文所描述的抗体和/或融合蛋白可以用于研究CD33活性抑制的体外测定。在一些实施例中，本文所描述的抗体和/或融合蛋白可以在被设计用于鉴定抑制CD33或以其它方式用于治疗CD33相关病症的另外的新型化合物的测定中用作阳性对照。
本文所描述的抗体和/或融合蛋白可以用于监测受试者，例如患有、疑似患有、有风险患有或正在治疗一种或多种CD33相关病症的受试者。监测可以包含确定受试者中，例如受试者的血清中的CD33的量或活性。在一些实施例中，评估在施用如本文所描述的抗体和/或融合蛋白之后至少一(1)小时，例如，至少2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时或48小时或至少1天、2天、4天、10天、13天、20天或更多天或至少1周、2周、4周、10周、13周、20周或更多周执行。可以在以下时段中的一个或多个时段内对受试者进行评估：治疗开始之前；治疗期间；或已经施用的治疗的一种或多种元素之后。评估可以包含评估对进一步治疗的需要，例如，评估是否应当改变剂量、施用的频率或治疗的持续时间。其还可以包含评估对添加或减少所选治疗方式的需要，例如，添加或减少针对本文所描述的CD33相关病症的任何治疗。
测量抗体与CD33的相互作用
本文所描述的抗体与CD33的结合性质可以通过本领域已知的方法来测量，例如以下方法之一：BIACORE分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)、x射线晶体学、序列分析和扫描诱变。可以使用表面等离振子共振(SPR)分析抗体与CD33的结合相互作用。SPR或生物分子相互作用分析(BIA)实时检测生物特异性相互作用，而无需标记任何相互作用物。BIA芯片的结合表面处的质量变化(表示结合事件)会导致表面附近光线的折射率发生变化。折射率的变化产生可检测的信号，所述信号被测量以指示生物分子之间的实时反应。用于使用SPR的方法描述于以下文献中：例如，美国专利第5,641,640号；Raether(1988)《表面等离子(Surface Plasmons)》施普林格出版社(Springer Verlag)；Sjolander和Urbaniczky(1991)《分析化学(Anal.Chem.)》63:2338-2345；Szabo等人(1995)《结构生物学新见(Curr.Opin.Struct.Biol.)》5:699-705以及BIAcore International AB(瑞典乌普萨拉(Uppsala,Sweden))提供的在线资源。另外地，也可以使用可从Sapidyne仪器公司(爱达荷州博伊西(Boise,Id.))获得的(动力学排除测定)测定。
来自SPR的信息可以用于提供对平衡解离常数(KD)以及动力学参数(包含Kon和Koff)的准确和定量的测量，用于抗体与CD33的结合。此类数据可以用于比较不同的分子。来自SPR的信息也可以用于开发结构-活性关系(SAR)。可以鉴定出给定位置处的与特定结合参数(例如，高亲和力)相关的变体氨基酸。
在某些实施例中，本文所描述的抗体对结合CD33表现出高亲和力。在各个实施例中，如本文所描述的抗体对CD33的KD小于约10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14或10-15M。在某些情况下，如本文所描述的抗体对CD33的KD介于0.001与1nM之间，例如，0.001nM、0.005nM、0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM或1nM。
在一些实施例中，本文所描述的抗体与CD33的特定表位结合，例如，包括CD33的一个或多个特定氨基酸。不希望受理论的束缚，破坏本文所描述的抗体的CD33表位的特定氨基酸的可用性(例如，通过诱变或由于竞争抗体的结合)可以降低或消除抗体的结合。在需要多个抗CD33抗体与CD33相互作用的治疗应用或产品制造中，选择或设计抗CD33抗体以靶向非竞争性CD33表位以避免相互干扰可能是重要的。在一些实施例中，本文所描述的抗CD33抗体特异性结合包括氨基酸W22、H45、Y49、Y50、R98和R122中的1个、2个、3个、4个、5个或全部(例如，W22、H45、Y49、Y50、R98和R122中的全部)的CD33表位。在一些实施例中，本文所描述的抗CD33抗体特异性结合包括氨基酸Y49、Y50和L78中的1个、2个或全部(例如、Y49、Y50和L78中的全部)的CD33表位。在一些实施例中，本文所描述的抗CD33抗体特异性结合包括氨基酸K52、L78、R98和R122中的1个、2个、3个或全部(例如、K52、L78、R98和R122中的全部)的CD33表位。在一些实施例中，本文所描述的抗CD33抗体特异性结合包括氨基酸Y49、Y50、K52和R98中的1个、2个、3个或全部(例如、Y49、Y50、K52和R98中的全部)的CD33表位。在一些实施例中，本文所描述的抗CD33抗体特异性结合包括氨基酸N20、H45、Y49和Y50中的1个、2个、3个或全部(例如、N20、H45、Y49和Y50中的全部)的CD33表位。在一些实施例中，本文所描述的抗CD33抗体特异性结合包括W22的CD33表位。在一些实施例中，本文所描述的抗CD33抗体特异性结合包括氨基酸Y49、Y50和N99中的1个、2个或全部(例如、Y49、Y50和N99中的全部)的CD33表位。在一些实施例中，本文所描述的抗CD33抗体特异性结合包括氨基酸H45、Y49、Y50、K52和R122中的1个、2个、3个、4个或全部(例如、H45、Y49、Y50、K52和R122中的全部)的CD33表位。
治疗方法
在一些实施例中，本文所描述的一种或多种抗CD33抗体用于治疗本文所描述的一种或多种病症，例如一种或多种与CD33表达相关的疾病或病症的方法中。与CD33表达相关的疾病或病症包含，例如，某些血液恶性病和赘生物，如MDS、AML和MM。在一些实施例中，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所描述的抗体或其抗原结合片段，或表达任何前述物质的细胞。在一些实施例中，本文所描述的一种或多种抗CD33抗体，包含包括任何抗CD33抗体的融合蛋白，用于治疗与CD33表达相关的疾病或病症的方法中。在一些实施例中，本文所描述的一种或多种抗CD33抗体用于治疗与CD33表达相关的血液赘生性疾病和恶性病的方法中。在一些实施例中，本文所描述的一种或多种抗CD33抗体用于治疗MDS、AML或MM的方法中。
组合疗法
在一些实施例中，本文所描述的抗CD33抗体与一种或多种另外的治疗剂如化学治疗剂或溶瘤治疗剂组合施用。如本文所用，“组合疗法”是指以重叠的方案施用两种或更多种不同的药剂，使得受试者同时暴露于两种药剂的那些情况。当用于组合疗法时，两种或更多种不同的药剂可以同时或单独施用。组合施用可以包含以相同剂型同时施用两种或更多种药剂、以单独剂型同时施用以及单独施用。即，可以将两种或更多种药剂一起调配在同一剂型中，并且同时施用。可替代地，可以同时施用两种或更多种药剂，其中药物存在于单独的调配物中。在另一个替代方案中，可以施用第一药剂，紧接着施用一种或多种另外的药剂。在单独的施用方案中，两种或更多种药剂可以相隔几分钟、几小时或几天施用。
如本文所用，术语“化学治疗剂”或“溶瘤治疗剂”(例如，抗癌药物，例如抗癌疗法，例如免疫细胞疗法)具有其本领域理解的含义，指一种或多种促凋亡剂、细胞生长抑制剂和/或细胞毒性剂和/或激素剂，例如具体地包含用于和/或推荐用于治疗与不期望的细胞增殖相关的一种或多种疾病、病症或病状的药剂。在一些实施例中，化学治疗剂和/或溶瘤治疗剂可以是或包括铂化合物(例如，顺铂、卡铂和奥沙利铂)、烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、氮芥、噻替派、美法仑、白消安、甲基苄肼、链脲佐菌素、替莫唑胺、达卡巴嗪和苯达莫司汀)、抗肿瘤抗生素(例如，柔红霉素、阿霉素、伊达比星、表阿霉素、米托蒽醌、博莱霉素、丝裂霉素C、褶皱霉素和达卡他霉素)、紫杉烷(例如，紫杉醇和多西他赛)、抗代谢药(例如，5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲喋呤、硫鸟嘌呤、氟尿苷、卡培他滨和氨甲喋呤)、核苷类似物(例如，氟达拉滨、氯法拉滨、克拉屈滨、喷司他丁和奈拉滨)、拓扑异构酶抑制剂(例如，拓扑替康和依立替康)、低甲基化剂(例如，阿扎胞苷和地西他滨)、蛋白体抑制剂(例如，硼替佐米)、表鬼臼毒素(例如，依托泊苷和替尼泊苷)、DNA合成抑制剂(例如，羟基脲)、长春花生物碱(例如，长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和长春碱)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，伊马替尼、达沙替尼、尼罗替尼、索拉非尼和舒尼替尼)、亚硝脲(例如，卡莫司汀、福莫司汀和洛莫司汀)、六甲基三聚氰胺、米托坦、血管生成抑制剂(例如，沙利度胺和来那度胺)、类固醇(例如，泼尼松、地塞米松和泼尼松龙)、激素剂(例如，他莫昔芬、雷洛昔芬、亮丙瑞林、比伐米特、格拉司琼和氟他胺)、芳香酶抑制剂(例如，来曲唑和阿那曲唑)、三氧化二砷、维甲酸、非选择性环加氧酶抑制剂(例如，非甾体抗炎药、水杨酸盐、阿司匹林、吡罗昔康、布洛芬、吲哚美辛、萘普生、双氯芬酸、托美汀、酮洛芬、萘丁美酮和奥沙普嗪)、选择性环加氧酶-2(COX-2)抑制剂或其任何组合。
在某些实施例中，用于抗癌治疗的化学治疗剂和/或溶瘤治疗剂包括生物剂，如肿瘤浸润性淋巴细胞、CAR T细胞、抗体、抗原、治疗性疫苗(例如，由患者自身的肿瘤细胞或其它物质如某些肿瘤产生的抗原制成)、免疫调节剂(例如，细胞因子，例如，免疫调节药物或生物应答调节剂)、检查点抑制剂或其它免疫剂。在某些实施例中，免疫剂包含免疫球蛋白、免疫刺激剂(例如，细菌疫苗、集落刺激因子、干扰素、白介素、治疗性疫苗、疫苗组合、病毒疫苗)和/或免疫抑制剂(例如，钙调神经磷酸酶抑制剂、白介素抑制剂、TNFα抑制剂)。在某些实施例中，激素剂包含用于抗雄激素疗法的药剂(例如，酮康唑(Ketoconazole)、阿比特龙(ABiraterone)、TAK-700、TOK-OOl、比卡鲁胺(Bicalutamide)、尼鲁米特(Nilutamide)、氟他胺(Flutamide)、恩扎鲁胺(Enzalutamide)、ARN-509)。
另外的化学治疗剂和/或溶瘤治疗剂包含免疫检查点治疗剂(例如，派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、曲美木单抗(tremelimumab)或西米普利单抗(cemiplimab))、其它单克隆抗体(例如，利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panetumumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)、贝伐单抗(bevacizumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、地诺单抗(denosumab)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、兰博利珠单抗(lambrolizumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、BMS-936559、RG7446/MPDL3280A、MEDI4736)、抗体-药物缀合物(例如，本妥昔单抗(brentuximabvedotin)(西雅图遗传学公司(Seattle Genetics))；恩美曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine)(/>罗氏公司(Roche))；吉妥珠单抗奥加米星(惠氏公司(Wyeth))；CMC-544；SAR3419；CDX-011；PSMA-ADC；BT-062；以及IMGN901)(参见例如，Sassoon等人,《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》1045:1-27(2013)；Bouchard等人,《生物有机化学与医药化学快报(Bioorganic Med.Chem.Lett.)》24:5357-5363(2014))或其任何组合。
在一些实施例中，抗CD33抗体和另外的治疗剂的组合施用使得癌症改善的程度大于单独施用抗CD33抗体或另外的治疗剂所产生的改善程度。组合作用与每种药剂单独作用之间的差异可以是统计学上显著的差异。在一些实施例中，组合作用可以是协同作用。在一些实施例中，与标准给药方案(例如，另外治疗剂的批准给药方案)相比，抗CD33抗体和另外治疗剂的组合施用允许以减少的剂量、减少的剂量次数和/或减少的剂量频率施用另外的治疗剂。
在一些实施例中，对针对其进行医学病状的其它治疗失败或通过其它方式治疗不太成功的受试者进行本文所描述的治疗方法。另外地，本文所描述的治疗方法可以与医学病状的一种或多种另外的治疗结合进行。例如，所述方法可以包括在施用本文所描述的抗CD33抗体或其组合物之前、基本上同时或之后，施用癌症方案，例如非清髓性化学疗法、手术、激素疗法和/或放射治疗。
本公开的各方面涉及施用造血细胞，所述造血细胞被基因修饰为具有降低的或消除的CD33的表达，例如，在治疗需要此类造血干细胞的受试者的情况下，所述受试者可以包含，例如，患有血液系统恶性病(例如，AML)或恶性病前期(例如，MDS)并且正在接受靶向CD33的免疫疗法方案，例如CD33-抗体-药物缀合物或CD33 CAR-T或CAR-NK疗法的受试者。此类治疗方案可以涉及例如以下步骤：(1)施用治疗有效量的任何各项中的任一种：抗CD33抗体、其CD33携带片段(包含融合蛋白，如例如CAR)以及表达任何前述物质的细胞，例如CAR-T或CAR-NK细胞，如本文所描述或本领域技术人员基于本公开以其它方式显而易见的；以及(2)向患者施用(例如，输注或再输注)自体或同种异体的造血干细胞，其中所述造血细胞降低了CD33的表达或消除了所述表达。在一些实施例中，造血细胞被基因修饰为具有降低的CD33的表达。在一些实施例中，造血细胞被基因修饰为具有消除的CD33的表达。在一些实施例中，造血细胞被基因修饰为具有降低或消除的由抗体或其CD33结合片段结合的CD33表位的表达，如本文所公开的。
调配物和施用
在各个实施例中，本文所描述的抗体可以掺入到药物组合物中。此类药物组合物可以用于例如预防和/或治疗疾病，例如癌症，如AML、MDS、MM。药物组合物可以通过本领域技术人员已知的方法调配(如《雷明顿氏药学全书(Remington's PharmaceuticalSciences)》,第17版,编辑Alfonso R.Gennaro,宾夕法尼亚州伊斯顿市的马克出版公司(Mack Publishing Company,Easton,Pa.)(1985)中描述的)。
在一些实施例中，可以将药物组合物调配成包含药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受的载体的实例包含但不限于生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸收延迟剂等。本发明的组合物可以包含药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐。
在一些实施例中，包含如本文所描述的抗体的组合物，例如用于注射的无菌调配物，可以使用注射用蒸馏水作为媒剂根据常规药学实践进行调配。例如，含有葡萄糖和其它补充物如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠的生理盐水或等渗溶液可以用作注射用水溶液，任选地与合适的增溶剂组合，所述增溶剂如例如醇如乙醇和/或多元醇如丙二醇或聚乙二醇，和/或非离子表面活性剂如聚山梨醇酯80TM或HCO-50。
如本文所公开的，药物组合物可以呈本领域已知的任何形式。此类形式包含例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如，可注射和可输注的溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、散剂、脂质体和栓剂。
任何特定形式的选择或使用可能部分地取决于预期的施用方式和治疗应用。例如，含有用于全身或局部递送的组合物的组合物可以呈可注射或不溶性溶液的形式。因此，可以将组合物配制成通过肠胃外模式(例如，静脉内、皮下、腹膜内或肌内注射)施用。如本文所用，肠胃外施用是指除了肠内施用和局部施用之外的、通常通过注射进行的施用模式，并且包含但不限于静脉内、鼻内、眼内、肺部、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、肺内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、脑内、颅内、颈动脉内以及胸骨内注射和输注。
施用途径可以是肠胃外施用，例如通过注射施用、经鼻施用、经肺施用或经皮施用。可以通过静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射或皮下注射进行全身或局部施用。
在一些实施例中，本发明的药物组合物可以被调配为溶液、微乳液、分散体、脂质体或其它适于高浓度下稳定储存的有序结构。无菌可注射溶液可以通过将所需量的本文所描述的组合物根据需要与以上列举的成分中的一种或其组合一起掺入适当溶剂中、随后过滤灭菌来制备。通常，通过将本文所描述的组合物掺入无菌媒剂中来制备分散液，所述无菌媒剂包括基础分散介质和来自以上列举的那些的其它所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，用于制备的方法包含真空干燥和冷冻干燥，其产生本文所描述的组合物的粉末加上来自其先前经无菌过滤的溶液的任何另外的期望成分(参见下文)。可以例如通过使用如卵磷脂等包衣、在分散体的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持溶液的合适流动性。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
药物组合物可以以可注射调配物的形式肠胃外施用，所述可注射调配物包括在水或另一种药学上可接受的液体中的无菌溶液或悬浮液。例如，药物组合物可以通过将治疗分子与药学上可接受的媒剂或介质，如无菌水和生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味赋形剂、稀释剂、媒剂、防腐剂、粘合剂适当组合，随后以通常可接受的药学实践所需的单位剂量形式混合来调配。包含在药物制剂中的活性成分的量使得在指定的范围内提供合适的剂量。油性液体的非限制性实例包含芝麻油和大豆油，并且可以与苯甲酸苄酯或苯甲醇组合作为增溶剂。可以包含的其它项是缓冲剂如磷酸盐缓冲剂或乙酸钠缓冲剂，安抚剂如盐酸普鲁卡因，稳定剂如苯甲醇或苯酚，以及抗氧化剂。调配的注射剂可以包装在合适的安瓿中。
在各个实施例中，皮下施用可以通过装置，如注射器、预填充注射器、自动注射器(例如，一次性或可重复使用的)、笔式注射器、贴片注射器、可穿戴注射器、具有皮下输注套件的流动注射器输注泵或用于与抗体药物组合以进行皮下注射的其它装置来实现。
本公开的注射系统可以采用美国专利第5,308,341号中描述的递送笔。最常用于向患有糖尿病的患者自行递送胰岛素的笔式装置在本领域中是众所周知的。此类装置可以包括至少一个注射针(例如，长度为约5至8mm的31号针)，通常预先填充有一个或多个治疗单位剂量的治疗溶液，并且可用于以尽可能小的疼痛向受试者快速递送溶液。一种药物输送笔包含药瓶支架，药瓶支架中可以收纳治疗药物或其它药物。所述笔可以是完全机械的装置，或者它可以与电子电路系统组合以精确地设定和/或指示注射到使用者体内的药物剂量。参见例如，美国专利第6,192,891号。在一些实施例中，笔式装置的针是一次性的，并且试剂盒包含一个或多个一次性替换针。适用于递送任何一种目前特征组合物的笔式装置也描述于例如美国专利第6,277,099号；第6,200,296号和第6,146,361号中，所有美国专利中的每个专利的公开内容通过引用整体并入本文。基于微针的笔式装置描述于例如美国专利第7,556,615号中，所述美国专利的公开内容通过引用整体并入本文。还参见精密笔式注射器(PPI)装置，MOLLYTM，由斯堪的纳维亚健康有限公司(Scandinavian Health Ltd)制造。
在一些实施例中，本文所描述的组合物可以通过局部施用的方式治疗性地递送至受试者。如本文所用，“局部施用”或“局部递送”可以指不依赖于组合物或药剂通过血管系统传输到其预期靶组织或位点的递送。例如，可以通过注射或植入组合物或药剂或通过注射或植入含有组合物或药剂的装置来递送组合物。在某些实施例中，在靶组织或位点附近局部施用之后，组合物或药剂或其一种或多种组分可以扩散到不是施用位点的预期的靶组织或位点。
在一些实施例中，组合物可以被调配用于在低于0℃(例如，-20℃或-80℃)的温度下储存。在一些实施例中，组合物可以被配制成在2-8℃(例如，4℃)下储存至多2年(例如，一个月、二个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、10个月、11个月、1年、11/2年或2年)。因此，在一些实施例中，本文所描述的组合物在2-8℃(例如，4℃)下稳定储存至少1年。
在一些实施例中，药物组合物可以被调配为溶液。在一些实施例中，组合物可以被调配为例如浓度适于在2-8℃(例如，4℃)下储存的缓冲溶液。
包含一种或多种如本文所描述的抗体的组合物可以被调配成免疫脂质体组合物。此类调配物可以通过本领域已知的方法制备。具有增强的循环时间的脂质体公开于例如美国专利第5,013,556号中。
在某些实施例中，化合物可以用将保护化合物免于快速释放的载体来调配，所述载体如控释调配物，包含植入物和微胶囊化递送系统。可以使用可生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类调配物的许多方法通常是本领域已知的。参见例如，J.R.Robinson(1978)“持续和受控释放药物递送系统(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)”,纽约市马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.,New York)。
在一些实施例中，通过向受试者施用编码抗体的核酸来实现如本文所描述的抗体的施用。编码本文所描述的治疗性抗体的核酸可以被整合到基因构建体中，用作基因疗法方案的一部分，以递送可以用于在细胞内表达和产生抗体的核酸。此类组分的表达构建体可以在任何治疗有效载体中施用，例如，任何能够将组分基因有效递送至体内细胞的制剂或组合物。方法包含将受试者基因插入病毒载体，包含重组逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒-1(HSV-1)，或重组细菌或真核质粒。病毒载体可以直接转染细胞；质粒DNA可以借助于例如阳离子脂质体(脂质体)或衍生的聚赖氨酸缀合物、短杆菌肽S、人工病毒包膜或其它此类细胞内载体，以及基因构建体的直接注射或CaPO4沉淀来递送(参见例如，WO04/060407)。合适的逆转录病毒的实例包含本领域技术人员已知的pLJ、pZIP、pWE和pEM(参见例如，Eglitis等人(1985)《科学(Science)》230:1395-1398；Danos和Mulligan(1988)《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》85:6460-6464；Wilson等人(1988)《美国国家科学院院刊》85:3014-3018；Armentano等人(1990)《美国国家科学院院刊》87:6141-6145；Huber等人(1991)《美国国家科学院院刊》88:8039-8043；Ferry等人(1991)《美国国家科学院院刊》88:8377-8381；Chowdhury等人(1991)《科学》254:1802-1805；van Beusechem等人(1992)《美国国家科学院院刊》89:7640-7644；Kay等人(1992)《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》3:641-647；Dai等人(1992)《美国国家科学院院刊》89:10892-10895；Hwu等人(1993)《免疫学杂志(J Immunol)》150:4104-4115；美国专利第4,868,116号和第4,980,286号；以及PCT公开第WO89/07136号、第WO89/02468号、第WO89/05345号和第WO92/07573号)。另一种病毒基因递送系统利用腺病毒源性载体(参见例如，Berkner等人(1988)《生物技术(BioTechniques)》6:616；Rosenfeld等人(1991)《科学》252:431-434；以及Rosenfeld等人(1992)《细胞(Cell)》68:143-155)。源自腺病毒毒株Ad 5型dl324或其它腺病毒毒株(例如，Ad2、Ad3、Ad7等)的合适的腺病毒载体对本领域技术人员来说是已知的。又另一种用于递送受试者基因的病毒载体系统是腺相关病毒(AAV)。参见例如，Flotte等人(1992)《美国呼吸系统细胞和分子生物学杂志(Am J Respir Cell MolBiol)》7:349-356；Samulski等人(1989)《病毒学杂志(J Virol)》63:3822-3828；以及McLaughlin等人(1989)《病毒学杂志》62:1963-1973。
在一些实施例中，本文提供的组合物以单位剂型存在，所述单位剂型可以适于自我施用。此类单位剂型可以在容器，典型地例如小瓶、药筒、预填充注射器或一次性笔中提供。剂量仪，如美国专利第6,302,855号中描述的剂量仪装置也可以用于例如本文所描述的注射系统。
本文所描述的组合物的其剂量能够治疗或预防受试者的病症的合适的剂量可以取决于多种因素，所述因素包含例如要治疗的受试者的年龄、性别和重量以及所使用的特定抑制剂化合物。例如，与如本文所描述的抗体的不同调配物的剂量相比，可能需要不同剂量的包含所述抗体的一种组合物来治疗患有癌症(例如，AML)的受试者。影响施用于受试者的剂量的其它因素包含例如病症的类型或严重程度。其它因素可以包含例如同时或先前影响受试者的其它医学病症、受试者的总体健康状况、受试者的遗传倾向、饮食、施用时间、排泄率、药物组合以及施用于受试者的任何其它另外的治疗剂。还应当理解的是，针对任何特定受试者的具体剂量和治疗方案也可以基于治疗医疗从业者的判断来调整。
本文所描述的组合物可以以固定剂量或每千克毫克(mg/kg)剂量的形式施用。在一些实施例中，还可以选择剂量以减少或避免针对组合物中的一种或多种抗原结合分子的抗体或其它宿主免疫应答的产生。抗体如本文所描述的组合物的示例性剂量包含例如受试者体重的0.0001至100mg/kg、0.01至5mg/kg、1-1000mg/kg、1-100mg/kg、0.5-50mg/kg、0.1-100mg/kg、0.5-25mg/kg、1-20mg/kg和1-10mg/kg。例如，剂量可以为0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、3.0mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg或20mg/kg体重或处于1-20mg/kg体重的范围内。示例性治疗方案需要按以下施用：每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每三至6个月一次，或者在开始时施用间隔较短(如每周一次至每三周一次)，并且然后间隔较长时间(如每月一次至每三至6个月一次)。
药物溶液可以包含治疗有效量的本文所描述的组合物。此类有效量可以由本领域的普通技术人员部分地基于施用的组合物的或组合物与一种或多种另外的活性剂(如果使用了多于一种药剂)的组合效果来容易地确定。本文所描述的组合物的治疗有效量也可以根据以下因素而变化：如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及组合物(和一种或多种另外的活性剂)在个体中引发期望的应答(例如，至少一种状况参数的改善，例如癌症(例如，AML)的至少一种症状的改善)的能力。例如，治疗有效量的本文所描述的组合物可以抑制(减轻其严重程度或消除其发生)和/或预防特定病症，和/或本领域已知或本文所描述的特定病症的症状中的任何一种。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过组合物的任何毒性或有害作用的量。
本文所描述的任何组合物的合适的人剂量可以在例如I期剂量递增研究中进一步评估。参见例如，van Gurp等人《美国移植杂志(Am J Transplantation)》(2008)8(8):1711-1718；Hanouska等人《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》(2007)13(2,第1部分):523-531；以及Hetherington等人《抗菌剂与化学疗法(Antimicrobial Agents andChemotherapy)》(2006)50(10):3499-3500。
可以通过已知药物程序来确定组合物在细胞培养物或实验动物(例如，本文所描述的癌症中的任何癌症的动物模型)中的毒性和治疗功效。这些程序可以用于例如确定LD50(对50％人群致死的剂量)和ED50(对50％人群治疗有效的剂量)。在毒性作用和治疗作用之间的剂量比为治疗指数，并且其可以表示为比率LD50/ED50。表现出高治疗指数的本文所描述的组合物是优选的。尽管可以使用展示出毒副作用的组合物，但应当注意设计一种将此类化合物靶向到受影响的组织的部位，并且用于最小化对正常细胞的潜在损伤并且由此减少副作用的递送系统。
本领域技术人员将理解，从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于调配用于在人类中使用的一系列剂量。本文所描述的组合物的适当剂量通常位于组合物的循环浓度范围内，所述循环浓度包含几乎没有或没有毒性的ED50。剂量可以根据所使用的剂型和所使用的施用途径在此范围内变化。对于本文所描述的组合物，治疗有效的剂量可以最初根据细胞培养测定估计。可以将动物模型中的剂量调配为实现包含如在细胞培养中确定的IC50(即，实现症状的半数最大抑制的抗体的浓度)的循环血浆浓度范围。可以使用这种信息来更精确地确定人体中的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱法来测量血浆中的水平。在一些实施例中，例如在期望局部施用(例如，对眼睛或关节)的情况下，可以使用细胞培养或动物模型来确定在局部部位内实现治疗有效浓度所需的剂量。
NFAT应答性报告系统
本公开的各方面涉及核酸构建体，所述核酸构建体包括激活T细胞的最小核因子(NFAT)应答性启动子，所述NFAT应答性启动子可以用于例如评估嵌合抗原受体(CAR)的活性和表达包括本文所描述的任何抗CD3抗体的CAR的细胞(例如，T细胞)的激活。CAR激活启动细胞内通路，产生T细胞激活和T细胞的效应子功能，其涉及NFAT信号传导和基因表达(参见例如，Hogan,《细胞钙(Cell Calcium.)》(2017)63:66–9)。如本文所用，术语“NFAT应答性启动子”是指被NFAT信号传导激活并在激活时促进与NFAT应答性启动子可操作连接的基因表达的启动子区。在一些实施例中，与NFAT应答性启动子可操作连接(在其控制下)的基因编码报告分子。
激活T细胞核因子(NFAT)是涉及调节免疫应答，包含调节白介素-2(IL-2表达)以及T细胞分化和自身耐受的转录因子家族，包含NFAT1-NFAT-5。参见例如，Macian《自然免疫学综述(Nat.Rev.Immunol.)》(2005)5:472-484。NFAT转录因子包括两种组分：细胞质Rel结构域蛋白(NFAT家族成员)和包括各种转录因子的核组分(Chow,《分子与细胞生物学(Molecular and Cellular Biology)》,1999；19(3):2300-7)。NFAT1和NFAT2主要在产生IL-2的外周T细胞中表达，并且NFAT结合位点通常位于NFAT调节基因如IL-2的上游(5')。参见例如，Chow,《分子与细胞生物学》,(1999)19(3):2300-7；Rooney等人,《分子与细胞生物学》,(1995)15(11):6299-310；以及Shaw等人,《免疫学杂志(Journal of Immunology)》,(2010)185(9):4972-5，所述分析的全部内容通过引用并入本文。
如本领域普通技术人员所理解的，在真核细胞中，与基因可操作连接的启动子通常包含邻近基因(编码序列)的转录起始位点的核心启动子和所述转录起始位点的5'。核心启动子的更上游(5')可以是顺式调节区，如转录因子结合位点。
在一些实施例中，NFAT应答性启动子包括多个NFAT结合位点。在一些实施例中，NFAT应答性启动子包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个NFAT结合位点。在一些实施例中，NFAT应答性启动子包括六个NFAT结合位点。在一些实施例中，NFAT应答性启动子的NFAT结合位点中的每一个可以是相同的NFAT结合位点(例如，结合相同类型的NFAT转录因子)或者是不同的NFAT结合位点(例如，结合不同类型的NFAT转录因子)。在一些实施例中，NFAT结合位点中的每一个均包括相同的核苷酸序列。在一些实施例中，NFAT结合位点包括不同的核苷酸序列。
NFAT结合位点的实例由SEQ ID NO:94：
5'-GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT-3'(SEQ ID NO:94)提供的核苷酸序列提供。
在一些实施例中，NFAT结合位点中的至少一个包括SEQ ID NO:94的核苷酸序列。在一些实施例中，NFAT结合位点中的每一个包括SEQ ID NO:94的核苷酸序列。
NFAT结合位点中的每一个被定位成彼此紧邻(例如，串联，在NFAT结合位点之间没有任何另外的核苷酸)。可替代地，一个或多个另外的核苷酸可以存在于两个或更多个NFAT结合位点之间。
在一些实施例中，NFAT应答性启动子包括IL-2启动子或其部分。在一些实施例中，NFAT应答性启动子包括最小IL-2启动子。在一些实施例中，NFAT应答性启动子包括核心IL-2启动子。通常，天然存在的IL-2启动子相对紧凑，并且包含含有TATA框的核心启动子和上游调控区。核心启动子被视为是转录起始位点大约-40和+40个核苷酸(例如，上游(5')40个核苷酸至下游(3')40个核苷酸)内的区域。参见例如，Weaver等人《分子免疫学(Mol.Immunol.)》(2007)44(11)2813-2819。
如本文所用，术语“最小IL-2启动子”是指转录所需的IL-2启动子的最小部分。在一些实施例中，最小IL-2启动子是IL-2核心启动子。在一些实施例中，NFAT应答性启动子包括包含TATA框的核心IL-2启动子。TATA框(也被称为“戈德堡-霍格内斯框(Goldberg-Hogness box)”)是在转录起始位点上游发现的富含T/A的序列(Shi和Zhou,《BMC生物信息学(BMC Bioinformatics)》(2006)7,文章编号S2)。在一些实施例中，TATA框包括共有序列5'-TATA(A/T)A(A/T)-3'。TATA框被认为涉及基因转录的起始前复合物的形成，并且结合TATA结合蛋白(TBP)。
在一些实施例中，最小IL-2启动子可以包括SEQ ID NO:95的核苷酸序列。
最小IL-2启动子的实例由SEQ ID NO:95：
5'-TAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGAATTCCA-3'(SEQ ID NO:95)提供的核苷酸序列提供。
在一些实施例中，NFAT结合位点定位于最小IL-2启动子的5'(上游)。在一些实施例中，NFAT结合位点定位于最小IL-2启动子5'(上游)的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49、50个或更多个核苷酸处。在一些实施例中，NFAT应答性启动子在最后一个NFAT结合位点与最小IL-2启动子之间包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个或更多个核苷酸。
最小NFAT应答性启动子的示例性核苷酸序列由SEQ ID NO:96提供。在一些实施例中，最小NFAT应答性启动子的核苷酸序列包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQID NO:96的核苷酸序列或与SEQ ID NO:96的核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。
包括6个NFAT结合位点的最小NFAT应答性启动子的示例性核苷酸序列(SEQ IDNO:96)：
5'-GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGATCTAGACTTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGAATTCCA-3'(SEQ ID NO:96)。
本文所描述的编码IL-2报告系统的任何核酸构建体可以进一步包括编码与组成型启动子(也被称为组成型活性启动子)可操作地连接(在其控制下)的第二报告分子的核苷酸序列。优选地，与最小NFAT应答性启动子可操作地连接的报告分子不同于与组成型活性启动子可操作地连接的第二报告分子，使得与最小NFAT应答性启动子可操作地连接的报告分子的检测指示NFAT应答性启动子的活性，并且与组成型活性启动子可操作地连接的报告分子的检测指示组成型活性启动子的活性。
在一些实施例中，控制第二报告分子表达的组成型启动子被称为“参考启动子”。组成型活性启动子的实例包含但不限于EF-1α(EF1a)、CMV启动子、SV40启动子、PGK1启动子、Ubc启动子、β肌动蛋白启动子、CAG启动子、TRE启动子、UAS启动子、Ac5启动子、多角体蛋白启动子和U6启动子。在一些实施例中，组成型活性启动子是EF1a启动子。
延伸因子1α(EF-1α)启动子的核苷酸序列由SEQ ID NO:97的核苷酸序列提供。
EF1α启动子(SEQ ID NO:97)
GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGATCCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA
本文所描述的核酸构建体包括与最小NFAT应答性启动子可操作地连接(在其控制下)的报告分子。在一些实施例中，核酸构建体包括与组成型活性启动子可操作地连接(在其控制下)的第二报告分子。任何合适的报告分子都可以用于本文所描述的核酸构建体。优选地，报告分子(报告蛋白)在表达时易于检测(直接或间接)。在一些实施例中，报告分子可以被称为可筛选标志物。报告分子的实例包含但不限于酶，如β-葡萄糖醛酸酶、α-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶和酪氨酸酶；荧光素酶；荧光标志物/蛋白质。荧光蛋白包含但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、EBFP、青色荧光蛋白、ECFP、EG荧光蛋白、黄色荧光蛋白、mWasabi、ZsGreen、黄色荧光蛋白(YFP)、ZsYellow、mHoneydew、mApple、mRuby、mBanana、mOrange、mCherry、mCerulean、mTurquoise、mTangerine、mStrawberry、mGrape、mRaspberry和mPlum。对合适的报告分子如荧光蛋白的选择取决于各因素，如用于检测和/或定量报告分子的方式。
本文所描述的核酸构建体包括与最小NFAT应答性启动子可操作地连接(在其控制下)的报告分子。在一些实施例中，核酸构建体包括与组成型活性启动子可操作地连接(在其控制下)的第二报告分子。任何合适的报告分子都可以用于本文所描述的核酸构建体。优选地，报告分子(报告蛋白)在表达时易于检测(直接或间接)。在一些实施例中，报告分子可以被称为可筛选标志物。报告分子的实例包含但不限于酶，如β-葡萄糖醛酸酶、α-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶和酪氨酸酶；荧光素酶；荧光标志物/蛋白质。荧光蛋白包含但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、EBFP、青色荧光蛋白、ECFP、EG荧光蛋白、黄色荧光蛋白、mWasabi、ZsGreen、黄色荧光蛋白(YFP)、ZsYellow、mHoneydew、mApple、mRuby、mBanana、mOrange、mCherry、mCerulean、mTurquoise、mTanerine、mStrawberry、mGrape、mRaspberry和mPlum。对合适的报告分子如荧光蛋白的选择取决于各因素，如用于检测和/或定量报告分子的方式。
在一些实施例中，报告分子是荧光蛋白。在一些实施例中，与NFAT应答性启动子可操作连接的报告分子是荧光蛋白。在一些实施例中，荧光蛋白是mTurquoise或mOrange。
编码mTurquoise的核苷酸序列由SEQ ID NO:98提供。
mTurquoise(SEQ ID NO:98)
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGTCCTGGGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACTTTAGCGACAACGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCAAGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
编码mOrange的核苷酸序列由SEQ ID NO:99提供。
mOrange(SEQ ID NO:99)
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGAATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGC
TTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGC
GAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCTTTCAGACCGCTAAGCTGAAGGTGACC
AAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCATTTCACCTAC
GGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTCAAGCTG
TCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTACGAGGACGGCGGC
GTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAG
GTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTGATGCAGAAGAAG
ACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGTGCCCTG
AAGGGCAAGATCAAGATGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACACCTCC
GAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTAC
ATCGTCGACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTG
GAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTG
TACAAG
通用技术
除非另有指示，否则本公开的实践将采用在本领域技术范围内的常规分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术。此类技术在如以下等文献中进行了充分解释：《分子克隆：实验室手册》,第二版(Sambrook等人,1989)冷泉港出版社；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait,编辑1984)；《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,胡马纳出版社(Humana Press)；《细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:A Laboratory Notebook)》(J.E.Cellis,编辑,1989)学术出版社(Academic Press)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney,编辑,1987)；《细胞和组织培养导论(Introduction to Cell and Tissue Culture)》(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998),普莱南出版社(Plenum Press)；《细胞和组织培养：实验室程序(Celland Tissue Culture:Laboratory Procedures)》(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,1993-8)约翰·威利父子出版公司(J.Wiley and Sons)；《酶学方法(Methods inEnzymology)》(学术出版社公司)：《实验免疫学手册(Handbook of experimentalimmunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)：《哺乳动物细胞基因转移载体(GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos,编辑,1987；《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人,编辑1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人,编辑1994)；《当代免疫学指南(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人,编辑,1991)；《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》(约翰威利父子出版公司,1999)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；《抗体(Antibodies)》(P.Finch,1997)；《抗体：实用方法(Antibodies:a practicalapproach)》(D.Catty.,编辑,IRL出版社,1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonalantibodies:a practical approach)》(P.Shepherd和C.Dean,编辑,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)；《使用抗体：实验室手册(Using antibodies:alaboratory manual)》(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社,1999)；《抗体》(M.Zanetti和J.D.Capra,编辑哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers),1995)；《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A practical Approach),第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1985)；《转录和翻译(Transcription and Translation)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑,(1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编辑,(1986)；《固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)》(IRL出版社,(1986)；以及B.Perbal,《分子克隆实用性指南(A practical Guide To Molecular Cloning)》(1984)；F.M.Ausubel等人(编辑)。
无需进一步阐述，据信，基于以上描述，本领域技术人员可以最大程度地利用本公开。因此，以下具体实施例应被解释为仅是说明性的并且不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文所提及的目的或主题，本文所引用的所有出版物均通过引用并入。
本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考通过引用整体并入本文。另外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不意在是限制性的。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管类似或等效于本文所描述的方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试本发明，但本文描述了合适的方法和材料。
在以下实例中对本公开进一步进行了说明。实例仅出于说明目的提供。所述实例不应被解释为以任何方式限制本公开的范围或内容。
实例
实例1.针对CD33生成新型抗体
淘选并筛选原初美洲驼噬菌体文库，以鉴定特异性识别CD33的单结构域抗体。表达CD33的MOLM-13细胞系用作CD33阳性细胞系，并且含有CD33敲除的MOLM-13细胞系用作CD-33阴性细胞系。纯化的抗人CD33抗体用作阳性对照。通过FACS证实了经鉴定的结合物的特异性结合活性。本文包含了经鉴定的结合物的重链可变区序列。
实例2.CAR构建体的生成和评估
CAR构建体
CAR构建体是用本文所描述的CD33特异性单结构域抗体片段(sdAb)开发的。CAR构建体包括与CD8a或CD28跨膜结构域连接，与4-1BB或CD28共刺激结构域以及CD3ζ(CD3zeta)信号传导结构域配对的sdAb。CAR序列被克隆到第三代慢病毒质粒中。
细胞系
含有不同水平的CD33表达和外显子2剪接变异的不同基因型的表达GFP和荧光素酶的AML细胞系MV411、THP1和MOLM14(Laszlo等人，《肿瘤靶标(Oncotarget)》,7:43281-94(2016))用于测试上文所描述的CAR构建体的功效。MV411是从患有急性单核细胞白血病(AML FAB M5)的10岁男孩建立的急性单核细胞白血病细胞系。THP-1是来自急性单核细胞白血病患者的人类单核细胞系。MOLM14是一种急性髓系白血病细胞系，建立自一名20岁患有在1995年初次骨髓增生异常综合征(MDS，原始细胞过多的难治性贫血，RAEB)之后复发的急性髓系白血病(AML FAB M5a)的患者的外周血。通过DNA分离，发现MOLM14具有CC基因型并且不含SNP，而TE1P1和MV411对于具有CT基因型的SNP都是杂合的(Lamba等人,《临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)》,35:2674-82(2017))。此细胞系既不表达CD33也不表达CD123。K562是从一名53岁女性慢性髓细胞性白血病患者建立和衍生的人红白血病细胞系。
CAR T细胞生成
编码CD33 CAR的慢病毒载体通过瞬时转染Lenti-X 293T lenti包装细胞系Lenti-X 293T细胞产生，并且铺板在聚-D赖氨酸包被的15cm板中(美国加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司(BD Biosciences,San Jose,CA,USA))。第二天，使用脂质体转染3000(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA))用编码CAR的质粒以及包装载体和包膜载体(pMDLg/pRRE、pMD-2G和pRSV-Rev)转染Lenti-X 293T细胞。在转染后24小时和48小时采集慢病毒上清液，以3000RPM离心10分钟以去除细胞碎片，并在干冰上冷冻和在-80℃下储存。来自正常供体的人PBMC通过NIH批准的方案获得，并且在含有40IU/mL重组IL-2和5％ FBS的AIM-V培养基中用1:3比率的CD3/CD28微珠(Dynabeads人T扩增器CD3/CD28，赛默飞世尔科技公司，目录号11141D)激活持续24小时。将激活T细胞以每2mL慢病毒上清液加1mL含有10mcg/mL硫酸鱼精蛋白和100IU/mLIL-2的新鲜AIM-V培养基的200万个细胞重悬于6孔板中。将板在32℃下以1000x g离心2小时，并在37℃下温育过夜。通过重复上文所描述的相同的转导程序，在第二天进行第二次转导。在转导后的第三天取出CD3/CD28珠，并将细胞在含有100IU/mL IL2的AIM-V中以300,000个细胞/mL培养，同时每2-3天添加含新鲜IL2的培养基，直到第8或9天采集。
流式细胞术
CD33 CAR转导的T细胞的表面表达使用蛋白-L(赛默飞世尔公司)或生物素化的人Siglec-3/CD33蛋白(美国特拉华州纽华克的百普赛斯生物科技公司(Aero Biosystems,Newark))通过流式细胞术，随后与链霉亲和素-PE(美国加利福尼亚州圣地亚哥的百进生物公司(BioLegend,San Diego,CA,USA))一起温育来确定。
PDX
在过继性CAR T细胞移植前一周，将100万个PDX白血病细胞系JMM117细胞注射到NSG小鼠体内。在第0天用CAR T细胞处理小鼠。两周后，取下小鼠并进行分析。
细胞毒性测定
将100μl RPMI培养基中的5E4个靶肿瘤细胞装载到96孔板((纽约康宁公司(Croning,NY))BioCoatTM聚-L-赖氨酸96孔透明TC处理的平底测定板)中。第二天，将等量的CAR T细胞添加到指定的孔中。将最初的砧细胞凋亡标志物(美国密歇根州安阿伯市的Essen生物科学公司(Essen BioScience,Ann Arbor,MI,USA))稀释在100μL PBS中，并将1μL稀释剂加入每个孔中。在40小时的持续时间内，每30分钟使用IncuCyte/>系统扫描板的GFP和/或RFP荧光表达，以监测细胞凋亡。每个时间点的细胞杀伤百分比是基线校正的。
细胞因子产生的分析
将靶肿瘤细胞和转导的CAR阳性T细胞用1XPBS洗涤3次，并以lE6/mL重悬于RPMI中。将l00μL具有l00μL CAR阳性T细胞的肿瘤细胞装载到96孔板的每个孔中。设置仅T细胞和仅肿瘤细胞对照。所有测试都是一式两份或三份进行。细胞在37℃下温育18小时，并且收集120μL培养物上清液用于检测细胞因子产生。上清液中的细胞因子水平用ELISA试剂盒(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司(R&D Systems,Minneapolis,MN)，EISA)或多重测定(马里兰州罗克维尔的中尺度发现公司(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)，EISA)进行测量。
生物能量学分析
对于糖酵解应激测试，将CAR-T细胞悬浮于补充有L-谷氨酰胺(200mM)和NaCl(143mM)的无血清无缓冲DMEM培养基(美国密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA))中。添加0.6mL 0.5％酚红溶液(SigmaP0290)，使最终浓度为3mg/L，并将pH调整至7.35+/-0.05。将CAR-T细胞铺板在海马细胞板上(每孔3E5个细胞)，用Cell-Tak(康宁公司)包被以促进T细胞附着。简言之，测定前一天对盒进行水合处理。在测定当天，将板用Cell-Tak包被，并且将细胞接种在Cell-Tak包被的板上，并且置于XF24分析仪上进行分析。详细的程序如下。
测定盒最初用200μL/孔的XF校准剂溶液水合，添加液压加力器，并包裹在石蜡膜中，并且将传感器盒放置在实用板的顶部，并在37℃无CO2下温育过夜。然后如下将细胞培养板用Cell-Tak包被：对于1个板，将46mL Cell-Tak稀释在204mL TC水和1mL NaHCO3中。将混合器在每个孔中分配50mL，并且将平板在室温下温育至少20分钟。取出Cell-Tak溶液之后，使用250mL TC水洗涤每个孔。将CAR-T细胞(3E5/孔)铺板在158mL测定培养基中。然后将细胞培养板以450rpm缓慢加速但不减速旋转1秒，并且然后将板的朝向逆转，并以650rpm缓慢加速但不减速旋转1秒。然后将板在37℃0％ C02下培养25-30分钟。
在25-30分钟温育之后，使用手动P200移液器将158μL温热的测定培养基缓慢且轻柔地添加到每个孔的沿着壁的侧面的顶部。将细胞板温育15-25分钟。在15-25分钟之后，将板放置在XF24分析仪上(校准完成之后)。然后进行XF测定。通过三个端口顺序注射溶液：端口A：葡萄糖80mM(3mL测定培养基中的96mL储备溶液)。端口B：寡霉素18mM(3mL测定培养基中的10.8mL储备溶液)。端口C：2DG使用储备溶液。在盒端口装载有75mL药物溶液之后，通过测量稳定状态下的ECAR(迈/分钟)进行糖酵解应激测试。
对于线粒体应激测试，将CAR T细胞悬浮在含有D-葡萄糖(25mM)和丙酮酸钠(1mM)的无血清无缓冲DMEM培养基中。线粒体应激测试与上文类似地进行，通过在稳态下和在顺序注射寡霉素(0.5mM)、FCCP(0.5mM)、鱼藤酮(1mM)和抗霉素A(1mM)(西格玛奥德里奇公司)之后测量OCR(皮摩尔/分钟)。用海马系统进行的实验利用了以下测定条件：2分钟混合；2分钟等待；以及3分钟测量。所有样品重复测试六次。
荧光显微术成像和分析
将MOLM14(4x10s)肿瘤细胞铺板在1mL温RPMI中，置于ibidi m-Dish 35mm的Cell-tak包被的内孔上，并在37℃培养箱中温育过夜。然后用Hoechst染料(2.5μg/mL)对肿瘤细胞进行染色。T细胞被转导以表达CAR-mCherry融合蛋白。分选CAR-T阳性细胞，并且然后将7.5E5这些CAR-T细胞与固定的MOLM14细胞在培养皿中温育一小时。随后将细胞洗涤并用新鲜制备的4％多聚甲醛固定，并固定在非硬化固定培养基中以准备成像。
为了评估免疫突触处肌动蛋白的表达，修改了上述方案，在多聚甲醛固定之后，将样品用0.1％triton x透化。将细胞用鬼笔环肽640(165nM)染色，并且然后在安装前洗涤。空气扫描图像是使用蔡司LSM 880获得的。整个实验的曝光设置是相同的。图像被收集为z堆叠，以覆盖免疫突触的整个体积。
使用具有63倍物镜的Nikon Eclipse Ti2旋转圆盘共焦显微镜获取图像。对于三个通道(405nm、488nm、640nm)，在焦平面上方和下方10μM的范围内并行获取0.5μM厚度的z叠堆。每个通道以50％的激光强度激发，分别地405的曝光时间为300毫秒、488的曝光时间为1秒并且640的曝光时间为300毫秒。ImageJ软件用于数据分析。
对每个CAR的n>10个免疫突触进行定量分析，以评估CAR和肌动蛋白积聚。具体地，确定突触处的平均荧光强度(MFI)的比率与T细胞表面其余部分的MFI的比率。另外的参数包含IS处的MFP体积与T细胞表面其余部分的MFI*体积的比率，IS的MF体积与T细胞的MFI*体积的比率，还评估了细胞内CAR信号与细胞外CAR信号的比率。对于肌动蛋白，IS处的荧光强度相对于基线肌动蛋白T细胞表达进行归一化。确定IS处肌动蛋白的MFP体积，并且减去未接合的T细胞和肿瘤细胞的MFI*体积，以说明基线肌动蛋白表达。
体内实验
动物实验是在动物护理和使用委员会(Animal Care and Use Committee)批准的方案下进行的。将AML细胞系和异种移植的人AML样本IV注射到NSG小鼠中。对于荧光素酶表达细胞系，使用异种IVIS Lumina(美国马萨诸塞州霍普金顿的凯利普生命科学公司(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA,USA))检测白血病。将NSG用3mg D-荧光素(凯利普生命科学公司)腹膜内注射，并且4分钟后对其AML细胞系进行成像，曝光时间为1分钟。使用Living Image 4.1版软件(凯利普生命科学公司)分析每只小鼠的总生物发光信号通量(以光子为单位)。在取下时，采集小鼠的骨髓、脾和肝，通过流式细胞术进行评估。
统计学分析
使用Prism 7.0软件执行统计学分析。图呈现为平均值+/-SD。使用不成对的学生t检验计算所有数据的统计学显著性。p<0.05被认为是显著的。
实例3：CAR构建体的表位作图和评估
了解抗CD33 CAR构建体所结合的CD33表位可以改进抗CD33 CAR构建体设计和治疗应用，例如，能够使用靶向CD33且彼此不干扰的抗CD33结合结构域的组合。进行Red 96测定以评估抗CD33单结构域抗体片段(sdAb)，并确定给定的两个抗CD33 sdAb是否竞争CD33分子上的相同结合位点。
生物素化的CD33蛋白被链霉亲和素(SA)传感器捕获，并且第一sdAb与CD33结合(图1)。然后检查第二抗体的结合。第一sdAb与CD33的结合诱导了光信号的变化，并且吸收的变化反映为曲线，并且第二抗体的添加可以或不可以诱导类似的曲线。当添加第二抗体时，信号没有增加，表明第二种抗体与第一抗体竞争相同的结合位点。当添加第二抗体时，信号增加，表明两种抗体之间没有竞争。
使用相互竞争结合的Octet生物素化CD33 SA传感器(图2和3)和对照抗CD33抗体hu195，测试了本公开的十种示例性抗CD33 sdAb。在数据的热图表示中，第二抗体结合的信号(并且因此缺乏竞争)用绿色表示，第二抗体结合的信号缺乏(并且因此第一抗体与第二抗体之间结合的竞争)用黄色和红色表示。来自图3的数据在表1中提供。
表1.来自图3的数字数据
结果表明，测试的sdab可以分为与CD33的相同或重叠表位结合的竞争组：组1(sdAb 389和430)、组2(sdAb 353、413和420)和组3(sdAb348、416、424和426)。
对接CD33和模型抗体的计算机建模实验用于预测CD33上抗CD33sdAb CDR附近的氨基酸残基。选择距离CDR内的CD33氨基酸进行诱变。残基被突变成丙氨酸，或者变成相反的电荷，或者变成极性或疏水性残基，或者反之亦然(图4)。将突变CD33-GFP构建体瞬时转染到293FT细胞中，并且转染后大约48小时，将293FT细胞与抗CD33 sdAb一起温育。FACS用于检测sdAb与突变CD33-GFP构建体的结合。参见图5中的示例FACS数据，显示出活W22ACD33 293FT细胞(P1，左上)、单重态非双细胞(中上)、GFP阳性细胞(右上)，以及最终结合sdAb 348(左下)和hu195(右下)的CD33突变体的细胞门控。表2列出了测试的CD33突变体和测试的10个sdAb的数据；hu195用作对照。‘AEAD’是一种四重突变体CD33，它不与sdAb结合或在293FT上不表达。
表2：sdAb FACS结合数据第1部分
表2：sdAb FACS结合数据第2部分
表2：sdAb FACS结合数据第3部分
表2：sdAb FACS结合数据第4部分
表2：sdAb FACS结合数据第5部分
图6以热图的形式示出了表2中的sdAb结合数据。如果sdAb失去了与CD33点突变体的结合，那么该残基被确定为对结合是重要的/关键的。在一些实施例中，多个残基形成表位，并且因此多于一个残基对于sdAb结合可能是关键的。
图7和8示出了CD33的结构模型，突出显示了被确定为对所指示的抗CD33 sdAb的结合很重要的氨基酸。表3总结了氨基酸位点数据。
表3：sdAb CD33结合位点汇总
抗体 氨基酸
348 W22、H45、Y49、Y50、R98、R122
353 Y49、Y50、L78
389 K52、L78、R98、R122
420 Y49、Y50、K52、R98
413 N20、H45、Y49、Y50
416 W22
424 Y49、Y50、N99
426 Y49、Y50、L78
429 H45、Y49、Y50、K52、R122
430 Y59、Y50、L78
实例4：建立T细胞激活报告系统
示例性核酸构建体被设计成编码与最小NFAT应答性启动子可操作地连接的报告分子和与组成型启动子(例如，EF1a)可操作地连接的第二报告分子。最小NFAT应答性启动子在包括TATA框和报告分子的编码序列的最小IL-2启动子上游含有6个NFAT结合位点。使用本领域已知的常规方法产生核酸。
第一核酸构建体(EF1a_mOrange_IL-2_mTurq)含有在组成型活性E1Fα启动子控制下的mOrange报告分子和在最小NFAT应答性启动子控制下的mTurquoise报告分子(mTurq)。第二核酸构建体(EF1a_mTurq_IL-2_mOrange)含有在组成型活性E1Fα启动子控制下的mTurquoise报告分子和在最小NFAT应答性启动子控制下的mOrange报告分子。
通过将慢病毒载体转导到Jurkat细胞中，产生了两种IL-2报告细胞系。将1×106个细胞/mL使用2μL佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)和离子霉素(T细胞激活混合物(参见例如，百进生物公司激活混合物))激活，持续24小时，并且使用流式细胞术评估每种报告分子以及CD69(T细胞激活的指标)的表达。如图9A和9B所示，当细胞未被激活时，在最小NFAT应答性启动子控制下的报告分子的表达被最低限度地检测到，当细胞被PMA/离子霉素激活时，所述表达显著增加。相比之下，在存在和不存在细胞激活的情况下，检测到了在EF1a(组成型启动子)控制下的报告分子的表达。在最小NFAT应答性启动子控制下的报告分子的表达被相对于在EF1a(组成型启动子)控制下的报告分子的表达归一化。参见图9C。
这些结果表明，当被激活时，最小NFAT应答性启动子诱导报告分子的表达。相对于在EF1a(组成型启动子)控制下的报告分子的表达，在最小NFAT应答性启动子控制下的报告分子的表达提供了一种使表达归一化以说明如构建体之间任何不同的转导效率等各种因素的方法。
实例5：使用报告系统评估CAR构建体
如实例2所描述，CAR构建体被设计为靶向CD33。CD33，也被称为Siglec(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素)，在介导细胞-细胞相互作用和维持免疫细胞处于静止状态中发挥作用。CD33在绝大多数AML母细胞和急变期慢性髓性白血病的表面上表达。它也在T细胞急性淋巴细胞白血病的亚群上异常表达。正常组织表达仅限于正常骨髓细胞。目前，用靶向CD33的疗法治疗AML可能是有效的，但是由于对正常血液和骨髓的毒性，所述疗法的实用性可能受到限制。本文所描述的方法允许比较CAR构建体，如CAR构建体的活性和功能，以及用于鉴定具有期望性质(例如，T细胞激活水平)的CAR构建体的高通量筛选方法。示例CAR构建体是本领域已知的。参加例如，PCT公开第WO 2019/178382 A1号以及Kenderian等人,《白血病(Leukemia)》(2015)29:1637-1647。
含有示例性核酸构建体EF1a_mOrange_IL-2_mTurq或EF1a_mTurq_IL-2_mOrange的报告细胞如实例2中所描述的生成。用表1和5中所示的8种不同的CD33 CAR转导细胞。将细胞与野生型MOLM-13细胞(CD33+)或CD33缺陷的MOLM-13细胞(MOLM-13CD33KO)共培养24小时。
共培养后，通过流式细胞术评估报告分子的表达。在显示与EF1a启动子连接的荧光标志物的Jurkat细胞上对细胞进行预门控，这表明细胞用核酸构建体转导并且能够表达所述构建体。接下来，在每个CD33 CAR构建体的每个共培养物中确定IL2连接的荧光报告基因的表达，作为组成型荧光阳性细胞的百分比(例如，在用EF1a_mOrange_IL-2_mTurq转导的细胞中，mTurq的表达作为mOrange阳性细胞的百分比)。确定在存在野生型MOLM-13细胞的情况下共培养时NFAT诱导型报告基因的表达相对于在存在MOLM-13CD33KO细胞的情况下共培养时NFAT诱导型报告基因的表达的比率，以确定CD33 CAR的活性(CD33特异性激活)。参见表4。
结果表明IL-2报告系统细胞可以用作用于比较CAR构建体活性的客观可靠的报告系统。评估组成型表达的报告分子的表达消除了可能由于转导效率改变而导致的错误结果，并且验证了报告构建体的成功转导。仅在激活细胞中驱动的报告分子的表达表示CAR构建体的抗原识别和活性。
表4：表1抗CD33-CAR的T细胞激活结果
结果表明，包括本公开的抗CD33抗体的抗CD33 CAR(CD33 CAR 5-8)显示出比至少一种先前已知的抗CD33 CAR更高的T细胞激活活性。在所有测试的抗CD33 CAR中，抗CD33-CAR5显示出最高的T细胞激活活性。这些结果证明了本公开的抗CD33 CAR在构建靶向表达CD33的癌症的CART治疗中的潜力。
通过检查NFAT诱导型荧光的增加倍数(图10，表5中的数据)、NFAT诱导型荧光的绝对变化(ΔFP2)(图11)和转导的Jurkat细胞表达CD33 CAR的程度(表4)，进一步评估了8种CD33 CAR激活T细胞的程度。作为对照，将编码已知共刺激物或共抑制剂(OX40、ICOS、TIM3或针对CD28的VH/VL)的慢病毒载体转导至预先用EF1a_mOrange_IL-2_mTurq或EF1a_mTurq_IL-2_mOrange构建体转导的Jurkat细胞中。
表5：测试的CAR中FP2的倍数和Δ增加
图10和11中的结果表明使用本公开的抗CD33抗体或其片段生成的CAR在CAR-IRS测定中不同程度地显示了T细胞激活活性。例如，抗CD33-CAR5显示出高的FP2增加倍数(图10)，表明比其它测试的CAR具有更高的T细胞激活活性。
示例性序列
抗CD33单结构域抗体序列
如本文所用，被称为sdCD33_2的抗体也可以被称为“348”或“sdAb348”。被称为sdCD33_3的抗体也可以被称为“353”或“sdAb353”。被称为sdCD33_4的抗体也可以被称为“389”或“sdAb389”。被称为sdCD33_5的抗体也可以被称为“413”或“sdAb413”。被称为sdCD33_6的抗体也可以被称为“416”或“sdAb416”。被称为sdCD33_7的抗体也可以被称为“420”或“sdAb420”。被称为sdCD33_8的抗体也可以被称为“424”或“sdAb424”。被称为sdCD33_9的抗体也可以被称为“426”或“sdAb426”。被称为sdCD33_10的抗体也可以被称为“429”或“sdAb429”。被称为sdCD33_11的抗体也可以被称为“430”或“sdAb430”。
重链可变区序列
sdCD33_1
sdCD33_2
sdCD33_3
sdCD33_4
sdCD33_5
sdCD33_6
sdCD33 7
sdCD33_8
sdCD33_9
sdCD33_10
sdCD33_11
表4.实例3中测试的sdAb和其中包含的示例性序列
示例性序列名称 实例3的sdAb
sdCD33_1 Hu195
sdCD33_2 348
sdCD33_3 353
sdCD33_4 389
sdCD33_5 413
sdCD33_6 416
sdCD33_7 420
sdCD33_8 424
sdCD33_9 426
sdCD33_10 429
sdCD33_11 430
等效形式
应当理解，虽然已经结合本发明的具体描述对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。
序列表
<110> VOR生物制药股份有限公司
<120> 针对CD33的单结构域抗体
<130> V0291.70030WO00
<140> 尚未指定
<141> 与此同时
<150> US 63/078,134
<151> 2020-09-14
<160> 111
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Leu Arg Arg Tyr
20 25 30
Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Leu Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Phe Thr Trp Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Leu Ser Arg Gln Val Ser Leu Gly Pro Gly Pro Pro Asn Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
Gly Arg Thr Leu Arg Arg Tyr Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
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1 5
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Gly Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
Ala Leu Ser Arg Gln Val Ser Leu Gly Pro Gly Pro Pro Asn Phe Asp
1 5 10 15
Tyr
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Phe Cys Val
1 5 10 15
Ala Ser Glu Glu Phe Phe Ser Ile Tyr Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln
20 25 30
Ala Pro Gly Lys Gln His Glu Met Val Ala Arg Phe Thr Arg Asp Gly
35 40 45
Lys Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg
50 55 60
Asp Ala Lys Asn Thr Leu Asn Leu Gln Met Asn Gly Leu Ile Pro Glu
65 70 75 80
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Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Phe Cys Val
1 5 10 15
Ala Ser
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
Glu Glu Phe Phe Ser Ile Tyr Ala
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 12
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln His Glu Met Val Ala
1 5 10 15
Arg
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<220>
<223> 合成
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成
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Thr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Ala
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Lys Asn Thr Leu Asn Leu Gln Met Asn Gly Leu Ile Pro Glu Asp Thr
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Ala Val Tyr Tyr Cys
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成
<400> 15
Asn Ile Asn His Tyr
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<223> 合成
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Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Val Ser Gly Asn Ile Asp Arg Phe Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Gln Leu Thr Asn Asn Glu Ile Thr Thr Tyr Gly Asp Ser Val Glu
50 55 60
Gly Gln Phe Ser Ile Ser Gly Asp Phe Asp Ala Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His
85 90 95
Ala His Val Thr Thr Thr Arg Trp Ser Gln Asp Tyr Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser
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<223> 合成
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Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Val Ser
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Gly Asn Ile Asp Arg Phe Tyr Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
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Gln
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Thr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Gly Gln Phe Ser Ile Ser Gly Asp Phe
1 5 10 15
Asp Ala Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<220>
<223> 合成
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<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ile Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Asp Ile Asp Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Pro Ser Gly Thr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Glu Cys Asn
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Thr Leu Ala Tyr Trp Gly Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 26
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
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Ile Asp Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Leu Ala
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Thr
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<220>
<223> 合成
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His Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Ser
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<220>
<223> 合成
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Trp Gly Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
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<223> 合成
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Ser Ile Tyr
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Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
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Ala Val Ile Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
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<223> 合成
<400> 34
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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Gly Ser Val Phe Ser Ile Tyr Ala
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<223> 合成
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Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
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Val
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Ile Thr Ser Gly Gly Ala Thr
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<223> 合成
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Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile
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Ala Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
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<213> 人工序列
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<223> 合成
<400> 39
Tyr Ala His Leu Leu Ile Gln Pro Phe Asp Arg Phe Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
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<213> 人工序列
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<223> 合成
<400> 40
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Ser Met Ser Ser Ile Tyr
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Ser Met Ser Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
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Ala Gly Leu Lys Ala Gly Pro Gly Pro Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Leu
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser
20 25
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
Gly Ser Met Ser Ser Ile Tyr Ser
1 5
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
Met Ser Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
1 5 10 15
His
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 45
Ile Thr Thr Thr Gly Thr Thr
1 5
<210> 46
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 46
Asn Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn
1 5 10 15
Asp Ile Asn Val Ile Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 47
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 47
Asn Ala Gly Leu Lys Ala Gly Pro Gly Pro Arg Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 48
Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 49
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Ser Ala Gly Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Gly Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Glu Arg Gln Arg Ala Gly Asp Val Lys Arg Ser Leu Ala Pro
100 105 110
Ile Thr Ala His Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 50
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
20 25
<210> 51
<211> 8
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 51
Gly Phe Thr Phe Lys Asp Tyr Gly
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 52
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Asp
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 53
Ile Asn Ser Ala Gly Asp Gly Ile
1 5
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 54
Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp
1 5 10 15
Ser Lys Gly Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 55
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 55
Ala Ala Glu Arg Gln Arg Ala Gly Asp Val Lys Arg Ser Leu Ala Pro
1 5 10 15
Ile Thr Ala His Ile
20
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 56
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
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<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ala Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ala Trp Thr Gly Thr His Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Val Phe
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Gln Ala Ser Ser Arg Tyr Arg Ala Val Thr Asp Ser Leu Ser Glu
100 105 110
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115 120 125
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<211> 25
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 59
Gly Gly Ala Phe Ser Thr Tyr Thr
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 60
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 61
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 61
Ile Ala Trp Thr Gly Thr His Thr
1 5
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 62
Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Asp Lys Asn Thr Val Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<211> 18
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 63
Ala Gln Ala Ser Ser Arg Tyr Arg Ala Val Thr Asp Ser Leu Ser Glu
1 5 10 15
Asn His
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 64
Trp Gly Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Thr
1 5 10
<210> 65
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 65
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Trp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gly Val
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Tyr Ala Phe Gly Arg Ser Arg Ala Gly Asp Ala Asn Gly Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 66
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 67
Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr Ala
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 68
Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 69
Ile Thr Trp Gly Gly Gly Ser Thr
1 5
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 70
Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Gly Val Leu Gln Met Asn Asn Leu Asp Val Asp Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 71
Tyr Ala Phe Gly Arg Ser Arg Ala Gly Asp Ala Asn Gly Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 72
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 72
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 73
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Arg Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ala Asp Ile Tyr
20 25 30
Asn Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Trp Ile Gly Arg Thr Pro Tyr Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Thr Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Ala His Tyr Leu Glu Gly Asn Thr Asp Tyr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 74
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Arg Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 75
Gly Arg Thr Ala Asp Ile Tyr Asn
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 76
Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 77
Ile Thr Trp Ile Gly Arg Thr Pro
1 5
<210> 78
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 78
Tyr Tyr Ala Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Thr Asp Ser
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 79
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 79
Asn Ala Ala His Tyr Leu Glu Gly Asn Thr Asp Tyr Tyr
1 5 10
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 80
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 81
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 81
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Ala Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Asp Ser Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Pro Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Gln Leu Lys Pro Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
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Tyr Ala Tyr Ile Arg Gly Val Gly Glu Val Arg Tyr Val Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 82
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 82
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 83
Gly Asp Thr Phe Ala Asn Tyr Ala
1 5
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 84
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 85
Ile Ser Trp Ser Asp Ser Ser Thr
1 5
<210> 86
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 86
His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Pro Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu Gln Met Asp Gln Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Met Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 87
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 87
Tyr Ala Tyr Ile Arg Gly Val Gly Glu Val Arg Tyr Val Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 88
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 89
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 89
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 90
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 90
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Val Leu Ala Ala Leu Leu Gln Gly
1 5 10 15
Val Gln Ala Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln
20 25 30
Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ile Thr Phe
35 40 45
Arg Asp Tyr Asp Ile Asp Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
50 55 60
Glu Trp Leu Ala Thr Ile Thr Pro Ser Gly Thr Thr His Tyr Pro Asp
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr
85 90 95
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr
100 105 110
Glu Cys Asn Thr Leu Ala Tyr Trp Gly Ser Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Ala Ala Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
130 135 140
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
145 150 155 160
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
165 170 175
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
180 185 190
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
195 200 205
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
210 215 220
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
225 230 235 240
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
245 250 255
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
260 265 270
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
275 280 285
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
290 295 300
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
305 310 315 320
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
325 330 335
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
340 345 350
Leu Pro Pro Arg
355
<210> 91
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 91
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Val Leu Ala Ala Leu Leu Gln Gly
1 5 10 15
Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Arg
20 25 30
Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ala
35 40 45
Asp Ile Tyr Asn Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
50 55 60
Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Trp Ile Gly Arg Thr Pro Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Thr Asp Ser Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Asn Ala Ala His Tyr Leu Glu Gly Asn Thr Asp Tyr Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr Thr
130 135 140
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
145 150 155 160
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
165 170 175
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
180 185 190
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
195 200 205
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
245 250 255
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
260 265 270
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
275 280 285
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
290 295 300
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
305 310 315 320
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
325 330 335
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
340 345 350
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360 365
<210> 92
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 92
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Val Leu Ala Ala Leu Leu Gln Gly
1 5 10 15
Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
20 25 30
Phe Cys Val Ala Ser Glu Glu Phe Phe Ser Ile Tyr Ala Met Gly Trp
35 40 45
Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln His Glu Met Val Ala Arg Phe Thr
50 55 60
Arg Asp Gly Lys Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr
65 70 75 80
Ile Thr Arg Asp Ala Lys Asn Thr Leu Asn Leu Gln Met Asn Gly Leu
85 90 95
Ile Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ile Asn His Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr Thr Thr
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
130 135 140
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
145 150 155 160
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
165 170 175
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
180 185 190
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
195 200 205
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
210 215 220
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
225 230 235 240
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
245 250 255
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
260 265 270
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
275 280 285
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
290 295 300
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
305 310 315 320
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
325 330 335
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
340 345
<210> 93
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 93
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Val Leu Ala Ala Leu Leu Gln Gly
1 5 10 15
Val Gln Ala Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Val Ser Gly Asn Ile Asp
35 40 45
Arg Phe Tyr Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg
50 55 60
Glu Leu Val Ala Gln Leu Thr Asn Asn Glu Ile Thr Thr Tyr Gly Asp
65 70 75 80
Ser Val Glu Gly Gln Phe Ser Ile Ser Gly Asp Phe Asp Ala Asn Thr
85 90 95
Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys His Ala His Val Thr Thr Thr Arg Trp Ser Gln Asp Tyr Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr Thr
130 135 140
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
145 150 155 160
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
165 170 175
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
180 185 190
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
195 200 205
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
245 250 255
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
260 265 270
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
275 280 285
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
290 295 300
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
305 310 315 320
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
325 330 335
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
340 345 350
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360 365
<210> 94
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 94
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 30
<210> 95
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 95
tagagggtat ataatggaag ctcgaattcc a 31
<210> 96
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 96
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 120
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 180
gatctagact tagagggtat ataatggaag ctcgaattcc a 221
<210> 97
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 97
ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60
ggaggggtcg gcaattgatc cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120
gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180
gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240
gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300
acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360
gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420
cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480
ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540
caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600
gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660
gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720
ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780
gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 840
acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 900
tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 960
tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1020
gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1080
ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1140
gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1179
<210> 98
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 98
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgtcctg gggcgtgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactactt tagcgacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg ccaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcggcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccaa gctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717
<210> 99
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 99
atggtgagca agggcgagga gaataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcgcatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggctttca gaccgctaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcatttc acctacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttcaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact acgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgtg 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggt 480
gccctgaagg gcaagatcaa gatgaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacacctcc 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacatcgtc 600
gacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaag 708
<210> 100
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 100
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 101
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 102
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 103
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 103
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 104
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 104
Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu
1 5 10 15
Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro
20 25 30
Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35 40
<210> 105
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(1)
<223> 可以重复3-12次
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(2)
<223> 可以重复3-12次
<400> 105
Gly Ser
1
<210> 106
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 106
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 107
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 107
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser
65
<210> 108
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 108
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 109
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 109
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 110
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 110
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 111
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(1)
<223> 可以重复1-10次
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(2)
<223> 可以重复1-5次
<220>
<221> REPEAT
<222> (2)..(2)
<223> 可以重复1-3次
<400> 111
Gly Ser
1

Claims (33)

1.一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括选自由SEQ ID NO:1-88组成的组的氨基酸序列。
2.一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括涵盖在SEQ ID NO:1-88中的任一个内的CDR序列。
3.一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括涵盖在SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73或81中的任一个内的CDR1、CDR2和CDR3。
4.一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括SEQ IDNO:1-88中的任一个中描绘的至少一个CDR(例如，CDR1、CDR2和/或CDR3)。
5.一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括至少一个CDR，所述至少一个CDR与SEQ ID NO:1-88中的任一个中描绘的CDR(例如，CDR1、CDR2和/或CDR3)至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
6.一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括VHH，所述VHH包括选自由SEQ ID NO:1-88组成的组的氨基酸序列。
7.一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括VHH，所述VHH包括涵盖在SEQ ID NO:1-88中的任一个内的CDR序列。
8.一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括VHH，所述VHH包括涵盖在SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73或81中的任一个内的CDR1、CDR2和CDR3。
9.一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括VHH，所述VHH包括SEQ ID NO:1-88中的任一个中描绘的至少一个CDR(例如，CDR1、CDR2和/或CDR3)。
10.一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段包括VHH，所述VHH包括至少一个CDR，所述至少一个CDR与SEQ ID NO:1-88中的任一个中描绘的CDR(例如，CDR1、CDR2和/或CDR3)至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗CD33抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗CD33抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
13.一种抗CD33抗体或其抗原结合片段，所述抗CD33抗体或其抗原结合片段与根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段竞争。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗CD33抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括CH2恒定结构域和CH3恒定结构域。
15.根据权利要求14所述的抗CD33抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗CD33抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是重链抗体。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的抗CD33抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是骆驼科抗体。
18.一种嵌合抗原受体，其包括根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
19.一种细胞，其表达根据权利要求18所述的嵌合抗原受体。
20.根据权利要求19所述的细胞，其中所述细胞是免疫效应细胞。
21.根据权利要求19或20所述的细胞，其中所述细胞是淋巴细胞。
22.根据权利要求19至22中任一项所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
23.根据权利要求19或20所述的细胞，其中所述细胞是NK细胞。
24.一种核酸，其包括编码根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求18所述的嵌合抗原受体的核酸序列。
25.一种载体，其包括根据权利要求24所述的核酸。
26.一种细胞，其包括根据权利要求24所述的核酸或根据权利要求25所述的载体。
27.根据权利要求26所述的细胞，其中所述细胞是免疫细胞。
28.根据权利要求27所述的细胞，其中所述免疫细胞选自由以下组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。
29.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达所述抗体或其抗原结合片段的条件下培养根据权利要求19至23或26至28中任一项所述的细胞。
30.一种治疗CD33相关疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求19至23或26至28中任一项所述的细胞。
31.一种治疗患有或有风险患有与CD33表达相关的血液赘生性疾病或恶性病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求19至23或26至28中任一项所述的细胞。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述与CD33表达相关的血液赘生性疾病或恶性病是骨髓增生异常综合征(MDS)、急性髓系白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)或其组合。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用有效量的化学治疗剂或溶瘤治疗剂。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023010118A1 (en) * 2021-07-29 2023-02-02 Vor Biopharma Inc. Nfat-responsive reporter systems for assessing chimeric antigen receptor activation and methods of making and using the same
WO2025030010A1 (en) 2023-08-01 2025-02-06 Vor Biopharma Inc. Compositions comprising genetically engineered hematopoietic stem cells and methods of use thereof

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL79289A (en) 1985-07-05 1992-01-15 Whitehead Biomedical Inst Introduction and expression of foreign genetic material into keratinocytes using a recombinant retrovirus
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
DE3852823T2 (de) 1987-09-11 1995-05-24 Hughes Howard Med Inst Transduktionsveränderte fibroblasten und ihre anwendung.
ATE110108T1 (de) 1987-12-11 1994-09-15 Whitehead Biomedical Inst Genetische modifizierung von endothelialen zellen.
EP0400047B1 (en) 1988-02-05 1997-04-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Modified hepatocytes and uses therefor
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
EP0556345B2 (en) 1990-10-31 2005-10-12 Cell Genesys, Inc. Retroviral vectors useful for gene therapy
SE9201984D0 (sv) 1992-06-29 1992-06-29 Pharmacia Biosensor Ab Improvement in optical assays
ATE452207T1 (de) 1992-08-21 2010-01-15 Univ Bruxelles Immunoglobuline ohne leichte ketten
US5308341A (en) 1993-09-28 1994-05-03 Becton, Dickinson And Company Method of testing the dose accuracy of a medication delivery device
US6146361A (en) 1996-09-26 2000-11-14 Becton Dickinson And Company Medication delivery pen having a 31 gauge needle
US6302855B1 (en) 1998-05-20 2001-10-16 Novo Nordisk A/S Medical apparatus for use by a patient for medical self treatment of diabetes
US6192891B1 (en) 1999-04-26 2001-02-27 Becton Dickinson And Company Integrated system including medication delivery pen, blood monitoring device, and lancer
US6277099B1 (en) 1999-08-06 2001-08-21 Becton, Dickinson And Company Medication delivery pen
DK1432466T3 (da) 2001-09-12 2012-12-03 Becton Dickinson Co Mikronål-baseret penapparat til lægemiddeludlevering og fremgangsmåde til anvendelse heraf
FR2849436B1 (fr) 2002-12-27 2007-01-05 Patrick Frayssinet Particules et ceramiques de phosphates de calcium pour transfection in vivo et in vitro
WO2012088461A2 (en) 2010-12-23 2012-06-28 Biogen Idec Inc. Linker peptides and polypeptides comprising same
AU2016343805A1 (en) 2015-10-30 2018-06-07 Aleta Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for tumor transduction
CN108602872A (zh) 2015-10-30 2018-09-28 艾丽塔生物治疗剂公司 用于治疗癌症的组合物和方法
JP2020508662A (ja) 2017-02-22 2020-03-26 アレタ・バイオセラピューティクス・インコーポレイテッドＡｌｅｔａ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ． 腫瘍形質導入のための組成物及び方法
MA47613A (fr) 2017-02-22 2020-01-01 Aleta Biotherapeutics Inc Compositions et procédés de traitement du cancer
US20210017277A1 (en) 2018-03-14 2021-01-21 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Anti-cd33 chimeric antigen receptors and their uses
CA3111458A1 (en) * 2018-09-10 2020-03-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies against cll1 and constructs thereof

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