CN116606384B - 一种蒲黄均一多糖及其制备方法与抗肿瘤用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蒲黄均一多糖，其分子量为5.9×104±3.0×104Da，由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和半乳糖组成，单糖摩尔比为鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖＝(3.00～4.00):(25.00～35.00):(4.50～7.50):(50.00～70.00)。该蒲黄均一多糖制备工艺简单，可用于预防和/或治疗肿瘤，具有开发成低毒高效的抗肿瘤药品、食品和/或保健品的潜在价值。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地，涉及肿瘤领域，更具体地，本发明涉及从蒲黄中提取的均一多糖。本发明还涉及含有它们的药物制剂、其制备方法、以及其用于预防和/或治疗肿瘤的用途。
背景技术
目前，结直肠癌(CRC)是世界上第三大癌症死亡原因。尽管在抗肿瘤方面取得了很大进展，但仍然存在许多挑战，包括化疗药物的严重不良反应。因此，人们越来越关注新的抗肿瘤策略，例如被认为是无毒和多靶向的天然产物。
多糖是由单糖分子脱水缩合而成的天然高分子聚合物。近年来，从自然资源中提取的多糖因其广泛的生物活性而受到越来越多的关注。其中，多糖的抗肿瘤作用一直是研究热点。而多糖的抗肿瘤活性通常通过两个主要途径介导：直接杀伤肿瘤细胞和激活免疫系统，后者有助于激活各种免疫细胞(如巨噬细胞)产生一系列免疫调节细胞因子。在现有的免疫细胞中，通常选择巨噬细胞作为体外多糖抗肿瘤活性的研究模型，因为活化的M1型巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)是两种重要的细胞毒性介质，以破坏癌细胞为目标。M1型肿瘤相关巨噬细胞(TAM)可以抑制微环境中的肿瘤生长，而M2型TAM可以促进肿瘤细胞存活、增殖、侵袭、血管生成和免疫抑制。在巨噬细胞的免疫调节中，存在多种调节信号通路，其中NF-kB一直被认为是典型的炎症信号通路，主要基于NF-kB通道促进炎症细胞因子如白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子a(TNF-α)的产生。大量研究表明，多糖通过调节免疫细胞的活化来调节炎症因子的产生，从而杀死肿瘤细胞。
蒲黄为香蒲科植物水烛香蒲Typha angustifolia L.、东方香蒲Typhaorientalis Presl或同属植物的干燥花粉。蒲黄生物活性成分的研究主要集中在其小分子成分，特别是黄酮类成分，它们在改善微循环、调节脂质和糖代谢和免疫调节方面有很好的效果，但对蒲黄中的大分子成分的结构及其药效研究较少。
发明内容
基于此，本发明提供了一种蒲黄均一多糖，分子量为5.9×104±3.0×104Da，由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和半乳糖组成，单糖摩尔比为鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖＝(3.00～4.00):(25.00～35.00):(4.50～7.50):(50.00～70.00)。
进一步地，该分子量为5.9×104±2.0×104Da。
进一步地，该分子量为5.9×104±1.0×104Da。
进一步地，峰高分子量为约5.9×104Da。
进一步地，该蒲黄为水烛香蒲、东方香蒲或其它蒲黄属植物的干燥花粉。
进一步地，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖＝(3.10～3.90):(27.00～33.00):(4.80～7.20):(52.00～68.00)。
进一步地，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖＝(3.20～3.80):(28.00～32.00):(5.00～7.00):(55.00～65.00)。
进一步地，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖＝(3.30～3.70):(29.00～31.00):(5.50～6.50):(58.00～62.00)。
进一步地，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖＝(3.55～3.65):(30.00～31.00):(5.90～6.20):(58.00～60.00)。
进一步地，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖＝3.6:30.5:6.1:58.9。
进一步地，该蒲黄均一多糖的骨架包含葡萄糖醛酸和半乳糖。
进一步地，该蒲黄均一多糖的该骨架包含T-β-D-Galp、1,3-β-D-Galp、1,6-β-D-Galp、1,3,6-β-D-Galp、T-β-D-4-OMe-GlcpA、T-α-D-GalpA和/或1,4-α-D-GalpA。
进一步地，该蒲黄均一多糖的分支包含鼠李糖和阿拉伯糖。
进一步地，该蒲黄均一多糖的该分支包含1,5-α-L-Araf、T-α-L-Araf和/或T-α-L-Rhap。
根据本发明的另一个方面，提供了一种制备上述蒲黄均一多糖的方法，该方法包括下述步骤：
(1)将蒲黄药材用水进行加热提取，得到水提液；
(2)将该水提液进行浓缩后离心以除去不溶物，得到浓缩液；
(3)将该浓缩液进行乙醇沉淀，离心以分离沉淀，得到沉淀部分；
(4)将该沉淀部分洗涤后加入水溶解并冷冻干燥，得到蒲黄粗多糖；
(5)将该蒲黄粗多糖用水溶解后离心，得到第一上清液；以及
(6)将该第一上清液进行DEAE琼脂糖凝胶柱层析和SuperdexTM 75或SuperdexTM200凝胶柱层析，采用H2O和/或0.1～2.0mol/L氯化钠溶液进行洗脱，检测糖峰并收集含糖流份，得到蒲黄均一多糖。
进一步地，该方法包括如下的[1]～[20]项中的任意一项或者多项：
[1]将该蒲黄药材进行粉碎；
[2]步骤(1)中所用水为蒸馏水或去离子水；
[3]步骤(1)中，该温度为50℃～100℃，优选为80℃～100℃，例如约100℃；
[4]将步骤(1)中的该加热提取的操作重复一次或者多次，例如3次，合并后得到该水提液；
[5]步骤(1)中水的用量为1～50倍量(L/kg)，优选为5～30倍量，更优选为6～20倍量，又优选为8～15倍量，例如约10倍量；
[6]步骤(1)中的该加热提取的时间为1～10小时，优选为2～8小时，更优选为3～5小时，例如约3小时；
[7]步骤(2)中，该离心的条件为在2000×g～6000×g转速下离心10～30分钟，优选为在3000×g～5000×g转速下离心15～30分钟，更优选为在3500×g～4500×g转速下离心15～25分钟，例如在约4000×g转速下离心约20分钟；
[8]步骤(3)中，该乙醇沉淀所用的该乙醇的浓度为60％～98％，优选为80％～98％，例如约95％；
[9]步骤(3)中所用的该乙醇的量为该浓缩液的1～5倍体积，例如约3倍体积；
[10]步骤(3)中该乙醇沉淀的时间为至少12小时、至少24小时、24～72小时或者48小时，例如约24小时；
[11]步骤(3)中，该离心的条件为在2000×g～6000×g转速下离心10～30分钟，优选为在3000×g～5000×g转速下离心15～30分钟，更优选为在3500×g～4500×g转速下离心15～25分钟，例如在约4000×g转速下离心约20分钟；
[12]该沉淀部分洗涤所用的该乙醇的浓度为60％～98％，优选为80％～98％，例如约95％；
[13]步骤(5)中水的用量为1～50倍量(mL/g)，优选为5～30倍量(mL/g)，更优选为6～20倍量(mL/g)，又优选为8～15倍量(mL/g)，例如约10倍量(mL/g)；
[14]步骤(5)中，该离心的条件为在6000×g～15000×g转速下离心5～20分钟，优选为在8000×g～12000×g转速下离心5～15分钟，例如在约10000×g转速下离心约10分钟；
[15]步骤(6)中，该第一上清液通过DEAE琼脂糖凝胶柱例如DEAE琼脂糖凝胶FF柱处理，分别用水、不同浓度的0.1～2.0mol/L氯化钠溶液依次洗脱，经浓缩、透析和冷冻干燥后，得到包含该蒲黄均一多糖的馏分；
[16]在[15]项中，将该包含该蒲黄均一多糖的馏分溶解在氯化钠溶液中并离心，得到第二上清液；
[17]在[16]项中，该氯化钠溶液的用量为0.01～0.1倍量(mL/mg)，优选为0.02～0.08倍量(mL/mg)，更优选为0.03～0.06倍量(mL/mg)，例如约0.04倍量(mL/mg)；
[18]在[16]项中，该氯化钠溶液的浓度为0.1～2.0mol/L，优选为0.1～1.0mol/L，例如约0.2mol/L，
[19]在[16]项中，该离心的条件为在6000×g～15000×g转速下离心5～20分钟，优选为在8000×g～12000×g转速下离心5～15分钟，例如在约10000×g转速下离心约10分钟；
[20]步骤(6)中，该第二上清液通过Sephadex G-200凝胶柱层析，以0.1～2.0mol/L，优选为0.1～1.0mol/L，例如约0.2mol/L氯化钠溶液作为流动相进行洗脱。
根据本发明的另一个方面，提供了一种蒲黄均一多糖，其由上述方法制得。
根据本发明的另一个方面，提供了一种蒲黄药物制剂，其包含上述蒲黄均一多糖，以及任选的药学上可接受的辅料。
进一步地，该蒲黄药物制剂进一步包含其它调节细胞免疫活性的药物或者提高免疫力的药物。
进一步地，该蒲黄药物制剂为口服制剂、注射制剂或冻干粉针剂。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述蒲黄均一多糖或上述蒲黄药物制剂在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药品、食品和/或保健品中的用途。
进一步地，该蒲黄均一多糖或该蒲黄药物制剂为调节细胞免疫活性的药物或者提高免疫力的药物；
进一步地，该调节为以下的一种或多种：促进巨噬细胞的增殖、诱导该巨噬细胞产生炎症因子TNF-α和IL-6、通过NF-kB信号通路激活该巨噬细胞和/或将该巨噬细胞极化转向M1型；
进一步地，该肿瘤为结直肠肿瘤。
进一步地，该结直肠肿瘤为结直肠良性肿瘤或结直肠恶性肿瘤例如结肠癌或直肠癌。
本发明的有益效果：
多糖是蒲黄水提物的主要大分子成分，在本发明中，从蒲黄中提取并纯化了一种均质多糖(PTPS-1-2)。通过一系列化学和物理分析方法对其结构进行了充分表征，PTPS-1-2的分子量为约59kDa，由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和半乳糖组成，摩尔比为3.6:30.5:6.1:58.9，其骨架主要由T-β-D-Galp、1,3-β-D-Galp、1,6-β-D-Galp、1,3,6-β-D-Galp、T-β-D-4-OMe-GlcpA、T-α-D-GalpA和1,4-α-D-GalpA，另外的分支包含1,5-α-L-Araf、T-α-L-Araf和T-α-L-Rhap。本发明的研究结果表明PTPS-1-2可以预防和治疗肿瘤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。
图1为蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)纯化流程图。
图2为蒲黄PTPS-1馏分的分子筛凝胶色谱柱的洗脱曲线。
图3为蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)的HPLC图谱。
图4为单糖组成分析GC图谱。其中，(A)单糖标准品；(B)均一多糖(PTPS-1-2)；(C)糖醛酸还原后的均一多糖(PTPS-1-2-Re)；(D)弱酸水解后的主链(PTPS-1-2-主)；(E)弱酸水解后的支链(PTPS-1-2-支)；1.鼠李糖；2.岩藻糖；3.阿拉伯糖；4.木糖；5.甘露糖；6.葡萄糖；7.半乳糖。
图5为蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)的甲基化分析图。(A)PTPS-1-2的GC色谱图；(B)PTPS-1-2-Re的GC色谱图；(C)PTPS-1-2-主的GC色谱图；T-Araf：端基呋喃环阿拉伯糖；1,5-Araf：1,5连接呋喃环阿拉伯糖；T-Rhap：端基吡喃环鼠李糖；T-Glcp：端基吡喃环葡萄糖；T-Galp：端基吡喃环半乳糖；1,4-Galp：1,4连接吡喃环半乳糖；1,3-Galp：1,3连接吡喃环半乳糖；1,6-Galp：1,6连接吡喃环半乳糖；1,3,6-Galp：1,3,6连接吡喃环半乳糖。
图6为蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)的甲基化分析质谱图。(A)T-Araf的PMAA质谱图；(B)T-Rhap的PMAA质谱图；(C)1,5-Araf的PMAA质谱图；(D)T-Glcp的PMAA质谱图；(E)T-Galp的PMAA质谱图；(F)1,4-Glcp的PMAA质谱图；(G)1,3-Galp的PMAA质谱图；(H)1,6-Galp的PMAA质谱图；(I)1,3,6-Galp的PMAA质谱图。
图7为蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)的1H NMR和13CNMR谱图。(A)PTPS-1-2的1H NMR谱图；(B)PTPS-1-2的13CNMR谱图；(C)PTPS-1-2-主的13CNMR光谱。
图8为PTPS-1-2和PTPS-1-2-主的二维核磁光谱图(HSQC和HMBC)。(A)PTPS-1-2的HSQC谱；(B)PTPS-1-2的HMBC谱；(C)PTPS-1-2-主的HSQC谱；(D)PTPS-1-2-主的HMBC谱。
图9为PTPS-1-2和PTPS-1-2-主的二维核磁光谱图(1H-1HCOSY)。(A)PTPS-1-2的1H-1H COSY谱；(B)PTPS-1-2-主的1H-1HCOSY谱。
图10为PTPS-1-2的化学结构图。
图11为PTPS-1-2活性筛选图。(A)蒲黄粗多糖PTPS，多糖馏分PTPS-W、PTPS-1、PTPS-2对RAW264.7细胞NO释放的影响(400μg/ml)；(B)蒲黄均一多糖PTPS-1-1、PTPS-1-2、PTPS-1-3、PTPS-2-3对RAW264.7细胞NO释放的影响(400μg/ml)；(C)不同浓度的PTPS-1-2(100、200、400μg/ml)对RAW264.7细胞细胞活力的影响。数据是平均值±SD(n＝3)。**P<0.01，***P<0.001代表与对照组之间的差异；###P<0.001代表PTPS-1-2与PTPS-1-1、PTPS-1-3或PTPS-2-3之间的差异。
图12为PTPS-1-2对RAW264.7细胞NF-κB信号通路的影响结果图。(A)RAW264.7细胞的代表性显微照片；(B)NO产生；(C)吞噬指数；(D)TNF-α水平；(E)IL-6水平；(F)p-p65与p65的比例；(G)p-IκBα与IκBα的比例；(H)PTPS-1-2对磷酸化p65和磷酸化IκBα的影响；数据是平均值±SD(n＝3)。**P<0.01，***P<0.001与对照组。
图13为PTPS-1-2对巨噬细胞极化的影响。(A)iNOS的mRNA水平；(B)TNF-α的mRNA水平；(C)IL-4的mRNA水平；(D)用流式细胞术分析了用PTPS-1-2刺激的RAW264.7上的CD86、CD16和CD206表达。数据是平均值±SD(n＝3)。**P<0.01，***P<0.001与对照组相比。
图14为PTPS-1-2激活的抑制RKO细胞增殖并诱导细胞凋亡。(A)用PTPS-1-2预处理的的条件培养基(CM)；(B)PTPS-1或条件培养基(CM)对RKO细胞增殖的影响；(C)PTPS-1-2激活的CM抑制了不同浓度的RKO细胞的生长；(D)活/死染色评估了CM对RKO细胞凋亡的影响。细胞在暴露于CM(0、100、200和400μg/mL)后用钙黄绿素-AM和PI染色，使用荧光示踪显微镜进行成像；(E)通过流式细胞术分析了CM在RKO细胞中诱导的细胞凋亡。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何药物组合、制备方法或材料，但本文描述了优选的药物组合、制备方法或材料。
正如背景技术部分所描述的，现有上市的肿瘤化疗药物存在严重的不良反应、毒性较大、药物作用机制较为单一的问题。为了解决上述问题，本发明提供了一种蒲黄均一多糖，分子量为5.9×104±3.0×104Da，由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和半乳糖组成，单糖摩尔比为鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖＝(3.00～4.00):(25.00～35.00):(4.50～7.50):(50.00～70.00)。
本发明的上述蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)可以通过NF-kB信号通路激活RAW264.7巨噬细胞并触发M1巨噬细胞转化，经PTPS-1-2预处理的人腹腔巨噬细胞条件(条件)培养基(CM)通过抑制人结肠腺癌细胞(RKO)细胞增殖和抑制细胞集落形成显著表现出抗肿瘤作用。
本发明的术语“均一多糖”(homogeneous polysaccharide)具有本领域公知的含义，是指分子量和电荷均一的多糖。
本发明的术语“多糖”是指由通过配糖键或糖苷键连接的至少两个单糖单元制成的化合物。具有大于约10,000Da的分子量(以kDa表示，其中“Da”代表“道尔顿”且1kDa＝1,000Da)的多糖可被称为“高分子量多糖”。
在本发明中，摩尔比、当量、浓度或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“3.00～4.00”、“25.00～35.00”、“4.50～7.50”、“50.00～70.00”时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和非整数，且在上述数值范围内均能实现本发明的技术效果。
在一种优选的实施方式中，该分子量为5.9×104±2.0×104Da。
在一种优选的实施方式中，该分子量为5.9×104±1.0×104Da。
在一种优选的实施方式中，峰高分子量为约5.9×104Da。
关于数值的术语“约”或“大约”意指该数值的±5％，但明确地包括确切的数值。例如，“约5.9×104Da”是指从5.605×104Da至6.195×104Da，但也明确地包括5.9×104Da。
在一种优选的实施方式中，该蒲黄为水烛香蒲、东方香蒲或其它蒲黄属植物的干燥花粉。
本发明的香蒲为沼泽多年生草本植物，高1～2m，根茎匍匐，有多数须根，其具有有止血，化瘀，通淋等功效。
在一种优选的实施方式中，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖＝(3.10～3.90):(27.00～33.00):(4.80～7.20):(52.00～68.00)。
在一种优选的实施方式中，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖＝(3.20～3.80):(28.00～32.00):(5.00～7.00):(55.00～65.00)。
在一种优选的实施方式中，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖＝(3.30～3.70):(29.00～31.00):(5.50～6.50):(58.00～62.00)。
在一种优选的实施方式中，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖＝(3.55～3.65):(30.00～31.00):(5.90～6.20):(58.00～60.00)。
在一种优选的实施方式中，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖＝3.6:30.5:6.1:58.9。
在一种优选的实施方式中，该蒲黄均一多糖的骨架包含葡萄糖醛酸和半乳糖。
在一种优选的实施方式中，该蒲黄均一多糖的该骨架包含T-β-D-Galp、1,3-β-D-Galp、1,6-β-D-Galp、1,3,6-β-D-Galp、T-β-D-4-OMe-GlcpA、T-α-D-GalpA和/或1,4-α-D-GalpA。
在一种优选的实施方式中，该蒲黄均一多糖的分支包含鼠李糖和阿拉伯糖。
在一种优选的实施方式中，该蒲黄均一多糖的该分支包含1,5-α-L-Araf、T-α-L-Araf和/或T-α-L-Rhap。
根据本发明的另一个方面，提供了一种制备上述蒲黄均一多糖的方法，该方法包括下述步骤：
(1)将蒲黄药材用水进行加热提取，得到水提液；
(2)将该水提液进行浓缩后离心以除去不溶物，得到浓缩液；
(3)将该浓缩液进行乙醇沉淀，离心以分离沉淀，得到沉淀部分；
(4)将该沉淀部分洗涤后加入水溶解并冷冻干燥，得到蒲黄粗多糖；
(5)将该蒲黄粗多糖用水溶解后离心，得到第一上清液；以及
(6)将该第一上清液进行DEAE琼脂糖凝胶柱层析和SuperdexTM 75或SuperdexTM200凝胶柱层析，采用H2O和/或0.1～2.0mol/L氯化钠溶液进行洗脱，检测糖峰并收集含糖流份，得到蒲黄均一多糖。
在一种优选的实施方式中，该方法包括如下的[1]～[20]项中的任意一项或者多项：
[1]将该蒲黄药材进行粉碎；
[2]步骤(1)中所用水为蒸馏水或去离子水；
[3]步骤(1)中，该温度为50℃～100℃，优选为80℃～100℃，例如约100℃；
[4]将步骤(1)中的该加热提取的操作重复一次或者多次，例如3次，合并后得到该水提液；
[5]步骤(1)中水的用量为1～50倍量(L/kg)，优选为5～30倍量，更优选为6～20倍量，又优选为8～15倍量，例如约10倍量；
[6]步骤(1)中的该加热提取的时间为1～10小时，优选为2～8小时，更优选为3～5小时，例如约3小时；
[7]步骤(2)中，该离心的条件为在2000×g～6000×g转速下离心10～30分钟，优选为在3000×g～5000×g转速下离心15～30分钟，更优选为在3500×g～4500×g转速下离心15～25分钟，例如在约4000×g转速下离心约20分钟；
[8]步骤(3)中，该乙醇沉淀所用的该乙醇的浓度为60％～98％，优选为80％～98％，例如约95％；
[9]步骤(3)中所用的该乙醇的量为该浓缩液的1～5倍体积，例如约3倍体积；
[10]步骤(3)中该乙醇沉淀的时间为至少12小时、至少24小时、24－72小时或者48小时，例如约24小时；
[11]步骤(3)中，该离心的条件为在2000×g～6000×g转速下离心10～30分钟，优选为在3000×g～5000×g转速下离心15～30分钟，更优选为在3500×g～4500×g转速下离心15～25分钟，例如在约4000×g转速下离心约20分钟；
[12]该沉淀部分洗涤所用的该乙醇的浓度为60％～98％，优选为80％～98％，例如约95％；
[13]步骤(5)中水的用量为1～50倍量(mL/g)，优选为5～30倍量(mL/g)，更优选为6～20倍量(mL/g)，又优选为8～15倍量(mL/g)，例如约10倍量(mL/g)；
[14]步骤(5)中，该离心的条件为在6000×g～15000×g转速下离心5～20分钟，优选为在8000×g～12000×g转速下离心5～15分钟，例如在约10000×g转速下离心约10分钟；
[15]步骤(6)中，该第一上清液通过DEAE琼脂糖凝胶柱例如DEAE琼脂糖凝胶FF柱处理，分别用水、不同浓度的0.1～2.0mol/L氯化钠溶液依次洗脱，经浓缩、透析和冷冻干燥后，得到包含该蒲黄均一多糖的馏分；
[16]在[15]项中，将该包含该蒲黄均一多糖的馏分溶解在氯化钠溶液中并离心，得到第二上清液；
[17]在[16]项中，该氯化钠溶液的用量为0.01～0.1倍量(mL/mg)，优选为0.02～0.08倍量(mL/mg)，更优选为0.03～0.06倍量(mL/mg)，例如约0.04倍量(mL/mg)；
[18]在[16]项中，该氯化钠溶液的浓度为0.1～2.0mol/L，优选为0.1～1.0mol/L，例如约0.2mol/L，
[19]在[16]项中，该离心的条件为在6000×g～15000×g转速下离心5～20分钟，优选为在8000×g～12000×g转速下离心5～15分钟，例如在约10000×g转速下离心约10分钟；
[20]步骤(6)中，该第二上清液通过SuperdexTM 200凝胶柱层析，以0.1～2.0mol/L，优选为0.1～1.0mol/L，例如约0.2mol/L氯化钠溶液作为流动相进行洗脱。
关于数值的术语“约”或“大约”意指该数值的±5％，但明确地包括确切的数值。例如，“约10倍量”是指从9.5倍量至10.5倍量，但也明确地包括10倍量；“约3小时”是指从2.85小时至3.15小时，但也明确地包括3小时；“约4000×g转速”是指从3800×g转速至4200×g转速，但也明确地包括4000×g转速；“约20分钟”是指从19分钟至21分钟，但也明确地包括20分钟。
根据本发明的另一个方面，提供了一种蒲黄均一多糖，其由上述方法制得。
根据本发明的另一个方面，提供了一种蒲黄药物制剂，其包含上述蒲黄均一多糖，以及任选的药学上可接受的辅料。
在一种优选的实施方式中，该辅料选自以下的一种或多种：缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、螯合剂、表面活性剂、填充剂和稳定剂。
在一种优选的实施方式中，该蒲黄药物制剂进一步包含其它调节细胞免疫活性的药物或者提高免疫力的药物。
本发明所涉及的“其它调节细胞免疫活性的药物或者提高免疫力的药物”包括但不限于化学合成药物左旋咪唑、异丙肌苷等，人或动物免疫产物胸腺素、转移因子、干扰素、白介素等，微生物来源的卡介苗及其他来源的生物多糖、中药有效成分等。
在一种优选的实施方式中，该蒲黄药物制剂为口服制剂、注射制剂或冻干粉针剂。
本发明的“口服制剂”包括但不限于散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂等。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述蒲黄均一多糖或上述蒲黄药物制剂在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药品、食品和/或保健品中的用途。
本发明的术语“食品”、“保健品”、“食物产品”、“保健产品”、“保健组合物”或“食物组合物”的含义是期望被动物(包括人)摄入并向该动物提供营养或保健作用的产品或组合物。
在一种优选的实施方式中，该蒲黄均一多糖或该蒲黄药物制剂为调节细胞免疫活性的药物或者提高免疫力的药物。
在一种优选的实施方式中，该调节为以下的一种或多种：促进巨噬细胞的增殖、诱导该巨噬细胞产生炎症因子TNF-α和IL-6、通过NF-kB信号通路激活该巨噬细胞和/或将该巨噬细胞极化转向M1型。
在一种优选的实施方式中，该肿瘤为结直肠肿瘤。
在一种优选的实施方式中，该结直肠肿瘤为结直肠良性肿瘤或结直肠恶性肿瘤例如结肠癌或直肠癌。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述蒲黄均一多糖或上述蒲黄药物制剂，用于预防或治疗受试者中的肿瘤。
根据本发明的另一个方面，提供了一种预防或治疗受试者中的肿瘤的方法，包括向该受试者施用有效量的上述蒲黄均一多糖或上述蒲黄药物制剂。
在本发明中，术语“受试者”、“个体”或“患者”在此可互换地使用并且是指一种脊椎动物，优选一种哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表肿瘤模型的受试者。优选地，所述受试者是人。这样的受试者们典型地遭受或易于患有一种可以通过给予本发明的上述蒲黄均一多糖或上述蒲黄药物制剂来预防或治疗的病症。
本发明所用的药物组合物或制剂的“有效量”可以获得所需要的治疗和/或预防效果。对此用途有效的量将取决于例如递送的途径、所采用的具体的活性物质或制剂的活性、癌症的类型、治疗的疾病的阶段和严重性、个体体重和总体健康状况、以及处方医师的判断。剂量的给予可以每周一次，或两天或每天一次，或甚至每天几次。可以在短期(例如数周至数月)或更长时间段(数月至数年)给予剂量单元。“有效量”具体指的是向所治疗的受试者赋予治疗作用(例如，控制、缓解、改善、缓和或减缓进展)；或预防(例如，延迟发作或降低发展风险)疾病、病症或病状或其症状的上述蒲黄均一多糖或上述蒲黄药物制剂的量。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例
1.制备蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)
蒲黄生药材3kg加入30L水在100℃下提取3h，重复3次，然后合并提取物并浓缩，然后以4000×g离心20分钟以除去不溶物。浓缩液加入3倍体积的95％乙醇沉淀，然后在室温下过夜，4000×g离心20分钟分离沉淀。分离出的沉淀物用95％乙醇洗涤两次，然后重新溶解在纯水中并冷冻干燥，得到粗多糖(PTPS)，如图1所示。
将PTPS(8.0g)溶解在80mL水中并以10000×g离心10分钟。上清液通过DEAESepharose Fast Flow柱(500×55mm)处理，分别用水、NaCl溶液(0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L和2.0mol/L)和1.0mol/L氢氧化钠溶液依次洗脱。浓缩、透析和冷冻干燥后，得到以下馏分(PTPS-W(PTPS水馏分)、PTPS-1、PTPS-2、PTPS-3、PTPS-5、PTPS-20和PTPS-OH)。随后，将PTPS-1(100mg)溶解在4mL 0.2mol/L NaCl中，并以10,000×g离心10分钟。上清液用SuperdexTM 200柱进行洗脱，0.2mol/L NaCl作为流动相，分离出三个的多糖(PTPS-1-1、PTPS-1-2、PTPS-1-3)，第二个是PTPS-1-2。PTPS-1馏分的分子筛凝胶色谱柱的洗脱曲线如图2所示。随后，将PTPS-2(100mg)溶解在4mL 0.2mol/L NaCl中，并以10,000×g离心10分钟。上清液用SuperdexTM 75柱进行洗脱，0.2mol/LNaCl作为流动相，分离得到PTPS-2-3，其分子量为12kDa，Rha:Ara:Xyl:Glc:Gal＝13.09:33.36:23.64:7.00:22.91。
2.蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)均一性和分子量测定
通过高效凝胶渗透色谱(HPGPC)进行测量，色谱柱为KS-804和KS-802的凝胶线性色谱柱串联使用。使用已知分子量(P-5至P-800)的支链淀粉绘制标准曲线，并使用0.2mol/LNaCl以0.8mL/min的流速进行柱洗脱。样品制备浓度为2.0mg/mL，每次运行进样20μL。经测定，PTPS-1-2为电荷量与分子量均一的多糖，它产生单个对称尖峰，其分子量(Mw＝59kDa)由HPGPC显示(图3)。
3.蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)单糖组成的测定
PTPS-1-2(1mg)用1mL 2mol/L三氟乙酸(TFA)在120℃下水解2小时。减压旋蒸完全去除TFA后，将剩余的残留物重新溶解在200μL蒸馏水中，加入1mL溶解在含有0.5M NaBH4的DMSO中于40℃下还原90分钟。反应结束后，再加入100μL乙酸中和后，用1mL乙酸酐和200μL1-甲基咪唑在40℃下处理样品10分钟进行乙酰化。色谱柱为HP-5ms色谱柱(长度：60m×0.25mm；厚度：0.25μm，安捷伦)。单糖分析的温度程序是从140℃以2℃/min的梯度升至198℃，保持4分钟，然后以4℃/分钟的梯度升至214℃，再以1℃/min梯度上升至217℃，保持4分钟，最后以3℃/分钟的速度最终升至250℃，保持4分钟。
单糖组成分析显示在GC-MS谱中出现了四个峰。与标准单糖光谱(图4A)相比，这些单糖峰被鉴定为鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖，比例为3.7:40.3:1.2:54.8(图4B)。另外，糖醛酸含量检测结果表明，PTPS-1-2中的糖醛酸含量为9.7±0.6％。羧基还原后的单糖组成结果表明，鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖的比例为3.6:30.5:6.1:58.9。这意味着糖醛酸是葡萄糖醛酸。以上数据表明，PTPS-1-2的真正单糖组成是鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸(图4C)。为了进一步分析多糖主链和分支的详细结构，PTPS-1-2用0.05mol/LTFA部分水解。单糖组成结果(图4D)表明主链(PTPS-1-2-主)几乎完全由半乳糖组成，分支(PTPS-1-2-支)由阿拉伯糖组成。
4.蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)部分酸水解
将PTPS-1-2(100mg)溶解在0.05M TFA(5mL)中并在100℃下水解60分钟。用5mL0.05M NaOH中和后，用1000Da透析袋透析48h，分离主链和支链。冻干后得到主链(PTPS-1-2-主，56mg)。为了进一步分析PTPS-1-2-主的结构，通过单糖组成和NMR对其进行了分析。
5.蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)甲基化分析
将10mg PTPS-1-2用(P2O5)在真空中干燥两天，然后放入充满氮气的茄子瓶中并溶解在2毫升无水DMSO。加入200mg NaOH粉末后，样品在氮气氛下搅拌1小时。样品最初用0.5mL CH3I甲基化20分钟，然后用1mL CH3I进一步甲基化90分钟。最后，加入2毫升水结束反应。加入3mL氯仿萃取，水洗氯仿层3次。将多糖甲基化四次，得到完全甲基化的多糖。将完全甲基化的PTPS-1-2水解并转化为部分甲基化的糖醇乙酸酯(PMAA)，并使用HP-5ms色谱柱(长度：60m×0.25mm；液相厚度：0.25μm，安捷伦)通过GC-MS进行分析)。升温程序如下：以2℃/min的梯度从140℃升至180℃，然后以1℃/min的速率升至200℃，最后升至250℃，并用3℃/min梯度，并保持5min。火焰离子化检测器设置为250℃，氦气(1.0mL/min)作为载气。
进行甲基化分析以确定PTPS-1-2、PTPS-1-2-主和PTPS-1-2-Re中的糖苷键，这些结果显示在图5和表1中。PMAA光谱已显示在图6。PTPS-1-2中的阿拉伯糖残基由末端连接的Araf(19.2％)和1,5-连接的Araf(15.5％)组成。半乳糖残基由末端连接的Galp(5.8％)、1,3-连接的Galp(9.8％)、1,6-连接的Galp(17.3％)和1,3,6-连接的Galp(32.1％)组成。并检测到少量的鼠李糖残基末端连接的Rhap(1.2％)。还原后的甲基化分析(PTPS-1-2-Re)表明，还含有1,4-连接的GalpA(3.5％)半乳糖残基和T-连接的GlcpA(6.2％)葡萄糖残基。并且主链PTPS-1-2-主经过部分酸水解进行甲基化分析，半乳糖残基1,6-连接的Galp(28.3％)显著增加。这表明主链主要由1,6-连接的Galp组成，主要分支点在1,3,6-连接的Galp的O-3处。
6.蒲黄均一多糖糖醛酸还原(PTPS-1-2-Re)
以半乳糖醛酸为标准，通过间羟基联苯法测定总糖醛酸浓度。糖醛酸对后期的分析有一定的影响，应还原后再分析，这里使用CMC-NaBH4进行羧基的还原。将100mg PTPS-1-2溶于蒸馏水中后，加入200mg碳二亚胺(CMC)，用0.1M HCl调节pH至4.75，保持3小时。随后，加入2M NaBH4(20ml)，同时用3M HCl调节pH至7.00，继续反应2小时。所得溶液用3500Da透析袋透析48h，袋内透析液冷冻干燥。重复上述步骤，直到所有的糖醛酸都被还原，得到被还原完全的均一多糖PTPS-1-2-Re，再进行PTPS-1-2-Re的单糖组成分析和甲基化分析。
表1PTPS-1-2、PTPS-1-2-主和PTPS-1-2-Re甲基化分析的GC-MS数据
7.蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)核磁解析
真空干燥后，将PTPS-1-2(80mg)和PTPS-1-2-主(56mg)溶解在0.5mL D2O(Aldrich)中。1H NMR、13CNMR(图7)，二维1H-1H相关光谱(COSY)、HSQC和HMBC NMR(图8)光谱在D2O中于25℃下使用Bruker Avance III 600进行测定。使用丙酮作为内标，13C和1HNMR的化学位移以ppm表示，13C和1H NMR相对于丙酮的位移分别为31.45和2.225ppm(图9)。所有数据均使用标准Bruker软件和MestReNova处理。
PTPS-1-2的主链由T-β-D-Galp、1,3-β-D-Galp、1,6-β-D-Galp、1,3,6-β-D-Galp、T-β-D-4-OMe-GlcpA、T-α-D-GalpA和1,4-α-D-GalpA，分支为1,5-α-L-Araf、T-α-L-Araf和T-α-L-Rhap(图10)。
表2.PTPS-1-2的13C NMR和1H NMR核磁信号归属(ppm)
8.蒲黄多糖的活性筛选
首先对蒲黄粗多糖(PTPS)与部位多糖(PTPS-W、PTPS-1、PTPS-2)进行活性筛选，将RAW264.7细胞(5×104个细胞/孔)接种在96孔板中24小时，然后将它们与100μL PTPS、PTPS-W、PTPS-1、PTPS-2(400μg/mL)或LPS(1μg/mL)一起孵育24小时。我们发现PTPS、PTPS-1、PTPS-2均具有良好的激活RAW264.7细胞作用，且部位多糖PTPS-1最强(图11A)。我们从PTPS-1中分离得到三个均一多糖(PTPS-1-1、PTPS-1-2、PTPS-1-3)，从PTPS-2中分离得到PTPS-2-3，经活性检测发现PTPS-1-2效果最强，而PTPS-2-3则未表现出激活RAW264.7细胞的作用(图11B)。此外，我们还评估了不同不同浓度的PTPS-1-2溶液(0、100、200和400μg/mL)对RAW264.7细胞活力的影响，结果显示PTPS-1-2能明显促进RAW264.7细胞的增殖(图11C)。
9.蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)对RAW264.7细胞活力和NO产生的影响
我们首先评估了PTPS-1-2在处理RAW264.7细胞时是否具有细胞毒性，将RAW264.7细胞(5×104个细胞/孔)接种在96孔板中24小时，然后将它们与100μL不同浓度的PTPS-1-2溶液(0、100、200和400μg/mL)或LPS(1μg/mL)一起孵育24小时。结果没有观察到细胞毒性。相反，我们发现PTPS-1-2在不同浓度的PTPS-1-2(0-400μg/mL)处理后促进了巨噬细胞的增殖。如图12A所示，对照组细胞较小，呈圆形，胞质紧密，细胞内无明显空泡。与正常对照组相比，不同浓度的PTPS-1-2或LPS刺激后细胞形态发生明显变化。细胞形态变为扁平星状细胞，有许多片状伪足延伸，细胞质呈颗粒状，同时可见数个掌状突起。随着PTPS-1-2浓度的增加，形态变化越来越明显。结果表明，经PTPS-1-2刺激的RAW264.7细胞由正常状态变为激活状态(图12A-C)。
10.蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)对RAW264.7细胞炎症介质表达的影响。
当巨噬细胞受到刺激时，会引起炎症因子TNF-α和IL-6的大量分泌，这不仅是巨噬细胞活化的标志，也是一系列后续免疫反应的介质。因此，我们研究了巨噬细胞产生TNF-α和IL-6，这些巨噬细胞已经用LPS(1μg/mL)作为阳性对照处理，以诱导这两种细胞因子的产生。然后我们用一系列PTPS-1-2浓度(0、100、200和400μg/mL)处理RAW264.7细胞24小时，发现这种处理与TNF-α的显著增加有关(图12D)和IL-6(图12E)的产生。这表明PTPS-1-2可以诱导RAW264.7巨噬细胞产生细胞因子(TNF-α、IL-6)，说明了该多糖具有免疫调节潜力。
11.蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)对RAW264.7细胞NF-κB信号通路的影响
核因子-κB(NF-κB)通路在人体的免疫反应中起着关键的调节作用。当巨噬细胞受到刺激时，多种因子可以激活NF-κB通路，从而激活巨噬细胞，增强免疫因子的正向调节。为了验证NF-κB通路在巨噬细胞活化中的作用，通过蛋白质印迹分析检测PTPS-1-2对NF-κB信号通路中p65和IκBα磷酸化蛋白表达的影响。结果表明，PTPS-1-2刺激细胞后(图12H)，磷酸化P65和磷酸化IκBα的表达呈剂量相关性显著增加，p-p65与p65和p-IκBα与IκBα的比例与对照组相比，PTPS-1-2组显著增加(图12F-G)，表明PTPS-1-2对巨噬细胞的激活可能是通过激活NF-κB信号通路来实现的。
12.蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)将巨噬细胞极化转向M1型
为了描述巨噬细胞的差异表型，通过实时定量PCR分析了M1和M2标记的表达。首先，我们分析了巨噬细胞施用PTPS-1-2后iNOS、TNF-α和IL-4mRNA的表达。结果显示，PTPS-1-2处理后M1标志物(iNOS和TNF-α)的mRNA水平显著上调(图13A-B)，而M2标志物(IL-4)没有变化(图13C)。为了进一步研究PTPS-1-2处理与巨噬细胞极化之间的关系，使用LPS在体外将RAW264.7细胞极化为M1型。如图13D所示，经PTPS-1-2处理后，M1标记基因(CD86和CD16)增加，M2标记基因(CD206)保持不变。这些结果表明PTPS-1-2处理可以增加巨噬细胞极化为M1表型的倾向。
13.蒲黄均一多糖(PTPS-1-2)激活抑制RKO细胞增殖并诱导细胞凋亡
为了进一步研究PTPS-1-2活化的的抗肿瘤活性，建立了用PTPS-1-2预处理的的条件培养基(CM)(图14A)。如图14B所示，用PTPS-1-2预处理的的CM对RKO细胞的增殖表现出显著的抑制作用。同时，通过集落形成单位测定法测量用CM处理后RKO细胞的克隆存活率。结果显示，经PTPS-1-2预处理的的CM处理的RKO细胞的集落形成效率被显著抑制(图14C)。此外，还通过活/死染色确定了用PTPS-1预处理的CM对CRC细胞凋亡的影响。结果表明，用CM处理后，RKO细胞中钙黄绿素-AM染色的活细胞数量显著减少，具有红色荧光的死细胞显著增加(图14D)。此外，流式细胞术分析以评估用PTPS-1-2预处理的的CM在RKO细胞凋亡中的作用。如14E所示，RKO细胞的凋亡率以PTPS-1-2的剂量依赖性方式显著增加。
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (57)
1.一种蒲黄均一多糖，其特征在于，峰高分子量为5.605×104Da至6.195×104Da，由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和半乳糖组成，单糖摩尔比为鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖＝3.6:30.5:6.1:58.9，所述蒲黄均一多糖的骨架包含T-β-D-Galp、1,3-β-D-Galp、1,6-β-D-Galp、1,3,6-β-D-Galp、T-β-D-4-OMe-GlcpA、T-α-D-GalpA和1,4-α-D-GalpA。
2.根据权利要求1所述的蒲黄均一多糖，其特征在于，所述蒲黄为水烛香蒲、东方香蒲或其它蒲黄属植物的干燥花粉。
3.根据权利要求1所述的蒲黄均一多糖，其特征在于，所述蒲黄均一多糖的分支包含鼠李糖和阿拉伯糖。
4.根据权利要求3所述的蒲黄均一多糖，其特征在于，所述蒲黄均一多糖的所述分支包含1,5-α-L-Araf、T-α-L-Araf和/或T-α-L-Rhap。
5.一种制备权利要求1至4中任一项所述的蒲黄均一多糖的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
(1)将蒲黄药材用水进行加热提取，得到水提液；
(2)将所述水提液进行浓缩后离心以除去不溶物，得到浓缩液；
(3)将所述浓缩液进行乙醇沉淀，离心以分离沉淀，得到沉淀部分；
(4)将所述沉淀部分洗涤后加入水溶解并冷冻干燥，得到蒲黄粗多糖；
(5)将所述蒲黄粗多糖用水溶解后离心，得到第一上清液；以及
(6)将所述第一上清液进行DEAE琼脂糖凝胶柱层析和SuperdexTM75或SuperdexTM 200凝胶柱层析，采用H2O和/或0.1～2.0mol/L氯化钠溶液进行洗脱，检测糖峰并收集含糖流份，得到蒲黄均一多糖。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下的[1]～[20]项中的任意一项或者多项：
[1]将所述蒲黄药材进行粉碎；
[2]步骤(1)中所用水为蒸馏水或去离子水；
[3]步骤(1)中，温度为50℃～100℃；
[4]将步骤(1)中的所述加热提取的操作重复一次或者多次，合并后得到所述水提液；
[5]步骤(1)中水的用量为1～50倍量L/kg；
[6]步骤(1)中的所述加热提取的时间为1～10小时；
[7]步骤(2)中，所述离心的条件为在2000×g～6000×g转速下离心10～30分钟；
[8]步骤(3)中，所述乙醇沉淀所用的所述乙醇的浓度为60％～98％；
[9]步骤(3)中所用的所述乙醇的量为所述浓缩液的1～5倍体积；
[10]步骤(3)中所述乙醇沉淀的时间为至少12小时；
[11]步骤(3)中，所述离心的条件为在2000×g～6000×g转速下离心10～30分钟；
[12]所述沉淀部分洗涤所用的所述乙醇的浓度为60％～98％；
[13]步骤(5)中水的用量为1～50倍量mL/g；
[14]步骤(5)中，所述离心的条件为在6000×g～15000×g转速下离心5～20分钟；
[15]步骤(6)中，所述第一上清液通过DEAE琼脂糖凝胶柱处理，分别用水、不同浓度的0.1－2.0mol/L氯化钠溶液依次洗脱，经浓缩、透析和冷冻干燥后，得到包含所述蒲黄均一多糖的馏分；
[16]在[15]项中，将所述包含所述蒲黄均一多糖的馏分溶解在氯化钠溶液中并离心，得到第二上清液；
[17]在[16]项中，所述氯化钠溶液的用量为0.01～0.1倍量mL/mg；
[18]在[16]项中，所述氯化钠溶液的浓度为0.1～2.0mol/L；
[19]在[16]项中，所述离心的条件为在6000×g～15000×g转速下离心5～20分钟；
[20]步骤(6)中，所述第二上清液通过Sephadex G-200凝胶柱层析，以0.1～2.0mol/L氯化钠溶液作为流动相进行洗脱。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[3]项中，所述温度为80℃～100℃。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[3]项中，所述温度为100℃。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[4]项中，所述加热提取的操作重复3次。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[5]项中，所述水的用量为5～30倍量L/kg。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[5]项中，所述水的用量为6～20倍量L/kg。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[5]项中，所述水的用量为8～15倍量L/kg。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[5]项中，所述水的用量为9.5～10.5倍量L/kg。
14.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[6]项中，所述加热提取的时间为2～8小时。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[6]项中，所述加热提取的时间为3～5小时。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[6]项中，所述加热提取的时间为2.85～3.15小时。
17.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[7]项中，所述离心的条件为在3000×g～5000×g转速下离心15～30分钟。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[7]项中，所述离心的条件为在3500×g～4500×g转速下离心15～25分钟。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[7]项中，所述离心的条件为在3800×g～4200×g转速下离心19～21分钟。
20.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[8]项中，所述乙醇沉淀所用的所述乙醇的浓度为80％～98％。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[8]项中，所述乙醇沉淀所用的所述乙醇的浓度为95％。
22.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[9]项中，所用的所述乙醇的量为所述浓缩液的3倍体积。
23.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[10]项中，所述乙醇沉淀的时间为至少24小时。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[10]项中，所述乙醇沉淀的时间为24～72小时。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[10]项中，所述乙醇沉淀的时间为48小时。
26.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[10]项中，所述乙醇沉淀的时间为24小时。
27.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[11]项中，所述离心的条件为在3000×g～5000×g转速下离心15～30分钟。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[11]项中，所述离心的条件为在3500×g～4500×g转速下离心15～25分钟。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[11]项中，所述离心的条件为在3800×g～4200×g转速下离心19～21分钟。
30.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[12]项中，所述沉淀部分洗涤所用的所述乙醇的浓度为80％～98％。
31.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[12]项中，所述沉淀部分洗涤所用的所述乙醇的浓度为95％。
32.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[13]项中，所述水的用量为5～30倍量mL/g。
33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[13]项中，所述水的用量为6～20倍量mL/g。
34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[13]项中，所述水的用量为8～15倍量mL/g。
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[13]项中，所述水的用量9.5～10.5倍量mL/g。
36.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[14]项中，所述离心的条件为在8000×g～12000×g转速下离心5～15分钟。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[14]项中，所述离心的条件为在10000×g转速下离心10分钟。
38.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[15]项中，所述DEAE琼脂糖凝胶柱为DEAE琼脂糖凝胶FF柱。
39.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[17]项中，所述氯化钠溶液的用量为0.02～0.08倍量mL/mg。
40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[17]项中，所述氯化钠溶液的用量为0.03～0.06倍量mL/mg。
41.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[17]项中，所述氯化钠溶液的用量为0.04倍量mL/mg。
42.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[18]项中，所述氯化钠溶液的浓度为0.1～1.0mol/L。
43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[18]项中，所述氯化钠溶液的浓度为0.2mol/L。
44.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[19]项中，所述离心的条件为在8000×g～12000×g转速下离心5～15分钟。
45.根据权利要求44所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[19]项中，所述离心的条件为在10000×g转速下离心10分钟。
46.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[20]项中，所述氯化钠溶液的浓度为0.1～1.0mol/L。
47.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，在所述方法的第[20]项中，所述氯化钠溶液的浓度为0.2mol/L。
48.一种蒲黄均一多糖，其由权利要求5至47中任一项所述的方法制得。
49.一种蒲黄药物制剂，其包含权利要求1至4中任一项所述的蒲黄均一多糖或权利要求48所述的蒲黄均一多糖，以及任选的药学上可接受的辅料。
50.根据权利要求49所述的蒲黄药物制剂，其特征在于，所述蒲黄药物制剂进一步包含其它调节细胞免疫活性的药物或者提高免疫力的药物。
51.根据权利要求49所述的蒲黄药物制剂，其特征在于，所述蒲黄药物制剂为口服制剂、注射制剂或冻干粉针剂。
52.权利要求1至4中任一项所述的蒲黄均一多糖或权利要求48所述的蒲黄均一多糖或权利要求49至51中任一项所述的蒲黄药物制剂在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药品、食品和/或保健品中的用途。
53.根据权利要求52所述的用途，其特征在于，所述蒲黄均一多糖或所述蒲黄药物制剂为调节细胞免疫活性的药物或者提高免疫力的药物。
54.根据权利要求53所述的用途，其特征在于，所述调节为以下的一种或多种：促进巨噬细胞的增殖、诱导所述巨噬细胞产生炎症因子TNF-α和IL-6、通过NF-kB信号通路激活所述巨噬细胞和/或将所述巨噬细胞极化转向M1型。
55.根据权利要求52所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为结直肠肿瘤。
56.根据权利要求55所述的用途，其特征在于，所述结直肠肿瘤为结直肠良性肿瘤或结直肠恶性肿瘤。
57.根据权利要求56所述的用途，其特征在于，所述结直肠恶性肿瘤为结肠癌或直肠癌。
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| 蒲黄多糖的研究;缪平, 林垚, 金声;高等学校化学学报;19901215(12);全文 * |
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