CN116593546B

CN116593546B - 一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法

Info

Publication number: CN116593546B
Application number: CN202310470948.2A
Authority: CN
Inventors: 高红方; 丁怡琳; 平平; 王登弘; 马钰杰
Original assignee: Wuxi University
Current assignee: Wuxi University
Priority date: 2023-04-27
Filing date: 2023-04-27
Publication date: 2024-07-30
Anticipated expiration: 2043-04-27
Also published as: CN116593546A

Abstract

本发明公开一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法，包括：将Ru(bpy)₃ ²⁺、AuNPs和Nafion按比例混匀，修饰在玻碳电极表面，形成Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极；将假结DNA固定在修饰电极表面，得到电化学发光适体传感器；将电化学发光适体传感器浸入含有目标物的待测溶液中，进行孵育；孵育完成后，以电化学发光适体传感器作为工作电极，浸入含有三丙胺的PBS缓冲溶液中，采用电化学发光仪记录电化学发光强度，根据电化学发光强度与已知目标物含量建立的标准曲线，测定待测溶液中目标物的含量。本发明步骤简单，分析快速，适体和目标物在均相溶液中发生反应，提高识别效率。

Description

一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法。

背景技术

膝沟藻毒素作为麻痹性贝类毒素中最具有代表性的神经毒素之一，严重影响身体健康、威胁患者生命。因此能够及时检测水体中膝沟藻毒素，是人们比较关注的问题。目前，常用的膝沟藻毒素检测方法主要包括小鼠生物学法、液相色谱法和免疫分析法等，而这些检测方法由于检测时间长，灵敏度不高，设备过大不易操作，需要专业的技术人员操作等问题。因此，亟需发展一种高灵敏、高选择、简单快速的电化学发光分析方法，实现水体中膝沟藻毒素的检测。

邻位连接技术是一种高灵敏度和高特异性的体外分析方法，具有灵敏度高、选择性好、简单快速、一步识别等优点在环境检测中显示出巨大的潜力。该方法是通过一对标记有一段寡核苷酸（单链DNA）的单克隆或者多克隆抗体的探针作为邻位探针，对目标蛋白进行识别，实现对目标蛋白的检测。目前邻位连接分析的识别元素主要分为适体和抗体两种，但是小分子化合物的结构太小，由于位阻效应，不能通过两个抗体或两个适体进行识别，因此限制了该方法的应用。此外，尽管邻位连接分析方法已取得了一定的进展，但是基于DNA结构转化的假结DNA及多种信号放大协同作用的邻位连接分析还未报道。

发明内容

解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法，能有效解决现有方法检测时间长，灵敏度不高，设备过大不易操作，需要专业的技术人员操作等问题。

技术方案：一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法，包括以下步骤：

S1、将Ru(bpy)₃ ²⁺、AuNPs和Nafion按比例混合均匀，修饰在玻碳电极表面，形成Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极；

S2、将假结DNA通过金硫键自组装固定在Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极表面，得到电化学发光适体传感器；

S3、将步骤S2得到的电化学发光适体传感器浸入含有目标物的待测溶液中，进行孵育；

S4、孵育完成后，以电化学发光适体传感器作为工作电极，浸入含有三丙胺的PBS缓冲溶液中，采用电化学发光仪记录电化学发光强度，根据电化学发光强度与已知目标物含量建立的标准曲线，测定待测溶液中目标物的含量。

优选的，所述假结DNA为茎环结构，一端修饰巯基，另一端修饰有二茂铁，且与茎环的环杂交，形成假结DNA。

进一步的，所述假结DNA的茎部和假结处分别含有5-9个互补的碱基对，且假结DNA与环的第三、第四或第五个碱基开始互补。

更进一步的，所述假结DNA的茎部和假结处分别含有7个互补的碱基对，且假结DNA与环的第四个碱基开始互补。

优选的，所述假结DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.0所示。

优选的，步骤S2的具体过程为：将Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极浸入浓度为5-20 μmol/L的假结DNA溶液中，孵育1-5 h后，通过金硫键自组装于Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极表面，然后再浸入浓度为 0.5-2 mmol/L 巯基乙醇中，封闭20-50min，得到电化学发光适体传感器。

优选的，所述待测溶液中包含适体和DNA1，其中适体的终浓度为1-10 nM，DNA1的终浓度为1-10 nM，所述DNA1一端修饰有二茂铁。

优选的，所述待测溶液的溶剂为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的浓度为75-150mmol/L、pH为7.4。

进一步的，PBS缓冲液的浓度为100 mmol/L。

进一步的，所述适体与DNA1含有8-12个互补的碱基对，适体与假结DNA有13-17个互补的碱基对，所述DNA1与假结DNA含有5-9个互补的碱基对。

更进一步的，所述DNA1与适体含有10个互补的碱基对，所述假结DNA与适体含有15个互补的碱基对，所述假结DNA与DNA1含有7个互补的碱基对。

进一步的，所述DNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，步骤S3中所述孵育的条件为25-37℃孵育30-90 min。

优选的，步骤S4中电化学发光适体传感器在浸入含有三丙胺的PBS缓冲溶液前，用pH为7.4、浓度为5-20 mmol/L的PB缓冲液冲洗，含有三丙胺的PBS缓冲溶液中三丙胺的终浓度为25-75 mmol/L，所述PBS缓冲溶液的浓度为75-150 mmol/L、pH为7.4。

有益效果：本发明一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法，通过假结DNA、DNA1和目标物竞争性地与适体结合，破坏邻位连接复合物的形成，淬灭剂二茂铁远离电极表面，电化学发光信号增强；通过假结DNA的特殊设计，采用一个适体识别的方式，构建了“信号增强”型电化学发光适体传感模式，并基于金纳米粒子和双淬灭剂协同信号放大，提高灵敏度。本方法为一步法检测，步骤简单，分析快速，适体和目标物在均相溶液中发生反应，提高识别效率。

附图说明

图1是本发明一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法的原理图；

图2是本发明一实施例中假结DNA及假结DNA、适体与DNA1形成的邻位连接复合物的结构和自由能的NUPACK分析图，其中A为假结DNA的结构和自由能的NUPACK分析图，B为假结DNA、适体与DNA1形成的邻位连接复合物的结构和自由能的NUPACK分析图；

图3是本发明一实施例中电化学发光适体传感器与不同浓度膝沟藻毒素孵育后的电化学发光曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明：

实施例1

一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法，包括以下步骤：

如图1所示，本发明一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法的原理为：将由假结DNA与Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极通过金硫键自组装形成的电化学发光适体传感器浸入含有适体和DNA1的待测溶液中并加入目标物混合；当无目标物时，假结DNA、适体和DNA1发生邻位杂交，使得假结DNA和DNA1上标记的二茂铁靠近电极表面，电化学发光降低；当有目标物时，目标物和适体结合，破坏了邻位连接复合物的形成，假结DNA上的二茂铁远离电极表面，电化学发光信号增强。

实施例2

S1、将Ru(bpy)₃ ²⁺、AuNPs和Nafion按比例混合均匀，修饰在玻碳电极表面，形成Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极；具体过程为：

将0.5 vol.% Nafion、AuNPs和1 mmol/L Ru(bpy)₃ ²⁺溶液按体积比1:2:1混合均匀，超声30分钟，得到混合液，然后滴10 μL混合液于2 mm玻碳电极表面，在室温下晾干，得到Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极。

S2、将假结DNA通过金硫键自组装固定在Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极的表面，得到电化学发光适体传感器；具体过程为：

室温条件下，将Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极浸入浓度为5 μmol/L的假结DNA溶液中，孵育1 h，使其通过金硫键自组装于Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极表面，用浓度为5 mmol/L、pH为7.4的PB缓冲液对电极进行冲洗，来除去未组装在Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极表面的假结DNA；然后再将其浸入浓度为0.5 mmol/L巯基乙醇中，封闭20 min，制得电化学发光适体传感器。

S3、将步骤S2得到的电化学发光适体传感器浸入含有目标物的待测溶液中，进行孵育，孵育条件为25 ℃下孵育30 min；具体过程为：

以PBS缓冲液作为待测溶液的溶剂，PBS缓冲液浓度为75 mmol/L、pH为7.4；向PBS缓冲溶液中分别加入适体和DNA1，使待测溶液包含1 nmol/L的适体、1 nmol/L的DNA1，于25℃下孵育30 min。

S4、孵育完成后，以电化学发光适体传感器作为工作电极，浸入含有三丙胺的PBS缓冲溶液中，采用电化学发光仪记录电化学发光强度，根据电化学发光强度与已知目标物含量建立的标准曲线，测定待测溶液中目标物的含量；具体过程为：

以孵育后的电化学发光适体传感器作为工作电极，用pH为7.4、浓度为5 mmol/L的PB缓冲液冲洗工作电极，然后，浸入浓度为25 mmol/L的三丙胺溶液中，其中，三丙胺溶液是以三丙胺为溶质，以pH为7.4、浓度为75 mmol/L的PBS缓冲液为溶剂制备而成。电化学发光反应中，其参比电极为Ag/AgCl，对电极为铂丝，在0-1.45 V电位范围内进行循环伏安扫描，扫速速度：100 mV/s，负高压：-500 V，记录电化学发光强度，根据1.22 V处的电化学发光强度和已知不同浓度梯度膝沟藻毒素的对数值建立标准曲线；建立标准曲线后，按照上述步骤测定未知浓度膝沟藻毒素的含量。

实施例3

S1、将Ru(bpy)₃ ²⁺、AuNPs和Nafion按比例混合均匀，修饰在玻碳电极表面，形成Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极；具体步骤同实施例2中步骤S1。

S2、将假结DNA通过金硫键自组装固定在Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极表面，得到电化学发光适体传感器；具体过程为：

室温条件下，将Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极浸入浓度为10 μmol/L的假结DNA溶液中，孵育3 h，使其通过金硫键自组装于Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极表面，用浓度为10 mmol/L、pH为7.4的PB缓冲液对电极进行冲洗，来除去未组装在Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极表面的假结DNA；然后再将其浸入浓度为1 mmol/L 巯基乙醇中，封闭30 min，制得电化学发光适体传感器；

其中，假结DNA为茎环结构，一端修饰巯基，另一端修饰二茂铁，且与茎环的环杂交；假结DNA的茎部和假结处分别含有连续互补的碱基对。其结构为：5′-HS(CH₂)₆-GCGAGGGCCCGTTCCATCCAACCTCGCCGAAAAAAAAAAAAAAAATGGAACG-Fc-3′，核苷酸序列如SEQ ID NO.0所示，即

SEQ ID NO.0：

GGCGAGGGCCCGTTCCATCCAACCTCGCCGAAAAAAAAAAAAAAAATGGAACG

用Nupack分析了假结DNA的结构和吉布斯自由能，结果如图2中A所示：假结DNA的吉布斯自由能为-6.98 kcal/mol。

S3、将步骤S2得到的电化学发光适体传感器浸入含有目标物的待测溶液中，进行孵育，孵育条件为37 ℃下孵育60 min；具体过程为：

以PBS缓冲液为待测溶液的溶剂，PBS缓冲液浓度为100 mmol/L、pH为7.4；向PBS缓冲溶液中分别加入适体和DNA1，使待测溶液包含5 nmol/L的适体、5 nmol/L的DNA1，于37℃下孵育60 min；

DNA1一端修饰有二茂铁，其结构为：5′-TTGGAAACCACCTCGCC-Fc-3′，序列如SEQ IDNO:1所示，即

SEQ ID NO.1：

TTGGAAACCACCTCGCC

适体与DNA1之间、适体与假结DNA之间、以及DNA1与假结DNA之间均含有连续互补的碱基对；用Nupack分析了假结DNA、适体与DNA1的结构和吉布斯自由能，结果如图2中B所示：假结DNA、适体和DNA1形成的邻位连接复合物的吉布斯自由能为-40.07kcal/mol；图2中A和B证明本发明设计的假结DNA和DNA1是成功的，设计的方案是可行的。

以孵育后的电化学发光适体传感器作为工作电极，用pH为7.4、浓度为10 mmol/L的PB缓冲液冲洗工作电极，然后，浸入浓度为50 mmol/L的三丙胺溶液中，其中，三丙胺溶液是以三丙胺为溶质，以pH为7.4、浓度为100 mmol/L的PBS缓冲液为溶剂制备而成。电化学发光反应中，参比电极为Ag/AgCl，对电极为铂丝，在0-1.45 V电位范围内进行循环伏安扫描，扫速速度：100 mV/s，负高压：-500 V，记录电化学发光强度，根据1.22 V处的电化学发光强度和已知不同浓度梯度膝沟藻毒素的对数值建立标准曲线；建立标准曲线后，按照上述步骤测定未知浓度膝沟藻毒素的含量。

按照本实施例的方法分别分析浓度为0、0.05、0.5 ng/mL膝沟藻毒素的电化学发光性能，结果如图3所示：如图3中的a所示，当膝沟藻毒素的浓度为0 ng/mL时，电化学发光强度为1934；如图3中的b所示，当膝沟藻毒素的浓度为0.05 ng/mL，电化学发光强度增加至4420；如图3中的c所示，当膝沟藻毒素的浓度为0.5 ng/mL，电化学发光强度进一步增加至8691。进一步证明本发明设计的方案是可行的。

实施例4

室温条件下，将Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极浸入浓度为20 μmol/L的假结DNA溶液中，孵育5 h，使其通过金硫键自组装于Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极表面，用浓度为20 mmol/L、pH为7.4的PB缓冲液对电极进行冲洗，来除去未组装在Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极表面的假结DNA；然后再将其浸入浓度为2 mmol/L 巯基乙醇中，封闭50 min，制得电化学发光适体传感器。

S3、将步骤S2得到的电化学发光适体传感器浸入含有目标物的待测溶液中，进行孵育；具体过程为：

以PBS缓冲液为待测溶液的溶剂，PBS缓冲液浓度为150 mmol/L、pH为7.4；向PBS缓冲溶液中分别加入适体和DNA1，使待测溶液包含10 nmol/L的适体、10 nmol/L的DNA1，于37℃下孵育90 min。

以孵育后的电化学发光适体传感器作为工作电极，用pH为7.4、浓度为20 mmol/L的PB缓冲液冲洗工作电极，然后，浸入浓度为75 mmol/L的三丙胺溶液中，其中，三丙胺溶液是以三丙胺为溶质，以pH为7.4、浓度为150 mmol/L的PBS缓冲液为溶剂制备而成。电化学发光反应中，参比电极为Ag/AgCl，对电极为铂丝，在0-1.45 V电位范围内进行循环伏安扫描，扫速速度：100 mV/s，负高压：-500 V，记录电化学发光强度，根据1.22 V处的电化学发光强度和已知不同浓度梯度膝沟藻毒素的对数值建立标准曲线；建立标准曲线后，按照上述步骤测定未知浓度膝沟藻毒素的含量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2、将假结DNA通过金硫键自组装固定在Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极表面，得到电化学发光适体传感器，所述假结DNA为茎环结构，一端修饰巯基，另一端修饰有二茂铁，且与茎环的环杂交，形成假结DNA；

S3、将步骤S2得到的电化学发光适体传感器浸入含有目标物的待测溶液中，进行孵育，所述待测溶液中包含适体和DNA1，其中适体的终浓度为1-10 nM，DNA1的终浓度为1-10 nM，所述DNA1一端修饰有二茂铁，所述适体与DNA1含有8-12个互补的碱基对，适体与假结DNA有13-17个互补的碱基对，所述DNA1与假结DNA含有5-9个互补的碱基对；

2.根据权利要求1所述的一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法，其特征在于：所述假结DNA的茎部和假结处分别含有5-9个互补的碱基对，且假结DNA与环的第三、第四或第五个碱基开始互补。

3.根据权利要求1所述的一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法，其特征在于：所述假结DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法，其特征在于，步骤S2的具体过程为：将Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极浸入浓度为5-20μmol/L的假结DNA溶液中，孵育1-5 h后，通过金硫键自组装于Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极表面，然后再浸入浓度为 0.5-2 mmol/L 巯基乙醇中，封闭20-50 min，得到电化学发光适体传感器。

5.根据权利要求1所述的一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法，其特征在于：所述DNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.根据权利要求1所述的一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法，其特征在于：步骤S3中所述孵育的条件为25-37℃孵育30-90 min。

7.根据权利要求1所述的一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法，其特征在于：步骤S4中电化学发光适体传感器在浸入含有三丙胺的PBS缓冲溶液前，用pH为7.4、浓度为5-20 mmol/L的PB缓冲液冲洗，含有三丙胺的PBS缓冲溶液中三丙胺的终浓度为25-75 mmol/L，所述PBS缓冲溶液的浓度为75-150 mmol/L、pH为7.4。