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CN116585272A - 喷雾冷冻干燥法制备融合蛋白吸入微粉剂 - Google Patents

喷雾冷冻干燥法制备融合蛋白吸入微粉剂 Download PDF

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CN116585272A CN202310819168.4A CN202310819168A CN116585272A CN 116585272 A CN116585272 A CN 116585272A CN 202310819168 A CN202310819168 A CN 202310819168A CN 116585272 A CN116585272 A CN 116585272A
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刘溪
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Sichuan Jianlin Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明涉及喷雾冷冻干燥法制备融合蛋白吸入微粉剂。一方面，本发明涉及一种用于经肺吸入或者经鼻喷雾给药的微粉剂，其包含融合蛋白AAFP和水溶性药用载体。该微粉剂具有1~50μm的质量中值空气动力学粒径，所述水溶性药用载体选择甘露醇、乳糖、山梨糖醇、海藻糖、菊粉或其组合；融合蛋白AAFP与水溶性药用载体的质量比为1：10~2000，使融合蛋白AAFP和水溶性药用载体溶解于水中制成固形物浓度为1~50%的溶液后通过喷雾冷冻干燥的方法制成的微粉。本发明微粉剂呈现优良的性能例如具有优良理化性能和生物学性能。

Description

喷雾冷冻干燥法制备融合蛋白吸入微粉剂
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种微粉状的吸入制剂，尤其涉及一种以融合蛋白为生物活性物质的吸入制剂，还涉及该吸入制剂的制备方法，尤其是使用喷雾冷冻干燥方法制备的融合蛋白吸入制剂。该吸入制剂还可以通过鼻腔给药。
背景技术
支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性气道疾病，它表现为气道炎症，黏液分泌增多以及气道高反应性。Th2细胞，嗜酸性粒细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞以及其他一些炎症因子，趋化因子等共同参与了过敏性哮喘的炎症应答。在过去的几十年里，由于空气污染等环境因素，全世界哮喘的发生率，发病率以及死亡率快速增长。β2-受体激动剂、抗胆碱能药物和吸入糖皮质激素是治疗哮喘的主要药物，起到支气管扩张或抗炎的效果。但其作用机制专注在炎性介质释放后的症状改善，并未从本质上阻断过敏反应的发生。部分患者用药后症状并无效果，因此在传统化药的基础上，亟需寻找新的靶点，开发在炎性介质释放前阻断过敏反应的生物药，满足临床上更多的治疗需求。
Xolair(通用名称：注射用奥马珠单抗)是全球唯一用于治疗和预防过敏性疾病的生物大分子药，用于经吸入型糖皮质激素和长效吸入型β2-肾上腺素受体激动剂治疗后，仍不能有效控制症状的中至重度持续性过敏性哮喘。Xolair是冻干制剂，复溶后经皮下注射给药。Xolair与IgE结合，从而防止IgE与嗜碱性粒细胞和肥大细胞的FcεRI(高亲和力IgE受体)结合，降低可导致过敏级联反应的游离IgE水平。但是该产品仍有不足之处，如保存条件苛刻，需2～8℃保存；使用时，复溶时间较长，15-20分钟方可溶解，甚至更长；给药不便，患者不宜自行注射。
重组人免疫球蛋白ε和γ的Fc融合蛋白(AAFP)是处于临床研究中的抗过敏生物药。AAFP可用于所有IgE介导的过敏反应，其作用机理是，直接交联过敏反应细胞表面的IgG受体FcγRIIb和IgE受体FcεRI，从而有效阻断细胞内激活信号的传导，抑制介质释放。与Xolair相比，AAFP易于溶解，给药剂量小，起效快、不需长期联合用药，粘膜给药无明显副作用。
如以哮喘为适应症，AAFP的优先剂型应是粉雾剂。粉雾剂是治疗哮喘最主要、最具优势的剂型。通过吸入给药，药物直达肺部，起效快，药物利用率高，可降低治疗所需剂量；减少系统性暴露，降低毒性，更安全；同时治疗无痛，便捷，患者依从性高。为获得可吸入的药物颗粒，常通过气流粉碎、喷雾干燥等技术手段将药物粒径降低至10μm以下。但由于生物药的特殊性，高强度的机械力、高温等因素都会导致其活性降低，对于生物药，上述常规的粉雾剂制备方式并不适用。
喷雾冷冻干燥技术无高强度的机械力应用、不使用高温干燥，为生物药制备成粉雾吸入剂提供了可行性。喷雾冷冻干燥将喷雾技术与冷冻干燥相结合，使液体雾化成微米级液滴，通过冷介质如液氮、冷空气等冻结成冰粒，最后利用冷冻干燥制备成固体粉末。制备成的粉末微观上为多孔、球形颗粒，具有良好的空气动力学性能。与传统热喷雾干燥相比，喷雾冷冻干燥全程在低温下进行，可避免高温对热敏性物料的破坏，尤其适用于蛋白质、多肽等生物制品的固体化，制得的粉末具有更高的生物活性。与传统冻干相比，喷雾冷冻干燥可实现对产品粒度、颗粒形态的控制，可获得微米级粒径粉末，颗粒大部分为多孔球形结构，密度较低，因此具有更优的空气动力学性能，即使颗粒的物理直径高于10μm也可入肺。
鉴于目前部分哮喘患者使用β2-受体激动剂、抗胆碱能药物和吸入糖皮质激素，无明显治疗效果，急需作用于新靶点的生物药满足该部分临床需求。而现有AAFP被设计成通过注射途径给药，需要专业人员进行操作，给药不便、有交叉污染的风险。吸入粉雾剂易于贮存、携带方便、起效迅速，对于呼吸道过敏疾病和哮喘的治疗更具优势。本领域期待有新的AAFP给药方案，例如通过吸入或鼻喷途径的用于融合蛋白AAFP的给药方案，尤其是例如通过经肺吸入或者鼻喷途径递送融合蛋白AAFP微粉。
发明内容
本发明的目的在于为融合蛋白AAFP提供一种新的给药方案，尤其是提供一种通过吸入或鼻喷途径使用融合蛋白AAFP的给药方案，特别是例如通过经肺吸入或者鼻喷途径给予融合蛋白AAFP微粉，以期用于呼吸道过敏或支气管哮喘等疾病的治疗。本发明人使用喷雾冷冻干燥法制备AAFP粉末，获得疏松多孔的球形颗粒，并通过吸入装置递送粉末，能够实现AAFP的经口吸入给药，维持原有生物活性的同时获得较高的肺部沉积量；本发明人还发现，通过调整颗粒粒径大小，AAFP粉末也可制备成鼻喷剂，用于过敏性鼻炎的治疗。本发明基于此类发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种用于经肺吸入或者经鼻喷雾给药的微粉剂，其包含融合蛋白AAFP和水溶性药用载体。
根据本发明第一方面的微粉剂，其具有1～50μm的质量中值空气动力学粒径，例如其具有1～20μm的质量中值空气动力学粒径，例如其具有1～10μm的质量中值空气动力学粒径，例如其具有1～5μm的质量中值空气动力学粒径。
根据本发明第一方面的微粉剂，其中所述水溶性药用载体选择甘露醇、乳糖、山梨糖醇、海藻糖、菊粉或其组合。
根据本发明第一方面的微粉剂，其中融合蛋白AAFP与水溶性药用载体的质量比为1：10～2000，例如质量比为1：20～1500，例如质量比为1：50～1000，例如质量比为1：100～500。
根据本发明第一方面的微粉剂，其是使融合蛋白AAFP和水溶性药用载体溶解于水中后通过喷雾冷冻干燥的方法制成的微粉。
根据本发明第一方面的微粉剂，其是使融合蛋白AAFP和水溶性药用载体溶解于水中制成固形物浓度为1～50％的溶液后通过喷雾冷冻干燥的方法制成的微粉，例如溶解于水中制成固形物浓度为2～40％的溶液，例如溶解于水中制成固形物浓度为3～30％的溶液，例如溶解于水中制成固形物浓度为5～20％的溶液；例如，该溶液中还添加0.12％硫酸铵和0.02％磷脂酰丝氨酸。
根据本发明第一方面的微粉剂，其是使用包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)使融合蛋白AAFP和水溶性药用载体以及任选的其余辅料溶解于水中制成溶液；
(2)将配制的溶液喷雾至液氮中，静置适时，将冰粒转移至使用干冰保温的不锈钢托盘内，待液氮挥发至残余量较少时，转移到预冷至-20℃以下的冷冻干燥机内；
(3)待液氮挥发完毕，抽真空并运行冻干程序，使冰粒干燥成微粉直至该微粉水分含量小于5％，得到用于经肺吸入或者经鼻喷雾给药的微粉剂。
根据本发明第一方面的微粉剂，其中步骤(2)将配制的溶液喷雾至杜瓦瓶保温的液氮中。
根据本发明第一方面的微粉剂，其中步骤(2)将配制的溶液喷雾至杜瓦瓶保温的液氮中，喷雾完毕后静置15～60min例如20～40min例如30min。
根据本发明第一方面的微粉剂，其中步骤(2)喷雾用的喷嘴选自气流喷嘴、超声喷嘴、振动筛喷嘴或能产生雾滴的其他喷嘴方式。
根据本发明第一方面的微粉剂，其中步骤(2)喷雾时，进液速度10～60ml/min。不同的喷嘴类型虽然操作参数不同(例如气流喷嘴要控制进气压力、超声喷嘴要控制超声频率)，但是可以通过调整进液速度来获得优良喷雾效果。
根据本发明第一方面的微粉剂，其中步骤(2)待液氮挥发至残余量较少时，转移到预冷至-20～-40℃例如-25～-35℃例如-30℃的冷冻干燥机内。
根据本发明第一方面的微粉剂，其中步骤(3)运行的冻干程序为：初级干燥，真空度0.05～0.15mbar例如0.1mbar，以0.5～2℃/min例如1℃/min的速度升温至-5～-15℃，然后恒温15～20h；二级干燥，真空度0.02～0.1mbar，以0.5～1℃/min的速度升温至25～30℃，然后恒温3～10h例如4～8h，得干燥的吸入用微粉的粉雾剂。
根据本发明第一方面的微粉剂，其中步骤(3)所得微粉进一步分装至空心胶囊中以用于经肺吸入或者经鼻喷雾给药。
本发明微粉剂制备时，药液经上述喷雾冷冻处理，雾滴在冷冻介质中冻结为冰粒。静置10～60min使冰粒沉淀，收集冰粒，转移至冻干机内。为避免冰粒融化造成粒径改变，转移过程采用干冰等保温；在转移至冻干机前，保证冰粒一直被冷冻介质包围；冻干机提前预冷至零下低温。冷冻介质挥发完毕后，运行冻干程序。冻干程序包括如上文所述的初级干燥、二次干燥。由此获得干燥的AAFP制剂粉末，其颗粒形态为多孔的球形，具有良好的气动性。除减压冷冻干燥外，冰粒的干燥也可通过其他冷冻干燥技术实现，如CN202110648469.6描述了一种通过高速干燥冷风实现常压冷冻干燥的方法和设备，该方法和设备将喷雾冷冻与冷冻干燥一体化，保证了生产的连续性、最大程度地规避了冰粒融化造成的粒径改变。
本发明粉雾剂用于经肺吸入给药时，AAFP吸入粉雾剂优选一次性单剂吸入装置，也可选择胶囊型、泡罩型、储库型等可重复使用的干粉吸入器。AAFP吸入粉雾剂经口吸入使用，装置内的粉末受患者吸入气流驱动，在装置内解聚分散，然后递送入肺。本发明人团队在中国专利申请号2022109127801的发明专利文献中详细介绍了多种吸入器，该文献资料的全部内容通过引用并入本文。AAFP鼻喷剂优选具有附加动力的主动递送装置，由泵或其他机械装置驱动，进行粉末递送，触发时经鼻协同吸入。
进一步的，本发明第二方面提供了制备用于经肺吸入或者经鼻喷雾给药的微粉剂的方法，该微粉剂包含融合蛋白AAFP和水溶性药用载体，包括如下步骤：
(1)使融合蛋白AAFP和水溶性药用载体以及任选的其余辅料溶解于水中制成溶液；
(2)将配制的溶液喷雾至液氮中，静置适时，将冰粒转移至使用干冰保温的不锈钢托盘内，待液氮挥发至残余量较少时，转移到预冷至-20℃以下的冷冻干燥机内；
(3)待液氮挥发完毕，抽真空并运行冻干程序，使冰粒干燥成微粉直至该微粉水分含量小于5％，得到用于经肺吸入或者经鼻喷雾给药的微粉剂。
根据本发明第二方面的方法，其所制得的微粉剂具有1～50μm的质量中值空气动力学粒径，例如其具有1～20μm的质量中值空气动力学粒径，例如其具有1～10μm的质量中值空气动力学粒径，例如其具有1～5μm的质量中值空气动力学粒径。
根据本发明第二方面的方法，其中所述水溶性药用载体选择甘露醇、乳糖、山梨糖醇、海藻糖、菊粉或其组合。
根据本发明第二方面的方法，其中融合蛋白AAFP与水溶性药用载体的质量比为1：10～2000，例如质量比为1：20～1500，例如质量比为1：50～1000，例如质量比为1：100～500。
根据本发明第二方面的方法，其是使融合蛋白AAFP和水溶性药用载体溶解于水中后通过喷雾冷冻干燥的方法制成的微粉。
根据本发明第二方面的方法，其是使融合蛋白AAFP和水溶性药用载体溶解于水中制成固形物浓度为1～50％的溶液后通过喷雾冷冻干燥的方法制成的微粉，例如溶解于水中制成固形物浓度为2～40％的溶液，例如溶解于水中制成固形物浓度为3～30％的溶液，例如溶解于水中制成固形物浓度为5～20％的溶液；例如，该溶液中还添加0.12％硫酸铵和0.02％磷脂酰丝氨酸。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(2)将配制的溶液喷雾至杜瓦瓶保温的液氮中。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(2)将配制的溶液喷雾至杜瓦瓶保温的液氮中，喷雾完毕后静置15～60min例如20～40min例如30min。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(2)喷雾用的喷嘴选自气流喷嘴、超声喷嘴、振动筛喷嘴或能产生雾滴的其他喷嘴方式。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(2)喷雾时，进液速度10～60ml/min。不同的喷嘴类型虽然操作参数不同(例如气流喷嘴要控制进气压力、超声喷嘴要控制超声频率)，但是可以通过调整进液速度来获得优良喷雾效果。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(2)待液氮挥发至残余量较少时，转移到预冷至-20～-40℃例如-25～-35℃例如-30℃的冷冻干燥机内。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(3)运行的冻干程序为：初级干燥，真空度0.05～0.15mbar例如0.1mbar，以0.5～2℃/min例如1℃/min的速度升温至-5～-15℃，然后恒温15～20h；二级干燥，真空度0.02～0.1mbar，以0.5～1℃/min的速度升温至25～30℃，然后恒温3～10h例如4～8h，得干燥的吸入用微粉的粉雾剂。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(3)所得微粉进一步分装至空心胶囊中以用于经肺吸入或者经鼻喷雾给药。
在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的各种实例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明制备的AAFP粉末，经流式细胞术检测，具有较高生物活性，经制剂工艺处理后生物活性未见损失。扫描电镜下可见颗粒为多孔球型，此类颗粒具有良好的空气动力学性能。
使用新一代级联撞击器测试，本发明制备的AAFP吸入粉雾剂的微细粒子分数最高可达25％以上可吸入进肺部的优良微粒性能(微细粒子分数即FPF，经空气动力学测试得来，该值越高预示着越多比例的药物可吸入进肺部)。该制剂可经口吸入给药，治疗无痛，便捷，患者依从性高；直达肺部，起效快，同时提高了药物利用率。
通过本发明制备的AAFP鼻喷剂，制剂为固体，储存运输方便。沉积在鼻腔，可靶向治疗过敏性鼻炎，提高药物利用率，降低用药剂量，减少全身毒副作用。
附图说明
图1：一种典型的吸入粉雾剂的扫描电镜图像。
图2：一种典型的鼻喷粉雾剂的扫描电镜图像。
图3：一种典型的吸入粉雾剂的流式细胞术测试结果。
具体实施方式
在本发明中，作为活性物质使用的融合蛋白AAFP可以通过市售途径获得，亦可使用本领域已知的方法获得。例如，通过使用CN114507291A(中国专利申请号202011278958.9，景峰)记载的方法获得可生产重组人免疫球蛋白ε和γ的Fc融合蛋白的CHO-K1细胞株；接着使用本领域常规方法从该细胞株获得融合蛋白AAFP，例如利用CD CHO(INVITROGEN，CA)培养基，在37℃，5％CO2培养上述CHO工程细胞株10～15天，高速离心收集上清液，再用离子交换和疏水层析分离纯化得到融合蛋白AAFP；如未另外说明，本发明使用的活性物质融合蛋白AAFP是购自上海碧博生物公司的GMP标准的产品。下文具体实例中列明喷雾用溶液的配方时，为方便起见以100ml的配液量列明，在实际制备时以融合蛋白AAFP投料量1g的量列明。
实施例1：使用喷雾冷冻干燥法制备AAFP吸入粉雾剂
喷雾用溶液的配方：50mg融合蛋白AAFP、5g甘露醇、水适量至100ml；将各物料按常法溶解制成溶液。
制法：
(1)使用二流体喷嘴(顶部接入，二流体空气雾化喷嘴，天津三安；喷雾进气压力5bar、进液速度45ml/min)将配制的溶液喷雾至杜瓦瓶保温的液氮中；
(2)喷雾完毕后使杜瓦瓶静置30min，然后将冰粒转移至使用干冰保温的不锈钢托盘内，待液氮挥发至残余量较少时，转移到预冷至-30℃的冻干机内；
(3)待液氮挥发完毕，运行以下冻干程序：初级干燥，真空度0.1mbar，以1℃/min的速度升温至-5℃，然后恒温15h；二级干燥，真空度0.02mbar，以0.5℃/min的速度升温至30℃，然后恒温4h，得干燥的吸入用微粉的粉雾剂；
(4)将干燥后的吸入用微粉填充至胶囊(每粒装10mg粉末)，可用于吸入器(市售可得)进行粉末递送。
经测定，本发明获得的全部干燥粉雾剂的微粉其水分含量均小于5％，均在2～3％范围内。
实施例2：使用喷雾冷冻干燥法制备AAFP吸入粉雾剂
喷雾用溶液的配方：50mg融合蛋白AAFP、10g甘露醇、水适量至100ml；将各物料按常法溶解制成溶液。
制法：
(1)使用超音波雾化喷嘴(顶部接入，上海焕领机电，JX4型，120kHz，进液速度10ml/min)将配制的溶液喷雾至杜瓦瓶保温的液氮中；
(2)喷雾完毕后使杜瓦瓶静置30min，然后将冰粒转移至使用干冰保温的不锈钢托盘内，待液氮挥发至残余量较少时，转移到预冷至-30℃的冻干机内；
(3)待液氮挥发完毕，运行以下冻干程序：初级干燥，真空度0.1mbar，以1℃/min的速度升温至-5℃，然后恒温20h；二级干燥，真空度0.02mbar，以1℃/min的速度升温至30℃，然后恒温5h，得干燥的吸入用微粉的粉雾剂；
(4)将干燥后的吸入用微粉填充至胶囊(每粒装10mg粉末)，可用于吸入器(市售可得)进行粉末递送。
实施例3：使用喷雾冷冻干燥法制备AAFP吸入粉雾剂
喷雾用溶液的配方：50mg融合蛋白AAFP、15g乳糖、水适量至100ml；将各物料按常法溶解制成溶液。
制法：
(1)使用PARI雾化器(德国百瑞，Compact N压缩雾化吸入机，进液速度30ml/min)将配制的溶液喷雾至杜瓦瓶保温的液氮中；
(2)喷雾完毕后使杜瓦瓶静置30min，然后将冰粒转移至使用干冰保温的不锈钢托盘内，待液氮挥发至残余量较少时，转移到预冷至-30℃的冻干机内；
(3)待液氮挥发完毕，运行以下冻干程序：初级干燥，真空度0.1mbar，以0.5℃/min的速度升温至-15℃，然后恒温15h；二级干燥，真空度0.1mbar，以0.5℃/min的速度升温至25℃，然后恒温8h，得干燥的吸入用微粉的粉雾剂；
(4)将干燥后的吸入用微粉填充至胶囊(每粒装15mg粉末)，可用于吸入器(市售可得)进行粉末递送。
实施例4：使用喷雾冷冻干燥法制备AAFP鼻喷粉雾剂
喷雾用溶液的配方：36mg融合蛋白AAFP、18g甘露醇、水适量至100ml；将各物料按常法溶解制成溶液。
制法：
(1)使用二流体喷嘴(顶部接入，二流体空气雾化喷嘴，天津三安；喷雾进气压力1bar、进液速度60ml/min)将配制的溶液喷雾至杜瓦瓶保温的液氮中；
(2)喷雾完毕后使杜瓦瓶静置60min，然后将冰粒转移至使用干冰保温的不锈钢托盘内，待液氮挥发至残余量较少时，转移到预冷至-30℃的冻干机内；
(3)待液氮挥发完毕，运行以下冻干程序：初级干燥，真空度0.1mbar，以1℃/min的速度升温至-10℃，然后恒温20h；二级干燥，真空度0.02mbar，以0.5℃/min的速度升温至30℃，然后恒温6h，得干燥的鼻喷用微粉的粉雾剂；
(4)将干燥后的鼻喷用微粉填充至胶囊(每粒装25mg粉末)，可用于经鼻喷雾给药进行鼻腔内的粉末递送。
以上实施例1～3粉雾剂更适宜经口吸入而实施例4更适宜经鼻喷雾，虽然它们本质上均可通过经口吸入和经鼻喷雾。
实施例5：空气动力学测试
如上文所述各实施例，在所得各种干燥微粉中的活性物质相对量非常低，使用更容易测定的化学物质代替融合蛋白制备干燥微粉，进而考察这类干燥微粉的空气动力学参数是可行的，也是本领域技术人员常用的药物替代性研究模型。本实施例使用硫酸沙丁胺醇等量代替融合蛋白AAFP并照实施例1～4处方和制法制得四种粉雾剂，以这四种粉雾剂为模拟制剂测定其空气动力学性能。空气动力学性能参照周颖文献(周颖，等，多方法测定硫酸沙丁胺醇吸入粉雾剂空气动力学粒径分布，中国新药杂志2017，26(12)：1428)之NGI法测定，具体如下。
参照《中国药典》2020年版四部通则之“0951吸入制剂微细粒子空气动力学特性测定法”装置3所用设备和方法进行，试验所用装置3为市售气雾粉雾两用新一代NGI药用撞击器系统(NGI主要参数：流速30-100升/分钟，粒径0.23-11μm，二级预分离器，7级中至少5级截止值位于0.5和6.5μm，抗腐蚀设计，校准30、60和100升/分钟)。
取滤膜放入NGI装置的微孔收集器(micro orifice collector，MOC)、在NGI的托盘上涂1.2％二甲硅油，组装NGI并向预分离器中加入10mL水；
连接泵、TPK、NGI、适配器，开启真空泵，调节流速60L/min，通过装置，检查P3/P2≤0.5，将计时器设为4s；
将待测吸入装置称重；
振摇吸入装置3次，通过适配器连接到NGI上，按下发射装置，将真空泵预热，开启TPK，4s后取下吸入装置，称量，记录读数；
同法发射10吸，每吸之间在除静电扇下放置2min；
用水冲洗适配器、预分离器、NGI各层级及滤膜并定量转移至量瓶中，超声10min，冷却至室温，加水稀释至刻度，过滤(0.45μm滤膜)，取续滤液即得；
用Copley NGI计算软件计算小于6.5μm的微细粒子剂量(fine particle dose，FPD)，并计算微细粒子分数(fine particle fraction，FPF)、质量中值空气动力学粒径(mass median aerodynamic diameter，MMAD)和几何标准偏差(geometric standarddeviation，GSD)等空气动力学参数，统计分析采用SPSS20.0软件的独立样本t检验，结果如下表(n＝10的均值)。
表：空气动力学结果
序号 FPF(％) MMAD(μm) GSD
实施例1 60.79 3.236 1.475
实施例2 49.40 3.693 1.613
实施例3 42.15 4.108 1.568
实施例4 50.27 5.274 1.684
由于每个实施例中的活性药物浓度不同，四种粉雾剂之间的FPD值不具直接比较意义因而在上表中未提供。由表中结果可见，本发明制备的AAFP吸入粉雾剂具有大于42％的较高肺部沉积量。一般地讲，具有1～5μm的质量中值空气动力学粒径的粉雾剂用于经肺干粉吸入，5-30微米的质量中值空气动力学粒径的粉雾剂可用于鼻喷给药。
尽管如上所述实施例1～4吸入用粉雾剂呈现良好的空气动力学性能，尤其是最观的FPF参数呈现本领域技术人员通常要求的大于25％的效果。然而，这些空气动力学结果的稳定性亦是本领域技术人员特别关注的。为此，本发明在此进行粉雾剂空气动力学(以FPF为指标)的考察：将实施例1～4所得胶囊用模拟上市产品的铝塑泡罩包装，置40℃放置3月，同上文方法测定每个样品0月和3月的FPF值，以0月FPF为基础，按下式计算某样品3月的相对FPF值：
相对FPF值＝(3月FPF÷0月FPF)×100％。
结果，实施例1～4之3月相对FPF值分别为64.3％、60.4％、67.7％、65.3％，这些结果表明四种粉雾剂相比于其0月有明显降低，例如实施例1粉雾剂3月时的FPF值为39.09％；
但是各样品在3月时的MMAD和GSD基本无变化，例如实施例1粉雾剂3月时的MMAD和GSD分别为3.213μm和1.492。
虽然上述4个粉雾剂样品在40℃处置3月后FPF仍然维持在25％以上的水平，但对上述相对FPF值的降低仍然是希望避免的。为了尽量避免相对FPF值的降低、保持粉雾剂的FPF值稳定是本领域技术人员所期待的。为此，本发明进行了一些补充实施例来制备粉雾剂以考察这些粉雾剂的FPF值稳定性，这些补充实施例具体如下。
补充实施例a：分别参考实施例1～4的配方和制法，以硫酸沙丁胺醇代替融合蛋白AAFP作为活性物质，配制的喷雾用溶液中还添加0.12％(w/v)硫酸铵和0.02％(w/v)磷脂酰丝氨酸，得到四种胶囊分装的粉雾剂，分别记为粉雾剂a1(参考实施例1所得，以下类同)、粉雾剂a2、粉雾剂a3、粉雾剂a4；
补充实施例b：分别参考实施例1～4的配方和制法，以硫酸沙丁胺醇代替融合蛋白AAFP作为活性物质，配制的喷雾用溶液中还添加0.12％(w/v)硫酸铵，得到四种胶囊分装的粉雾剂，分别记为粉雾剂b1、粉雾剂b2、粉雾剂b3、粉雾剂b4；补充实施例c：分别参考实施例1～4的配方和制法，以硫酸沙丁胺醇代替融合蛋白AAFP作为活性物质，配制的喷雾用溶液中还添加0.02％(w/v)磷脂酰丝氨酸，得到四种胶囊分装的粉雾剂，分别记为粉雾剂c1、粉雾剂c2、粉雾剂c3、粉雾剂c4；照实施例5方法测定三组补充实施例所得12种粉雾剂的空气动力学参数，结果0月时FPF均在46％～62％范围内、MMAD均在3.36～4.98μm范围内、GSD均在1.37～1.62范围内，例如粉雾剂a1在0月时的FPF＝61.74％、MMAD＝3.368μm、GSD＝1.436，这些结果表明三组粉雾剂在0月时的空气动力学参数与实施例1～4基本相同；12种粉雾剂经历40℃处置3月后MMAD均在3.52～5.34μm范围内、GSD均在1.32～1.71范围内，各粉雾剂与自身0月结果相比基本无变化，例如粉雾剂a1在3月时的MMAD＝3.472μm、GSD＝1.417；12种粉雾剂经历40℃处置3月后FPF值呈现不同组别之间有明显差异的变化，补充实施例a的4种粉雾剂FPF值基本无变化且粉雾剂a1～a4四者3月时的相对FPF值分别为93.7％、89.3％、91.6％、94.1％，而补充实施例b的4种粉雾剂FPF值明显降低且3月时的相对FPF值均在62.3％～67.6％范围内例如粉雾剂b1在3月时的相对FPF值为65.1％，补充实施例c的4种粉雾剂FPF值明显降低且3月时的相对FPF值均在63.4％～66.1％范围内例如粉雾剂c1在3月时的相对FPF值为64.8％，这表明在喷雾用溶液中添加规定量的硫酸铵和磷脂酰丝氨酸后能够显著地改善粉雾剂在经历长时间贮藏后的空气动力学稳定性。
实施例6：扫描电镜的结果
将导电胶带粘在样品台上，再均匀地把粉末样品撒在上面，用洗耳球吹去未粘牢的粉末，注意样品量不要过多，用ZEISS Sigma 300扫描电镜测试。如图1、2所示，分别为粉雾剂a1和粉雾剂a4样品的扫描电镜图像，两者均为多孔球形，粉雾剂a1所用溶液浓度较低，其孔隙率高于粉雾剂a4，拥有更好的空气动力学性能，适合递送入肺，而粉雾剂a4更适用于经鼻给药。另外的结果显示，实施例1～3粉雾剂以及粉雾剂c2和粉雾剂c3的扫描电镜图像与粉雾剂a1图像基本相同，实施例4粉雾剂的扫描电镜图像与粉雾剂a4图像基本相同。
实施例7：融合蛋白AAFP对OVA致小鼠过敏性哮喘的干预作用
本实施例所涉及的试验方法是本领域公知的并且在本发明中有所借鉴。本实验采用致敏-激发-再激发实验模式建立卵白蛋白(OVA)致小鼠哮喘模型[Kanehiro,et al,Inhibition of Phospho diesterase 4artenuates airway hyperresponsiveness andairwayInflammation in a model of seeondary allergenehallenge.Am.J.ResPir.Crit.Care Med.2001；163-173]。该模型很好地模拟了人类哮喘的发病过程。以此模型来评价AAFP对小鼠哮喘的干预作用。
致敏原在过敏性哮喘的发生和发展中占重要的地位，种类有很多，其中OVA是建立过敏性哮喘模型中最为常用的过敏原，氢氧化铝胶是其最为常用的免疫佐剂。佐剂在局部产生炎症反应，充分激活抗原递呈细胞，表达高水平的协同刺激因子，有效的产生免疫应答，防止脱敏现象，且铝制剂作为免疫佐剂易使机体产生IgE抗体，故同时加用氢氧化铝凝胶来作为免疫佐剂[Hoshino,H.et al.Inereased elastase and myeloperoxidaseactivity associated with neutrophil recruitment by IL-17in airways in vivo,J.Allergy Clin.Immunol 2003；105:143-149]。
本实验拟采用OVA为诱因的BALB/c小鼠过敏性哮喘模型，观察AAFP对BALF中炎性细胞数目的干预作用，探讨AAFP对IgE介导的过敏性哮喘的干预作用。
1、材料
实验动物：4-6周龄雌性BALB/c小鼠，18-20g，购于三峡大学实验动物中心，SCXK(鄂)2022-0012。
试药：以AAFP为活性物质分别使用实施例1所得粉雾剂(称为粉雾剂1)和补充实施例a参考实施例1方法所得粉雾剂即粉雾剂a1。
试剂与仪器：铝佐剂、卵白蛋白(OVA)均购自Sigma-Aldrich，其它常用试剂均可容易经由市售途径购得。超低温冰箱(赛默飞)；高速冷冻离心机(吉迪)。
2、配液
AAFP溶液：融合蛋白AAFP(原料)、粉雾剂1、粉雾剂a1分别用无菌生理盐水配制成以AAFP计1mg/ml的浓度，现用现配；
卵白蛋白致敏液：用铝佐剂配制成OVA浓度为50μg/mL混悬液，充分混匀后使用；
卵白蛋白激发液：用生理盐水配制成OVA浓度为150μg/mL的溶液。
3、方法
雌性4-6周龄BABL/c小鼠，体重18-29g，随机分成5组，每组10只，分别为阴性对照组(生理盐水)、模型组、AAFP组(10mg/kg)、粉雾剂1组(以AAFP计10mg/kg)、粉雾剂a1组(以AAFP计10mg/kg)。生理盐水、致敏液、AAFP及其制剂均腹腔注射，激发液滴鼻。
参照Christine文献方法[Christine A.et al.Supplemental and HighlyElevated Tocopherol Doses Differentially RegμLate Allergic Inflammation:Reversibility ofα-Tocopherol andγ-Tocopherol’s Effects.JImmunology.2011,186:3673-3685]建立模型。
在第0天、第7天，模型组、各AAFP治疗组的小鼠腹腔注射致敏液0.2mL致敏，阴性对照组小鼠注射等量生理盐水；在第14天、第17天、第20天，模型组与各AAFP治疗组小鼠乙醚麻醉后滴鼻激发液50μL(激发至小鼠出现明显烦躁不安、抓鼻、点头、身体颤抖、呼吸急促及伏地现象，这些现象是造模成功的表现)，阴性对照组小鼠滴鼻50μL生理盐水。在第18天时，AAFP组、粉雾剂1组和粉雾剂a1组分别腹腔注射以AAFP计10mg/kg的药物，模型组和正常对照组腹腔注射等量生理盐水。
在最后一次激发操作24h后，将小鼠处死，剥离颈部肌肉，暴露气管，用注射器注入1mL的PBS(磷酸氢二钠溶液，磷酸根离子浓度20mM，磷酸调pH6.8)于支气管肺中，抽出，置于离心管中，重复10次，收集得到的肺泡灌洗液(BALF)，于4℃以4500r/min离心10min，得到的沉淀用于细胞计数。
用1mL的PBS重悬BALF离心后所得细胞沉淀，用细胞计数板在低倍镜下计数细胞总数。取500μL的细胞悬液于载玻片上均匀的涂片，晾干，用瑞氏染色液染色后清水冲洗晾干，油镜下进行细胞的分类计数。按照形态学特点将细胞分为嗜酸性粒细胞(Eosinophil，Eos)，中性粒细胞((Neutrophil，Neu)，淋巴细胞(Lymphocyte，Lym)，单核细胞(Monocytes，Mon)，巨噬细胞(Macrophage，Mac)。观察500个细胞。
所有数据均以均数±标准差表示，采用SPSS20.0统计软件进行分析，AAFP对BALF中炎性细胞数目影响的结果(×10e4个/ml)见下表：
注：##与阴性组比较p＜0.001；**与模型组比较p＜0.01。
如上表结果所示，与阴性对照组相比，模型组小鼠肺泡灌洗液中炎性细胞总数以及嗜酸性粒细胞，中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞的细胞数量极其显著的升高(p＜0.01)；与模型组相比，AAFP组、粉雾剂1组和粉雾剂a1组在小鼠肺泡灌洗液中的炎性细胞总数以及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞的细胞数量均呈现极其显著的降低(p＜0.01)；AAFP组、粉雾剂1组和粉雾剂a1组三者之间，小鼠肺泡灌洗液中的炎性细胞总数以及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞的细胞数量均无统计学差异。结果表明，AAFP和本发明制备的粉雾剂在一定试验剂量浓度时能够有效地抑制肺泡灌洗液中炎性细胞的大量浸润。
从本实施例的结果显示，粉雾剂1和粉雾剂a1二者在总细胞数和五种典型细胞数方面基本无差异并且与AAFP原料药的结果基本相同，表明通过本实施例的试验模型通过腹腔注射途径给药后粉雾剂1和粉雾剂a1二者的生物学活性基本无差异，但是鉴于实施例5关于粉雾剂1和粉雾剂a1在空气动力学稳定性方面的差异，在通过吸入方式使用时，粉雾剂a1显然比粉雾剂1更优。
实施例7：流式细胞术测试
使AAFP溶液或粉雾剂a1溶液(AAFP浓度均为10μg/ml)与THP1细胞系按1：1的比例共孵育4小时后采用流式细胞术检测，结果如图3所示，其中，(a)为未加AAFP、抗体的空白对照1；(b)为仅加抗体的空白对照2；(c)为未经喷雾冷冻干燥处理的AAFP对照；(d)为实施例a1制备的AAFP吸入粉雾剂。从图中可见，相同AAFP浓度的(c)、(d)两组生物活性无显著差异，表明喷雾冷冻干燥未降低AAFP生物活性。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于经肺吸入或者经鼻喷雾给药的微粉剂，其包含融合蛋白AAFP和水溶性药用载体。
2.根据权利要求1的微粉剂，其具有1~50μm的质量中值空气动力学粒径，例如其具有1~20μm的质量中值空气动力学粒径，例如其具有1~10μm的质量中值空气动力学粒径，例如其具有1~5μm的质量中值空气动力学粒径。
3.根据权利要求1的微粉剂，其中所述水溶性药用载体选择甘露醇、乳糖、山梨糖醇、海藻糖、菊粉或其组合。
4.根据权利要求1的微粉剂，其中融合蛋白AAFP与水溶性药用载体的质量比为1：10~2000，例如质量比为1：20~1500，例如质量比为1：50~1000，例如质量比为1：100~500。
5.根据权利要求1的微粉剂，其是使融合蛋白AAFP和水溶性药用载体溶解于水中后通过喷雾冷冻干燥的方法制成的微粉。
6.根据权利要求1的微粉剂，其是使融合蛋白AAFP和水溶性药用载体溶解于水中制成固形物浓度为1~50%的溶液后通过喷雾冷冻干燥的方法制成的微粉，例如溶解于水中制成固形物浓度为2~40%的溶液，例如溶解于水中制成固形物浓度为3~30%的溶液，例如溶解于水中制成固形物浓度为5~20%的溶液；例如，该溶液中还添加0.12%硫酸铵和0.02%磷脂酰丝氨酸。
7.根据权利要求1的微粉剂，其是使用包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)使融合蛋白AAFP和水溶性药用载体以及任选的其余辅料溶解于水中制成溶液；
(2)将配制的溶液喷雾至液氮中，静置适时，将冰粒转移至使用干冰保温的不锈钢托盘内，待液氮挥发至残余量较少时，转移到预冷至-20℃以下的冷冻干燥机内；
(3)待液氮挥发完毕，抽真空并运行冻干程序，使冰粒干燥成微粉直至该微粉水分含量小于5%，得到用于经肺吸入或者经鼻喷雾给药的微粉剂。
8.根据权利要求7的微粉剂，其中：
步骤(2)将配制的溶液喷雾至杜瓦瓶保温的液氮中；
步骤(2)将配制的溶液喷雾至杜瓦瓶保温的液氮中，喷雾完毕后静置15~60min例如20~40min例如30min；
步骤(2)喷雾用的喷嘴选自气流喷嘴、超声喷嘴、振动筛喷嘴或能产生雾滴的其他喷嘴方式；
步骤(2)喷雾时，进液速度10~60ml/min；
步骤(2)待液氮挥发至残余量较少时，转移到预冷至-20~-40℃例如-25~-35℃例如-30℃的冷冻干燥机内；
步骤(3)运行的冻干程序为：初级干燥，真空度0.05~0.15mbar例如0.1mbar，以0.5~2℃/min例如1℃/min的速度升温至-5~-15℃，然后恒温15~20h；二级干燥，真空度0.02~0.1mbar，以0.5~1℃/min的速度升温至25~30℃，然后恒温3~10h例如4~8h，得干燥的吸入用微粉的粉雾剂；
步骤(3)所得微粉进一步分装至空心胶囊中以用于经肺吸入或者经鼻喷雾给药。
9.制备权利要求1~8任一项所述的方法，包括如下步骤：
(1)使融合蛋白AAFP和水溶性药用载体以及任选的其余辅料溶解于水中制成溶液；
(2)将配制的溶液喷雾至液氮中，静置适时，将冰粒转移至使用干冰保温的不锈钢托盘内，待液氮挥发至残余量较少时，转移到预冷至-20℃以下的冷冻干燥机内；
(3)待液氮挥发完毕，抽真空并运行冻干程序，使冰粒干燥成微粉直至该微粉水分含量小于5%，得到用于经肺吸入或者经鼻喷雾给药的微粉剂。
10.根据权利要求10的方法，其中：
步骤(2)将配制的溶液喷雾至杜瓦瓶保温的液氮中；
步骤(2)将配制的溶液喷雾至杜瓦瓶保温的液氮中，喷雾完毕后静置15~60min例如20~40min例如30min；
步骤(2)喷雾用的喷嘴选自气流喷嘴、超声喷嘴、振动筛喷嘴或能产生雾滴的其他喷嘴方式；
步骤(2)喷雾时，进液速度10~60ml/min；
步骤(2)待液氮挥发至残余量较少时，转移到预冷至-20~-40℃例如-25~-35℃例如-30℃的冷冻干燥机内；
步骤(3)运行的冻干程序为：初级干燥，真空度0.05~0.15mbar例如0.1mbar，以0.5~2℃/min例如1℃/min的速度升温至-5~-15℃，然后恒温15~20h；二级干燥，真空度0.02~0.1mbar，以0.5~1℃/min的速度升温至25~30℃，然后恒温3~10h例如4~8h，得干燥的吸入用微粉的粉雾剂；
步骤(3)所得微粉进一步分装至空心胶囊中以用于经肺吸入或者经鼻喷雾给药。
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