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CN116568321A - 用于治疗神经变性疾病的靶向髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)的基于car-treg的疗法 - Google Patents

用于治疗神经变性疾病的靶向髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)的基于car-treg的疗法 Download PDF

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CN116568321A
CN116568321A CN202180059182.8A CN202180059182A CN116568321A CN 116568321 A CN116568321 A CN 116568321A CN 202180059182 A CN202180059182 A CN 202180059182A CN 116568321 A CN116568321 A CN 116568321A
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CN
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protein
cells
disease
mog
marker
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L·B·沃特金
P·G·阿什顿-里卡特
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Az Treatment Co ltd
Original Assignee
Az Treatment Co ltd
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Abstract

本发明提供了用于遏制神经变性疾病的自身免疫组分并且由此向患有此类疾病的患者提供治疗效果的组合物和方法。组合物和方法包括免疫抑制部分，如调控性T细胞(Treg)和由与特异性地结合一种或多种神经胶质细胞标志物的嵌合抗原受体或蛋白质偶联的Treg表达的蛋白质。公开了治疗有效剂量的所述化合物用于治疗神经变性疾病，所述神经变性疾病包括进行性核上性麻痹(PSP)、帕金森病(PD)、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、慢性创伤性脑病(CTE)、多发性硬化症和朊病毒病。

Description

用于治疗神经变性疾病的靶向髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (MOG)的基于CAR-TREG的疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年5月28日提交的美国临时专利申请号63/031,261的权益和优先权，所述申请以引用的方式整体并入。
序列表
本申请含有具有XX个序列的序列表，所述序列表已经经由EFS-Web提交并且特此以引用的方式整体并入本文。2021年XX月创建的所述ASCII拷贝名称为48219WO_CRF_sequencelisting.txt并且大小为XXX字节。
技术领域
本发明提供特异性地调控与各种神经变性疾病如进行性核上性麻痹和帕金森病有关的免疫应答和炎症的CAR-Treg组合物及其使用方法。
背景技术
诸如帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和进行性核上性麻痹(PSP)的神经变性疾病影响相当数量的人，通常导致快速身体和/或精神衰退和死亡。那些疾病没有已知的治愈方法，并且治疗集中于控制症状和延缓衰退。
一种这样的疾病PSP是一种在老年人中并不少见的特发性变性疾病，其类似于帕金森病(PD)。临床表现包括核上性凝视麻痹、轴向强直、痴呆和假性延髓麻痹四联症。它与运动迟缓、严重姿势障碍和频繁跌倒相关。病理与主要在脑干、苍白球、丘脑底核和齿状核中的细胞损失和Tau神经原纤维缠结相关。PSP的患病率为每100,000人5-6人，导致美国每年5000-25000名患者。所述疾病的平均发病年龄是63岁，从诊断至死亡的通常预后在5至10年的范围内，并且没有可用的疾病改善治疗。
帕金森病是没有已知治愈方法的另一种神经变性疾病。帕金森症的患病率为约每1,000人1-2人。帕金森症的特征在于基底神经节中的细胞死亡以及黑质中的星形胶质细胞死亡和小胶质细胞增加，从而导致那些区域中的多巴胺缺乏。在细胞死亡之前，被称为路易体的内含物在受损细胞中形成。有人猜测帕金森症中驱动脑细胞死亡的潜在机制，但对所述潜在机制的了解仍然很少，并且治疗目前集中在控制疾病症状上。
发明内容
本发明的组合物和方法使用T调控性淋巴细胞(Treg)或由Treg细胞表达的免疫抑制蛋白来调节靶向中枢神经系统(CNS)中的神经胶质细胞的神经变性免疫应答。通过将Treg或免疫抑制蛋白与嵌合抗原受体(CAR)或特异性地识别并结合神经胶质细胞标志物的单链可变片段(scFv)偶联，免疫抑制Treg或蛋白被吸引至CNS的神经胶质细胞以减轻炎症并保护CNS免受自身免疫攻击。
本发明认识到大多数神经变性疾病缺乏有效治疗选择以及几种此类疾病的自身免疫和/或炎症组分的存在，并且工程化组合物以特异性地遏制那些疾病组分。本发明的化合物和方法允许神经胶质细胞调节破坏性免疫细胞，如1型辅助细胞(Th1)、T辅助17细胞(Th17)、细胞毒性T细胞(CTL)、M1巨噬细胞和多形核嗜中性粒细胞(PMN)。
本发明将免疫抑制分子(Treg或免疫抑制蛋白)引导至少突胶质细胞(ODC)神经胶质细胞。所得化合物及其使用方法募集身体的自身免疫系统来对抗神经变性疾病如帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和进行性核上性麻痹(PSP)的影响。本发明解决了一种机制(即，中枢神经系统的自身免疫攻击)，几种神经变性疾病通过所述机制破坏神经功能，但不依赖于潜在疾病的任何特定生化原因。因此，本发明的化合物和方法可提供跨多种神经变性疾病的治疗效果。
本发明的方面包括用于治疗受试者的神经变性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的调控性T细胞(Treg)的步骤，所述调控性T细胞表达特异性地结合至神经胶质细胞标志物的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述神经变性疾病是多发性硬化症(MS)。然后CAR-Treg保护神经组织并减少神经组织中的炎症，从而治疗神经变性疾病。在各种实施方案中，所述受试者可以是人。
所述神经胶质细胞标志物可以是少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、少突胶质细胞标志物01(OM1)、少突胶质细胞标志物04(OM4)、神经/神经胶质标志物2(NG2)、A2B5、半乳糖神经酰胺酶(GALC)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或髓鞘少突胶质细胞特异性蛋白(MOSP)。在一些实施方案中，所述神经胶质细胞标志物是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)。
所治疗的神经变性疾病可以是进行性核上性麻痹(PSP)、阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病、帕金森病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、慢性创伤性脑病(CTE)、多发性硬化症或朊病毒病。在一些实施方案中，所述神经变性疾病是进行性核上性麻痹(PSP)。在其他实施方案中，所述神经变性疾病是阿尔茨海默病(AD)。在仍然其他实施方案中，所述神经变性疾病是帕金森病(PD)。
在某些方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含治疗有效量的工程化调控性T细胞(Treg)以治疗非多发性硬化症的神经变性疾病，所述工程化Treg表达特异性地结合至神经胶质细胞标志物的嵌合抗原受体(CAR)。所述组合物中的神经胶质细胞标志物可以是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、少突胶质细胞标志物01(OM1)、少突胶质细胞标志物04(OM4)、神经/神经胶质标志物2(NG2)、A2B5、半乳糖神经酰胺酶(GALC)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或髓鞘少突胶质细胞特异性蛋白(MOSP)。
所述组合物可在治疗上有效治疗进行性核上性麻痹(PSP)、帕金森病(PD)、阿尔茨海默症、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、慢性创伤性脑病(CTE)、多发性硬化症或朊病毒病。
本发明的各个方面包括一种工程化蛋白质，所述工程化蛋白质包含与由调控性T细胞(Treg)表达的分子偶联的神经胶质细胞特异性结合蛋白。由Treg表达的所述分子可以是细胞外免疫抑制酶。在某些实施方案中，由Treg表达的所述分子可以是CD73、CD39、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)或谷氨酸-草酰乙酸转氨酶1(GOT1)。所述神经胶质细胞特异性结合蛋白可以是抗体分子的四聚体单链可变片段(scFv)。
在某些实施方案中，所述Treg表达的分子结合的神经胶质细胞特异性结合蛋白可结合髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、少突胶质细胞标志物01(OM1)、少突胶质细胞标志物04(OM4)、神经/神经胶质标志物2(NG2)、A2B5、半乳糖神经酰胺酶(GALC)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或髓鞘少突胶质细胞特异性蛋白(MOSP)。
在一些方面，本发明提供了一种工程化蛋白质，所述工程化蛋白质包含与模拟由调控性T细胞(Treg)表达的分子的活性的分子偶联的神经胶质细胞特异性结合蛋白。由Treg表达的所述模拟分子可以是细胞外免疫抑制酶，如CD73、CD39、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)或谷氨酸-草酰乙酸转氨酶1(GOT1)。所述模拟分子结合的神经胶质细胞特异性结合蛋白可结合髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、少突胶质细胞标志物01(OM1)、少突胶质细胞标志物04(OM4)、神经/神经胶质标志物2(NG2)、A2B5、半乳糖神经酰胺酶(GALC)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或髓鞘少突胶质细胞特异性蛋白(MOSP)。
附图说明
图1示出神经胶质细胞特异性CAR-Treg及其免疫抑制功能。
图2示出神经胶质细胞靶向免疫抑制蛋白及其免疫抑制功能。
图3示出pMHC-四聚体与细胞毒性T细胞的结合以及本发明的GITP与靶MOG蛋白的结合。
图4示出与CTL和pMHC相比，用标记的GITP蛋白对MOG靶细胞的最大染色。
图5示出与CTL和pMHC相比，用标记的GITP蛋白对MOG靶细胞的染色的半衰期。
图6示出与阴性对照和阳性对照相比，GTIP结合的MOG-靶细胞抑制T效应细胞增殖的比较。
图7示出与表达对MOG具有特异性的scFv的CAR分子对MOG-靶细胞的相对亲合力相比，pMHC对相应细胞毒性T细胞克隆的相对亲合力。
图8示出七种不同的scFv蛋白针对人MOG-1的相对免疫反应性。
图9示出scFv 3、4、6和17结合细胞表面MOG-1蛋白。
图10示出scFv(PMC 669(克隆17H-L)、670(克隆17L-H)、696(克隆3H-L)、697(克隆3L-H)、698(克隆6H-L)和699(克隆6L-H))与MOG-1的结合的FACS的验证。
图11示出用PMC671慢病毒转导并用2μg/ml嘌呤霉素选择的细胞。
图12描绘构建体PMC691和PMC692可成功地在细胞内和细胞外表达髓鞘少突胶质细胞糖蛋白。
图13示出CD69结合测定。
图14描绘scFv克隆3(PMC 696)的CD69结合测定的结果。
图15示出CAR-Treg抑制测定。
图16是PMC 669：具有FLAG标签的[克隆17H-LscFv]-CD8-CD28-CD3z的载体图。
图17是PMC 670：具有FLAG标签的[克隆17L-HscFv]-CD8-CD28-CD3z的载体图。
图18是PMC 691的载体图。
图19是PMC 692的载体图。
图20是PMC 696：具有FLAG标签的[克隆3H-LscFv]-CD8-CD28-CD3z的载体图。
图21是PMC 697：具有FLAG标签的[克隆3L-HscFv]-CD8-CD28-CD3z的载体图。
图22是PMC 698：具有FLAG标签的[克隆6H-LscFv]-CD8-CD28-CD3z的载体图。
图23是PMC 699：具有FLAG标签的[克隆6L-HscFv]-CD8-CD28-CD3z的载体图。
图24是scFv4[8-18C5]CAR序列的载体图。
图25是scFv4[18C5-8]CAR序列的载体图。
图26A-D示出前八个scFV氨基酸序列和盒的比对。
具体实施方式
本发明涉及用于调控各种神经变性疾病的自身免疫组分的组合物。本文提供的组合物和方法靶向神经胶质细胞特异性标志物以将免疫抑制分子(例如，Treg或由Treg表达的免疫抑制蛋白)吸引至CNS并破坏促成诸如进行性核上性麻痹(PSP)、阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病、帕金森病(PD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、慢性创伤性脑病(CTE)或朊病毒病的疾病的神经变性影响的自身免疫攻击。
血脑屏障可充当治疗脑或CNS病症的障碍，因为所述屏障可阻止治疗性化合物接近受影响的细胞。重要的是，Treg能够穿过血脑屏障并且可通过Treg结合的神经胶质细胞定位于CNS的神经元，从而允许本发明的化合物有效地治疗CNS的神经变性病症。
本发明的化合物和方法不依赖于任何疾病特异性生化机制，而是使许多神经变性疾病影响精神和身体衰退的免疫应答短路。因此，相同的化合物和方法可为多种神经变性疾病提供治疗效果。
例如，PSP涉及tau蛋白累积和神经原纤维缠结，并且导致神经元和神经胶质细胞损伤和丧失、相关的身体和精神衰退以及最终死亡。帕金森病涉及基底神经节中的神经元丧失以及黑质中的星形胶质细胞死亡和小胶质细胞增加。在细胞死亡之前，被称为路易体的内含物在受损细胞中形成。ALS的特征在于运动皮层中的运动神经元在其细胞体和轴突中形成富含蛋白质的内含物后死亡。
本发明认识到，尽管潜在原因和疾病机制不同，但PSP、帕金森症和ALS以及包括阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病、慢性创伤性脑病(CTE)和朊病毒病的神经变性疾病可能包括促成炎症和CNS退化的免疫组分。参见，Malaspina等人,2015,Disease origin andprogression in amyotrophic lateral sclerosis:an immunology perspective,International Immunology,27(3):117-129；Mosley R,Gendelman H,2017,T cells andParkinson’s disease,Lancet Neurology,16(10):769-71；其各自的内容以引用的方式并入本文。因此，集中于遏制CNS中的免疫应答和解决驱动许多神经变性疾病的慢性炎症的本发明化合物和方法在治疗许多那些疾病方面可以是治疗上有效的。
本发明的化合物和方法使用特异性地结合神经胶质细胞标志物的嵌合抗原受体(CAR)、抗体或单链可变片段(scFv)。神经胶质细胞结合分子与Treg、由Treg表达的免疫抑制蛋白或被配置为模拟由Treg表达的免疫抑制蛋白的分子偶联。神经胶质细胞是在包括人类的各种动物的中枢和周围神经系统中执行多种支持神经元的功能的非神经元细胞。神经胶质细胞包括少突胶质细胞、星形胶质细胞、室管膜细胞和小胶质细胞。由于它们在维持CNS的神经元方面的功能，神经胶质细胞迁移至CNS的神经元并且因此可用于将治疗性化合物定位在那里。例如，少突胶质细胞(ODC)神经胶质细胞运输至CNS以通过形成髓鞘来维持轴突绝缘。本发明的化合物和方法包括将免疫抑制分子偶联至神经胶质细胞如ODC，使得当神经胶质细胞执行它们的功能时，所述免疫抑制分子与CNS的神经元紧密接近，如图1和2所示。免疫抑制分子的存在调节可能存在于CNS中并促成PD、PSP等中的神经变性疾病症状的任何正在进行的免疫应答和慢性炎症。
神经胶质细胞特异性靶标包括由各种神经胶质细胞和其他标志物表达的蛋白质，如髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、少突胶质细胞标志物01(OM1)、少突胶质细胞标志物04(OM4)、神经/神经胶质标志物2(NG2)、A2B5、半乳糖神经酰胺酶(GALC)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或髓鞘少突胶质细胞特异性蛋白(MOSP)。
在各种实施方案中，CAR、scFv或抗体可结合至免疫抑制分子并用于靶向神经胶质细胞。CAR是可提供对免疫效应细胞(T细胞)的特异性的工程化受体。CAR已被用于赋予对用于癌症免疫疗法中的细胞毒性T淋巴细胞的肿瘤细胞特异性。参见，Couzin-Frankel,2013,Cancer immunotherapy,Science,342(6165):1432-33；Smith等人,2016,Chimericantigen receptor(CAR)T cell therapy for malignant cancers:Summary andperspective,Journal of Cellular Immunotherapy,2(2):59-68；其各自的内容以引用的方式并入本文。使用类似的原理，本发明的化合物和方法包括工程化对在神经胶质细胞如ODC上发现的标志物具有特异性的CAR，但是代替将神经胶质细胞特异性CAR移植到细胞毒性T细胞，所述神经胶质细胞特异性CAR被移植到工程化的免疫抑制Treg上。
本发明的CAR-Treg可表达靶向相同或两种或更多种不同神经胶质细胞标志物的多种嵌合抗原受体。
ScFv是包含免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。ScFv可通过克隆用所需靶分子(例如，MOG)免疫的小鼠或其他动物的VH和VL基因来产生。VH和VL基因然后可以多个取向表达并与各种接头一起形成各种scFv，然后可通过实验验证所述scFv以提供所需的稳定性、表达水平和对神经胶质细胞或其特异性标志物的结合亲和力。上文论述的对神经胶质细胞标志物具有特异性的ScFv或抗体可连接至下文论述的免疫抑制蛋白，以形成能够提供CNS定位免疫抑制疗法的融合蛋白，如图2所示和下文所论述。
可通过本领域已知的方法产生靶向神经胶质细胞标志物的抗体，包括用于产生来自例如Pacific Immunology(San Diego,CA)或ABclonal(Woburn,MA)的定制抗体的商业上可获得的服务。
CAR-Treg可通过用于制备CAR-T细胞的已知方法进行工程化。Treg细胞可分离自受试者，优选来自待治疗患者的自体Treg细胞。然后可通过已知技术诸如电穿孔、病毒载体或其他形式的用编码所选择工程化嵌合抗原受体的核酸转染来修饰Treg细胞的基因。同种异体细胞(即与受试者不HLA匹配或仅部分匹配的细胞)也可用于本文所述的方法和治疗。此类同种异体细胞的来源包括外周血单核细胞(PBMC)。可通过从丢弃的、去识别的白细胞减少过滤器(美国红十字会)获得的样品或来自知情同意健康志愿者的献血的Ficol l-Hypaque密度梯度离心来分离PBMC。细胞群、来源和用于选择或富集所需细胞类型的方法的描述可例如在美国专利号9,347,044中发现。CAR-Treg细胞然后可在引入患者的系统进行治疗之前通过实验来验证。
调控性T细胞或Treg调节免疫系统并通常下调效应T细胞的诱导和增殖。Treg阻止自身免疫应答并帮助免疫系统区分自身和非自身。调控性T细胞产生抑制性细胞因子，包括转化生长因子β、白细胞介素35和白细胞介素10，并且可诱导其他细胞类型表达白细胞介素10。Treg还可产生颗粒酶B，其进而可诱导效应细胞的凋亡。Treg还通过经由与树突细胞的直接相互作用反向信号传导和免疫抑制吲哚胺2,3-双加氧酶的诱导发挥作用。Treg还可通过胞外酶CD39和CD73和免疫抑制性腺苷的产生来下调免疫应答。Treg还通过LAG3和TIGIT通过与树突细胞的直接相互作用来遏制免疫应答。另一种控制机制是通过IL-2反馈回路。Treg的另一种免疫抑制机制是通过经由分子CTLA-4的作用阻止CD28对效应T细胞的共刺激。
图1示出靶向神经胶质细胞的CAR-Treg及其治疗机制。CAR-Treg细胞表达特异性地结合神经胶质细胞上的标志物的CAR。CAR-Treg细胞由此结合至神经胶质细胞并穿过血脑屏障且通过神经胶质细胞的自然功能定位于CNS的神经元。结合的Treg细胞然后通过遏制局部神经元的免疫攻击来执行其自然调控功能。
图2示出本发明的遏制神经元的免疫攻击的神经胶质细胞靶向免疫抑制蛋白(GTIP)。GTIP可包含存在于Treg细胞中的免疫抑制蛋白或酶，如清除免疫激活代谢物(例如，ATP、AMP、色氨酸和谷氨酸)的细胞外酶。此类细胞外酶可包括CD73、CD39、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和谷氨酸-草酰乙酸转氨酶1(GOT1)。在图2中，表达MOG的神经胶质细胞由GTIP结合，所述GTIP由与免疫抑制酶(IE)连接的抗MOG scFV组成。神经胶质细胞在执行其神经元相关功能时将结合的IE定位于受到各种免疫细胞(Th17细胞、Th1细胞、CTL细胞、M1细胞和PMN细胞)的免疫攻击的神经元，并调节或关闭免疫应答，从而保护神经元并减少潜在神经变性疾病的症状。GTIP可用于治疗神经变性疾病，如进行性核上性麻痹(PSP)、阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病、帕金森病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、慢性创伤性脑病(CTE)、多发性硬化症(MS)和朊病毒病。
本发明的GTIP可包含与靶向相同或两种或更多种不同神经胶质细胞标志物的一种或多种scFv或抗体连接的一种或多种免疫抑制蛋白(包括两种或更多种不同的蛋白)。蛋白质可通过任何已知方式连接以形成本发明的GTIP，包括例如融合蛋白或生物素-链霉亲和素键联。
如在癌症免疫治疗技术中使用的过继性细胞转移技术(包括涉及细胞毒性T淋巴细胞的那些)可用于制备用于本发明的化合物和方法中的自体CAR-Treg。参见，Rosenberg等人,2008,Adoptive cell transfer:a clinical path to effective cancerimmunotherapy,Nat Rev Cancer,8(4):299-308，其内容以引用的方式并入本文。
本发明的CAR-Treg或神经胶质细胞靶向免疫抑制蛋白可并入含有一种或多种本文所述的治疗性化合物的载体系统中。在某些实施方案中，载体系统可以是包含二硫化物交联的聚乙烯亚胺(CLPEI)和脂质的纳米颗粒。脂质可以是胆汁酸，如胆酸、脱氧胆酸和石胆酸。此类载体系统在下文的实施例中进一步描述。其他示例性载体系统例如在Wittrup等人(Nature Reviews/Genetics,16:543-552,2015)中进行了描述，其内容以引用的方式整体并入本文。
如本文所用的短语“胃肠外施用”和“胃肠外地施用”意指除了肠内施用和局部施用以外的、通常通过注射进行的施用模式，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内以及胸骨内注射和输注。
如本文所用的短语“全身施用”、“全身性地施用”、“外周施用”和“外周地施用”意指化合物、药物或其他材料除直接施用到中枢神经系统中之外的施用，使得其进入患者的系统，并且因此经受代谢以及其他类似过程，例如皮下施用。
当本发明的化合物作为药物施用于人和哺乳动物时，它们可本身或作为含有例如0.1％至99.5％(更优选0.5％至90％)活性成分(即至少一种本发明的治疗性化合物和/或其衍生物)与药学上可接受的载体的组合的药物组合物给予。
考虑诸如患者的年龄、体重、性别和临床病史的典型因素，熟练的技术人员可容易地确定每种剂的有效剂量。一般来说，本发明化合物的适合每日剂量将是化合物的有效产生治疗效果的最低剂量的量。这种有效剂量通常将取决于上述因素。
如果需要，活性化合物的有效每日剂量可任选地以单位剂型以在全天内的适当时间间隔分开施用的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量施用。
本发明的药物组合物包含“治疗有效量”或“预防有效量”的一种或多种本发明的化合物或其功能性衍生物。“有效量”是如本文在定义部分中所定义的量，并且是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需治疗结果(例如，减少或预防与神经性和/或炎症性疼痛相关的效应)的量。本发明化合物或其功能性衍生物的治疗有效量可根据诸如以下的因素而不同：受试者的疾病状态、年龄、性别和体重、以及治疗性化合物在受试者中引发所需应答的能力。治疗有效量还是治疗有益作用超过治疗剂的任何毒性或有害作用的量。
“预防有效量”是指在必要剂量和时段下有效实现所需预防结果的量。通常，因为预防性剂量是在疾病之前或在疾病早期用于受试者中，所以预防有效量可少于治疗有效量。预防或治疗有效量也是其中有益效果超过化合物的任何毒性或有害效应的量。
“有效量”是指在必要剂量和时段下有效实现所需结果的量。
可调整给药方案以提供最佳的所需应答(例如治疗性或预防性应答)。例如，可施用单次推注，可随时间推移施用若干分次剂量，或者如由治疗情况的紧急性所指示剂量可成比例地减少或增加。特别有利的是将胃肠外组合物配制成便于施用和剂量均匀的剂量单位形式。可改变本发明药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以便获得对于特定受试者、组合物和施用方式有效实现所需治疗应答而对患者无毒的活性成分的量。
如本文所用的术语“剂量单位”是指适合作为单位剂量用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上分离的单位；每个单位均含有被计算为与所需要的药物载体相结合产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格决定于且直接取决于(a)化合物的独特特征，和(b)本领域中混配这种活性化合物用于治疗个体的敏感性的固有限制。
在一些实施方案中，治疗有效量最初可在细胞培养测定或在动物模型(通常是小鼠、兔、狗或猪)中估计。动物模型还用于实现令人希望的施用浓度范围和途径。这种信息然后可用于确定用于在其他受试者中施用的有用剂量和途径。通常，治疗有效量足以减少或抑制受试者中的神经性和/或炎症性疼痛。在一些实施方案中，治疗有效量足以消除受试者中的神经性和/或炎症性疼痛。
用于特定患者的剂量可由本领域的普通技术人员使用常规考虑(例如借助于适当的常规药理学方案)来确定。医师可例如首先制订相对低的剂量，随后增加剂量，直至获得适当应答。取决于应用，施用于患者的剂量足以随时间推移在患者中实现有益治疗应答，或例如减少症状，或其他适当活性。剂量由特定制剂的功效和本发明化合物或其功能性衍生物的活性、稳定性或血清半衰期和患者的状况以及待治疗患者的体重或表面积来确定。还通过在特定受试者中施用特定载体、制剂等所伴有的任何不利副作用的存在、性质和程度来确定剂量的大小。包含一种或多种本发明化合物或其功能性衍生物的治疗性组合物任选地在疾病的一种或多种适当的体外和/或体内动物模型，如神经性和/或炎症性疼痛的模型中进行测试以根据本领域熟知的方法确认功效、组织代谢并估计剂量。特别地，剂量最初可在相关测定中通过治疗对比非治疗的活性、稳定性或其他合适量度(例如，治疗对比未治疗细胞或动物模型的比较)来确定。制剂以由相关制剂的LD50和/或各种浓度的本发明化合物或其功能性衍生物例如在应用时对患者的质量和总体健康的任何副作用的观察结果确定的速率施用。施用可经由单次剂量或分开剂量来完成。
施用通常涉及施用药学上可接受的剂型，其意指本文所述化合物的剂型，并且包括例如片剂、糖锭剂、粉末、酏剂、糖浆剂、液体制剂，包括混悬剂、喷雾剂、吸入剂、片剂、锭剂、乳剂、溶液剂、颗粒剂、胶囊剂和栓剂，以及注射用液体制剂，包括脂质体制剂。技术和制剂通常可在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,最新版本中找到，其特此以引用的方式整体并入。施用可经口、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下或鼻内进行。化合物可单独或与合适的药物载体一起施用，并且可呈固体或液体形式，如片剂、胶囊剂、粉末、溶液剂、混悬剂或乳剂。
含有活性成分的药物组合物可呈适合于口服使用的形式，例如呈片剂、糖锭剂、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散粉末或颗粒剂、乳剂、硬质或软质胶囊或糖浆剂或酏剂形式。意图用于口服使用的组合物可根据药物组合物制造领域已知的任何方法来制备，并且此类组合物可含有一种或多种选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的剂，以便提供药学上优良且可口的制剂。片剂含有与适合用于制造片剂的无毒药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的或者它们可通过已知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并且由此在更长时期内提供持续作用。例如，可采用延时材料，诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它们也可通过美国专利4,256,108、美国专利4,166,452和美国专利4,265,874(其各自的内容以引用的方式整体并入本文)中描述的技术进行包衣，以形成用于控制释放的渗透治疗片剂。
用于口服使用的制剂还可呈现为硬质明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或呈现为软明胶胶囊，其中所述活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
制剂还可包括母体(未离子化)化合物与β-环糊精衍生物，尤其是羟丙基-β-环糊精的复合物。
替代口服制剂可使用受控释放制剂来实现，其中化合物被包封在肠溶包衣中。
水性混悬剂含有与适于制造水性混悬剂的赋形剂混合的活性材料。此类赋形剂是混悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶以及阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七乙烯氧基十六醇)，或环氧乙烷与源于脂肪酸和己糖醇的部分酯如聚氧乙烯与源于脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。水性混悬剂也可含有一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯)、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂以及一种或多种甜味剂(如蔗糖或糖精)。
油性混悬剂可通过使活性成分混悬于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(如液体石蜡)中来配制。油性混悬剂可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可添加甜味剂(如上述的那些甜味剂)和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可通过添加抗氧化剂如抗坏血酸来保存。
适合于通过添加水来制备水性混悬剂的可分散粉末和颗粒剂提供与分散剂或润湿剂、混悬剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。举例说明了合适的分散剂或润湿剂和混悬剂，例如也可存在甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可呈水包油型乳剂的形式。油相可以是植物油(例如，橄榄油或花生油)或矿物油(例如，液体石蜡)或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄蓍胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂以及源自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如，脱水山梨糖醇单油酸酯)；以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。乳剂还可含有甜味剂和调味剂。
糖浆剂和酏剂可与甜味剂，例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖一起配制。此类制剂还可含有缓和剂、防腐剂和调味剂以及着色剂。药物组合物可呈无菌可注射水性或油性混悬剂形式。可根据已知技术，使用上文提及的那些合适的分散剂或润湿剂以及混悬剂来配制这种混悬剂。无菌可注射制剂也可呈在无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂或混悬剂形式，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液剂。可采用的可接受的媒介物和溶剂为水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油常规地用作溶剂或混悬介质。出于这个目的，可采用任何温和不挥发性油，包括合成单甘油酯或二甘油酯。此外，诸如油酸的脂肪酸可用于制备可注射剂。
术语“药物组合物”意指组合物，所述组合物取决于施用模式和剂型的性质而包含如本文所述的化合物以及包括以下的至少一种组分：药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物，如防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、混悬剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂。
术语“药学上可接受的载体”用于意指如本文所述的任何载体、稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。混悬剂的实例包括乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶或这些物质的混合物。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保对微生物作用的防止。也可能希望包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。可通过使用延迟吸收的剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来引起可注射药物形式的延长吸收。合适的载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇、其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。赋形剂的实例包括乳糖、奶糖、柠檬酸钠、碳酸钙和磷酸二钙。崩解剂的实例包括淀粉、海藻酸和某些复合硅酸盐。润滑剂的实例包括硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石以及高分子量聚乙二醇。
术语“药学上可接受的”意指其在合理的医学判断范围内适合用于与人和低等动物的细胞接触，而无不当毒性、刺激、过敏反应等并且与合理的益处/风险比相称。
实施例
实施例1
四聚体结合测定将用于比较GITP结合至靶细胞的亲合力与已知四聚体针对T细胞的亲合力(Ober,B等人,2000 Int Immunol，以引用的方式并入本文)，如图3所示。H-Y肽/MHC H-2Db(pMHC)四聚体对B6.2.16CTL上的TCR的相对亲合力将通过使用细胞染色和流式细胞术(FCM)确定两个参数来进行测量。这些将是得到最大染色和四聚体染色(细胞洗涤后)的半衰期(t1/2)所需的浓度。MOG靶细胞将通过非粘附靶细胞(例如RMA或Jurkat细胞)的基因转染产生。抗体染色和流式细胞术(FCM)将确认MOG的表面表达。抗体染色和FCM将鉴定与CTL上的B6.2.16TCR具有相同MOG水平的转染子。将测量用标记的GITP蛋白对MOG靶细胞的最大染色和染色半衰期，并与CTL和pMHC四聚体进行比较，如图4和5所示。目的将是产生与CTL和pMHC四聚体相比具有相当或更好的细胞相互作用亲合力的GITP。如果GITP分子中的四聚体抗MOG scFv达不到这个标准，则scFv的化合价可增加。如果需要甚至更高的化合价，则纳米颗粒支架可用于实现靶细胞结合的所需亲合力。
实施例2
将测试与MOG靶细胞结合的GTIP遏制T效应(T eff)细胞增殖的能力。由给定清除剂IE的四聚体组成的GTIP(参见下表1)将与MOG靶细胞结合，洗涤，然后与增殖人Teff(例如在抗CD3/CD28和IL-2刺激3天后使用标准程序产生)一起孵育(图6的中间栏)。
表1
细胞将在掺杂有相关促有丝分裂代谢物(M)的培养基中培养，所述代谢物是GTIP中IE的底物(参见上表)。随时间推移，将测量M的浓度和Teff的数量，如图6所示。固定时间后，GTIP修饰的MOG靶细胞的数量将根据Teff的数量进行滴定，以给出抑制活性的指数。阴性对照实验(图6的左栏)，其中与MOG靶细胞结合的仅四聚体scFv将导致更长的M半衰期、固定时间后更大量的Teff以及对Teff细胞累积没有抑制活性。作为阳性对照(图6的右栏)，人Treg(例如在CD3/CD28和TGF-β刺激9天后在标准条件下产生)将与Teff细胞共培养，并且与GTIP修饰的MOG靶细胞相比具有抑制活性。GTIP修饰的MOG靶细胞与人Treg细胞在细胞间基础上的可比功效将作为具有特定IE的GTIP分子的积极验证。所述测定将鉴定由最有效的IE分子组成的GTIP。可通过在GTIP分子中添加多于一种类型的IE分子和/或增加IE分子的化合价来提高功效。
实施例3
一种测定用于测量表达对MOG具有特异性的scFv的CAR分子使Treg细胞以接近生理学上有意义的T细胞:靶细胞相互作用的相对亲合力的相对亲合力结合至表达MOG的靶细胞的能力。用于比较的生理学上有意义的T细胞:靶细胞相互作用细胞是CTL:肽/MHC(pMHC)/靶细胞相互作用。这是使用细胞-细胞缀合物的基于流式细胞术(FCM)的测定完成的(Opferman,JT等人,2001 Int Immunol.，以引用的方式并入本文)。
确定pMHC靶标对相关CTL克隆(B6.2.16)的相对亲合力(图7的左栏)。将靶标用活体染料PKH26(红色)标记，并将CTL用CFSE(绿色)标记，共孵育4小时，然后经受标准剪切力并通过FCM进行检查。缀合物被检测为双重染色双重峰，并取决于H-Y肽抗原的存在。pMHC靶标:B6.2.16CTL相互作用的相对亲合力通过两个参数进行测量-缀合物形成的最大水平(总输入细胞的约80％)和缀合物解离的半衰期。将MOG靶细胞与在标准条件(例如抗CD3/CD28IL-2刺激的T细胞的慢病毒转导)下产生的表达CAR-抗MOG scFv的人T细胞一起孵育。经标记细胞之间缀合物的半衰期将通过FCM测量(图7的右栏)。可比的缀合物半衰期与CTL:pMHC/靶细胞的半衰期将指示抗MOG scFv/CAR对MOG阳性靶细胞的T细胞的生理亲合力。
实施例4
通过人噬菌体展示scFv文库的亲和力淘选，产生了对人MOG具有特异性的ScFv抗体。QC SDS-PAGE在文库筛选之前进行，以评估靶标的纯度。为了减少非特异性结合物，在靶向筛选之前，首先使用聚苯乙烯平底板和针对噬菌体文库的封闭缓冲液进行预反选择。
在三轮生物淘选后，观察到阳性富集。从第三轮中随机挑取20个克隆并进行QC单克隆噬菌体ELISA。与对照相比，发现18个克隆与靶标结合。对所有18个阳性克隆进行了测序。
从第三轮中挑取另外20个克隆并进行QC单克隆噬菌体ELISA。与对照相比，发现第二组克隆中的所有20个都与靶标结合。对所有这些进行测序。
在对38个阳性克隆的分析后，鉴定了具有独特序列的8个阳性克隆(克隆1、3、4、6、10、13、17、21)。下文列出8种scFv蛋白的序列和编码它们的DNA序列。
表2
表3
克隆1 DNA(SEQ ID NO:1)：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTTCTGATTATGGTAATACTACAGCTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAATGCTAATTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACTTCTACTTATCCTGGTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
克隆1 scFv蛋白质(SEQ ID NO:2)：
MEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISDYGNTTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNANYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTSTYPGTFGQGTKVEIK
克隆3 DNA(SEQ ID NO:3)：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTTCTTCTTATGGTTCTTATACAGGTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAATGGTTATGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAATGATGCTTCTCCTAATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
克隆3 scFv蛋白质(SEQ ID NO:4)：
MEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSYGSYTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNGYAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNDASPNTFGQGTKVEIK
克隆6 DNA(SEQ ID NO:5)：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTTCTACTTATGGTGATTATACAACTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGTAGTTATACTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCTATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTCTAATGCTACTCCTTCTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
克隆6 scFv蛋白质(SEQ ID NO:6)：
MEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISTYGDYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSYTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASYLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNATPSTFGQGTKVEIK
克隆10 DNA(SEQ ID NO:7)：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTACTAATTATGGTTATACTACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCTTCTTATTCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTCTGCTTATTATCCTGATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
克隆scFv 10蛋白质(SEQ ID NO:8)：
MEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITNYGYTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSYSFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSAYYPDTFGQGTKVEIK
克隆13 DNA(SEQ ID NO:9)：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTAATTCTGCTGGTGGTTCTACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTATATTACTGTGCGAAAAATTCTGCTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCAATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACTGATACTTATCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
克隆13 scFv蛋白质(SEQ ID NO:10)：
MEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSINSAGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNSAYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTDTYPTTFGQGTKVEIK
克隆17 DNA(SEQ ID NO:11)：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTTCTACTTCTGGTAGTTATACAGCTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGTGGTTATACTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTGATGGTAATCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
克隆17 scFv蛋白质(SEQ ID NO:12)：
MEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISTSGSYTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGYTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDGNPTTFGQGTKVEIK
克隆21 DNA(SEQ ID NO:13)：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCCTCTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGATTCCACCTTTAGCAGCTATGCCATGACCGGGTCCCCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTTCGAATCGGGGTAAGTAGACAATTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACATAATGCGCATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCAGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTGCGATGGTGCCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
克隆21 scFv蛋白质(SEQ ID NO:14)：
MEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISYSGAYTAYADSVNGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSGTDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNYDPSTFGQGTKVEIK
对八种scFv蛋白中的每一种构建表达载体。之后，将细胞裂解物包被用于ELISA。然后使用来自30℃和37℃的细胞裂解物进行可溶性ELISA。与对照相比，在所有7个克隆中容易地观察到差异。在7个阳性克隆中，克隆1、6和13比其他克隆强的多。
对从七个阳性克隆产生的可溶性scFv进行ELISA与滴定，以对它们结合MOG的能力进行排序。将7个scFv亚克隆到pET-26b中，以被构建为scFv-myc-6×His格式。7个scFv克隆的表达盒在下文示出，其中每个相应的scFv多核苷酸或氨基酸序列加下划线：
克隆1盒DNA(SEQ ID NO:15)：
ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCATG GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG ATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTT CTGATTATGGTAATACTACAGCTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAC ACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAATGCTAATTATTT TGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTG GCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACT TGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT CTATGATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCA CCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACTTCTACTTATCCTGGTACGTTCGGC CAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGAATTCGAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
克隆1盒蛋白(SEQ ID NO:16)：
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLE WVSSISDYGNTTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNANYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTSTYPGTFGQGTKVEIKEFEQKLISEEDLLEHHHHHH
克隆3盒DNA(SEQ ID NO:17)：
ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCATG GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG ATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTT CTTCTTATGGTTCTTATACAGGTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAC ACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAATGGTTATGCTTT TGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTG GCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACT TGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT CTATGGTGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCA CCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAATGATGCTTCTCCTAATACGTTCGGC CAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGAATTCGAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
克隆3盒蛋白(SEQ ID NO:18)：
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLE WVSSISSYGSYTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNGYAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASALQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNDASPNTFGQGTKVEIKEFEQKLISEEDLLEHHHHHH
克隆6盒DNA(SEQ ID NO:19)：
ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCATG GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG ATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTT CTACTTATGGTGATTATACAACTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAC ACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGTAGTTATACTTT TGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTG GCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACT TGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT CTATTCTGCATCCTATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCA CCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTCTAATGCTACTCCTTCTACGTTCGGC CAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGAATTCGAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
克隆6盒蛋白(SEQ ID NO:20)：
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLE WVSTISTYGDYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSYTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASYLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNATPSTFGQGTKVEIKEFEQKLISEEDLLEHHHHHH
克隆10盒DNA(SEQ ID NO:21)：
ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCATG GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG ATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTA CTAATTATGGTTATACTACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAC ACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCTTCTTATTCTTT TGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTG GCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACT TGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT CTATGCTGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCA CCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTCTGCTTATTATCCTGATACGTTCGGC CAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGAATTCGAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
克隆10盒蛋白(SEQ ID NO:22)：
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLE WVSGITNYGYTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSYSFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASALQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSAYYPDTFGQGTKVEIKEFEQKLISEEDLLEHHHHHH
克隆13盒DNA(SEQ ID NO:23)：
ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCATG GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG ATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTA ATTCTGCTGGTGGTTCTACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAC ACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGGTATATTACTGTGCGAAAAATTCTGCTTATTT TGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTG GCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACT TGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT CTATGATGCATCCAATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCA CCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACTGATACTTATCCTACTACGTTCGGC CAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGAATTCGAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
克隆13盒蛋白(SEQ ID NO:24)：
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLE WVSSINSAGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNSAYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTDTYPTTFGQGTKVEIKEFEQKLISEEDLLEHHHHHH
克隆17盒DNA(SEQ ID NO:25)：
ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCATG GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG ATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTT CTACTTCTGGTAGTTATACAGCTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAC ACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGTGGTTATACTTT TGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTG GCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACT TGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT CTATTCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCA CCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTGATGGTAATCCTACTACGTTCGGC CAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGAATTCGAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
克隆17盒蛋白(SEQ ID NO:26)：
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLE WVSSISTSGSYTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGYTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDGNPTTFGQGTKVEIKEFEQKLISEEDLLEHHHHHH
克隆21盒DNA(SEQ ID NO:27)：
ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCATG GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG ATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCGTCTATTT CTTATTCTGGTGCTTATACAGCTTACGCAGACTCCGTGAACGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAC ACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCTGGTACTGATTT TGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTG GCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACT TGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT CTATGGTGCATCCAATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCA CCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTCTAATTATGATCCTAGTACGTTCGGC CAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGAATTCGAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
克隆21盒蛋白(SEQ ID NO:28)：
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLE WVSSISYSGAYTAYADSVNGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSGTDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNYDPSTFGQGTKVEIKEFEQKLISEEDLLEHHHHHH
在16℃下诱导的7个scFv的纯度为>85％，而在37℃下诱导时的纯度更低。因此，确定16℃是更合适的产生条件。进行QC ELISA以分析七个scFv中的每一个与靶MOG的结合能力。与对照相比，容易地在7个阳性克隆(克隆1、3、6、10、13、17、21)中的每一个中发现差异。在7个阳性克隆中，三个克隆(克隆3、6和17)指示与靶标的更强结合能力。
对在16℃下诱导的7个克隆中的每一个进行QC ELISA滴定。将7个克隆的七种不同浓度用于ELISA滴定。结果指示所有7个克隆可特异性地结合至靶MOG。在7个克隆中，克隆3、6和17仍然指示与靶标的更强结合能力。结果示于图8中，说明克隆17的抗hMOG1 scFv表现出最强的结合，其次是克隆6，然后是克隆3。
实施例5
ScFv产生
将大肠杆菌BL21(DE3)菌株用2YT-K培养基中的pET26b-scFv表达载体转染。当菌株呈对数生长时，分别将1mM和0.2mM IPTG添加至培养基中，以在26℃下诱导scFv的表达16小时。通过SDS-PAGE测试抗体的表达和溶解度。scFv在大肠杆菌BL21菌株中高度表达，但主要存在于包涵体中。
为了获得可溶性scFv抗体，对表达条件进行优化。当将大肠杆菌BL21用pET26b-scFv转染时，它们呈对数生长，并且将0.1mM IPTG添加至培养基中以在22℃下诱导scFv的表达过夜。通过亲和色谱法进行纯化。
还通过包涵体复性纯化scFv。将包涵体用PBS洗涤一次，然后用1M尿素洗涤两次。添加8M尿素以溶解包涵体。然后通过透析袋(8KDa,Biotics,F132579)和Millipore浓缩器纯化scFv。最终获得总计1.17mg的scFv抗体片段(0.9mg/mL，1.3mL)。
实施例6
用FITC标记的ScFv
将scFv用碳酸钠缓冲液(pH 9.0)稀释至1mg/mL。将其与FITC溶液(Sigma，F7250)混合，并在4℃下在黑暗中孵育过夜。将标记的scFv通过Millipore浓缩器浓缩。最终获得总计0.83mg的FITC标记的scFv抗体。测定标记效率，并且结果显示对于每个scFv抗体片段标记了2.52个FITC分子。
DNA(pelB-VH-接头-VL-6His)(SEQ ID NO:29)：
ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCATGGCCGAAGTGAAACTGCATGAAAGCGGCGCGGGCCTGGTGAAACCGGGCGCGAGCGTGGAAATTAGCTGCAAAGCGACCGGCTATACCTTTAGCAGCTTTTGGATTGAATGGGTGAAACAGCGCCCGGGCCATGGCCTGGAATGGATTGGCGAAATTCTGCCGGGCCGCGGCCGCACCAACTATAACGAAAAATTTAAAGGCAAAGCGACCTTTACCGCGGAAACGAGCAGCAACACCGCGTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACGAGCGAAGATAGCGCTGTATATTACTGTGCGACGGGCAACACCATGGTGAACATGCCGTATTGGGGCCAAGGCACCACCGTGACCGTGAGCTCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGTTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGAACTGACGCAGAGCCCGAGCAGCCTGGCGGTGAGCGCGGGCGAAAAAGTGACCATGAGCTGCAAAAGCAGTCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCAATCAGAAAAACTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCTGCCGCCGAAACTGCTGATTTATGGCGCGAGCACCCGCGAAAGCGGCGTGCCGGATCGCTTTACCGGCAGCGGCAGCGGGACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCGTGCAAGCGGAAGATCTGGCGGTGTATTACTGTCAGAATGATCATAGCTATCCGCTGACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAAATTAAACGCCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
蛋白质(pelB-VH-接头-VL-6His)(SEQ ID NO:30)：scFv 4序列加下划线
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMAEVKLHESGAGLVKPGASVEISCKATGYTFSSFWIEWVKQRPGHG LEWIGEILPGRGRTNYNEKFKGKATFTAETSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCATGNTMVNMPYWGQGTTVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGLPPKLLIYGASTRESG VPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPLTFGAGTKLEIKRLEHHHHHH*
SEQ ID NO:41：scFv 4氨基酸序列：
MAEVKLHESGAGLVKPGASVEISCKATGYTFSSFWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGRGRTNYNEKFKGKATFTAETSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCATGNTMVNMPYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGLPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPLTFGAGTKLEIKRLE
蛋白质1PKQ_1|链A,F|(8-18C5)嵌合Fab，轻链|小家鼠(10090)(SEQ ID NO:31)：
MKQSTIALALLPLLFTPVTKADIELTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGLPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
蛋白质1PKQ_2|链B,G|(8-18C5)嵌合Fab，重链|小家鼠(10090)(SEQ ID NO:32)：
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAEVKLHESGAGLVKPGASVEISCKATGYTFSSFWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGRGRTNYNEKFKGKATFTAETSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCATGNTMVNMPYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCSAWSHPQFEK
实施例7
scFv CAR抗原识别
表达HEK293的MOG-1：通过用编码MOG-1和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒对亲本HEK293上皮细胞系进行慢病毒转导而产生了表达MOG-1的HEK293细胞。将细胞维持在含有10％ FCS和2ug/mL嘌呤霉素的DMEM培养基中以确保MOG-1表达的保留。使用FITC标记的抗MOG 1抗体针对MOG-1表达定期对细胞进行FACS纯化
scFv抗MOG-1结合活性：将10^4个MOG-1表达或亲本HEK293细胞以10^5/mL接种于96孔板中并在37C下在5％ CO2中孵育过夜。然后在37C下在含有10％ FCS的DMEM培养基中用FITC标记的scFv对细胞染色20分钟(以所指示的浓度)。然后根据制造商的方案(在室温下100uL固定透化30分钟Cytofix-Cytoperm Biolegend)将细胞固定和透化。然后将细胞洗涤并用Cell Mask Red(2mg/mL)在透化洗涤液中染色30分钟以可视化质膜，且随后用DAPI(500nM)染色5分钟以可视化细胞核。然后将细胞洗涤并储存在PBS中，直到在Leica EVOSM7000荧光显微镜上成像。通过计算scFv-FITC信号和Cell Mask Red信号的比率来测量结合活性。Cell Mask Red和scFv-FITC最小阈值设置为3x背景。scFv结合值被限制至8x背景以消除非特异性色斑染色模式。然后将结果绘制为结合活性对scFv浓度。参见图9。
用编码DNA的抗MOG-1CAR构建体转导T细胞，并测量它们识别细胞表面上的MOG-1的能力。简言之，在37C下将总T细胞(Stem cell technologies)用抗CD3、CD28抗体以2.5e10^4/mL激活48小时。然后用抗MOG-1CAR慢病毒(MOI＝5)转导细胞。在7天培养后，收获T细胞并计数，并且冷冻保存或下游用于CAR识别测定。将10^4个MOG-1表达或亲本HEK293细胞以10^5/mL接种于96孔板中并在37C下在5％CO2中孵育过夜。然后将CAR T细胞与细胞一起以100:1、50:1或25:1Treg与HEK细胞的比率在37C下孵育4小时。刺激后，除了FOXP3和FLAG标签的细胞内染色以鉴定转导的T-reg外，还进行表面染色以鉴定激活标志物CD69(Biolegend 310930)以及T-reg表型标志物CD4、CD25和CD127的上调，以鉴定T-reg。在塔夫茨大学流核区在FACS aria上读取细胞，并使用flowjo分析数据，其中分析在graphpadprism中进行。CD69MFI是从CD4+CD25hi、CD127lo、FLAG+门测量的，并比较了MOG-HEK和HEK-亲本组。(参见图11-13)。
一小瓶病毒用于在24孔板中转导5E5个供体PBMC。按照扩增方案，收获细胞并通过流式测定Flag表达。使用抗Flag抗体(小鼠抗DDDDK，ProMab，目录号20201)。病毒转导在两个不同的日期A和B进行(参见图10)。
DNA PMC 669：具有FLAG标签的[克隆17H-LscFv]-CD8-CD28-CD3z(SEQ ID NO: 33)：
ACGCGTGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAATTCAAAATTTTATCGATACTAGTATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTTTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCCGCCACCATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTTCTACTTCTGGTAGTTATACAGCTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGTGGTTATACTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGAGGCGGAGGAAGTGGTGGCGGAGGATCAGGCGGTGGTGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTGATGGTAATCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGCGGCCGCAGACTACAAAGACGATGACGACAAGATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAATAGagaccgcgtctggaacGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAAATAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCTATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGACTTTTGCAGAGACGGCCCAAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTG
DNA PMC 670：具有FLAG标签的[克隆17L-HscFv]-CD8-CD28-CD3z(SEQ ID NO: 34)：
ACGCGTGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAATTCAAAATTTTATCGATACTAGTATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTTTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCCGCCACCATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTGATGGTAATCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGAGGCGGAGGAAGTGGTGGCGGAGGATCAGGCGGTGGTGGATCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTTCTACTTCTGGTAGTTATACAGCTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGTGGTTATACTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGGCCGCAGACTACAAAGACGATGACGACAAGATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAATAGagaccgcgtctggaacGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAAATAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCTATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTAT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DNA scFv4[18C5-8]CAR序列(SEQ ID NO:40)：
AATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGCTAGCTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTACTAGTGATTATCGGATCAACTTTGTATAGAAAAGTTGTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGCCGACATTGAACTGACGCAGAGCCCGAGCAGCCTGGCGGTGAGCGCGGGCGAAAAAGTGACCATGAGCTGCAAAAGCAGTCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCAATCAGAAAAACTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCTGCCGCCGAAACTGCTGATTTATGGCGCGAGCACCCGCGAAAGCGGCGTGCCGGATCGCTTTACCGGCAGCGGCAGCGGGACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCGTGCAAGCGGAAGATCTGGCGGTGTATTACTGTCAGAATGATCATAGCTATCCGCTGACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAAATTAAACGCTCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGTTCTGGCGGTGGCGGATCGGAAGTGAAACTGCATGAAAGCGGCGCGGGCCTGGTGAAACCGGGCGCGAGCGTGGAAATTAGCTGCAAAGCGACCGGCTATACCTTTAGCAGCTTTTGGATTGAATGGGTGAAACAGCGCCCGGGCCATGGCCTGGAATGGATTGGCGAAATTCTGCCGGGCCGCGGCCGCACCAACTATAACGAAAAATTTAAAGGCAAAGCGACCTTTACCGCGGAAACGAGCAGCAACACCGCGTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACGAGCGAAGATAGCGCTGTATATTACTGTGCGACGGGCAACACCATGGTGAACATGCCGTATTGGGGCCAAGGCACCACCGTGACCGTGAGCTATAAGGACGACGACGACAAGTTCGTGCCTGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCCACTACTACCCCTGCCCCCAGGCCTCCAACACCTGCCCCAACCATCGCTTCTCAGCCACTGTCTCTGCGACCAGAAGCGTGCAGACCCGCCGCCGGGGGCGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGATATCTACATCTGGGCACCTCTGGCCGGGACCTGTGGAGTGCTGCTCCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGTAACCACAGGAACAGAAGCAAGAGGAGCCGGCTGCTGCATTCCGACTATATGAACATGACCCCTAGGCGCCCAGGGCCCACTAGAAAACATTACCAGCCTTATGCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCTTATAGGTCTAGAGTGAAGTTCTCACGGAGCGCAGACGCACCTGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTGTATAACGAACTCAACCTGGGGAGGAGGGAGGAATACGATGTCCTGGATAAGCGCAGGGGCAGGGATCCCGAGATGGGAGGCAAACCTCAGAGGAGGAAGAACCCTCAGGAGCAGCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAAGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGGAGGGGCAAGGGACACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCCACAAAGGATACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGGTAATGAACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAATCGAATTCCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCATCGGGAATTCCCGCGGTTCGCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTG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测试了每种scFv的两种不同CAR构建体。一种构建体按顺序VH-VL编码可变结构域，并且另一种构建体按VL-VH顺序编码可变结构域。基于核心scFv序列测试两种不同的CAR变体允许选择具有最佳表面表达、稳定性、抗原识别和信号传导能力的CAR。
实施例8
研究设计
患有进行性核上性麻痹(PSP)的参与者将接受单次输注离体扩增的自体CD4+CD127lo/-CD25+CAR-T调控性细胞(Treg)。CAR-Treg将被设计用于特异性地识别髓鞘少突胶质细胞蛋白(MOG)(一种在中枢神经系统(CNS)中特异性表达的糖蛋白)，并在脑中诱导免疫耐受和抗炎效应。
主要目标将是在至少5名PSP患者中评估静脉内输注离体选择、扩增和转导的自体CNS特异性CAR-Treg的安全性和可行性。
主要结果量度将是：
1.不良事件
2.实验室异常
3.输液反应
4.与感染有关的并发症
5.对PSP过程的潜在负面影响
次要目标将是评估CNS特异性CAR-Treg对PSP的影响，并获得关于在其他神经变性疾病中潜在应用的指示。
终点将是：
1.评估CNS特异性CAR-Treg对PSP患者中的临床、神经心理学、放射学和生物力学参数的影响。
2.获得关于CNS特异性CAR-Treg在其他神经变性疾病(包括阿尔茨海默病(AD))中的潜在治疗用途的指示。
3.获得关于潜在II期随机化、双盲、安慰剂对照试验的指示，所述试验可提供对CAR-Treg用于神经变性病症的潜在功效的有价值的见解。
患者评估
临床和神经心理学评估：纳入和排除标准的详细描述以及临床(运动和神经心理学)和神经影像学评估将如先前所报告进行(Giordano等人,J.Transl.Med.2014；Canesi等人,J.Transl.Med.2016，以引用的方式并入本文)。患者将进行神经学检查以使用以下量表评估运动功能：统一帕金森病评定量表(UPDRS第III部分，运动得分)、Hoehn和Yahr分期(H&Y)、PSP评定量表(PSP-RS)(Goetz等人,Mov.Disord.2004；Golbe等人,Brain 2007；其各自的内容以引用的方式并入本文)。还将如先前所述进行简易精神状态检查(MMSE)(Folstein等人J.Psychiatr.Res.1975，以引用的方式并入本文)。所有这些测试将在基线和每个随访点(细胞施用后1、3、6和12个月)进行评估。如果UPDRS和PSP-RS得分与基线相比下降不超过30％并且H&Y分期在所定义的时间点没有改变，则临床状况将被分类为“稳定”(Canesi等人,J.Transl.Med.2016，以引用的方式并入本文)。
神经影像学：所有患者将进行纵向神经影像学评估，使用脑磁共振成像(MRI)(基线，细胞施用后24小时和1年后)、纹状体多巴胺转运体单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)和正电子发射断层摄影术(PET)(基线时和12个月后)。用碘-123(FP-CIT)和18F-氟-2-脱氧葡萄糖(β-CIT)标记的Tropanic示踪剂将分别用于SPECT成像和PET/TC成像。
对于SPECT，静脉内施用110–140MBq的[123I]FP-CIT(Datscan,GE-Health,Amersham,UK)将在所有患者中在甲状腺阻断(口服10–15mg的卢戈溶液)后30-40分钟进行。将如先前所述进行分析(Isaias等人,NeuroReport 2007，以引用的方式并入本文)。灰质解剖分布的体积模板将通过应用宏观解剖方法(自动解剖标记)从蒙特利尔神经学研究所MRI单参与者脑图谱生成，并将重新定向且重新格式化以获得2.64-cm厚的参考部分。将在此部分上手动绘制八个不规则目标区域(ROI)的模板，以评估分别具有[123I]FP-CIT的特异性和非特异性摄取的纹状体和枕叶结构的解剖程度。ROI模板也将定位在参考SPECT部分上，并在纹状体和枕叶皮质上进行调整。纹状体ROI还将分段成它们的前部(尾状核)和后部(核壳)部分。[123I]FP-CIT的特异性纹状体多巴胺摄取转运体(DAT)结合将使用下式在整个纹状体、核壳和尾状核中计算：[(特异性ROI中的平均计数)-(枕叶ROI中的平均计数)]/(枕叶ROI中的平均计数)。还将计算每个受试者的核壳和尾状核比率。
在静脉内注射170MBq后，所有患者还将在休息时进行F-氟-2-脱氧葡萄糖正电子发射断层摄影术扫描(FDGPET)。每次采集将包括头部的计算机断层摄影术(CT)透射扫描(50mAs，持续16秒)，然后使用Biograph Truepoint 64PET/CT扫描仪(Siemens)进行15分钟的三维(3D)静态发射。PET部分将使用迭代算法(OS-EM)进行重建，并使用从用相同扫描仪获得的头部的低剂量CT扫描导出的密度系数校正散射和衰减。将使用迭代算法、有序子集预期最大化(OSEM)以 至2mm的128像素的轴向图像形式重建图像。PET系统的分辨率将是4–5mm FWHM。
生物力学评价：生物力学评价将在基线以及CAR-Treg细胞施用后6个月和12个月时进行评估。两组特定参数(一组针对站立且一组针对步态启动)将通过特别算法自动提取(Carpinella等人,IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng.2007，以引用的方式并入本文)。对于站立，将测量压力中心(CoP)平均速度和空间位移(Canesi等人,J.Transl.Med.2016，以引用的方式并入本文)。为了检查步态启动，将分析预期姿势调整(Canesi等人,J.Transl.Med.2016，以引用的方式并入本文)(即不平衡和卸载阶段)并测量以下参数：(1)两个阶段的持续时间，(2)CoP的前-后(AP)和中侧(ML)偏移和速度,(3)CoP平均长度和速度。还将测量第一步的(4)长度和(5)速度。空间参数将根据身高(BH％)进行归一化。
CAR-Treg细胞的制备和施用
Treg分离和扩增：将基于三种细胞表面标志物—CD4、CD25和CD127从五个患有PSP的个体选择和扩增PolyTreg，以纯化存在于外周血中的FOXP3+Treg，如前所述(Putnam等人,Diabetes 2009；Bluestone等人,Sci.Transl.Med.,2015，以引用的方式并入本文)。
400ml新鲜外周血将收集到含有柠檬酸盐磷酸盐右旋糖的血包单元中，并在24小时内加工以通过Ficoll密度梯度分离PBMC。Treg将在高速细胞分选仪上用以下GMP级冻干抗体分离：CD4-PerCP(多甲藻素叶绿素蛋白)(L200克隆)、CD127-PE(藻红蛋白)(40131克隆)和CD25-APC(别藻蓝蛋白)(2A3克隆)。分选的CD4+CD127lo/-CD25+细胞将被收集到3ml的含有10％人热灭活合并AB血清(Valley Biomedical)的X-VIVO 15培养基(Lonza，目录号04-418Q)中。将在分选后分析Treg的纯度。CD4+CD127lo/-CD25+细胞的预期纯度超过96％(Bluestone等人,Sci.Transl.Med.,2015，以引用的方式并入本文)。
纯化的Treg将与用抗CD3和抗CD28加重组IL-2包被的临床级Dynabead一起培养，如先前所述(Bluestone等人,Sci.Transl.Med.,2015，以引用的方式并入本文)。一单位的血液预期产生介于4.2x106与11.8x106之间的纯化CD4+CD127lo/-CD25+Treg，(Bluestone等人,Sci.Transl.Med.,2015，以引用的方式并入本文)。扩增的Treg制剂预期在90％FOXP3+左右。将检查Treg制剂的活力、CD4+百分比和CD8+细胞污染(Bluestone等人,Sci.Transl.Med.,2015，以引用的方式并入本文)。
扩增的polyTreg的表型和TCR分析：用于分离Treg的关键细胞表面标志物CD4和CD127将在扩增后进行检查。
以前的数据表明，初始CD45RA+Treg优先在这些培养物中扩增，并且CD45RA+RO-细胞在扩增期内下调CD45RA并上调CD45RO(Bluestone等人,Sci.Transl.Med.,2015，以引用的方式并入本文)。CCR7(一种Treg运输受体)、CD38(一种与增强的Treg功能相关的多功能胞外酶)和CD45 RO将在扩增之前和之后进行测定。还将分析扩增的Treg的TCRβ谱库并与新鲜分离的群体进行比较，以确定扩增的Treg的多克隆性。扩增的细胞预期表现出与扩增前培养物无法区分的多克隆性，并且Treg在扩增后仍然是高度多样化的群体(Bluestone等人,Sci.Transl.Med.,2015，以引用的方式并入本文)。
扩增的polyTreg的功能分析：将在Treg扩增后进行以下测定(Bluestone等人,Sci.Transl.Med.,2015，以引用的方式并入本文)：
-FOXP3基因座的增强子区域的DNA甲基化状态以评估扩增的Treg的总体纯度和稳定性。
-细胞因子产生(IFNγ、IL-4、IL-5和IL-17)以评估淋巴细胞表型
-体外抑制活性以确定扩增的细胞的功能潜力。
CAR-Treg细胞的产生和功能分析：CAR RNA将根据公开的方案针对人Treg电穿孔后Treg上和过继转移至PSP小鼠模型后小鼠Treg上的抗MOG CAR表达进行优化(Zhao,Y等人,2010 Cancer Res and Beatty；GL等人,2014Cancer Immunol Res；Singh,N等人,2014Oncoimmunol；其各自的内容以引用的方式并入本文)。还将优化使用第二代慢病毒载体和标准方案递送抗MOG CAR(Levine,B.L.等人,2017 Mol Ther Methods&Clin Dev，以引用的方式并入本文)。将在GMP条件下使用RNA的电穿孔(约1μg/3x106个Treg)或通过慢病毒转导(1x106pfu/3x106个Treg)转导人Treg。将产生用于抗MOG CAR的临床级RNA。对于2.6x109个Treg细胞每名患者约0.9mg RNA；对于5名患者将需要4.5mg。将产生临床级慢病毒。对于2.6x109个Treg细胞，每名患者约8.7x109pfu；对于5名患者将需要4.3x1010pfu。MOG特异性CAR-Treg的功能分析将如上文在3.3中所述进行。
细胞施用
将对每名患者进行MOG特异性CAR-Treg的一次单次施用(每名患者2.6x109个CAR-Treg)。细胞将施用于至少5名PSP患者。患者将接受对乙酰氨基酚和苯海拉明的术前用药。CAR-Treg将通过外周静脉注射管在10至30分钟内输注。将在输注之前和之后取得生命体征，然后每15分钟一次持续至少1小时，然后对于前4小时每小时一次，且每4小时一次持续20小时。在从临床研究单位出院前的第二天，将重复进行化学和全血细胞计数以及血细胞分类计数。患者将在输注后第4天接受随访评估，然后每周一次持续4周，然后每13周一次持续1年，且然后每26周一次持续2年。不良事件的电话监测将在输注后继续每6个月一次持续5年，随后是最后一次门诊访视。
CAR-Treg细胞输注后的患者评估
将如上文所述评估CNS特异性CAR-Treg对PSP患者中的临床、神经心理学、放射学和生物力学参数的影响。所有测试将在每个随访点进行：细胞施用后1、3、6和12个月。
实施例9
将开发和测试用于多发性硬化症(MS)的采用免疫抑制T调控淋巴细胞(Treg)的组分来关闭导致疾病的破坏性免疫应答的药物。全球MS市场是约$215亿，但用于最常见形式的MS的批准药物得到仅适度疾病改善与显著副作用。对于更严重形式的MS，治疗选择仅限于1种最近批准的药物。
存在11种FDA批准的药物用于复发缓解形式的MS(RRMS-确诊MS的85％)。存在几种当前批准或正针对RRMS进行临床评估的口服可用的和基于抗体的药物。2017年3月，FDA批准了奥瑞珠单抗(抗CD20抗体，Roche)用于原发性进行性多发性硬化症(PPMS–确诊MS的约10％)。奥瑞珠单抗使症状减少25％，并且是目前美国用于PPMS的唯一免疫调节剂。继发性进行性多发性硬化症(SPMS)总是发生在RRMS患者中，对于这些患者，疾病治疗选择也有限。
生物制剂的产生
将通过CRO用重组人MOG免疫小鼠来产生抗MOG杂交瘤。将克隆VH和VL基因和抗scFv分子。VH和VL的取向以及接头(在scFv之间或每个scFv内部)可能极大地影响GTIP的稳定性、表达水平和结合能力。在一些情况下，这些形式中仅一种将产生功能分子。因此，VH-VL的几种取向将以小规模表达并在扩大生产之前进行测试。将产生编码4个抗MOG scFv的表达构建体，其具有连接接头、中心接头，然后连接至Treg相关酶或模拟物。
在小鼠MS模型中验证GTIP蛋白质产物
GTIP将在MS的小鼠、急性和慢性EAE模型中进行测试。将测量对髓鞘碱性蛋白(MBP)具有特异性的Th1、Th17、CTL(血液和CNS)、骨髓炎性细胞(巨噬细胞和嗜中性粒细胞)和抗MBP抗体的水平。免疫应答将与疾病进展相关。将改变剂量，以深入了解在晚期MS中的潜在用途。产物将在正常小鼠中给药，以深入了解任何潜在脱靶效应。
临床评价
将进行临床研究以测试GTIP作为MS中的疾病调节剂的功效。这些产物将首先在对首次使用药物无反应的RRMS患者中进行测试。将使用类似于抗体疗法的给药方案来测量安全性和耐受性(例如前3个静脉内剂量每2周一次，然后每4周一次持续20周)。在2期研究中，主要量度将是降低的疾病复发频率和脑损伤。次要量度将是血液中减少的炎症细胞因子、Th1/Th17细胞和其他白细胞水平。副作用可包括对感染的易感性增加。这些研究将使我们能够将化合物的有效性与其他二次使用药物进行比较，所述二次使用药物可使复发频率降低达49％。如果产物显示可接受的功效水平，则它们将进入PPMS患者中的长期临床2期研究。主要量度将是运动功能的下降延迟和脑损伤减少，并且次要量度将是血液中降低的炎性细胞因子、Th1/Th17细胞和其他白细胞水平。
1.等效方案和以引用的方式并入
本文引用的所有参考文献以引用的方式并入，其程度如同每个单独的公布、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利出于所有目的具体地且单独地指明以引用的方式整体并入一般。以引用的方式并入的这种声明由申请人根据37C.F.R.§1.57(b)(1)预期，以与每一个单独的公布、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利相关，其各自根据37C.F.R.§1.57(b)(2)明确标识，即使这种引用不是紧邻以引用的方式并入的专门声明。在说明书中包含以引用的方式并入的专门声明(如果有的话)不会以任何方式削弱以引用的方式并入的这种一般声明。本文对参考文献的引用并不意味着承认所述参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些公布或文件的内容或日期的任何承认。
虽然已经尤其参考优选实施方案和多种替代实施方案示出和描述了本发明，但相关领域的技术人员应理解，可在其中进行形式和细节的多种改变而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (28)

1.一种工程化蛋白质，所述工程化蛋白质包含与由调控性T细胞(Treg)表达的分子偶联的神经胶质细胞特异性结合蛋白。
2.如权利要求1所述的工程化蛋白质，其中由Treg表达的所述分子是细胞外免疫抑制酶。
3.如权利要求2所述的工程化蛋白质，其中由Treg表达的所述分子选自由以下组成的组：CD73、CD39、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和谷氨酸-草酰乙酸转氨酶1(GOT1)。
4.如权利要求1所述的工程化蛋白质，其中所述神经胶质细胞特异性结合蛋白是抗体分子的四聚体单链可变片段(scFv)。
5.如权利要求1所述的工程化蛋白质，其中所述神经胶质细胞特异性结合蛋白结合选自由以下组成的组的标志物：髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、少突胶质细胞标志物01(OM1)、少突胶质细胞标志物04(OM4)、神经/神经胶质标志物2(NG2)、A2B5、半乳糖神经酰胺酶(GALC)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和髓鞘少突胶质细胞特异性蛋白(MOSP)。
6.如权利要求5所述的工程化蛋白质，其中所述神经胶质细胞特异性结合蛋白结合髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)。
7.如权利要求6所述的工程化蛋白质，其中所述神经胶质细胞特异性结合蛋白是抗体分子的单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID No:2、4、6、8、10、12、14和41。
8.一种工程化蛋白质，所述工程化蛋白质包含与模拟由调控性T细胞(Treg)表达的分子的活性的分子偶联的神经胶质细胞特异性结合蛋白。
9.如权利要求8所述的工程化蛋白质，其中由Treg表达的所述分子是细胞外免疫抑制酶。
10.如权利要求9所述的工程化蛋白质，其中由Treg表达的所述分子选自由以下组成的组：CD73、CD39、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和谷氨酸-草酰乙酸转氨酶1(GOT1)。
11.如权利要求8所述的工程化蛋白质，其中所述神经胶质细胞特异性结合蛋白是抗体分子的四聚体单链可变片段(scFv)。
12.如权利要求8所述的工程化蛋白质，其中所述神经胶质细胞特异性结合蛋白结合选自由以下组成的组的标志物：髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、少突胶质细胞标志物01(OM1)、少突胶质细胞标志物04(OM4)、神经/神经胶质标志物2(NG2)、A2B5、半乳糖神经酰胺酶(GALC)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和髓鞘少突胶质细胞特异性蛋白(MOSP)。
13.如权利要求12所述的工程化蛋白质，其中所述神经胶质细胞特异性结合蛋白结合髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)。
14.如权利要求13所述的工程化蛋白质，其中所述神经胶质细胞特异性结合蛋白是抗体分子的单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID No:2、4、6、8、10、12、14和41。
15.一种包含多个工程化调控性T细胞(Treg)的组合物，所述组合物包含权利要求1-14中任一项所述的工程化蛋白质。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述工程化调控性T细胞(Treg)能够特异性地结合至神经胶质细胞标志物或受体。
17.如权利要求15或16所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂或稀释剂。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述组合物还包含第二治疗剂。
19.一种治疗受试者的神经变性疾病的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-14所述的工程化蛋白质或权利要求15-18所述的组合物中的至少一者，其中所述工程化蛋白质或包含所述多个工程化调控性T细胞(Treg)的所述组合物能够特异性地结合至神经胶质细胞标志物或受体。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述受试者是人。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述神经胶质细胞标志物或受体选自由以下组成的组：少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、少突胶质细胞标志物01(OM1)、少突胶质细胞标志物04(OM4)、神经/神经胶质标志物2(NG2)、A2B5、半乳糖神经酰胺酶(GALC)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和髓鞘少突胶质细胞特异性蛋白(MOSP)。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述神经胶质细胞标志物是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)。
23.如权利要求19所述的方法，其中所述神经变性疾病选自由以下组成的组：进行性核上性麻痹(PSP)、阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病、帕金森病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、慢性创伤性脑病(CTE)和朊病毒病。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述神经变性疾病是进行性核上性麻痹(PSP)。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默病(AD)。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述神经变性疾病是帕金森病(PD)。
27.一种用于测量表达对蛋白质具有特异性的scFv的CAR分子结合至表达所述蛋白质的Treg细胞的能力的方法，其中所述scFv和所述蛋白质用不同的荧光标记物标记并且施加剪切力持续孵育期。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述两种标记物中的一者具有介于500-625nm之间的荧光峰，并且另一者具有介于375与500nm之间的荧光峰。
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