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CN116555114B - 一种发酵剂及其应用、一种奶豆腐及其制备方法 - Google Patents

一种发酵剂及其应用、一种奶豆腐及其制备方法 Download PDF

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CN116555114B CN202310552636.6A CN202310552636A CN116555114B CN 116555114 B CN116555114 B CN 116555114B CN 202310552636 A CN202310552636 A CN 202310552636A CN 116555114 B CN116555114 B CN 116555114B
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Abstract

本发明属于传统乳制品生产技术领域，具体涉及一种发酵剂及其应用、一种奶豆腐及其制备方法。本发明提供了一种发酵剂，包括乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)；所述乳酸乳球菌的活菌数≥2.5×106CFU/mL；所述副干酪乳酪杆菌的活菌数≥2.5×105CFU/mL。利用本发明的发酵剂制备的奶豆腐中含有较高含量的2‑庚酮、2‑壬酮和乙偶姻等酮类化合物，具有独特的水果清香和奶油香气。本发明发酵剂制备的奶豆腐贮藏过程中口感不会变硬，韧性强度增强，脆性指数降低，提升了奶豆腐的质构特性。

Description

一种发酵剂及其应用、一种奶豆腐及其制备方法
技术领域
本发明属于乳制品技术领域，具体涉及一种发酵剂及其应用、一种奶豆腐及其制备方法。
背景技术
奶豆腐，蒙古语称“浩乳德”，是一种以鲜牛奶为原料，经过滤除杂质后自然发酵至呈凝固型酸乳后收取浮于表面的奶油层，再将下层凝乳加热呈絮状凝乳块去除乳清且使乳蛋白等固形物热变性成黏稠状态，装模成型而制成的传统乳制品。有报道称其为中国内蒙古的“Hurood”，因其外形类似于普通豆腐而称之为“奶豆腐”，但它并不含任何豆类成分。
奶豆腐是一种高蛋白质含量的乳制品，其含量一般大于30％，蛋白质在微生物和酶的作用下被分解为胨、肽、氨基酸以及无机或有机化合物等小分子物质，易于被人体消化吸收，是膳食优质蛋白质的良好来源。同时奶豆腐中含有大量的钙、磷、钠、钾、镁、铁、锌以及脂溶性维生素和水溶性维生素等多种营养素，其中的必须氨基酸含量占氨基酸总含量的36.10％～37.75％，奶豆腐是为人类提供优质蛋白质和足够钙质的营养全面的健康食品。
直到目前为止，奶豆腐的制备仍以自然发酵为主，发酵微生物主要来自新鲜未杀菌的牛乳和发酵容器及环境。因长期的牛乳发酵，其环境和容器中自然选择构成优势乳酸菌类群，其种类复杂多样还有其他类群的微生物存在，例如耐酸性葡萄球菌、酵母菌和霉菌等，从而导致奶豆腐质地和风味特征随制作者个人习惯和经验而有较大的差异。奶豆腐自然发酵中参与的微生物类群复杂，微生物类群受环境因素影响波动变化大，甚至还有一些易导致奶豆腐变质的真菌类微生物存在，从而导致自然发酵法生产的奶豆腐风味不稳定性，口感不佳。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种发酵剂，应用该发酵剂制备奶豆腐时能够产生酯类、烷烃、烯烃、酸类和醇类风味物质，奶豆腐风味稳定且口感好。
本发明提供了一种发酵剂，包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)IMAU12063和副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)IMAU12062；所述发酵剂中乳酸乳球菌的有效活菌数≥2.5×106CFU/mL；所述发酵剂中副干酪乳酪杆菌的有效活菌数≥2.5×105CFU/mL；
所述乳酸乳球菌IMAU12063的保藏编号为CGMCC NO.26949；所述副干酪乳酪杆菌IMAU12062的保藏编号为CGMCC NO.26948。
优选的，所述乳酸乳球菌和所述副干酪乳酪杆菌的质量比为1：(1～2)。
本发明提供了上述技术方案所述的发酵剂在制备奶豆腐中的应用。
优选的，所述发酵剂单独使用或者与其他商业发酵剂联用。
本发明提供了一种奶豆腐的制备方法，包括如下步骤：
利用上述技术方案所述的发酵剂对牛乳进行发酵，得到发酵产物；
对所述发酵产物凝乳后排乳清，得到奶豆腐。
优选的，所述发酵的温度为28～33℃，所述发酵在发酵产物的pH值达到4.48～4.52时停止。
优选的，所述发酵剂与牛乳的质量比为1：20～50。
优选的，所述排乳清的温度为43℃～47℃。
优选的，对所述发酵产物凝乳的方式包括：将所述发酵产物与凝乳酶混合。
本发明提供了上述技术方案所述的制备方法得到的奶豆腐，其特征在于，所述奶豆腐的风味物质包括2-庚酮、2-壬酮、乙偶姻、3-甲基-丁醛、庚醛和辛醛中的一种或多种。
本发明的有益效果：本发明提供的发酵剂，包括乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)；所述乳酸乳球菌的活菌数≥2.5×106CFU/mL；所述副干酪乳酪杆菌的活菌数≥2.5×105CFU/mL；所述乳酸乳球菌包括保藏编号为CGMCC NO.26949的乳酸乳球菌IMAU12063；所述副干酪乳酪杆菌包括保藏编号为CGMCC NO.26948的副干酪乳酪杆菌IMAU12062。本发明将乳酸乳球菌和副干酪乳酪杆菌复配，在发酵过程中可以产生丰富的酯类、烷烃、烯烃、酸类和醇类化合物，制备的奶豆腐口感好，利用本发明的发酵剂制备的奶豆腐中含有较高含量的2-庚酮、2-壬酮和乙偶姻等酮类化合物，赋予奶豆腐独特的水果清香和奶油香气。奶豆腐含有丰富的3-甲基-丁醛、庚醛和辛醛等醛类化合物，这些物质能产生令人愉悦的香气。同时，奶豆腐富含丰富的酯类、烷烃、烯烃、酸类和醇类等化合物，赋予奶豆腐独特且稳定的风味。
普通奶豆腐容易呈现碎渣，本发明发酵剂能够改善奶豆腐贮藏过程中逐渐变硬的口感，不出现碎渣，同时相比于现有技术中的市售奶豆腐，本发明制备的奶豆腐贮藏之后韧性强度增强，脆性指数降低，奶豆腐的质构得到了整体的提升且奶豆腐的风味稳定。
生物保藏说明
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)IMAU12063，于2023年03月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.26949，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)IMAU12062，于2023年03月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.26948，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中乳酸乳球菌和副干酪乳酪杆菌菌株凝乳情况；
图2为实施例1中乳酸乳球菌发酵期间pH值变化情况；
图3为实施例1中乳酸乳球菌发酵期间滴定酸度变化情况；
图4为实施例1中副干酪乳酪杆菌发酵期间pH变化情况；
图5为实施例1中副干酪乳酪杆菌发酵期间滴定酸度变化情况；
图6为实施例1中乳酸菌菌株发酵乳发酵终点黏度(A)结果；
图7为实施例1中乳酸菌菌株发酵乳发酵终点感官评定测定(B)结果；
图8为实施例2～9和对比例1中发酵剂发酵乳发酵期间发酵的pH和滴定酸度测定结果；
图9为实施例2～9和对比例1中发酵剂发酵乳感官评分结果；
图10为实施例10和对比例2的奶豆腐贮藏期间各类化合物总含量变化结果；
图11为实施例10和对比例2的奶豆腐贮藏期间挥发性物质总量变化结果；
图12为实施例10和对比例2的奶豆腐贮藏期间各类化合物种类结果；
图13为实施例10制备的奶豆腐贮藏期间电子鼻传感器雷达图及箱线图分析结果；其中，a为电子鼻检测风味雷达图；b为电子鼻检测风味箱线图。
具体实施方式
本发明提供了一种发酵剂，包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)IMAU12063和副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)IMAU12062；所述发酵剂中乳酸乳球菌的活菌数≥2.5×106CFU/mL；所述发酵剂中副干酪乳酪杆菌的活菌数≥2.5×105CFU/mL，本发明所述乳酸乳球菌IMAU12063的保藏编号为CGMCCNO.26949；本发明所述副干酪乳酪杆菌IMAU12062的保藏编号为CGMCCNO.26948。
在本发明中，所述发酵剂中的乳酸乳球菌和副干酪乳酪杆菌的质量比优选为1：(1～2)，进一步优选为1：(1～1.5)，更优选为1：1。
本发明所述乳酸乳球菌IMAU12063，保藏编号为CGMCC NO.26949，拉丁文名称为Lactococcus lactis，分离自锡林郭勒盟地区的奶酪样品，由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室分离、鉴定并保存，其16S rRNA序列测序信息为OQ694910。IMAU12063的最佳生长温度为30℃～37℃，在乳中生长良好，产酸速度较快，具有良好的凝乳特性和产黏特性。本发明所述乳酸乳球菌IMAU12063的产酸性能较好，单菌发酵12h到达发酵终点，黏度值较高，达到700Pa·S以上，表明其发酵的乳制品具有较高的蛋白质含量及营养价值。
本发明所述副干酪乳酪杆菌IMAU12062，保藏编号为CGMCC NO.26948，拉丁文名称为Lacticaseibacillusparacasei，分离自香格里拉市的奶酪样品，由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室分离、鉴定并保存，其16S rRNA序列测序信息为OQ694911。IMAU12062最佳生长温度为30℃～37℃，适合于奶豆腐发酵乳的低温发酵积累更多风味物质的需要，在乳中生长良好，产酸速度适中，具有良好的凝乳特性。本发明所述副干酪乳酪杆菌IMAU12062的产酸性能较好，发酵速度适中，黏度值居中，单菌发酵16h到达发酵终点，黏度值为500Pa·S左右。
本发明还提供了上述技术方案所述的发酵剂在制备奶豆腐中的应用。本发明所述发酵剂能够改善传统奶豆腐风味及品质。本发明的目的在于针对奶豆腐以自然发酵制作而有潜在质量与安全问题、风味问题的现状，提供两株乳酸菌，即乳酸乳球菌IMAU12063和副干酪乳酪杆菌IMAU12062，并将其作为奶豆腐生产制作过程中发酵乳的发酵剂菌株而复配使用，本发明将乳酸乳球菌IMAU12063和副干酪乳酪杆菌IMAU12062复配制备奶豆腐，能够减少杂菌污染、过程可控、提高制品卫生质量和安全性以及延迟货架期，生产具有浓郁奶香的传统风味奶豆腐。
本发明提供了一种发酵剂，包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)，本发明所述发酵剂的制备方法优选包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)混合后应用，更优选为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌悬液和副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)菌悬液混合后应用。
本发明所述乳酸乳球菌菌悬液的制备方法优选包括如下步骤：将乳酸乳球菌接种于无菌液体MRS培养基中活化培养后得到菌泥，所述菌泥与PBS溶液混合得到菌悬液。本发明所述乳酸乳球菌菌悬液的有效活菌数优选为0.75×107～5×107CFU/mL，更优选为2.5×107CFU/mL。
本发明所述副干酪乳酪杆菌菌悬液的制备方法优选包括如下步骤：将副干酪乳酪杆菌接种于无菌液体MRS培养基中活化培养后得到菌泥，所述菌泥与PBS溶液混合得到菌悬液。本发明所述副干酪乳酪杆菌菌悬液的有效活菌数优选为0.75×107～5×107CFU/mL，更优选为2.5×107CFU/mL。
在本发明中，所述MRS培养基的组成优选：每升包括大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、吐温-80 1mL、磷酸氢二钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g、琼脂粉15g和1L无菌蒸馏水；所述MRS培养基的pH值优选为6.20。本发明所述MRS培养基优选在温度为121℃条件下灭菌15min后使用。
本发明所述活化培养的温度优选为37℃，所述活化培养的时间优选为24h。本发明优选对所述活化培养后得到的培养液进行离心得到沉淀，所述沉淀即为菌泥。本发明所述离心的转速优选为2800～3200r/min，更优选为3000r/min，本发明所述离心的时间优选为8～12min，更优选为10min。本发明所述PBS溶液优选由NaCl、Na2HPO4、KH2PO4和水配制而成。本发明所述PBS溶液中，NaCl的质量浓度优选为8g/L，Na2HPO4的质量浓度优选为1.4g/L，KH2PO4的质量浓度优选为0.24g/L。
本发明所述发酵剂优选可单独使用，也可与其他菌株或发酵剂复配使用。在本发明中，所述发酵剂优选还包括和其他的商业发酵剂联用；所述商业发酵剂优选包括丹麦科汉森股份有限公司生产的YF-L904(商品名称为Chr.Hansen YF-L904 Thermophilicculture，Size 25X200 U)。本发明所述商业发酵剂的用量优选为牛奶原料质量的0.001％～0.003％，更优选为0.0015％。
在本发明实施例中，本发明的发酵剂与市售的商业发酵剂联合应用制备奶豆腐时可进一步提高产酸性能，制备的奶豆腐口感更好。
本发明提供了一种奶豆腐的制备方法，包括如下步骤：
利用上述技术方案所述的发酵剂对牛乳进行发酵得到发酵产物；
对所述发酵产物凝乳后排乳清，得到奶豆腐。
本发明利用上述技术方案所述的发酵剂对牛乳进行发酵，得到发酵产物。
本发明进行所述发酵前，优选对所述牛乳进行灭菌，冷却后与无水氯化钙混合，得预混料。在本发明中，所述灭菌优选包括巴氏杀菌；所述巴氏杀菌的温度优选为75℃，时间优选为15min。本发明所述牛乳优选为全脂牛乳。本发明所述牛乳灭菌能避免牛乳制备奶豆腐时牛乳杂菌的污染，使奶豆腐风味稳定。本发明所述无水氯化钙的添加量优选为灭菌后牛乳质量的0.02％(w/w)，所述无水氯化钙提高了牛乳的凝固性。本发明优选将灭菌的牛乳冷却至30～33℃后加入无水氯化钙。
得到预混料后，本发明所述预混料优选与发酵剂混合后进行发酵，得到发酵产物。
在本发明中，所述发酵剂优选以发酵剂菌悬液的形式进行接种。本发明所述发酵剂菌悬液包括乳酸乳球菌菌悬液和副干酪乳酪杆菌菌悬液。
在本发明中，所述发酵剂与牛乳的质量比优选为1：20～50，更优选为1：50。本发明所述发酵的温度优选为28～33℃，进一步优选为29～31℃，更优选为30℃。本发明优选在所述发酵过程中发酵产物的pH值达到4.48～4.52时停止发酵。本发明所述发酵产物的pH值的选择在于促进后续的发酵产物凝乳。
得到所述发酵乳后，本发明优选将所述发酵乳与凝乳酶混合，得到凝乳后的发酵乳。本发明所述凝乳酶的添加量优选为每1kg发酵乳中加入0.001g凝乳酶。本发明所述凝乳酶的酶活力优选为1～2万U，更优选为1.3万U。本发明所述凝乳酶加入后优选先静置后再缓慢加热，本发明所述静置的时间优选为55～65min，更优选为60min，本发明所述静置的作用为在凝乳酶充分发挥作用的同时有利于奶豆腐形成稳定的凝固物。本发明所述缓慢加热优选为每30min温度上升5℃。本发明加热后的温度优选为29～31℃，更优选为30℃。本发明优选发酵乳pH值为4.5±0.02时凝乳停止。本发明所述pH值的选择在于保证乳酸菌的活力，同时使酸奶也具有良好的风味。本发明所述凝乳后的发酵乳的酸度优选控制在50～55°T，更优选为53°T。
得到所述凝乳后的发酵乳后，本发明对所述凝乳后的发酵乳进行排乳清，得到所述奶豆腐。在本发明中，所述排乳清的温度优选为43℃～47℃，更优选为45℃。本发明对所述排乳清的方法没有特殊限定，采用常规的方法即可。本发明优选排乳清后，将凝块装入模具中压榨定型得到所述奶豆腐成品。本发明对所述压榨定型没有特殊限定，采用常规的方法即可。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法得到的奶豆腐，所述奶豆腐的风味物质包括2-庚酮、2-壬酮、乙偶姻、3-甲基-丁醛、庚醛和辛醛中的一种或多种。本发明利用上述制备方法得到的奶豆腐富含2-庚酮、2-壬酮、乙偶姻、3-甲基-丁醛、庚醛和辛醛中的一种或多种。本发明中制备好的奶豆腐(实施例10制备好之后直接测量)中2-庚酮的含量为5.0～5.20μg/L，2-壬酮的含量为2.0～2.32μg/L，乙偶姻的含量为4.62～4.82μg/L，3-甲基-丁醛的含量为0.13～0.15μg/L，庚醛的含量为0.18～0.22μg/L，辛醛的含量为0.10～0.12μg/L。并且本发明制备得到的奶豆腐稳定性好，在温度为4℃条件下贮藏14d，奶豆腐中2-庚酮的含量为3.18～3.30μg/L，2-壬酮的含量为1.13～1.15μg/L，乙偶姻的含量为4.01～4.13μg/L，3-甲基-丁醛的含量为0.03～0.05μg/L，庚醛的含量为0.38～0.40μg/L，辛醛的含量为0.17～0.19μg/L。
本发明筛选获得一株乳酸乳球菌IMAU12063和一株副干酪乳酪杆菌IMAU12062，将这两株乳酸菌按比例复配作为发酵剂用于全脂牛乳发酵并制作奶豆腐，其奶豆腐质地和风味特征优于自然发酵乳制作的奶豆腐。该发明可缩短牛乳发酵时间、发酵过程可控、发酵乳的风味物质以乙醛、双乙酰、乙偶姻等为主，赋予奶传统豆腐特有的风味特征的同时提高了奶豆腐的卫生质量和安全性，弥补了传统奶豆腐制作工艺中原料乳自然发酵仅凭经验控制的不足。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
适用于奶豆腐发酵乳发酵菌株的筛选
MRS液体培养基：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、吐温-801mL、磷酸氢二钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g、琼脂粉15g，蒸馏水定容1L，调节初始pH至6.20，121℃灭菌15min。
10％脱脂乳培养基：10g脱脂乳粉，蒸馏水90mL，加热至50℃充分溶解后分装试管或三角瓶，115℃灭菌10min。
全脂原料牛乳：未经杀菌处理的全脂原料牛乳购于内蒙古农业大学益得乳制品实验厂。
本发明中乳酸乳球菌和副干酪乳酪杆菌分离自中国不同地区的奶酪样品，由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室分离、鉴定并保藏。菌株的鉴定采用16SrRNA基因序列比对方法。
本发明针对内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室乳酸菌菌种资源库中保藏的分离自不同地区的传统乳制品中的56株乳酸乳球菌和24株副干酪乳酪杆菌，采用脱脂乳培养基发酵实验筛选发酵特性优良的菌株。具体实验方法如下：将56株乳酸乳球菌和34株副干酪乳酪杆菌接种于液体MRS培养基中，置于37℃、24h培养，以此活化培养三代后，将活化菌液按质量比2％的接种量接种于10％灭菌脱脂乳培养基中，置于30℃恒温培养并观察24h。菌株的凝乳情况见图1和表1，菌株在其发酵过程中每2h测定pH值和滴定酸度，结果如图2～3和表1所示。
表1乳酸乳球菌和副干酪乳酪杆菌pH值和凝乳情况
根据图1～图5和表1可以看出，在24h发酵时间内，56株乳酸乳球菌中有47株菌可以在脱脂乳中生长并能够凝乳，24株副干酪乳酪杆菌中有19株在脱脂乳中生长并能够凝乳(见图1)。其中，11株乳酸乳球菌在脱脂乳中发酵12h时致使其pH值接近4.5(见图2)，并散发出酸乳的自然香味，有凝乳现象；有6株副干酪乳酪杆菌在发酵12h时其pH值接近5.0左右(见图4)，开始呈现凝乳现象。所选11株乳酸乳球菌中IMAU12063、IMAU81310、IMAU81321、IMAU81309共4株菌在发酵8h时脱脂乳pH值达5.2左右，12h后其滴定酸度到88°T左右(见图3和表2)。6株副干酪乳酪杆菌中，菌株IMAU12062、IMAU50903、IMAU50897到达发酵终点时滴定酸度达到86°T左右(见图5和表3)。在众多的发酵菌中，乳酸乳球菌IMAU12063、IMAU81310、IMAU81321、IMAU81309和3株副干酪乳酪杆菌IMAU50897、IMAU50903、IMAU12062在脱脂乳中的酸度在86°T～88°T，制备的发酵乳酸度好。
表2不同发酵时间下乳酸乳球菌酸度测定结果(TA)
表3不同发酵时间下副干酪乳杆菌酸度测定结果(TA)
时间(h) IMAU50903 IMAU50921 IMAU12062 IMAU50896 IMAU50897 IMAU50918
0 24±1.2 16±0.7 22±0.9 18±1.2 20±0.9 20±0.9
2 24±0 20±0.9 24±0 20±0.9 24±1 24±1
4 24±1.2 22±0.6 24±1.2 24±1 26±0.9 24±0.7
6 24±10.9 24±1 28±0.9 26±0.7 28±1 24±0.9
8 34±0.9 32±0.9 36±1 34±0.9 36±1 36±0.9
10 52±0.6 46±0.9 52±1 44±1 50±0.6 44±1
12 62±1 54±1 60±1.2 56±1 58±0.9 52±1
14 74±1 64±1 72±0.9 66±0.9 70±1.2 68±1.2
16 84±0.6 74±0.7 84±0.9 80±0.9 78±0.9 76±1.2
17 88±1 82±0.9 90±1 86±1 86±0.9 82±0.9
利用上述乳酸乳球菌IMAU12063、IMAU81310、IMAU81321、IMAU81309和3株副干酪乳酪杆菌IMAU50897、IMAU50903、IMAU12062分别在10％灭菌脱脂乳培养基中进行培养和发酵，待4株乳酸乳球菌IMAU12063、IMAU81310、IMAU81321、IMAU81309和3株副干酪乳酪杆菌IMAU50897、IMAU50903、IMAU12062到达发酵终点后，利用DV2T粘度计进行黏度测定，且根据GB 19302-2010《食品安全国家标准发酵乳》进行发酵乳的感官评定，结果如图7和表4所示。
表4发酵乳感官评分
菌株名称 气味(30分) 滋味(30分) 质地、色泽(20分) 口感(30分) 总分(30分)
IMAU12062 26.375±1.57 26.25±1.29 16.5±0.86 16.625±0.69 85.75±2.05
IMAU50897 22.25±1.29 23.25±0.58 14.75±1.56 15±0.70 75.25±1.32
IMAU81309 20.125±1.16 20.625±1.72 17.25±0.66 16.5±0.70 69.25±2.23
IMAU12063 17.625±0.85 20±0.86 16.5±1.11 15.125±0.78 74.5±1.36
IMAU81310 17±0.70 19±1.22 16.875±0.92 15.375±0.85 68.25±2.24
根据图6可以看出，乳酸乳球菌IMAU12063的产酸性能较好，黏度值较高，达到700Pa·S以上；副干酪乳酪杆菌IMAU12062的产酸性能较好，发酵速度适中，黏度值居中，为500Pa·S左右，并优于其他菌株(见图6)。经过上述实验综合比较菌株产酸性能、发酵乳黏度和感官评定多项指标进行分析，从7株菌株中筛选到株乳酸乳球菌IMAU12063、IMAU81310、IMAU81309和3株副干酪乳酪杆菌IMAU50897、IMAU50903、IMAU12062进行感官评分，乳酸乳球菌IMAU12063感官评分为74.5分、副干酪乳酪杆菌IMAU12062感官评分为85.75分，如图7所示。
对乳酸乳球菌IMAU12063和副干酪乳酪杆菌IMAU12062进行生物保藏，乳酸乳球菌IMAU12063的保藏编号为CGMCC NO.26949，副干酪乳酪杆菌IMAU12062的保藏编号为CGMCCNO.26948。
实施例2
实施例1得到并生物保藏的乳酸乳球菌IMAU12063和副干酪乳酪杆菌IMAU12062的复配，并进行牛乳发酵试验。
1.将冻干保藏菌株乳酸乳球菌IMAU12063接种于无菌液体MRS培养基(组成同实施例1)中，于37℃活化培养24h后经3000r/min离心10min去除上清液，将沉淀菌泥与PBS溶液(8g/LNaCl、1.4g/L Na2HPO4和0.24g/L KH2PO4)均匀混合制备成活菌数为2.5×107CFU/mL的乳酸乳球菌IMAU12063菌悬液置于4℃冰箱保藏，备用。
将冻干保藏菌株副干酪乳酪杆菌IMAU12062分别接种于无菌液体MRS培养基中，于37℃活化培养24h后经3000r/min离心10min去除上清液，将沉淀菌泥与PBS溶液(8g/LNaCl、1.4g/L Na2HPO4和0.24g/L KH2PO4)均匀混合制备成活菌数为2.5×107CFU/mL的副干酪乳酪杆菌IMAU12062菌悬液置于4℃冰箱保藏，备用。
2.将原料牛乳20kg经巴氏杀菌(75℃，15min)后冷却至30℃后接种复配发酵菌剂0.4kg。复配发酵菌剂的组成为商业发酵剂(YF-L904)0.0003kg和本发明的发酵剂0.3997kg。本发明的发酵剂中乳酸乳球菌IMAU12063菌悬液和副干酪乳酪杆菌IMAU12062菌悬液的质量比为1:1，原始乳酸乳球菌IMAU12063菌悬液的有效活菌数为2.5×107CFU/mL和原始副干酪乳酪杆菌IMAU12062菌悬液的有效活菌数为2.5×107CFU/mL。
3.接种后，在温度为30℃的条件下恒温发酵6h左右，当pH＝4.5±0.02时达到发酵终点，具体发酵剂的接种种类和接种量见表2。
实施例3
同实施例2，唯一区别在于本发明的发酵剂的有效活菌数不同。本发明的发酵剂中乳酸乳球菌IMAU12063菌悬液和副干酪乳酪杆菌IMAU12062菌悬液的质量比为1:1，乳酸乳球菌IMAU12063的原始有效活菌数为1.75×107CFU/mL和副干酪乳酪杆菌IMAU12062的原始有效活菌数为0.75×107CFU/mL。发酵菌剂的组成为商业发酵剂(YF-L904)0.0003kg和本发明的发酵剂0.3997kg。
实施例4
同实施例2，唯一区别在于本发明的发酵剂的有效活菌数不同。本发明的发酵剂中乳酸乳球菌IMAU12063菌悬液和副干酪乳酪杆菌IMAU12062菌悬液的质量比为1:1，原始乳酸乳球菌IMAU12063的有效活菌数为1.25×107CFU/mL和原始副干酪乳酪杆菌IMAU12062的有效活菌数为1.25×107CFU/mL。发酵菌剂的组成为商业发酵剂(YF-L904)0.0003kg和本发明的发酵剂0.3997kg。
实施例5
同实施例2，唯一区别在于本发明的发酵剂的有效活菌数不同。本发明的发酵剂由乳酸乳球菌IMAU12063和副干酪乳酪杆菌IMAU12062组成，本发明的发酵剂中乳酸乳球菌IMAU12063菌悬液和副干酪乳酪杆菌IMAU12062菌悬液的质量比为1:1，原始乳酸乳球菌IMAU12063的有效活菌数为2×107CFU/mL和原始副干酪乳酪杆菌IMAU12062的有效活菌数为0.5×107CFU/mL。复配发酵菌剂的组成为商业发酵剂(YF-L904)0.0003kg和本发明的发酵剂0.3997kg。
实施例6
同实施例2，唯一区别在于复配发酵菌剂仅含有本发明的发酵剂。本发明的发酵剂由乳酸乳球菌IMAU12063和副干酪乳酪杆菌IMAU12062组成，本发明的发酵剂中乳酸乳球菌IMAU12063菌悬液和副干酪乳酪杆菌IMAU12062菌悬液的质量比为1:1，原始乳酸乳球菌IMAU12063的有效活菌数为5×107CFU/mL和原始发酵剂中副干酪乳酪杆菌IMAU12062的有效活菌数为5×107CFU/mL。本发明的发酵剂添加量为0.4kg。
实施例7
同实施例2，区别在于复配发酵菌剂仅含有本发明的发酵剂，本发明的发酵剂由乳酸乳球菌IMAU12063和副干酪乳酪杆菌IMAU12062组成，本发明的发酵剂中乳酸乳球菌IMAU12063菌悬液和副干酪乳酪杆菌IMAU12062菌悬液的质量比为1:1，原始乳酸乳球菌IMAU12063的有效活菌数为3.5×107CFU/mL和原始副干酪乳酪杆菌IMAU12062的有效活菌数为1.5×107CFU/mL。本发明的发酵剂添加量为0.4kg。
实施例8
同实施例2，区别在于复配发酵菌剂仅含有本发明的发酵剂。本发明的发酵剂由乳酸乳球菌IMAU12063和副干酪乳酪杆菌IMAU12062组成，本发明的发酵剂中乳酸乳球菌IMAU12063菌悬液和副干酪乳酪杆菌IMAU12062菌悬液的质量比为1:1，原始乳酸乳球菌IMAU12063的有效活菌数为2.5×107CFU/mL和原始副干酪乳酪杆菌IMAU12062的有效活菌数为2.5×107CFU/mL。本发明的发酵剂添加量为0.4kg。
实施例9
同实施例2，区别在于复配发酵菌剂仅含有本发明的发酵剂。本发明的发酵剂由乳酸乳球菌IMAU12063和副干酪乳酪杆菌IMAU12062组成，本发明的发酵剂中乳酸乳球菌IMAU12063菌悬液和副干酪乳酪杆菌IMAU12062菌悬液的质量比为1:1，原始乳酸乳球菌IMAU12063的有效活菌数为4.0×107CFU/mL和原始副干酪乳酪杆菌IMAU12062的有效活菌数为1.0×107CFU/mL。本发明的发酵剂添加量为0.4kg。
对比例1
同实施例2，区别在于复配发酵菌剂仅含有商业发酵剂YF-L904，商业发酵剂购买自丹麦科汉森股份有限公司；YF-L904的添加量为0.0006kg。
实施例2～9和对比例1添加的发酵剂的具体组成见表5。
表5不同组发酵剂的制备
测试例1
(1)实施例2～9和对比例1接种后的发酵过程中每隔2h进行发酵特性指标的测定，直至发酵到发酵乳的pH值为4.48～4.52，发酵特性测定结果如图8中A和B、表6、表7所示。不添加商业发酵剂的四组(B、C、D、E)中E组产酸性能最佳，在添加商业发酵剂的四组(F、G、H、I)中F组和I组的产酸性能较好。
表6实施例2～9和对比例1发酵乳发酵期间滴定酸度
时间(h) A B C D E F G H I
0 18±1.08 18±0.91 18±0.91 18±1.13 20±1.92 18±1.21 20±1.27 18±0.98 18±1.08
2 24±0.90 22±0.93 22±0.92 22±1.20 29±0.91 30±1.14 34±1.12 36±1.20 34±1.08
4 56±1.03 34±1.39 32±1.24 28±1.20 42±1.01 56±1.20 56±1.21 60±1.14 60±1.20
6 68±1.02 52±1.28 44±1.28 54±1.15 64±1.03 74±1.18 68±1.09 72±1.24 74±1.20
8 78±0.90 62±0.92 62±1.12 66±1.08 76±1.02 86±1.08 76±0.90 80±1.02 86±1.18
10 84±1.19 78±0.91 82±1.01 82±0.91 84±1.14 90±1.10 86±00.90 86±1.021 92±1.13
表7实施例2～9和对比例1发酵乳发酵期间pH
(2)发酵至发酵乳的pH值为4.48～4.52后，对对比例1、实施例6、实施例5和实施例2进行感官评分及挥发性风味物质测定。
测定采用固相微萃取—气质联用技术(SPME-GC-MS)法，具体方法如下：SPME条件：取5g奶豆腐样品放入15mL的萃取瓶，在温度为50℃的水浴锅中水浴30min，水浴后将萃取头插入到萃取瓶中进行萃取，萃取条件为65℃、60min。
GC条件：采用DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)，色谱柱升温程序为：起始柱温35℃，保持3min，以5℃/min速率升到100℃，保持3min，然后以5℃/min速率升到150℃，最后以8℃/min速率升到230℃，保持3min，载气为He，流速为1mL/min。不分流进样。
MS条件：质量扫描范围m/z 20～350。
测定结果如图9和表8所示。根据图8、图9和表8可知，实施例2组复配菌株发酵4h时后进入快速发酵阶段其pH值低于5.0，滴定酸度55°T，而且继续发酵至10h后将形成丰富的风味物质，此组合比较适合奶豆腐发酵乳制备。
表8不同发酵剂制备的发酵乳中挥发性风味化合物的鉴定结果
注：-指未检测到该物质
根据表3和图8～图9可知，实施例2的发酵乳的感官评分优于其他实验组，且实施例2的发酵乳含有丰富的可以修饰和改善发酵乳风味和口感的挥发性风味物质，包括乙酸乙酯、己酸乙酯和甲酸乙烯酯等，因此筛选得最优复配发酵剂组合：原始乳酸乳球菌的有效活菌数为2.5×107CFU/mL，原始副干酪乳酪杆的有效活菌数为菌2.5×107CFU/mL，添加商业发酵剂占牛乳的质量比(w/w)为0.0015％。
实施例10乳酸乳球菌IMAU12063和副干酪乳酪杆菌IMAU12062在奶豆腐制作中的应用
全脂原料乳经巴氏杀菌法(75℃，15min)灭菌后冷却至32～33℃左右，添加0.02％的无水氯化钙，添加复配发酵菌剂。复配发酵菌剂由商业发酵剂(YF-L904)和本发明的发酵剂组成。本发明的发酵剂中乳酸乳球菌IMAU12063菌悬液和副干酪乳酪杆菌IMAU12062菌悬液的质量比为1:1，乳酸乳球菌IMAU12063菌悬液的有效活菌数为2.5×107CFU/mL和副干酪乳酪杆菌IMAU12062菌悬液的有效活菌数为2.5×107CFU/mL；
将复配发酵菌剂与全脂原料乳混合，即本发明的发酵剂和商业发酵剂组成的复配发酵菌剂与全脂原料乳质量的质量比为1：50，复配发酵菌剂中商业发酵剂为全脂原料乳质量的0.0015％(w/w)，搅拌混匀后于30℃恒温发酵，并随时间检测其pH值，当pH值达到4.5±0.02时，加入0.001g/kg的凝乳酶后静置60min左右，凝乳酶的酶活力为13万U，随后缓慢加热使其凝乳，将酸度控制在50～55°T，在45℃条件下排乳清，乳清不断排出后将凝块装入模具中进行压榨定型即为奶豆腐成品。
对比例2
市售的商业奶豆腐，市售的商业奶豆腐购买自市场的民族奶食品店由传统方法制作的奶豆腐产品，其制作方法是将新鲜牛乳不加热杀菌经自然状态下静置发酵呈凝乳后刮取上浮于表层的奶油，将剩余的凝乳放入锅中加热至絮状凝块分离去除乳清，继续加热并搅揉至拉丝状后装模成型冷却即成奶豆腐。
测试例2
对实施例10制备的奶豆腐与对比例2的市售商业奶豆腐从质构和挥发性风味物质进行比较，同时对贮藏期的奶豆腐的质构、挥发性风味物质和气味进行评价。
1.采用TA.XT.plus质构仪对本发明制备的奶豆腐和市售进行质构检测，试验结果如表9所示。根据表9可以看出，奶豆腐在4℃恒温保藏时，本发明制备的奶豆腐保藏14d柔软度较好，本发明改善了奶豆腐贮藏过程中逐渐变硬的口感，相对于对比例2其韧性强度增强，脆性指数降低，奶豆腐的质构得到了整体的提升。
表9奶豆腐贮藏期内质构测定结果
2.运用固相微萃取-气相色谱-质谱联用(SPME-GC-MS)技术检测分析方法对贮藏期奶豆腐挥发性风味物质分析。分别在贮藏0d、1d、7d和14d对实施例10制备的奶豆腐挥发性风味物质分析，结果如图10～图12和表10所示。根据图10～图12和表10可以看出，所述奶豆腐中含有较高含量的2-庚酮、2-壬酮和乙偶姻等酮类化合物，赋予奶豆腐独特的水果清香和奶油香气。含有丰富的3-甲基-丁醛、庚醛和辛醛等醛类化合物，这些物质能产生令人愉悦的香气。同时，奶豆腐富含丰富的酯类、烷烃、烯烃、酸类和醇类等化合物，赋予奶豆腐独特且稳定的风味。
表10贮藏期间奶豆腐中挥发性风味化合物的鉴定结果
注：-指未检测到该物质；DJ代表贮藏7天的市售传统奶豆腐。
3.利用采用PEN3型电子鼻测定气味，设置参数为自动清洗时间为100s，样品测定时间为90s，对实施例10制备的奶豆腐进行贮藏期间的气味成分变化情况，结果如图13和表11所示。图13中W1C代表芳烃化合物、W5S代表氮氧化合物、W3C代表胺和部分芳香族化合物、W6S代表氢化物、W5C代表烯烃、芳族、极性分子、W1S代表烷类化合物、W1W代表硫化合物、W2S代表醇类和部分芳香族化合物、W2W代表芳烃化合物、硫的有机化合物、W3S代表烷类和酯类。根据图13可以看出，在贮藏期间奶豆腐中的氮氧化合物、氨类物质、烷烃芳香成分、有机硫化物芳香成分、醇类、醛酮类物质、烷烃类物含量相对稳定，表明其气味较稳定。
表11奶豆腐贮藏期间电子鼻传感器雷达图及箱线图分析结果
化合物 0d 1d 7d 14d
W1C 1.2382 1.6994 2.00725 1.8936
W5S 1.1949 1.28735 1.28865 1.3091
W3C 0.8423 0.8567 0.8854 0.8956
W6S 1.2678 1.28815 1.40455 1.32275
W5C 0.89535 0.9196 0.9507 0.9641
W1S 1.49895 1.4982 1.4374 1.3437
W1W 0.66035 0.69515 0.75615 0.7721
W2S 1.42075 1.3975 1.3518 1.3187
W2W 0.94505 0.9779 1.03975 0.9918
W3S 1.2764 1.32815 1.36775 1.3896
综上，利用本发明的发酵剂制备的奶豆腐贮藏过程中不会逐渐变硬，同时其韧性强度增强，脆性指数降低，奶豆腐的质构得到了整体的提升。制备的奶豆腐含有较高含量的2-庚酮、2-壬酮和乙偶姻等酮类化合物，赋予奶豆腐独特的水果清香和奶油香气。含有丰富的3-甲基-丁醛、庚醛和辛醛等醛类化合物，这些物质能产生令人愉悦的香气。同时，奶豆腐富含丰富的酯类、烷烃、烯烃、酸类和醇类等化合物，赋予奶豆腐独特且稳定的风味，口感好。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (11)

1.一种发酵剂，其特征在于，包括乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)IMAU12063和副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)IMAU12062；所述发酵剂中乳酸乳球菌的有效活菌数≥2.5×106CFU/mL；所述发酵剂中副干酪乳酪杆菌的有效活菌数≥2.5×105CFU/mL；
所述乳酸乳球菌IMAU12063的保藏编号为CGMCCNO.26949；所述副干酪乳酪杆菌IMAU12062的保藏编号为CGMCCNO.26948。
2.根据权利要求1所述的发酵剂，其特征在于，所述乳酸乳球菌和所述副干酪乳酪杆菌的质量比为1：(1～2)。
3.权利要求1或2所述的发酵剂在制备奶豆腐中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵剂单独使用或者与其他商业发酵剂联用。
5.一种奶豆腐的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
利用权利要求1或2所述的发酵剂对牛乳进行发酵，得到发酵产物；
对所述发酵产物凝乳后排乳清，得到奶豆腐。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的温度为28～33℃，所述发酵在发酵产物的pH值达到4.48～4.52时停止。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵剂与牛乳的质量比为1：20～50。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述排乳清的温度为43℃～47℃。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，对所述发酵产物凝乳的方式包括：将所述发酵产物与凝乳酶混合。
10.权利要求5～9任一项所述的制备方法得到的奶豆腐，其特征在于，当发酵剂单独使用时，所述奶豆腐的风味物质包括2-庚酮、2-壬酮和3-甲基-丁醛中的一种或多种。
11.根据权利要求10所述的奶豆腐，其特征在于，所述发酵剂与其他商业发酵剂联用时，所述商业发酵剂为丹麦科汉森股份有限公司生产的YF-L904；所述奶豆腐的风味物质还包括乙偶姻、庚醛和辛醛中的一种或多种。
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